Summary
Describimos el uso de microscopía de coherencia óptica de campo completo como un método para la evaluación de alta calidad del estroma del donante corneal. Este protocolo se puede utilizar para identificar características indicativas de salud o enfermedad, y tiene como objetivo mejorar la detección y selección de tejidos de donantes y, por lo tanto, los resultados de la queratoplastia.
Abstract
Es probable que la calidad del estroma corneal del donante, que constituye aproximadamente el 90% del grosor corneal total, sea uno de los principales, si no el principal, factor limitante (s) para el éxito de la queratoplastia lamelar anterior profunda y penetrante. Estos son procedimientos quirúrgicos que implican reemplazar parte o la totalidad de las capas corneales enfermas, respectivamente, por tejido donado, el injerto, tomado de un individuo recientemente fallecido. Sin embargo, los medios para evaluar la calidad estromal de los injertos corneales en los bancos de ojos son limitados y carecen de la capacidad de evaluación cuantitativa de alta resolución de los indicadores de enfermedad. La microscopía de coherencia óptica de campo completo (FF-OCM), que permite obtener imágenes 3D de alta resolución de muestras de tejido biológico ex vivo frescas o fijas, es una técnica no invasiva muy adecuada para la evaluación de la córnea del donante. Aquí describimos un método para el análisis cualitativo y cuantitativo del estroma corneal utilizando FF-OCM. El protocolo se ha aplicado con éxito a córneas de donantes normales y botones corneales patológicos, y se puede utilizar para identificar características sanas y patológicas tanto a nivel macroscópico como microscópico, facilitando así la detección de trastornos estromales que podrían comprometer el resultado de la queratoplastia. Al mejorar el control de calidad del injerto, este protocolo tiene el potencial de resultar en una mejor selección (y rechazo) de los tejidos del donante y, por lo tanto, una disminución del fracaso del injerto.
Introduction
Las enfermedades corneales se encuentran entre las principales causas de ceguera en todo el mundo1. Algunas enfermedades solo se pueden tratar quirúrgicamente, a menudo involucrando el reemplazo de parte (es decir, queratoplastia lamelar) o toda la córnea enferma (es decir, queratoplastia penetrante), por tejido donado, el injerto, tomado de un individuo recientemente fallecido. Para las enfermedades corneales que no afectan el endotelio (p. ej., queratocono, cicatrices estromales después de queratitis infecciosa, traumatismos y distrofias estromales), la queratoplastia lamelar anterior profunda (DALK) se considera actualmente como la técnica quirúrgica de elección 2,3,4,5. Esta técnica posibilita la preservación del endotelio corneal del receptor, al reemplazar solamente el epitelio corneal central y el estroma, lo que se asocia con una menor incidencia de rechazo del injerto, ausencia de rechazo endotelial, menor pérdida de células endoteliales y relación costo-efectividad favorable 6,7,8,9,10,11 . Además, DALK permite que las córneas con una calidad endotelial inferior a la óptima se utilicen como injertos, ya que esta capa comprometida no será trasplantada12. Por el contrario, es probable que la calidad del estroma corneal del donante sea el principal factor limitante para el éxito del injerto y la recuperación de la visión porque el estroma es la única capa corneal del donante que permanece, mientras que el epitelio del donante será reemplazado por el epitelio receptor. Desafortunadamente, los medios para evaluar el estroma corneal del donante en los bancos de ojos son limitados. Por lo general, incluyen el examen con lámpara de hendidura del globo ocular del donante cuando la recuperación del tejido se realiza mediante enucleación y el examen con microscopio óptico del estroma del donante13. Algunos bancos de ojos han comenzado a complementar estos procedimientos estándar mediante la tomografía de coherencia óptica de dominio de Fourier (FD-OCT)14.
La tomografía de coherencia óptica oftálmica (OCT), un análogo óptico de la imagen ecográfica15, utiliza interferencia de banda ancha o luz sintonizable para generar secciones ópticas de la retina 16 y el segmento anterior17. En la OCT en el dominio del tiempo, la base de los primeros sistemas clínicos, la posición de un espejo de referencia se altera, de modo que los patrones de interferencia aparecen cada vez que el haz de referencia ha viajado casi la misma cantidad de tiempo que el haz reflejado en las diversas interfaces de tejido, con exploraciones A que se generan en función del tiempo. En FD-OCT (también llamada OCT espectral o de dominio de frecuencia), la base de la mayoría de los sistemas clínicos modernos, el espejo de referencia se fija en una posición y un A-scan individual, con todos los patrones de interferencia mezclados, se adquiere a la vez y se disecciona a través del análisis de Fourier.
Si bien los sistemas clínicos (tiempo o dominio espectral) de OCT permiten vistas transversales de la córnea y la detección de opacidades estromales a una resolución axial más alta que la biomicroscopía con lámpara de hendidura, su resolución lateral es limitada. La microscopía confocal18 permite el examen de la córnea a una resolución lateral cercana al detalle histológico, pero está limitada axialmente.
La microscopía tomográfica de coherencia óptica de campo completo (FF-OCT o FF-OCM)19,20 combina elementos tanto de microscopía confocal como de OCT, logrando una resolución lateral comparable a la resolución axial de aproximadamente 1 μm. Más específicamente, FF-OCM utiliza fuentes de luz de banda ancha incoherentes (por ejemplo, una lámpara halógena) y óptica de alta apertura numérica para adquirir imágenes tomográficas 2D en la cara sin escaneo lateral. Al escanear en la dirección de profundidad, FF-OCM permite obtener imágenes 3D no invasivas de muestras de tejido biológico ex vivo frescas o fijas. Se ha utilizado para obtener imágenes de la córnea21,22,23. Al proporcionar vistas frontales y transversales de alta resolución, FF-OCM proporciona información sobre la estructura histológica y los detalles celulares de la córnea. De hecho, FF-OCM ha demostrado proporcionar información estructural superior a la histología y fue capaz de identificar más indicadores de enfermedad como fue posible con la combinación de OCT de dominio espectral y microscopía confocal24,25.
Aquí describimos un protocolo para la evaluación cualitativa y cuantitativa del estroma del donante corneal utilizando FF-OCM. El método se basa en el análisis histológico de características macroscópicas y microscópicas indicativas de condición estromal estromal, incluidos tres parámetros estromales cuantitativos (es decir, el grosor de la capa de Bowman y su variabilidad, y la reflectividad del estroma). Por lo tanto, el protocolo descrito se aplica a los tejidos normales y anormales de la córnea y permite la diferenciación de los tejidos corneales humanos enfermos de los normales.
Protocol
Todos los métodos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y siguieron los requisitos éticos internacionales para los tejidos humanos. Este fue un estudio observacional prospectivo de casos y controles. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes. No se introdujeron modificaciones en las normas francesas de tratamiento o seguimiento. La aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB) se obtuvo del Comité de Protección del Paciente, Ile-de-France V (14944).
1. Selección y preparación de tejidos
- Seleccione córneas de donantes.
- Transfiera las córneas de donantes almacenadas en medio de cultivo de órganos 26 al medio de cultivo de órganos suplementado con dextrano durante 3 días para permitir la deturgescencia27 antes de la obtención de imágenes FF-OCM28 (consulte la Tabla de materiales).
- Prepare las muestras.
- Coloque la córnea, sumergida en un medio de almacenamiento, en el portamuestras con el epitelio hacia arriba.
- Coloque un cubreobjetos de sílice limpio (provisto con el soporte de muestra) en la parte superior de la córnea y cierre el soporte girando suavemente su base hasta que la muestra esté ligeramente aplanada e inmovilizada debajo del cubreobjetos, proporcionando una superficie de imagen relativamente uniforme. Tome precauciones para evitar cualquier burbuja de aire.
- Aplique una capa gruesa de gel oftálmico u óptico sobre el cubreobjetos como medio de inmersión.
2. Inicialización, configuración y adquisición de imágenes de FF-OCM
- Inicialice el dispositivo.
- Encienda el dispositivo accionando el interruptor de encendido en la parte posterior del dispositivo; La iluminación de un LED verde en la parte frontal del dispositivo indica que la alimentación está encendida.
- Encienda la computadora dedicada y la fuente de luz halógena accionando el interruptor de encendido en la parte frontal.
- Inicie el software de adquisición (consulte la Tabla de materiales) haciendo doble clic en el acceso directo del escritorio.
- Asegúrese de que la etapa de imagen esté despejada, excepto por la bandeja móvil. Luego haga clic en "Aceptar" para inicializar los motores cuando se le solicite.
- Saque la bandeja e inserte el portamuestras en el recipiente dedicado, luego empuje suavemente hacia atrás la bandeja.
- Configure el dispositivo.
- Introduzca un "identificador de muestra" en el campo designado y obligatorio; Opcionalmente, introduzca una "Descripción de la muestra" y/o "Descripción del estudio".
- Haga clic en "Adquirir imagen macro" cuando esté listo, para crear una instantánea de la muestra que se puede utilizar para fines de posicionamiento lateral y navegación más adelante; una vez satisfecho, valide la imagen en el indicador haciendo clic en "Sí", después de lo cual el dispositivo mueve la bandeja de muestra debajo del objetivo y realiza un ajuste automático.
- Asegúrese de que el objetivo del microscopio esté bien sumergido en el gel óptico antes de continuar.
- Adquiere las pilas.
- Seleccione la pestaña "Explorar" para preparar una adquisición.
- Antes de adquirir una pila de imágenes, navegue hasta el centro de la córnea, mediante la traducción del joystick o la selección manual en la pantalla (es decir, haciendo clic y arrastrando el cuadrado rojo de la imagen macro adquirida a la ubicación deseada).
- Varíe la profundidad de imagen mediante la rotación del joystick, el ajuste del control deslizante o la entrada manual del teclado en la interfaz gráfica de usuario (GUI) y ajuste el valor promedio (generalmente se recomienda un promedio de 40 para obtener imágenes corneales óptimas).
NOTA: Esto se hace para determinar el grosor de la muestra corneal y el promedio necesario para obtener imágenes a través de todo el grosor corneal mientras se observa la primera y la última ubicación de la imagen en profundidad. La superficie inferior del cubreobjetos crea franjas de interferencia paralelas que se ven en la imagen tomográfica (en el lado derecho de la GUI), que facilitan la localización de la superficie corneal. - Introduzca el valor de la superficie corneal o la primera ubicación de la imagen en profundidad en el campo "Profundidad".
- Seleccione la pestaña "Adquirir", para adquirir imágenes.
- Seleccione el "Espaciado de corte" (la configuración predeterminada y recomendada es 1 μm, que coincide con la resolución axial del dispositivo) e introduzca el valor de espesor corneal en consecuencia, en "Número de cortes".
- Revise los parámetros y el tiempo de adquisición, y cuando esté satisfecho, presione "OK" para iniciar la adquisición.
- Durante la adquisición, evite cualquier contacto con la mesa en la que se coloca el FF-OCM.
- Seleccione la pestaña "Explorar" para preparar una adquisición.
3. Gestión de las imágenes adquiridas
- Ver y exportar imágenes.
- Inicie el software de visualización FF-OCM (consulte la Tabla de materiales) haciendo doble clic en el acceso directo del escritorio; Las imágenes adquiridas (identificadas por el ID de muestra) aparecen en la lista "Estudios locales".
- Seleccione el estudio con el ID de muestra correspondiente, que contiene tanto la imagen macro como la pila de imágenes adquiridas, y "exporte" esta última haciendo clic derecho en la serie de imágenes y seleccionando el formato "DICOM" para conservar los datos y metadatos de píxeles sin procesar para su posterior análisis.
- Muestre las pilas de imágenes 3D en vistas frontales y transversales utilizando el modo de reconstrucción multiplanar (MPR), haciendo doble clic en la serie de imágenes; Navegue por las imágenes (por ejemplo, mediante el desplazamiento de la rueda del mouse o el ajuste del control deslizante) y seleccione vistas representativas en la cara y transversales de cada pila.
- Exporte las vistas seleccionadas haciendo clic en el icono en la parte inferior derecha de la ventana, utilizando el formato "DICOM".
- Importar imágenes.
- Abra el software de procesamiento de imágenes (consulte la Tabla de materiales) haciendo doble clic en el acceso directo del escritorio y navegue hasta el "Importador de bioformatos" en "Complementos" para importar imágenes DICOM; asegúrese de que "Agrupar archivos con nombres similares" esté seleccionado en la ventana "Opciones de importación de bioformatos".
4. Análisis de imágenes: evaluación cualitativa y cuantitativa de la morfología y características del estroma
- Evaluar el grosor del estroma y de la capa de Bowman.
- Mida distancias manualmente en secciones transversales corneales, por ejemplo, en cinco puntos igualmente espaciados a través de la sección transversal25.
- Dibuje una línea entre dos puntos de distancia conocida (como, de izquierda a derecha de toda la imagen, es decir, según el campo de visión predeterminado, 1.024 píxeles o 780 μm), vaya a "Analizar" y seleccione "Establecer escala", e ingrese la "Distancia conocida" y la "Unidad de longitud" en los campos apropiados y haga clic en "Aceptar".
- Dibuja una línea entre dos puntos de distancia desconocida; Lea la longitud o distancia medida directamente desde la barra de estado.
- Registre la media y el coeficiente de variación (COV). El grosor de la capa de Bowman inferior a 6,5 μm y un COV superior al 18,6% se han asociado con estroma corneal anormal25.
- Mida distancias manualmente en secciones transversales corneales, por ejemplo, en cinco puntos igualmente espaciados a través de la sección transversal25.
- Determinar la densidad de queratocitos.
- Siguiendo la convención de la microscopía confocal: suma imágenes estromales en cara en grupos de 7 para producir cortes de espesor comparable. Para esto, vaya a la pestaña "Imagen" y seleccione "Reslice Z" en "Pilas".
- Tener en cuenta la diferente densidad celular (decreciente) en la progresión a través del estroma24,25. Para esto, se puede considerar que el estroma está compuesto por 4 regiones según la profundidad: (1) el estroma muy anterior debajo de la capa de Bowman, que es el 2% del grosor total del estroma; El estroma restante (es decir, el 98% del grosor total del estroma), con tres zonas de grosor idéntico: (2) estroma anterior, (3) estroma medio y (4) estroma posterior.
- Para un análisis adicional, incluya todos los cortes faciales disponibles para el estroma muy anterior, 15 imágenes para el estroma anterior, 5 imágenes para el estroma medio, así como 5 imágenes para el estroma posterior (donde el número de imágenes por región requeridas para un recuento confiable se determinó mediante análisis escalonado29).
- En cada imagen frontal , seleccione una región de interés de 300 μm x 300 μm. Para mejorar la visualización del núcleo, invierta la imagen, usando "Invertir" en la pestaña "Editar", y ajuste el contraste y el brillo. Para este último, vaya a "Imagen" y navegue hasta "Brillo / Contraste" en "Analizar".
- Contar manualmente los núcleos celulares, utilizando, por ejemplo, la función "contador de celdas"25. Para esto, vaya a "Complementos" y navegue a "Contador de celdas" en "Analizar". Presione "inicializar" y luego seleccione un tipo de contador. Luego comience a contar los núcleos de la celda haciendo clic en las características ovaladas oscuras en la imagen invertida, considerando las que aterrizan en un borde de imagen solo para dos de los cuatro lados de la imagen25.
- Registrar la densidad celular en términos de densidad de área, es decir, en células/mm² (dividir el número de células contadas por 0,09, para convertir de células/90.000 μm² a células/mm²), siguiendo la convención de microscopía confocal donde las densidades de queratocitos han demostrado ser menores en pacientes (por ejemplo, con queratocono) que en sujetos sanos y correlacionarse con la gravedad de la enfermedad25.
NOTA: Se necesitan más estudios clínicos para determinar si se requiere un umbral mínimo de densidad de queratocitos para obtener un injerto de córnea perfectamente claro después del trasplante.
- Evaluar la reflectividad del estroma.
- Genere perfiles de profundidad de intensidad media de pilas de imágenes estromales, utilizando, por ejemplo, la función "perfil del eje Z" y / o software personalizado25,30,31.
NOTA: Estos son, de hecho, perfiles de profundidad de amplitud ya que FF-OCM mide la amplitud de la luz retrodispersada por la muestra en lugar de su intensidad.- Calcule el nivel de gris medio para cada pila de caras .
- Reste el valor gris mínimo y normalícelo por el valor gris máximo.
- Visualización en escala logarítmica en función de la profundidad estromal (% del grosor estromal ).
- Aproximar el perfil logarítmico resultante mediante una línea de regresión lineal, que minimiza la suma de los residuos al cuadrado (ajuste de mínimos cuadrados).
- Registre el valor R-cuadrado (R²) como una medida de linealidad. Valores inferiores a 0,94 podrían ser una indicación de patología corneal25.
NOTA: Para diferenciar la insuficiencia de un modelo de regresión logarítmica lineal (o un modelo de decaimiento monoexponencial) debido a la presencia de una patología del mero ruido de medición, se puede realizar un análisis de señal por inferencia bayesiana31. Además, en córneas con perfiles de profundidad estromal logarítmicos lineales (o monoexponenciales) (por ejemplo, representados por valores R-cuadrado30 o relaciones de Birge 31 cercanas a 1), el cálculo de la trayectoria libre media del fotón a partir de la tasa de decaimiento de la señal puede usarse para cuantificar aún más el grado de transparencia31.
- Genere perfiles de profundidad de intensidad media de pilas de imágenes estromales, utilizando, por ejemplo, la función "perfil del eje Z" y / o software personalizado25,30,31.
- Evaluar la visibilidad de otras características estromales e indicadores de enfermedad.
- Compruebe la presencia de cicatrices, tejido fibrótico, lagos o estrías de Vogt.
- Evaluar el grosor medio de los nervios en el estroma, si es suficientemente visible para la medición24.
- Seleccione una imagen en la cara donde el nervio estromal sea más visible (generalmente en la región del estroma medio).
- Mida el grosor del nervio, por ejemplo, en cinco puntos24, luego calcule la media y la desviación estándar. Los espesores nerviosos superiores a 9 μm pueden ser un indicador adicional de patología, como el queratocono24.
Representative Results
El dispositivo FF-OCM (ver Tabla de Materiales)28 y la configuración general utilizada en este manuscrito se muestran en la Figura 1. La Figura 2 muestra una córnea de donante humano hinchada después del almacenamiento en medio de cultivo de órganos, dando un modelo fisiopatológico de córnea edematosa y evitando la adquisición de imágenes FF-OCM a través de todo el espesor corneal debido a la profundidad de penetración limitada. La transferencia a medio de cultivo de órganos suplementado con dextrano causa hinchazón y da lugar a córneas de donantes de grosor normal, como se representa en la Figura 3. Las córneas enfermas pueden reconocerse por cambios morfológicos y características estromales típicas, incluido un grosor disminuido y variable del estroma (Figura 4) y / o la capa de Bowman (Figura 5). La evaluación de la densidad de queratocitos (Figura 6) y la reflectividad estromal (Figura 7) puede ayudar aún más en el análisis histológico y la diferenciación de tejidos corneales normales de patológicos con FF-OCM, más allá de las capacidades de los sistemas clínicos de OCT (Figura 8).
Figura 1: Esquema y fotografías de la configuración general y el dispositivo FF-OCM utilizado en este trabajo. (A) Fotografía del dispositivo FF-OCM (ver Tabla de Materiales)28. (B) Configuración esquemática y óptica del dispositivo. (C) Fotografía de la córnea de un donante humano en el portamuestras. (D) Zoom en el objetivo de inmersión y el portamuestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Córnea humana normal cultivada en órganos antes de la deturgescencia. Vista transversal (A) y en la cara (B, corte a través del estroma) de la córnea hinchada ("edematosa") causada por el almacenamiento en un medio de cultivo de órganos, donde los lagos pueden verse como áreas oscuras (como lo indican las flechas). El grosor corneal se ha duplicado a más de 1.100 μm, lo que impide la adquisición de imágenes a través de toda la profundidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Córnea humana normal cultivada en órganos después de la deturgescencia. Vista transversal a través de toda la córnea (A) y vista estromal en la cara (B) de córnea hinchada inmersa en medio suplementado con dextrano, mostrando queratocitos hiperrreflectantes (blancos) distribuidos regularmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación general de la morfología y las características del estroma, incluido el grosor del estroma. En comparación con la córnea humana normal (A), las córneas con queratocono (B) presentan un grosor estromal disminuido y variable, junto con numerosas estrías Vogt paralelas que son observables como bandas verticales oscuras en vistas transversales, y nervios estromales gruesos que se pueden encontrar en cortes de cara del estroma medio (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Evaluación del grosor de la capa de Bowman, que está delineada anteriormente por la membrana basal epitelial hiperreflectante y posteriormente por los queratocitos hiperrreflectantes en el estroma muy anterior. En comparación con una córnea humana normal (A), la córnea patológica (por ejemplo, queratocono) (B) presenta un grosor de capa de Bowman disminuido y variable debido a la interrupción y la cicatrización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Evaluación de la densidad de queratocitos. (A) Los núcleos de queratocitos se cuentan manualmente en imágenes mejoradas e invertidas en la cara después de la selección de una región de interés de 300 μm x 300 μm. (B) Los núcleos contados se indican con flechas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Evaluación de la reflectividad del estroma. La cantidad de luz retrodispersada disminuye (exponencialmente) con la profundidad en el estroma de las córneas normales de donantes (ver Figura 3 y Figura 4A), lo que resulta en perfiles de profundidad logarítmicos lineales, representados por valores R-cuadrado cercanos a 1 (traza verde). Esto puede no ser cierto para las córneas patológicas que presentan regiones estromales de mayor retrodispersión de la luz (ver Figura 4B). La presencia de tales características macroscópicas, como en el ejemplo de una córnea con cicatriz estromal después de una queratitis infecciosa (representada en el recuadro), creará perfiles de profundidad de intensidad logarítmica no lineales, representados por un valor R-cuadrado por debajo de un cierto umbral (por ejemplo, inferior a 0.9425; traza roja). Tenga en cuenta que los perfiles de profundidad de amplitud logarítmica se muestran de hecho como FF-OCM mide la amplitud de la luz retrodispersada por la muestra en lugar de su intensidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Demostración de los beneficios de FF-OCM sobre la histología y la OCT de dominio espectral. (A) Histología y (B) correspondiente imagen de OCT de dominio espectral adquirida en la misma córnea in vivo antes de la queratoplastia. (C) Sección transversal FF-OCM correspondiente del botón corneal ex vivo después de la queratoplastia, que ilustra una resolución superior en comparación con las imágenes de OCT de dominio espectral clínico. La fibrosis también es más claramente visible en las imágenes de FF-OCM que en la histología. La alta densidad de queratocitos en el estroma superior se puede ver claramente tanto en la sección transversal (C) como en (D) en la cara . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El protocolo descrito aquí para la evaluación cualitativa y cuantitativa del estroma del donante corneal utilizando FF-OCM se basa en el análisis histológico de características macroscópicas y microscópicas indicativas de condición estromal más allá de las capacidades de OCT de dominio espectral y microscopía confocal21,24,25, y permite diferenciar los tejidos humanos enfermos de los normales.
Además de una excelente evaluación de la calidad endotelial de las córneas de donantes humanos mediante microscopía especular, la evaluación de la calidad del estroma es un desafío en los bancos de ojos, y generalmente se limita a una observación macroscópica con biomicroscopía con lámpara de hendidura y / o microscopía de luz en los protocolos actuales. La falta de resolución fina con los métodos existentes no sólo significa que las córneas con alguna enfermedad del estroma pueden ser seleccionadas que comprometen el resultado de la queratoplastia, sino también que las córneas pueden ser rechazadas para las opacidades del estroma estromal que de hecho son restrictivas para el estroma anterior o las regiones epiteliales y aún podrían ser utilizadas para procedimientos de queratoplastia endotelial14.
El protocolo actual de banco de ojos podría complementarse con la adición de FF-OCM, que debido a su resolución superior, constituye una herramienta poderosa y no invasiva para completar la evaluación de la calidad de la córnea, especialmente del estroma (incluida la capa de Bowman). A diferencia del examen con lámpara de hendidura, el injerto permanece inmerso en una cámara cerrada llena de medio de almacenamiento durante la adquisición de imágenes FF-OCM, disminuyendo cualquier riesgo potencial de contaminación.
Para una adquisición exitosa de imágenes con FF-OCM (ver Tabla de materiales), es importante que el objetivo del microscopio esté bien sumergido en el gel óptico que se aplica sobre el cubreobjetos del portamuestras (paso 2.2.3). Además, se recomienda comprobar regularmente la calibración del dispositivo, un procedimiento que también debe realizarse después de un ajuste automático fallido (paso 2.2.2) y al que se accede a través de "Herramientas y opciones" en el software de adquisición (consulte la Tabla de materiales). El procedimiento, que implica la utilización de un espejo de calibración en el portamuestras, es el mismo que la preparación habitual de la muestra (ver paso 1.2), excepto que el gel óptico debe aplicarse en el espejo antes de colocar el cubreobjetos.
Se utilizó una serie de injertos de córnea de donantes, considerados con estroma normal según los procedimientos existentes del banco de ojos, para describir el protocolo en este manuscrito y demostrar específicamente la idoneidad de FF-OCM para una evaluación precisa y confiable de la calidad del estroma del donante. Estas córneas de donantes normales se compararon con córneas patológicas sumergidas en medio de almacenamiento, mostrando que el análisis histológico posible con FF-OCM de varias características estromales (ilustrado en la Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7 y Figura 8) en injertos corneales permite distinguir tejidos corneales humanos enfermos de normales.
Aparte de los cambios morfológicos, como la presencia de cicatrices (Figura 5 y Figura 7), tejido fibrótico (Figura 8), lagos (Figura 2), estrías de Vogt (Figura 4) o aumento del diámetro del nervio estromal (Figura 4), las características estromales típicas están presentes en las córneas enfermas. Los parámetros estromales particularmente relevantes en la evaluación de la calidad del estroma parecen ser el grosor de la capa de Bowman y su variabilidad, y la reflectividad del estroma. Los pasos críticos dentro del protocolo son, por lo tanto, los pasos 4.1 y 4.3.
Mientras se secreta durante el desarrollo de la córnea humana, la capa de Bowman, en particular, se distingue a las 19 semanas de gestación y nunca se repara después del nacimiento32. El daño a la capa de Bowman es, por lo tanto, irreversible y sirve como un indicador ideal del daño estromal previo en el tejido corneal del donante, incluido el daño causado por cirugía refractiva, queratitis infecciosa, queratocono. Tales enfermedades corneales, que constituyen contraindicaciones para el uso de la córnea del donante, se asocian con un grosor de capa de Bowman disminuido y variable debido a la interrupción y cicatrización (Figura 5), y es probable que los protocolos actuales de bancos oculares no las pierdan cuando no se conoce con precisión el historial del donante.
Aunque la transparencia corneal se ve afectada después de la muerte del donante debido al edema corneal post mortem , se espera que la cantidad de luz retrodispersada o reflectividad estromal disminuya exponencialmente con la profundidad en el estroma (ver Figura 3 y Figura 4A); como resultado, el logaritmo de la reflectividad estromal normalizada será una función lineal de la profundidad estromal en córneas normales de donantes, representada por valores R-cuadrado cercanos a 1. Por el contrario, la presencia de características macroscópicas se asocia con perfiles de profundidad logarítmicos no lineales e indicativos de enfermedad estromal (Figura 4B y Figura 7)25.
Dado que la densidad de queratocitos es responsable de la fibrilla de colágeno estromal y la síntesis y renovación de la matriz extracelular, parece razonable suponer que la densidad de queratocitos es otro parámetro relevante para evaluar la calidad del estroma del donante, y que los tejidos que exhiben recuentos de queratocitos muy bajos no deben trasplantarse. Por lo tanto, el protocolo incluye un método preciso y confiable para medir la densidad de queratocitos a partir de imágenes FF-OCM que se puede usar fácilmente en bancos de ojos25 y sigue la convención de la microscopía confocal. Tenga en cuenta que con FF-OCM, la densidad de queratocitos también puede determinarse contando los queratocitos directamente en la vista transversal33, una ventaja potencial sobre la microscopía confocal, que requiere que los queratocitos se cuenten en múltiples cortes en la cara. Sin embargo, a diferencia de los pacientes vivos, donde se ha demostrado que las densidades de queratocitos son menores en pacientes con enfermedad que en controles normales 34,35,36,37 y que se correlacionan con la gravedad de la enfermedad 34,38, este no fue el caso en muestras de tejido ex vivo humanas 25 , y se necesitan estudios adicionales para determinar si se requiere un número mínimo de queratocitos en las córneas de los donantes para lograr una buena recuperación visual después del trasplante. La baja densidad de queratocitos en el tejido del donante como en el tejido patológico podría explicarse por el envejecimiento, la pérdida post mortem de células inducida por isquemia y/o el almacenamiento de tejido donante 27,39,40,41. También debe señalarse que las córneas normales de donantes que se obtuvieron y se obtuvieron imágenes en este protocolo estaban almacenadas y edematosas o desinflamadas, o habían sido descartadas por el banco de ojos antes del trasplante debido a la mala calidad endotelial de acuerdo con los estándares de la Asociación de Bancos de Ojos de la UE. Si las imágenes de FF-OCM junto con el protocolo descrito se incluyeran en el entorno del banco de ojos, las córneas generalmente se evaluarían en un estado más fresco de lo que era posible aquí, lo que puede afectar las densidades de queratocitos.
El protocolo descrito aquí para el análisis de la calidad estromal podría ampliarse para la evaluación de la membrana de Descemet, que también puede resolverse con FF-OCM en términos de espesor y estructura21,24. Esto puede resultar útil para la selección de tejidos para la queratoplastia endotelial de membrana de Descemet, donde las membranas delgadas de Descemet pueden ser más difíciles de separar del estroma.
En conclusión, FF-OCM permite una evaluación precisa y confiable del estroma corneal del donante humano durante el almacenamiento. Al mejorar la calidad del injerto, la adición de este protocolo a los procedimientos actuales de bancos de ojos tiene el potencial de mejorar la detección y selección de tejidos de donantes y, por lo tanto, los resultados de la queratoplastia. La integración en la vida real del dispositivo FF-OCM en la rutina del banco de ojos debe verse facilitada por las recientes actualizaciones tecnológicas, incluida una adquisición de imágenes más rápida y un campo de visión más amplio gracias al desarrollo de una cámara CMOS personalizada, y el diseño de casetes desechables estériles personalizados para el almacenamiento y manejo de la córnea durante la obtención de imágenes.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo ha recibido financiación de la Agence Nationale de Recherche (ANR), en virtud de una subvención PRTS (Projet de Recherche Translationelle en Santé) No ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) y del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie No 709104 (K.I.). Los autores agradecen a Céline de Sousa por su ayuda con el recuento de células y el procesamiento histológico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light-CT Scanner | LLTech, France | http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/ | FF-OCM device used in this manuscript for imaging |
| CorneaJet | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html | Organ culture medium in which donor corneas are stored |
| CorneaMax | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html | Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence |
| Fiji (ImageJ) | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | https://fiji.sc/ | Open source image processing software |
| Matlab | Mathworks, Inc., Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | Mathematical computing software |
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