Summary
Vi beskriver bruk av fullfelts optisk koherensmikroskopi som metode for kvalitetsvurdering av hornhinnedonorstroma. Denne protokollen kan brukes til å identifisere egenskaper som indikerer helse eller sykdom, og er rettet mot å forbedre screening og utvalg av donorvev, og dermed resultatene av keratoplastikk.
Abstract
Kvaliteten på donor hornhinne stroma, som utgjør ca 90% av total hornhinnetykkelse, er sannsynligvis en av de viktigste, om ikke den viktigste, begrensende faktoren (e) for suksess av dyp fremre lamellar og penetrerende keratoplastikk. Dette er kirurgiske prosedyrer som innebærer å erstatte en del eller alle de syke hornhinnelagene, henholdsvis av donert vev, transplantatet, tatt fra en nylig avdød person. Imidlertid er midler til å evaluere stromalkvalitet av hornhindetransplantater i øyebanker begrenset og mangler evnen til høyoppløselig kvantitativ vurdering av sykdomsindikatorer. Fullfelt optisk koherensmikroskopi (FF-OCM), som tillater høyoppløselig 3D-avbildning av ferske eller faste ex vivo biologiske vevsprøver, er en ikke-invasiv teknikk som er godt egnet for vurdering av donorhornhinnen. Her beskriver vi en metode for kvalitativ og kvantitativ analyse av hornhinnestroma ved bruk av FF-OCM. Protokollen har blitt brukt på normale donorhornhinner og patologiske hornhinneknapper, og kan brukes til å identifisere sunne og patologiske egenskaper på både makroskopisk og mikroskopisk nivå, og dermed lette påvisning av stromale lidelser som kan kompromittere utfallet av keratoplastikk. Ved å forbedre kvalitetskontrollen av transplantat, har denne protokollen potensial til å resultere i bedre utvelgelse (og avvisning) av donorvev og dermed redusert transplantatsvikt.
Introduction
Hornhinnesykdommer er blant de viktigste årsakene til blindhet over hele verden1. Noen sykdommer kan bare behandles kirurgisk, ofte involverer utskifting av del (dvs. lamellar keratoplastikk) eller hele (dvs. penetrerende keratoplastikk) syk hornhinne, av donert vev, transplantatet, tatt fra en nylig avdød person. For hornhinnesykdommer som ikke påvirker endotelet (f.eks. keratokonus, stromale arr etter infeksiøs keratitt, traumer og stromale dystrofier), anses dyp fremre lamellar keratoplastikk (DALK) for tiden som den kirurgiske teknikken av valg 2,3,4,5. Denne teknikken muliggjør bevaring av mottakerens hornhinneendotel ved å erstatte bare det sentrale hornhinneepitelet og stroma, som er forbundet med en lavere forekomst av transplantatavvisning, fravær av endotelavvisning, lavere endotelcelletap og gunstig kostnadseffektivitetsforhold 6,7,8,9,10,11 . DALK tillater videre hornhinner med mindre enn optimal endotelkvalitet som skal brukes som transplantater, da dette kompromitterte laget ikke vil bli transplantert12. Omvendt er kvaliteten på donor hornhinne stroma sannsynligvis den viktigste begrensende faktoren for graftsuksess og syngjenoppretting fordi stroma er det eneste donorhornhinnelaget som forblir, mens donorepitelet vil bli erstattet av mottakerepitel. Dessverre er midler til å vurdere donor hornhinne stroma i øyebanker begrenset. De inkluderer vanligvis spaltelampeundersøkelse av donorøyebollet når vevsuthenting gjøres ved enukleasjon og lysmikroskopundersøkelse av donorstroma13. Noen øyebanker har begynt å supplere slike standardprosedyrer ved hjelp av Fourier-domene optisk koherenstomografi (FD-OCT)14.
Oftalmisk optisk koherenstomografi (OCT), en optisk analog til ultralydavbildning15, bruker interferens av bredbånd eller justerbart lys for å generere optiske seksjoner av retina 16 og fremre segment17. I tidsdomene OCT, grunnlaget for tidlige kliniske systemer, endres posisjonen til et referansespeil, slik at interferensmønstre dukker opp når referansestrålen har reist nesten like mye tid som strålen reflektert ved de forskjellige vevsgrensesnittene, med A-skanninger generert som en funksjon av tid. I FD-OCT (også kalt spektral- eller frekvensdomene OCT), grunnlaget for de fleste moderne kliniske systemer, er referansespeilet festet i en posisjon og en individuell A-skanning, med alle interferensmønstre blandet sammen, erverves om gangen og dissekeres fra hverandre via Fourier-analyse.
Mens kliniske (tids- eller spektraldomene) OCT-systemer tillater tverrsnittsvisning av hornhinnen og påvisning av stromale fortetninger ved høyere aksial oppløsning enn spaltelampebiomikroskopi, er deres laterale oppløsning begrenset. Konfokalmikroskopi18 gjør det mulig å undersøke hornhinnen ved en lateral oppløsning som nærmer seg histologisk detalj, men er begrenset aksialt.
Fullfelt optisk koherens tomografisk mikroskopi (FF-OCT eller FF-OCM)19,20 kombinerer elementer fra både konfokalmikroskopi og OCT, og oppnår en lateral oppløsning sammenlignbar med den aksiale oppløsningen på ca. 1 μm. Mer spesifikt bruker FF-OCM usammenhengende bredbåndslyskilder (f.eks. en halogenlampe) og optikk med høy numerisk blenderåpning for å skaffe seg 2D-tomografiske bilder uten sideskanning. Ved å skanne i dybderetningen muliggjør FF-OCM ikke-invasiv 3D-avbildning av ferske eller faste ex vivo biologiske vevsprøver. Det har blitt brukt til å avbilde hornhinnen21,22,23. Ved å gi både høyoppløselige en ansikts- og tverrsnittsvisninger, gir FF-OCM informasjon om både den histologiske strukturen og cellulære detaljer i hornhinnen. Faktisk har FF-OCM vist seg å gi strukturell informasjon overlegen histologi og var i stand til å identifisere flere sykdomsindikatorer som var mulig med kombinasjonen av spektraldomene OCT og konfokal mikroskopi24,25.
Her beskriver vi en protokoll for kvalitativ og kvantitativ vurdering av hornhinnedonorstroma ved bruk av FF-OCM. Metoden er basert på histologilignende analyse av makroskopiske og mikroskopiske trekk som indikerer stromaltilstand, inkludert tre kvantitative stromale parametere (dvs. Bowmans lagtykkelse og dens variabilitet og stromalreflektivitet). Den beskrevne protokollen brukes derfor på normalt og unormalt hornhinnevev og tillater differensiering av syke fra normalt humant hornhinnevev.
Protocol
Alle metodene beskrevet her ble utført i henhold til prinsippene i Helsinkideklarasjonen og fulgte internasjonale etiske krav til humant vev. Dette var en prospektiv observasjonell case-control studie. Informert samtykke ble innhentet fra pasientene. Ingen endringer i franske standarder for behandling eller oppfølging ble gjort. Godkjenning fra Institutional Review Board (IRB) ble innhentet fra Patient Protection Committee, Ile-de-France V (14944).
1. Vevsvalg og forberedelse
- Velg donor hornhinner.
- Overføring av donorhornhinner lagret i organkulturmedium26 til dekstransupplert organkulturmedium i 3 dager for å tillate deturgescens27 før FF-OCM avbildning28 (se materialfortegnelse).
- Forbered prøvene.
- Plasser hornhinnen, nedsenket i lagringsmedium, i prøveholderen med epitelet vendt oppover.
- Plasser en ren silikadeksel (følger med prøveholderen) på toppen av hornhinnen og lukk holderen ved å vri basen forsiktig til prøven er litt flatt og immobilisert under dekselet, noe som gir en relativt jevn bildeoverflate. Ta forholdsregler for å unngå luftbobler.
- Påfør et tykt lag oftalmisk eller optisk gel på dekselet som nedsenkningsmedium.
2. FF-OCM initialisering, oppsett og bildeoppkjøp
- Initialiser enheten.
- Slå på enheten ved å betjene strømbryteren på baksiden av enheten; belysning av en grønn LED foran på enheten indikerer at strømmen er på.
- Slå på den dedikerte datamaskinen og halogenlyskilden ved å betjene strømbryteren på forsiden.
- Start anskaffelsesprogramvaren (se Materialfortegnelse) ved å dobbeltklikke på snarveien på skrivebordet.
- Sørg for at avbildningstrinnet er klart bortsett fra den bevegelige skuffen. Klikk deretter "OK" for å initialisere motorene ved ledeteksten.
- Trekk ut skuffen og sett prøveholderen inn i den dedikerte beholderen, og skyv deretter skuffen forsiktig tilbake.
- Sett opp enheten.
- Skriv inn en "prøveidentifikator" i det angitte og obligatoriske feltet; Eventuelt skriv inn en "prøvebeskrivelse" og/eller "studiebeskrivelse".
- Klikk på "Hent makrobilde" når du er klar, for å lage et øyeblikksbilde av prøven som kan brukes til lateral posisjonering og navigering senere; Når du er fornøyd, validerer du bildet ved ledeteksten ved å klikke på "Ja", hvoretter enheten beveger prøvebrettet under målet og utfører en automatisk justering.
- Forsikre deg om at mikroskopmålet er godt nedsenket i den optiske gelen før du fortsetter.
- Skaff deg stablene.
- Velg "Utforsk" -fanen for å forberede et oppkjøp.
- Før du kjøper en bunke med bilder, naviger til midten av hornhinnen, via oversettelse av joysticken eller manuelt valg på skjermen (det vil si ved å klikke og dra den røde firkanten på det oppkjøpte makrobildet til ønsket sted).
- Varier bildedybden via rotasjon av styrespaken, justering av glidebryteren eller manuell tastaturinngang i det grafiske brukergrensesnittet (GUI), og juster gjennomsnittsverdien (et gjennomsnitt på 40 anbefales generelt for optimal hornhinneavbildning).
MERK: Dette gjøres for å bestemme tykkelsen på hornhinnen, prøven og gjennomsnittet som er nødvendig for å avbilde gjennom hele hornhinnen, mens du noterer den første og siste bildeplasseringen i dybden. Den nederste overflaten av dekselet skaper parallelle interferensfrynser som ses på det tomografiske bildet (på høyre side av GUI), noe som gjør det lettere å lokalisere hornhinnen. - Skriv inn hornhinnenes overflateverdi eller første bildeplassering i dybden i feltet "Dybde".
- Velg "Skaff fanen", for å skaffe bilder.
- Velg "Stykkeavstand" (standard og anbefalt innstilling er 1 μm, som samsvarer med enhetens aksiale oppløsning) og skriv inn hornhinnenes tykkelsesverdi tilsvarende under "Antall skiver".
- Gå gjennom parametere og anskaffelsestid, og når du er fornøyd, trykk "OK" for å starte oppkjøpet.
- Under oppkjøpet må du unngå kontakt med bordet som FF-OCM er plassert på.
- Velg "Utforsk" -fanen for å forberede et oppkjøp.
3. Forvaltning av anskaffede bilder
- Se og eksporter bilder.
- Start visningsprogramvaren FF-OCM (se Materialfortegnelse) ved å dobbeltklikke på snarveien på skrivebordet; Anskaffede bilder (identifisert av prøve-ID) vises i listen "Lokale studier".
- Velg studien med tilhørende prøve-ID, som inneholder både makrobildet og den anskaffede bildestakken, og "eksporter" sistnevnte ved å høyreklikke på bildeserien og velge "DICOM" -formatet for å beholde de rå pikseldataene og metadataene for videre analyse.
- Vis 3D-bildestakkene i ansikts - og tverrsnittsvisninger ved hjelp av MPR-modus (multiplanar reconstruction) ved å dobbeltklikke på bildeserien. Naviger gjennom bildene (f.eks. via musehjulsrulling eller glidebryterjustering) og velg representative ansikts- og tverrsnittsvisninger for hver stabel.
- Eksporter de valgte visningene ved å klikke på ikonet nederst til høyre i vinduet, ved hjelp av "DICOM" -formatet.
- Importer bilder.
- Åpne bildebehandlingsprogramvaren (se Materialfortegnelse) ved å dobbeltklikke på snarveien på skrivebordet, og naviger til "Bio-formater" "Importør" under "Plugins" for å importere DICOM-bilder; Forsikre deg om at "Grupper filer med lignende navn" er valgt i vinduet "Bio-Formats Import Options".
4. Bildeanalyse: Kvalitativt og kvantitativt vurdering av stromalmorfologi og egenskaper
- Vurder stromal og Bowmans lagtykkelse.
- Mål avstander manuelt på hornhinnens tverrsnitt, for eksempel på fem like fordelte punkter over tverrsnittet25.
- Tegn en linje mellom to punkter med kjent avstand (for eksempel fra venstre til høyre for hele bildet, det vil si i henhold til standard synsfelt, 1.024 piksler eller 780 μm), gå til "Analyser" og velg "Angi skala", og skriv inn "Kjent avstand" og "Lengdeenhet" i de aktuelle feltene og klikk "OK".
- Tegn en linje mellom to punkter med ukjent avstand; Les lengden eller avstanden målt direkte fra statuslinjen.
- Registrer gjennomsnittet og variasjonskoeffisienten (COV). Bowmans lagtykkelse mindre enn 6,5 μm og en COV større enn 18,6 % har vært assosiert med unormal hornhinnestroma25.
- Mål avstander manuelt på hornhinnens tverrsnitt, for eksempel på fem like fordelte punkter over tverrsnittet25.
- Bestem keratocytttettheten.
- Etter konvensjon av konfokal mikroskopi: sum stromal en face bilder i grupper på 7 for å produsere skiver av sammenlignbar tykkelse. For dette, gå til "Bilde" -fanen og velg "Reslice Z" under "Stacks".
- Ta hensyn til den forskjellige (avtagende) celletettheten ved progresjon gjennom stroma24,25. For dette kan stroma betraktes som sammensatt av 4 regioner i henhold til dybde: (1) den meget fremre stroma under Bowmans lag, det vil si 2% av hele stromale tykkelsen; Den resterende stroma (det vil si 98% av hele stromaltykkelsen), med tre soner med identisk tykkelse: (2) fremre stroma, (3) mid stroma og (4) bakre stroma.
- For videre analyse, inkluder alle tilgjengelige ansiktsskiver for svært fremre stroma, 15 bilder for fremre stroma, 5 bilder for midtstroma, samt 5 bilder for bakre stroma (hvor antall bilder per region som kreves for en pålitelig telling ble bestemt ved trinnvis analyse29).
- På hvert ansiktsbilde velger du et område av interesse på 300 μm x 300 μm. For å forbedre kjernevisualisering, inverter bildet ved å bruke "Inverter" under "Rediger" -fanen, og juster kontrast og lysstyrke. For sistnevnte, gå til "Bilde" og naviger til "Lysstyrke / kontrast" under "Analyser".
- Telle cellekjerner manuelt, for eksempel ved hjelp av funksjonen "celleteller"25. For dette, gå til "Plugins" og naviger til "Cell Counter" under "Analyze". Trykk "initialiser" og velg deretter en tellertype. Begynn deretter å telle cellekjernene ved å klikke på mørke ovale trekk i det omvendte bildet, med tanke på de som lander på en bildekant bare for to av de fire sidene av bildet25.
- Registrer celletettheten i form av arealtetthet, det vil si i celler / mm² (del antall celler telt med 0,09, for å konvertere fra celler / 90 000 μm² til celler / mm²), etter konfokalmikroskopikonvensjon der keratocytttettheter har vist seg å være lavere hos pasienter (f.eks. med keratokonus) enn hos friske personer og å være korrelert med sykdommens alvorlighetsgrad25.
MERK: Ytterligere kliniske studier er nødvendige for å avgjøre om en minimal terskel for keratocytttetthet er nødvendig for å oppnå et helt klart hornhinnetransplantat etter transplantasjon.
- Vurder stromal reflektivitet.
- Generer gjennomsnittlige intensitetsdybdeprofiler for stromale bildestakker, ved hjelp av for eksempel funksjonen "Z-akseprofil" og/eller tilpasset programvare25,30,31.
MERK: Dette er faktisk amplitudedybdeprofiler ettersom FF-OCM måler amplituden til lyset tilbakespredt av prøven i stedet for intensiteten.- Beregn gjennomsnittlig grått nivå for hver ansiktsstabel .
- Trekk fra den minste grå verdien og normaliser med den maksimale grå verdien.
- Visning i loggskala som funksjon av stromaldybde (% av stromaltykkelsen).
- Tilnærme den resulterende logaritmiske profilen med en lineær regresjonslinje, som minimerer summen av de kvadrerte restene (minste kvadraters passform).
- Registrer R-kvadratverdien (R²) som et mål på linearitet. Verdier under 0,94 kan være en indikasjon på hornhinnepatologi25.
MERK: For å skille utilstrekkeligheten til en lineær logaritmisk regresjonsmodell (eller en mono-eksponentiell henfallsmodell) på grunn av tilstedeværelse av en patologi fra ren målestøy, kan signalanalyse ved bayesiansk inferens utføres31. Også i hornhinner med lineære logaritmiske (eller mono-eksponentielle) stromale dybdeprofiler (f.eks. representert ved R-kvadratverdier30 eller Birge-forhold 31 nær 1), kan beregningen av fotonets middelfrie bane fra signalhenfallshastigheten brukes til ytterligere å kvantifisere graden av gjennomsiktighet31.
- Generer gjennomsnittlige intensitetsdybdeprofiler for stromale bildestakker, ved hjelp av for eksempel funksjonen "Z-akseprofil" og/eller tilpasset programvare25,30,31.
- Vurder synligheten av andre stromale funksjoner og sykdomsindikatorer.
- Sjekk for tilstedeværelse av arr, fibrotisk vev, innsjøer eller Vogt striae.
- Vurder gjennomsnittlig tykkelse på nerver i stroma, hvis tilstrekkelig synlig for måling24.
- Velg et ansiktsbilde der stromalnerven er mest synlig (vanligvis i midtre stromalområdet).
- Mål tykkelsen på nerven, for eksempel ved fem punkter24, og beregn deretter gjennomsnittet og standardavviket. Nervetykkelser over 9 μm kan være en ekstra indikator for patologi, for eksempel keratokonus24.
Representative Results
FF-OCM-enheten (se materialfortegnelse)28 og det generelle oppsettet som er brukt i dette manuskriptet, er vist i figur 1. Figur 2 viser en oppsvulmet hornhinne fra human donor etter lagring i organkulturmedium, noe som gir en patofysiologisk modell av ødematøs hornhinne og hindrer FF-OCM bildeopptak gjennom hele hornhinnetykkelsen på grunn av begrenset penetrasjonsdybde. Overgang til dekstransupplert organkulturmedium forårsaker avsvulming og resulterer i donorhornhinner med normal tykkelse, som vist i figur 3. Syke hornhinner kan gjenkjennes ved morfologiske forandringer og typiske stromale trekk, inkludert redusert og variabel tykkelse på stroma (figur 4) og/eller Bowmans lag (figur 5). Vurdering av keratocytttetthet (figur 6) og stromalreflektivitet (figur 7) kan ytterligere hjelpe til med histologilignende analyse og differensiering av normalt fra patologisk hornhinnevev med FF-OCM, utover egenskapene til kliniske OCT-systemer (figur 8).
Figur 1: Skjematisk og fotografier av det generelle oppsettet og FF-OCM-enheten som brukes i dette arbeidet. (A) Fotografi av FF-OCM-enheten (se materialfortegnelse)28. (B) Skjematisk og optisk oppsett av enheten. (C) Fotografi av en human donor hornhinne i prøveholderen. (D) Zoom på nedsenkingsmålet og prøveholderen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Organdyrket normal human hornhinne før avurgescens. Tverrsnitt (A) og en face view (B, skjær gjennom stroma) av svulmet ("edematøs") hornhinne forårsaket av lagring i organkulturmedium, hvor innsjøer kan sees som mørke områder (som indikert med piler). Hornhinnens tykkelse har doblet seg til over 1,100 μm, og forhindrer bildeopptak gjennom hele dybden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Organdyrket normal human hornhinne etter avurgescens. Tverrsnittsvisning gjennom hele hornhinnen (A) og en face stromal view (B) av de-swelled cornea nedsenket i dextran-supplert medium, som viser regelmessig distribuerte hyperreflekterende (hvite) keratocytter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Samlet vurdering av stromalmorfologi og trekk, inkludert stromaltykkelse. Sammenlignet med normal human hornhinne (A) har hornhinner med keratokonus (B) redusert og variabel stromaltykkelse, sammen med mange, parallelle Vogt striae som kan observeres som mørke vertikale bånd i tverrsnittsvisninger, og tykke stromale nerver som kan finnes i midtre stromal en ansiktsskiver (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Vurdering av Bowmans lagtykkelse, som er avgrenset anteriort av hyperreflekterende epitelkjellermembran og posteriort av de hyperrefleksive keratocytter i selve fremre stroma. Sammenlignet med en normal human hornhinne (A), har patologisk hornhinne (f.eks. keratokonus) (B) redusert og variabel Bowmans lagtykkelse på grunn av avbrudd og arrdannelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Vurdering av keratocytttetthet. (A) Keratocyttkjerner telles manuelt på forbedrede og inverterte ansiktsbilder etter valg av et område av interesse på 300 μm x 300 μm. (B) Telte kjerner er indikert med piler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Vurdering av stromal reflektivitet. Mengden tilbakespredt lys avtar (eksponentielt) med dybden i stroma av normale donorhornhinner (se figur 3 og figur 4A), noe som resulterer i lineære logaritmiske dybdeprofiler, representert ved R-kvadratverdier nær 1 (grønt spor). Dette gjelder kanskje ikke for patologiske hornhinner med stromale regioner med økt lys tilbakespredning (se figur 4B). Tilstedeværelsen av slike makroskopiske trekk, som i eksemplet med en hornhinne med stromale arr etter infeksiøs keratitt (avbildet i innfelt), vil dermed skape ikke-lineære logaritmiske intensitetsdybdeprofiler, representert ved en R-kvadratverdi under en viss terskel (f.eks. lavere enn 0,9425; rødt spor). Merk at logaritmiske amplitudedybdeprofiler faktisk vises når FF-OCM måler amplituden til lyset som er tilbakespredt av prøven i stedet for intensiteten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Demonstrasjon av fordelene med FF-OCM over histologi og spektraldomene OCT. (A) Histologi og (B) tilsvarende spektraldomene-OCT-bilde tatt på samme hornhinne in vivo før keratoplastikk. (C) Tilsvarende FF-OCM tverrsnitt av ex vivo hornhinneknappen etter keratoplastikk, som illustrerer overlegen oppløsning sammenlignet med det kliniske spektraldomenet OCT-bilder. Fibrosen er også tydeligere synlig på FF-OCM-bilder enn i histologien. Den høye tettheten av keratocytter i øvre stroma kan tydelig ses i både (C) tverrsnitt og (D) en ansiktsvisning . Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Protokollen beskrevet her for kvalitativ og kvantitativ vurdering av hornhinnedonorstroma ved bruk av FF-OCM er basert på histologilignende analyse av makroskopiske og mikroskopiske trekk som indikerer stromaltilstand, utover mulighetene til spektraldomene OCT og konfokalmikroskopi21,24,25, og muliggjør differensiering av syke fra normalt humant vev.
Bortsett fra en utmerket endotelkvalitetsvurdering av humane donorhornhinner ved hjelp av spekulær mikroskopi, er vurdering av stromalkvalitet utfordrende i øyebanker, og generelt begrenset til en grov observasjon med spaltelampebiomikroskopi og / eller lysmikroskopi i gjeldende protokoller. Mangel på fin oppløsning med eksisterende metoder betyr ikke bare at hornhinner med noen stromalsykdom kan velges som kompromitterer resultatet av keratoplastikk, men også at hornhinner kan avvises for stromale fortetninger som faktisk er begrenset til fremre stroma eller epitelregioner og fortsatt kan brukes til endotelial keratoplastikkprosedyrer14.
Den nåværende øyebankprotokollen kan suppleres med tillegg av FF-OCM, som på grunn av sin overlegne oppløsning utgjør et kraftig og ikke-invasivt verktøy for å fullføre kvalitetsvurderingen av hornhinnen, spesielt stroma (inkludert Bowmans lag). I motsetning til under spaltelampeundersøkelse forblir transplantatet nedsenket i et lukket kammer fylt med lagringsmedium gjennom hele FF-OCM bildeopptak, noe som reduserer potensiell risiko for forurensning.
For vellykket bildeopptak med FF-OCM (se materialfortegnelse) er det viktig at mikroskopmålet er godt nedsenket i den optiske gelen som påføres på toppen av prøveholderens deksel (trinn 2.2.3). Det anbefales videre å regelmessig kontrollere kalibreringen av enheten, en prosedyre som også skal utføres etter mislykket automatisk justering (trinn 2.2.2) og åpnes via "Verktøy og alternativer" i anskaffelsesprogramvaren (se Materialfortegnelse). Prosedyren, som innebærer bruk av et kalibreringsspeil i prøveholderen, er den samme som vanlig prøvepreparering (se trinn 1.2), bortsett fra at den optiske gelen skal påføres speilet før dekkslipen plasseres.
En serie donorhornhinnetransplantater, som anses å ha normal stroma i henhold til eksisterende øyebankprosedyrer, ble brukt til å beskrive protokollen i dette manuskriptet og spesifikt demonstrere egnetheten til FF-OCM for presis og pålitelig vurdering av donorstromalkvalitet. Disse normale donorhornhinnene ble sammenlignet med patologiske hornhinner nedsenket i lagringsmedium, noe som viste at den histologilignende analysen muliggjorde med FF-OCM av flere stromale trekk (illustrert i figur 2, figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7 og figur 8) i hornhinnetransplantater gjør det mulig å skille syke fra normale humane hornhinnevev.
Bortsett fra morfologiske forandringer, som tilstedeværelse av arr (figur 5 og figur 7), fibrotisk vev (figur 8), innsjøer (figur 2), Vogt striae (figur 4) eller økt stromalnervediameter (figur 4), er typiske stromale trekk til stede i syke hornhinner. Stromal parametere som er spesielt relevante i den stromale kvalitetsvurderingen synes å være Bowmans lagtykkelse og dens variabilitet, og stromal reflektivitet. Kritiske trinn i protokollen er dermed trinn 4.1 og 4.3.
Mens det blir utskilt under menneskelig hornhinneutvikling, blir spesielt Bowmans lag tydelig ved 19 ukers svangerskap og reparerer aldri etter fødselen32. Skader på Bowmans lag er dermed irreversible og fungerer som en ideell indikator på tidligere stromalskade i donorhornhinnevev, inkludert skade forårsaket av brytningskirurgi, infeksiøs keratitt, keratokonus. Slike hornhinnesykdommer, som utgjør kontraindikasjoner for donorhornhinnebruk, er forbundet med redusert og variabel Bowmans lagtykkelse på grunn av avbrudd og arrdannelse (figur 5), og vil sannsynligvis bli savnet av gjeldende øyebankprotokoller når donorhistorikken ikke er nøyaktig kjent.
Selv om hornhinnens gjennomsiktighet er svekket etter donordød på grunn av post mortem hornhinneødem, forventes mengden tilbakespredt lys eller stromalreflektivitet å avta eksponentielt med dybden i stroma (se figur 3 og figur 4A); som et resultat vil logaritmen til normalisert stromalreflektivitet være en lineær funksjon av stromaldybde i normale donorhornhinner, representert ved R-kvadratverdier nær 1. Omvendt er tilstedeværelsen av makroskopiske trekk assosiert med ikke-lineære logaritmiske dybdeprofiler og indikerer stromalsykdom (figur 4B og figur 7)25.
Siden keratocytttetthet er ansvarlig for stromal kollagenfibriller og ekstracellulær matrikssyntese og fornyelse, synes det rimelig å anta at keratocytttetthet er en annen relevant parameter for å vurdere donorstromalkvalitet, og at vev med svært lavt keratocyttall ikke bør transplanteres. Protokollen inneholder derfor en presis og pålitelig metode for å måle keratocytttetthet fra FF-OCM-bilder som enkelt kan brukes i øyebanker25 og følger konvensjonen for konfokalmikroskopi. Merk at med FF-OCM kan keratocytttettheten også bestemmes ved å telle keratocytter direkte i tverrsnittsvisning33, en potensiell fordel i forhold til konfokal mikroskopi, som krever at keratocytter telles på flere ansiktsskiver. Imidlertid, i motsetning til hos levende pasienter, hvor keratocytttetthet har vist seg å være lavere hos sykdomspasienter enn hos normale kontroller 34,35,36,37 og å korrelere med sykdommens alvorlighetsgrad 34,38, var dette ikke tilfelle i humane ex vivo vevsprøver 25 , og videre studier er nødvendige for å avgjøre om et minimalt antall keratocytter er nødvendig i donorhornhinner for å resultere i god visuell utvinning etter transplantasjon. Lav keratocytttetthet i donorvev som i patologisk vev kunne forklares med aldring, post mortem-tap av celler indusert av iskemi og/eller lagring av donorvev 27,39,40,41. Det bør også påpekes at de normale donorhornhinnene som ble oppnådd og avbildet i denne protokollen, enten ble lagret og edematøse eller de-hovne, eller hadde blitt kassert av øyebanken før transplantasjon på grunn av dårlig endotelkvalitet i henhold til standardene til EU Eye Bank Association. Hvis FF-OCM-avbildning sammen med den beskrevne protokollen skulle inkluderes i øyebankinnstillingen, ville hornhinnene typisk bli vurdert i en friskere tilstand enn det som var mulig her, noe som kan påvirke keratocytttetthetene.
Protokollen beskrevet her for den stromale kvalitetsanalysen kan utvides for vurdering av Descemets membran, som også kan løses med FF-OCM når det gjelder tykkelse og struktur21,24. Dette kan være nyttig for seleksjon av vev for Descemets membranendotelial keratoplastikk, hvor tynne Descemets membraner kan være vanskeligere å skille fra stroma.
Avslutningsvis muliggjør FF-OCM presis og pålitelig vurdering av human donor hornhinnestroma under lagring. Ved å forbedre graftkvaliteten har tillegg av denne protokollen til dagens øyebankprosedyrer potensial til å forbedre screening og valg av donorvev, og dermed resultatene av keratoplastikk. Virkelig integrering av FF-OCM-enheten i øyebankrutinen bør tilrettelegges av nylige teknologiske oppdateringer, inkludert raskere bildeopptak og større synsfelt takket være utviklingen av et tilpasset CMOS-kamera, og utformingen av tilpassede sterile engangskassetter for lagring og håndtering av hornhinnen under bildebehandling.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet har mottatt finansiering fra Agence Nationale de Recherche (ANR), under en PRTS (Projet de Recherche Translationelle en Santé) grant No ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) og fra EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under Marie Skłodowska-Curie grant agreement No 709104 (K.I.). Forfatterne takker Céline de Sousa for hjelp med celletelling og histologisk prosessering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light-CT Scanner | LLTech, France | http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/ | FF-OCM device used in this manuscript for imaging |
| CorneaJet | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html | Organ culture medium in which donor corneas are stored |
| CorneaMax | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html | Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence |
| Fiji (ImageJ) | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | https://fiji.sc/ | Open source image processing software |
| Matlab | Mathworks, Inc., Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | Mathematical computing software |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P.
- Shimazaki, J., Shimmura, S., Ishioka, M., Tsubota, K. Randomized clinical trial of deep lamellar keratoplasty vs penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 134, 159-165 (2002).
- Tsubota, K., Kaido, M., Monden, Y., Satake, Y., Bissen-Miyajima, H., Shimazaki, J. A new surgical technique for deep lamellar keratoplasty with single running suture adjustment. Am J Ophthalmol. 126, 1-8 (1998).
- Busin, M., Zambianchi, L., Arffa, R. C. Microkeratome-assisted lamellar keratoplasty for the surgical treatment of keratoconus. Ophthalmology. 112, 987-997 (2005).
- Amayem, A. F., Anwar, M.
- Borderie, V. M., Guilbert, E., Touzeau, O., Laroche, L. Graft rejection and graft failure after anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 151, 1024-1029 (2011).
- Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Gaujoux, T., Touzeau, O., Laroche, L. Long-term results of deep anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Ophthalmology. 119, 249-255 (2012).
- Koo, T. S., Finkelstein, E., Tan, D., Mehta, J. S. Incremental cost-utility analysis of deep anterior lamellar keratoplasty compared with penetrating keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 152, 40-47 (2011).
- Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Comparison of three different techniques of corneal transplantation for keratoconus. Am J Ophthalmol. 146, 905-912 (2008).
- Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Longterm results of deep anterior lamellar keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 151, 760-767 (2011).
- Cheng, Y. Y., et al. Endothelial cell loss and visual outcome of deep anterior lamellar keratoplasty versus penetrating keratoplasty: a randomized multicenter clinical trial. Ophthalmology. 118, 302-309 (2011).
- Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Guilbert, E., Goldschmidt, P., Laroche, L. Donor tissue selection for anterior lamellar keratoplasty. Cornea. 32, 1105-1109 (2013).
- Borderie, V., Martinache, C., Sabolic, V., Touzeau, O., Laroche, L. Light microscopic evaluation of human donor corneal stroma during organ culture. Acta Ophthalmol Scand. 76, 154-157 (1998).
- Bald, M. R., Stoeger, C., Galloway, J., Tang, M., Holiman, J., Huang, D. Use of fourier-domain optical coherence tomography to evaluate anterior stromal opacities in donor corneas. J Ophthalmol. 2013. 397680, (2013).
- Huang, D., et al.
- Swanson, E. A., et al. In vivo retinal imaging by optical coherence tomography. Opt Lett. 18, 1864-1866 (1993).
- Izatt, J. A., et al. Micrometer-scale resolution imaging of the anterior eye in vivo with optical coherence tomography. Arch Ophthalmol. 112, 1584-1589 (1994).
- Stave, J., Zinser, G., Grummer, G., Guthoff, R. Modified Heidelberg retinal tomograph HRT. Initial results of in vivo presentation of corneal structures. Ophthalmologe. 99, 276-280 (2002).
- Beaurepaire, E., Boccara, A. C., Lebec, M., Blanchot, L., Saint-Jalmes, H.
- Dubois, A., Vabre, L., Boccara, A. C., Beaurepaire, E. High-resolution full-field optical coherence tomography with a Linnik microscope. Appl Opt. 41, 805-812 (2002).
- Ghouali, W., et al. Full-field optical coherence tomography of human donor and pathological corneas. Curr Eye Res. 24, 1-9 (2014).
- Akiba, M., et al. Ultrahigh-resolution imaging of human donor cornea using full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 12, 041202 (2007).
- Latour, G., Georges, G., Lamoine, L. S., Deumie, C., Conrath, J., Hoffart, L. Human graft cornea and laser incisions imaging with micrometer scale resolution full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 15, 056006 (2010).
- Grieve, K., Georgeon, C., Andreiuolo, F., Borderie, M., Ghoubay, D., Rault, J., Borderie, V. M. Imaging microscopic features of keratoconic corneal morphology. Cornea. 35, 1621-1630 (2016).
- Borderie, M., et al. New parameters in assessment of human donor corneal stroma. Acta Ophthalmol. 95. 297, e297-e306 (2017).
- Borderie, V. M., Scheer, S., Touzeau, O., Vedie, F., Carvajal-Gonzalez, S., Laroche, L. Donor organ cultured corneal tissue selection before penetrating keratoplasty. Br J Ophthalmol. 82, 382-388 (1998).
- Borderie, V. M., Baudrimont, M., Lopez, M., Carvajal, S., Laroche, L. Evaluation of the deswelling period in dextran-containing medium after corneal organ culture. Cornea. 16, 215-223 (1997).
- Tech, L. L. , Light-CT Scanner. http://www.lltechimaging.com/products-applications/products (2017).
- Doughty, M. J., Müller, A., Zaman, M. L. Assessment of the reliability of human corneal endothelial cell-density estimates using a noncontact specular microscope. Cornea. 19, 148-158 (2000).
- Irsch, K., Borderie, M., Grieve, K., Plamann, K., Laroche, L., Borderie, V. M. Objective analysis of stromal light backscattering with full-field optical coherence tomographic microscopy shows potential to quantify corneal transparency. Frontiers in Optics. OSA Technical Digest (online), paper FW6A.6. , (2015).
- Bocheux, R., Pernot, P., Borderie, V., Plamann, K., Irsch, K. Quantitative measures of corneal transparency, derived from objective analysis of depth-resolved corneal images, demonstrated with full-field optical coherence tomographic microscopy. PLoS ONE. e0221707. 14, (2019).
- Karimi, A. H., Wong, A., Bizheva, K. Automated detection and cell density assessment of keratocytes in the human corneal stroma from ultrahigh resolution optical coherence tomograms. Biomed Opt Express. 2, 2905-2916 (2011).
- Ku, J. Y., Niederer, R. L., Patel, D. V., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal analysis of keratocyte density in keratoconus. Ophthalmology. 115, 845-850 (2008).
- Ozgurhan, E. B., Kara, N., Yildirim, A., Bozkurt, E., Uslu, H., Demirok, A. Evaluation of corneal microstructure in keratoconus: a confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 156, 885-893 (2013).
- Erie, J. C., Patel, S. V., McLaren, J. W., Nau, C. B., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Keratocyte density in keratoconus. A confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 134, 689-695 (2002).
- Imre, L., Resch, M., Nagymihaly, A.
- Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal microscopy reveals reduced innervation and reduction in cell density in all layers of the keratoconic cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 2964-2970 (2008).
- Patel, S., McLaren, J., Hodge, D., Bourne, W. Normal human keratocyte density and corneal thickness measurement by using confocal microscopy in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42, 333-339 (2001).
- Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4 degrees. C. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2827-2832 (1999).
- Gambato, C., Longhin, E., Catania, A. G., Lazzarini, D., Parrozzani, R., Midena, E. Aging and corneal layers: an in vivo corneal confocal microscopy study. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 253, 267-275 (2015).
