Summary
我们描述了使用全场光学相干显微镜作为高质量评估角膜供体基质的方法。该协议可用于识别指示健康或疾病的特征，旨在改善供体组织的筛选和选择，从而改善角膜移植术的结果。
Abstract
供体角膜基质的质量约占角膜总厚度的90%，可能是深前层和穿透性角膜移植术成功的主要（如果不是主要）限制因素之一。这些是外科手术，分别通过捐赠的组织（从最近去世的人身上取下的移植物）替换部分或全部患病角膜层。然而，评估眼库角膜移植物基质质量的手段有限，缺乏对疾病指标进行高分辨率定量评估的能力。全场光学相干显微镜（FF-OCM）允许对新鲜或固定 的离 体生物组织样本进行高分辨率3D成像，是一种非常适合供体角膜评估的非侵入性技术。在这里，我们描述了一种使用FF-OCM对角膜基质进行定性和定量分析的方法。该方案已成功应用于正常供体角膜和病理性角膜纽扣，可用于在宏观和微观水平上识别健康和病理特征，从而有助于检测可能影响角膜移植术结果的基质疾病。通过改善移植物质量控制，该方案有可能导致更好的供体组织选择（和排斥），从而减少移植失败。
Introduction
角膜疾病是全世界失明的主要原因之一1。有些疾病只能通过手术治疗，通常涉及通过捐赠的组织（即穿透性角膜移植术）或整个（即穿透性角膜移植术）病变角膜，从最近去世的个体中取出移植物。对于不影响内皮的角膜疾病（例如圆锥角膜、感染性角膜炎后的基质瘢痕、创伤和基质营养不良），深前层角膜移植术 （DALK） 目前被认为是首选的手术技术2，3，4，5。该技术通过仅替换中央角膜上皮和基质，可以保留受体的角膜内皮，这与移植排斥反应的发生率较低，无内皮排斥反应，较低的内皮细胞丢失和有利的成本效益比有关6，7，8，9，10，11.DALK进一步允许将内皮质量不佳的角膜用作移植物，因为该受损层不会被移植12。相反，供体角膜基质的质量可能是移植成功和视力恢复的主要限制因素，因为基质是唯一保留的供体角膜层，而供体上皮将被受体上皮取代。不幸的是，评估眼库供体角膜基质的方法有限。它们通常包括通过剜除术进行组织提取时对供体眼球进行裂隙灯检查和供体基质13的光学显微镜检查。一些眼库已经开始使用傅里叶域光学相干断层扫描（FD-OCT）14来补充此类标准程序。
眼科光学相干断层扫描（OCT）是超声成像15的光学模拟，它使用宽带或可调谐光的干涉来生成视网膜16和前段17的光学切片。在早期临床系统的基础时域OCT中，参考镜的位置被改变，因此每当参考光束行进的时间几乎与在各种组织界面反射的光束相同的时间时，就会出现干涉图案，A扫描是时间的函数。在大多数现代临床系统的基础FD-OCT（也称为光谱或频域OCT）中，参考镜固定在一个位置，一次采集一个单独的A扫描，将所有干涉图样混合在一起，并通过傅里叶分析进行解剖。
虽然临床（时域或光谱域）OCT系统允许角膜的横截面视图和基质混浊检测，轴向分辨率高于裂隙灯生物显微镜，但它们的横向分辨率是有限的。共聚焦显微镜18 允许以接近组织学细节的横向分辨率检查角膜，但轴向有限。
全场光学相干断层扫描显微镜（FF-OCT或FF-OCM）19，20结合了共聚焦显微镜和OCT的元素，实现了与约1μm轴向分辨率相当的横向分辨率。更具体地说，FF-OCM使用非相干宽带光源（例如卤素灯）和高数值孔径光学器件来获取面部2D断层扫描图像，而无需横向扫描。通过深度方向扫描，FF-OCM能够对新鲜或固定的离体生物组织样品进行无创3D成像。它已被用于对角膜进行成像21，22，23。通过提供高分辨率的面部和横截面视图，FF-OCM提供了角膜的组织学结构和细胞细节的信息。事实上，FF-OCM已被证明可以提供优于组织学的结构信息，并且能够通过光谱域OCT和共聚焦显微镜的组合识别更多的疾病指标24，25。
在这里，我们描述了使用FF-OCM对角膜供体基质进行定性和定量评估的方案。该方法基于对指示基质状况的宏观和微观特征的组织学分析，包括三个定量基质参数（即Bowman层厚度及其变异性以及基质反射率）。因此，所述方案适用于正常和异常角膜组织，并允许区分患病和正常人角膜组织。
Protocol
这里描述的所有方法都是根据《赫尔辛基宣言》的原则进行的，并遵循人体组织的国际道德要求。这是一项前瞻性观察性病例对照研究。获得患者的知情同意。没有对法国的治疗或随访标准进行修改。机构审查委员会（IRB）获得了患者保护委员会的批准，Ile-de-France V（14944）。
1. 组织选择和制备
- 选择供体角膜。
- 在FF-OCM成像28之前，将储存在器官培养基26中的供体角膜转移到补充葡聚糖的器官培养基中3天，以允许膨胀27（参见材料表）。
- 准备样品。
- 将角膜浸入储存介质中，放在样品架中，上皮朝上。
- 将干净的二氧化硅盖玻片（随样品架一起提供）放在角膜顶部，并通过轻轻转动其底座来关闭支架，直到样品稍微变平并固定在盖玻片下方，从而提供相对均匀的成像表面。采取预防措施以避免任何气泡。
- 在盖玻片上涂上一层厚厚的眼科或光学凝胶作为浸没介质。
2. FF-OCM初始化、设置和图像采集
- 初始化设备。
- 通过操作设备背面的电源开关打开设备;设备正面的绿色 LED 亮起表示电源已打开。
- 通过操作前面的电源开关打开专用计算机和卤素光源。
- 双击桌面快捷方式启动采集软件（参见 材料表）。
- 确保成像载物台畅通无阻，但可移动托盘除外。然后单击“确定”以在提示符下初始化电机。
- 拉出托盘并将样品架插入专用容器中，然后轻轻推回托盘。
- 设置设备。
- 在指定和必填字段中输入“样本标识符”;可选择输入“样品描述”和/或“研究描述”。
- 准备好后单击“获取微距图像”，以创建样品的快照，以便以后用于横向定位和导航目的;满意后，在提示符下单击“是”验证图像，然后设备将样品盘移动到物镜下方并执行自动调整。
- 在继续操作之前，请确保显微镜物镜充分浸入光学凝胶中。
- 获取堆栈。
- 选择“探索”选项卡以准备收购。
- 在获取一堆图像之前，通过操纵杆的平移或在屏幕上手动选择（即，通过单击并将采集的宏观图像上的红色方块拖动到所需位置）导航到角膜中心。
- 通过旋转操纵杆、调整滑块或在图形用户界面 （GUI） 中手动输入键盘来改变成像深度，并调整平均值（通常建议平均值为 40 以获得最佳角膜成像）。
注意：这样做是为了确定角膜样本的厚度以及在整个角膜厚度上成像所需的平均值，同时深入记录第一个和最后一个图像位置。盖玻片的底面产生平行的干涉条纹，在断层扫描图像（GUI的右侧）上可以看到，这有助于定位角膜表面。 - 在“深度”字段中输入角膜表面值或深度的第一个图像位置。
- 选择“获取选项卡”以获取图像。
- 选择“切片间距”（默认和推荐设置为 1 μm，与设备的轴向分辨率相匹配），然后在“切片数”下相应地输入角膜厚度值。
- 查看参数和采集时间，满意后按“确定”启动采集。
- 在采集过程中，避免与 FF-OCM 所在的工作台接触。
- 选择“探索”选项卡以准备收购。
3. 采集图像的管理
- 查看和导出图像。
- 双击桌面快捷方式启动FF-OCM查看软件（见 材料表）;采集的图像（由样品ID标识）显示在“局部研究”列表中。
- 选择具有相应样本ID的研究，其中包含宏图像和采集的图像堆栈，并通过右键单击一系列图像并选择“DICOM”格式来“导出”后者，以保留原始像素数据和元数据以供进一步分析。
- 通过双击一系列图像，使用多平面重建 （MPR） 模式在 面 和横截面视图中显示 3D 图像堆栈;浏览图像（例如，通过鼠标滚轮滚动或滑块调整）并选择每个堆栈的代表性 EN 面 和横截面视图。
- 使用“DICOM”格式，通过单击窗口右下角的图标导出所选视图。
- 导入图像。
- 双击桌面快捷方式打开图像处理软件（见 材料表），然后导航到“插件”下的“生物格式”“导入器”以导入DICOM图像;确保在“生物格式导入选项”窗口中选择了“具有相似名称的组文件”。
4. 图像分析：基质形态和特征的定性和定量评估
- 评估基质和鲍曼层厚度。
- 手动测量角膜横截面的距离，例如横截面25 上的五个等间距点。
- 在已知距离的两个点之间画一条线（例如，从整个图像的左到右，即根据默认视场，1，024像素或780μm），转到“分析”并选择“设置比例”，然后在相应的字段中输入“已知距离”和“长度单位”并单击“确定”。
- 在两个未知距离的点之间画一条线;直接从状态栏读取测量的长度或距离。
- 记录均值和变异系数 （COV）。Bowman的层厚度小于6.5μm和COV大于18.6%与角膜基质异常有关25。
- 手动测量角膜横截面的距离，例如横截面25 上的五个等间距点。
- 确定角质细胞密度。
- 遵循共聚焦显微镜的惯例：以7为一组将基质 和面部 图像相加，以产生厚度相当的切片。为此，请转到“图像”选项卡，然后在“堆栈”下选择“重新切片Z”。
- 考虑到通过基质24，25的进展时不同（减少）的细胞密度。为此，根据深度，基质可以被认为是由4个区域组成的：（1）鲍曼层以下的最前基质，即整个基质厚度的2%;剩余的基质（即整个基质厚度的98%）具有三个相同厚度的区域：（2）前基质，（3）中基质和（4）后基质。
- 为了进一步分析，包括 所有可用的前 基质切片，前基质的15张图像，中基质的5张图像，以及后基质的5张图像（其中每个区域所需的可靠计数的图像数量通过逐步分析确定29）。
- 在每个 面部 图像上，选择一个 300 μm x 300 μm 的感兴趣区域。要增强细胞核可视化，请使用“编辑”选项卡下的“反转”反转图像，并调整对比度和亮度。对于后者，请转到“图像”并导航到“分析”下的“亮度/对比度”。
- 手动计数细胞核，例如使用“细胞计数器”功能25。为此，请转到“插件”并导航到“分析”下的“单元格计数器”。按“初始化”，然后选择计数器类型。然后通过单击倒置图像中的深色椭圆形特征开始计数细胞核，考虑那些仅针对图像25 的四个边中的两个落在图像边框上的细胞核。
- 按照共聚焦显微镜惯例记录以面积密度表示的细胞密度，即细胞/mm²（将计数的细胞数除以 0.09，以从细胞/90，000 μm² 转换为细胞/mm²），其中已显示患者（例如圆锥角膜）的角质细胞密度低于健康受试者，并且与疾病严重程度25 相关。
注意：需要进一步的临床研究来确定是否需要角质细胞密度的最小阈值才能在移植后获得完全清晰的角膜移植物。
- 评估基质反射率。
- 生成基质图像堆栈的平均强度深度剖面，例如使用“Z轴剖面”功能和/或自定义软件25，30，31。
注意：这些实际上是振幅深度剖面，因为FF-OCM测量的是样品反向散射的光的振幅，而不是其强度。- 计算每个 面 堆栈的平均灰度。
- 减去最小灰度值并按最大灰度值归一化。
- 在对数刻度中显示为基质深度（基质厚度的百分比）的函数。
- 通过线性回归线近似生成的对数轮廓，该线最小化残差平方和（最小二乘拟合）。
- 记录 R 平方值 （R²） 作为线性度的度量。低于 0.94 的值可能表明角膜病变25.
注意：为了区分线性对数回归模型（或单指数衰减模型）由于病理的存在而不足之处，而不仅仅是测量噪声，可以通过贝叶斯推理进行信号分析31。此外，在具有线性对数（或单指数）基质深度剖面的角膜中（例如，由R平方值30或Birge比率31接近1表示），根据信号衰减率计算光子平均无路径可用于进一步量化透明度31。
- 生成基质图像堆栈的平均强度深度剖面，例如使用“Z轴剖面”功能和/或自定义软件25，30，31。
- 评估其他基质特征和疾病指标的可见性。
- 检查是否存在疤痕、纤维化组织、湖泊或 Vogt 条纹。
- 评估基质中神经的平均厚度，如果足以进行测量24。
- 选择一个基质神经最明显的 面部图像（ 通常在基质中部区域）。
- 测量神经的厚度，例如在五个点24处，然后计算平均值和标准偏差。神经厚度高于9μm可能是病理学的附加指标，例如圆锥角膜24。
Representative Results
本手稿中使用的FF-OCM设备（见 材料表）28 和一般设置如图 1所示。 图2 显示了储存在器官培养基中的人类供体角膜后肿胀，给出了水肿性角膜的病理生理模型，并且由于穿透深度有限，可以防止FF-OCM图像通过整个角膜厚度采集。转移到补充葡聚糖的器官培养基会导致肿胀并导致正常厚度的供体角膜，如图 3所示。患病角膜可以通过形态变化和典型的基质特征来识别，包括基质厚度减少和变化（图4）和/或鲍曼层（图5）。评估角质细胞密度（图6）和基质反射率（图7）可能进一步帮助FF-OCM对正常角膜组织进行组织学样分析和区分正常与病理性角膜组织，超出临床OCT系统的能力（图8）。
图 1：本工作中使用的一般设置和 FF-OCM 设备的原理图和照片。（A） FF-OCM装置的照片（见材料表）28.（B） 设备的原理图和光学设置。（C）样品架中人类供体角膜的照片。（D） 放大浸没物镜和样品架。请点击此处查看此图的大图。
图2：脱落前器官培养的正常人角膜。 由储存在器官培养基中引起的肿胀（“水肿”）角膜的横截面（A）和 正面 视图（B，切开基质），其中湖泊可被视为黑暗区域（如箭头所示）。角膜厚度翻了一番，达到 1，100 μm 以上，阻止了整个深度的图像采集。 请点击此处查看此图的大图。
图3：器官培养的正常人角膜在脱落后。浸入葡聚糖补充培养基中的脱肿角膜的整个角膜 （A） 和面部基质视图 （B） 的横截面视图，显示规则分布的超反射（白色）角质细胞。请点击此处查看此图的大图。
图 4：基质形态和特征的总体评估，包括基质厚度。 与正常人角膜 （A） 相比，圆锥角膜 （B） 的特征是基质厚度减少且可变，以及许多平行的 Vogt 条纹，在横截面视图中可观察到为深色垂直带，以及在中基质 面部切片中 可能发现的厚基质神经 （C）。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：评估 Bowman 层厚度，该层厚度在前部由高反射上皮基底膜描绘，向后由最前基质中的高反射角化细胞描绘。 与正常人角膜 （A） 相比，病理性角膜（例如圆锥角膜）（B）的特征是由于中断和瘢痕形成而导致的 Bowman 层厚度减小和可变。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：角质细胞密度的评估。 （A）在选择300μm x 300μm感兴趣区域后，在增强和倒置 的面部 图像上手动计数角质细胞核。（B）计数的原子核用箭头表示。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：基质反射率的评估。 反向散射光的量随着正常供体角膜基质的深度而减少（指数）（见图 3 和 图4A），导致线性对数深度剖面，由接近1的R平方值表示（绿色迹线）。这可能不适用于具有光反向散射增加的基质区域的病理性角膜（见 图4B）。这种宏观特征的存在，例如感染性角膜炎后带有基质疤痕的角膜示例（插图中所示），因此将产生非线性对数强度深度剖面，由低于某个阈值的 R 平方值表示（例如，低于 0.9425;红色迹线）。请注意，对数振幅深度剖面实际上显示为FF-OCM测量样品反向散射的光的振幅，而不是其强度。 请点击此处查看此图的大图。
图 8：FF-OCM 相对于组织学和谱域 OCT 的优势演示。 （A）组织学和（B）在角膜移植 术之前在同一 角膜上获得的相应光谱 - 域 - OCT图像。（C）角膜移植术后离 体 角膜纽扣的相应FF-OCM横截面，说明与临床光谱域OCT图像相比具有更高的分辨率。FF-OCM图像中的纤维化也比组织学图像更清晰。在（C）横截面和（D） 面部 视图中都可以清楚地看到上基质中高密度的角质细胞。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
这里描述的用于使用FF-OCM对角膜供体基质进行定性和定量评估的方案基于对指示基质状况的宏观和微观特征的组织学样分析，超出了光谱域OCT和共聚焦显微镜21，24，25的能力，并且能够区分患病和正常人体组织。
除了通过镜面显微镜对人类供体角膜进行出色的内皮质量评估外，在眼库中评估基质质量具有挑战性，并且通常仅限于使用裂隙灯生物显微镜和/或当前方案中的光学显微镜进行大体观察。现有方法缺乏精细分辨率不仅意味着可能选择患有某些基质疾病的角膜，从而损害角膜移植术的结果，而且还可能因基质混浊而被拒绝角膜，而基质混浊实际上限制了前基质或上皮区域，并且仍然可以用于内皮角膜移植术程序14。
目前的眼库协议可以通过添加FF-OCM来补充，由于其卓越的分辨率，它构成了完成角膜质量评估的强大且非侵入性的工具，尤其是基质（包括鲍曼层）。与裂隙灯检查不同，在整个FF-OCM图像采集过程中，移植物始终浸入充满存储介质的封闭室中，从而降低了任何潜在的污染风险。
为了使用FF-OCM成功采集图像（参见 材料表），重要的是将显微镜物镜充分浸入施加在样品架盖玻片顶部的光学凝胶中（步骤2.2.3）。进一步建议定期检查设备的校准，该过程也将在自动调整失败后执行（步骤2.2.2），并通过采集软件中的“工具和选项”访问（见 材料表）。该过程涉及在样品架中使用校准镜，与通常的样品制备（见步骤1.2）相同，只是在定位盖玻片之前应将光学凝胶涂在镜子上。
根据现有的眼库程序，一系列被认为具有正常基质的供体角膜移植物用于描述本手稿中的方案，并特别证明了FF-OCM适用于精确可靠地评估供体基质质量。将这些正常供体角膜与浸入储存培养基中的病理性角膜进行比较，表明使用FF-OCM对角膜移植物中的几种基质特征（如图2，图3，图4，图5，图6，图7和图8所示）进行组织学样分析可以区分患病和 正常人角膜组织。
除了形态变化，例如疤痕（图5和图7），纤维化组织（图8），湖泊（图2），Vogt纹（图4）或基质神经直径增加（图4）的存在外，病变角膜中还存在典型的基质特征。在基质质量评估中特别相关的基质参数似乎是鲍曼层厚度及其变异性，以及基质反射率。因此，协议中的关键步骤是步骤4.1和4.3。
在人类角膜发育过程中分泌的同时，鲍曼层在妊娠19周时变得明显，并且在出生后从未修复32。因此，Bowman层的损伤是不可逆的，并且可以作为供体角膜组织中先前基质损伤的理想指标，包括屈光手术，感染性角膜炎，圆锥角膜引起的损伤。这种角膜疾病是供体角膜使用的禁忌症，与由于中断和瘢痕形成而导致的Bowman层厚度减少和变化有关（图5），并且当供体病史不准确时，当前的眼库方案可能会遗漏这些疾病。
尽管由于死后角膜水肿导致供体死亡后角膜透明度受损，但预计背散射光或基质反射率的量会随着基质深度呈指数级下降（见图3和图4A）;因此，归一化基质反射率的对数将是正常供体角膜中基质深度的线性函数，由接近 1 的 R 平方值表示。相反，宏观特征的存在与非线性对数深度剖面有关，并指示基质病（图4B和图7）25。
由于角质细胞密度负责基质胶原纤维和细胞外基质的合成和更新，因此假设角质细胞密度是评估供体基质质量的另一个相关参数似乎是合理的，并且不应移植角质细胞计数非常低的组织。因此，该协议包括一种精确可靠的方法来测量来自FF-OCM图像的角质细胞密度，该方法可以很容易地用于眼库25，并遵循共聚焦显微镜的惯例。请注意，使用FF-OCM，角质细胞密度也可以通过在横截面视图33中直接计数角质细胞来确定，这是与共聚焦显微镜相比的潜在优势，共聚焦显微镜需要在多个面部切片上计数角质细胞。然而，与活体患者不同，在活体患者中，疾病患者的角质细胞密度已被证明低于正常对照组34，35，36，37，并且与疾病严重程度34，38相关，而在人类离体组织样本中并非如此25，还需要进一步的研究来确定供体角膜中是否需要最少数量的角质细胞才能在移植后实现良好的视力恢复。供体组织中的角质细胞密度低，如病理组织，可以通过衰老、缺血引起的细胞死后损失和/或供体组织的储存来解释27，39，40，41。还应该指出的是，根据欧盟眼库协会的标准，在该协议中获得和成像的正常供体角膜要么被储存和水肿或脱肿，要么在移植前被眼库丢弃，因为内皮质量差。如果将FF-OCM成像与所描述的方案一起包含在眼库设置中，则角膜通常会以比此处更新鲜的状态进行评估，这可能会影响角质细胞密度。
这里描述的基质质量分析方案可以扩展用于评估Descemet的膜，这也可以用FF-OCM在厚度和结构方面解决21，24。这可能被证明可用于选择Descemet膜内皮角膜移植术的组织，其中薄的Descemet膜可能更难与基质分离。
总之，FF-OCM能够在储存过程中对人类供体角膜基质进行精确可靠的评估。通过提高移植物质量，将该协议添加到当前的眼库程序中有可能改善供体组织的筛选和选择，从而改善角膜移植术的结果。最近的技术更新应促进FF-OCM设备在现实生活中集成到眼库程序中，包括由于定制CMOS相机的开发而实现更快的图像采集和更大的视野，以及用于成像期间角膜储存和处理的定制无菌一次性盒的设计。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家研究机构（ANR）、PRTS（专业翻译研究项目）拨款编号ANR-13-PRTS-0009（V.B.）和欧盟地平线2020研究和创新计划的资助，资助了玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议第709104号（K.I.）。作者感谢Céline de Sousa在细胞计数和组织学处理方面的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light-CT Scanner | LLTech, France | http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/ | FF-OCM device used in this manuscript for imaging |
| CorneaJet | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html | Organ culture medium in which donor corneas are stored |
| CorneaMax | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html | Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence |
| Fiji (ImageJ) | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | https://fiji.sc/ | Open source image processing software |
| Matlab | Mathworks, Inc., Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | Mathematical computing software |
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