Summary
Protokollen presenteres her beskriver en plattform for å identifisere små molekyler for behandling av leversykdommer. En detaljert beskrivelse vises detaljering hvordan skille iPSCs i celler med hepatocyte egenskaper i 96-brønnen plater, og bruke cellene til skjermen for små molekyler med potensielle terapeutisk aktivitet.
Abstract
Muligheten til å skille menneskelig indusert pluripotent stamceller (iPSCs) i hepatocyte-lignende celler (HLCs) gir nye muligheter til å studere medfødt feil i hepatic metabolisme. Men for å gi en plattform som støtter identifikasjon av små molekyler som kan brukes til å behandle leversykdom, krever prosedyren et kultur-format som er kompatibelt med screening tusenvis av forbindelser. Her beskriver vi en helt definert kultur vilkår, som tillater reproduserbar differensiering av menneskelig iPSCs hepatocyte-lignende celler i 96-brønnen vev kultur plater-protokoll. Vi tilbyr også et eksempel på bruk av plattformen til skjermen forbindelser for sin evne til å senke Apolipoprotein B (APOB) produsert fra iPSC-avledet hepatocytter generert fra en familiær hyperkolesterolemi pasient. Tilgjengeligheten av en plattform som er kompatibel med medisiner bør tillate forskere å identifisere romanen legemiddelselskap for sykdommer som påvirker leveren.
Introduction
Suksess i å identifisere legemidler som kan brukes til å målrette en sjelden sykdom er avhengig av utviklingen av analyser som kan brukes for screening. Hypotesen eller mål-baserte skjermer (omvendt farmakologi) er nyttig, men krever en detaljert forståelse av molekylære grunnlaget for sykdommen. Fenotypiske skjermer (klassisk farmakologi) unngå behovet for en grundig forståelse av biokjemiske, men i stedet stole på utvikling av modeller som nøyaktig speil i patofysiologien av sykdom. Til tross for entusiasme for mål-baserte tilnærminger avslører analyser av FDA godkjente første i klassen stoffer at fenotypiske skjermer er langt mer vellykket1. Det overordnede målet med denne metoden er å etablere en plattform for høy gjennomstrømning screening som kan brukes til å identifisere små molekyler for behandling av metabolske leversykdom. Flere i vitro modeller har blitt beskrevet som primære hepatocytter, hepatoma celler og leveren stamfar celler2. Men de fleste av disse modellene har begrensninger, og det er behov for nye modeller som kan nøyaktig recapitulate i Patofysiologien ved metabolske leveren mangler i kultur. Nylig menneskelige pluripotent stilk celler kombinert med gene redigering har tilbudt en mulighet å modellere selv de sjeldneste av sjeldne sykdommer i kultur uten å måtte tilgang pasienter direkte3. Mens bruk av pasient-spesifikke iPSCs som et verktøy for å oppdage små molekyler for behandling av sjeldne leversykdommer er konseptuelt rimelig, er det bare noen rapporter demonstrere muligheten for denne tilnærmingen4. Imidlertid har vi nylig etablert en plattform som brukes iPSC-avledet hepatocytter kunne identifisere legemidler som kan gjenbrukes i behandling av mangler i leveren metabolismen5.
Denne protokollen forklarer prosessen med å skille menneskelig iPSCs hepatocyte-lignende celler i 96-brønnen plater og bruke dem til skjermen et bibliotek av små molekyler. Den beskriver også endepunktet analysen med hyperkolesterolemi som eksempel på metabolske leversykdom. Denne tilnærmingen bør være nyttig å studere rolle og anvendelse av små molekyler i forbindelse med smittsomme leversykdom, metabolske leversykdom, drug giftighet og andre leversykdommer lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kultur av menneskelige indusert Pluripotent stamceller
-
Belegg rekombinant menneskelige E-Cadherin Fc Fusion Protein (E-cad-Fc) eller andre matriser egnet for hPSC kultur 6
- Fortynn E-cad-Fc til 15 μg/mL med Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline inneholder kalsium og magnesium (DPBS (+)).
- Pels 100 mm suspensjon vev kultur retter med 5 mL utvannet E-cad-Fc og ruge på 37 grader for minst 1 h. Fjern substrat og erstatte med 5 mL av medium (f.eks mTeSR1 kalt M mellomstore heretter)7.
Merk: Kultur mediet som brukes i denne protokollen er utarbeidet etter publiserte protokoller7. Imidlertid flere andre medier preparater er beskrevet, eller er tilgjengelig kommersielt, som er trolig kompatibel med fremgangsmåten. - Hente ampuller med cryopreserved iPSCs fra flytende nitrogen. Tine på 37 grader til en liten is krystall gjenstår. Pipetter forsiktig celler i et sterilt 15-mL konisk rør som inneholder 4 mL av M-medium.
- Sentrifuge 300 x g for 5 min. fjerne nedbryting og forsiktig å suspendere celler med 5 mL av mediet med 10 µM av Y-27632, en selektiv inhibitor av Rho-assosiert, kveilet-coil inneholder protein kinase (ROCK).
- Fjern M-mediet fra trinn 1.1.2, og overføre 5 mL av celler fra trinn 1.1.4 E-cad-Fc-belagt 100 mm suspensjon vev kultur retter.
-
Opprettholde menneskelige iPSCs i kultur
- Når iPSCs nå rundt 80% confluency, fjerne kultur medium og vask en gang med kalsium og magnesium gratis DPBS (-). Sug opp DPBS (-) og legge til en tilstrekkelig mengde 0.02% EDTA løsning å dekke platene, så ruge for opptil 3 min ved romtemperatur.
Merk: På 80% samløpet, skal platen inneholde rundt 2 x 107 celler. Det er viktig ikke å overgrow cellene, og sikre at cellene beholde en udifferensierte morfologi. Pluripotency cellene kan bestemmes av farging med stilk cellen markør Tra-1-60 eller tilsvarende8. - Så snart cellene begynner å løslate, Fjern 0.02% EDTA løsningen og flom parabolen med 10 mL av M-mediet å frigi cellene. Hjelp brøkdel av iPSCs ved forsiktig pipettering.
Merk: Den gjennomsnittlige inkubasjon celler koble er rundt 3 min, men dette må bestemmes empirisk for hver iPSC linje. Cellene skal være utgitt som klaser med rundt 5-10 iPSCs per sektorgruppe. - Overføre 1/10 av suspendert celler per frisk E-cad-Fc belagt 100 mm suspensjon vev kultur parabol med 5 mL av M-mediet. Inkuber kulturer på 37 grader under 4% O2/5% CO2 og endre mediet daglig.
Merk: Selv om iPSCs er rutinemessig kulturperler under fysiologiske oksygen forhold å fremme pluripotency, kan iPSCs også dyrkes bruker ambient oksygen.
- Når iPSCs nå rundt 80% confluency, fjerne kultur medium og vask en gang med kalsium og magnesium gratis DPBS (-). Sug opp DPBS (-) og legge til en tilstrekkelig mengde 0.02% EDTA løsning å dekke platene, så ruge for opptil 3 min ved romtemperatur.
2. differensiering av menneskelig iPSCs til Hepatocyte som celler i 96-brønnen plater
Merk: Denne delen beskriver differensiering av iPSCs i et format som er kompatibelt med screening. Bruke denne metoden, er det mulig å indusere menneskelige iPSCs å skille og hepatocyte som celler i 20 dager. Mens dette er egnet for de fleste analyser, kan lengden på kultur utvides for å forbedre modenheten til cellene.
-
Belegg 96-brønns vev kultur plater med redusert vekstfaktor kjelleren membran matrise
- Klargjør lager ved å fortynne matrisen til 2 mg/mL med iskald sterilt DMEM/F12 vev kultur medium. Dele matrisen i 250 μL dele og lagre på-80 grader til nødvendig. Chill 10 mL av DMEM/F12 på is 30 min. hente en 250 μL aliquot av 2 mg/mL matrix lager og tine på is.
- Kombiner matrix med 10 mL kaldt DMEM/F12 ved å blande forsiktig bruker en pre kjølt pipette for å gjøre endelige konsentrasjon av 0,05 mg/mL.
- Overføre 100 μL utvannet matrise i hver brønn av en 96-brønns vev kultur plate. Ruge på 37 grader, 4% O2/5% CO2 for minst 1 h. forkaste matrix og erstatte med 50 μL av M-medium per brønn. Lagre på 37 ° C, 4% O2/5% CO2 inntil nødvendig.
-
Plate celler for differensiering
- Kultur iPSCs på 100 mm plater til cellene tilnærming 80% samløpet. Kontroller at platen inneholder rundt 2 x 107 celler. Bestemme cellen tallene av cellen flyt cytometer eller hemocytometer.
Merk: Med erfaring, kan kvaliteten på iPSCs cellene bedømmes av mikroskopi; imidlertid skal nær 98% av cellene uttrykke pluripotency markører som TRA-1-60 epitope med FACS eller immunostai. Det er viktig at cellene forbli aktivt dele og er ikke overgrodd. - Å høste iPSCs fra hver 100 mm plate, Sug opp kultur medium og skyll med 5 mL av DPBS (-). Erstatt skylling med 3 mL celle avdeling (f.eks, accutase) og ruge i ca 2 minutter ved 37 ° C, 4% O2/5% CO2.
Merk: Det er viktig å følge brøkdel av celler ved mikroskopi. Gjør ikke over digest med accutase. Målet er å frigi cellene som klaser med minimal behandling. - Så snart cellene begynner å løsne, høste ved å legge til 7 mL av M-mediet. Pipetter flere ganger for å dissociate celle koloniene i klaser med rundt 3-6 celler (figur 1A).
- Samle iPSCs i en 15-mL steril sentrifuge rør og sentrifuger 300 x g for 5 min. fjerne nedbryting og å suspendere celle pellet i 5 mL M-medium.
- Jevnt distribuere cellene på 96-brønns matrix-belagt plater av pipettering 50 μL av suspensjon celler i hver brønn. Sette opp hver 96-brønns plate, kan du bruke en 100 mm plate av iPSCs med cellene på ca 80% confluency som inneholder rundt 5 x 106 celler å setup differensiering. Bruk en flerkanals pipette for å fremskynde prosessen. Kultur cellene overnatting på 37 grader, 4% O2/5% CO2.
Merk: Det er viktig at samme antall celler er avsatt i hver brønn å sikre reproduserbar atskillinger.
- Kultur iPSCs på 100 mm plater til cellene tilnærming 80% samløpet. Kontroller at platen inneholder rundt 2 x 107 celler. Bestemme cellen tallene av cellen flyt cytometer eller hemocytometer.
-
Indusere differensiering cellene
- Undersøke 96-brønns platene ved mikroskopi slik at cellene dekker minst 70% av overflaten av hver enkelt også. Hvis dekningen er mindre enn 70%, Erstatt medium med fersk medium og Inkuber en ekstra 24 h på 37 grader, 4% O2/5% CO2.
Merk: Rugende celler for mer enn 48 timer etter plating uten å indusere differensiering vanligvis reduserer effektiviteten av differensiering. Differensiering vil også skje med ambient oksygen, selv om effektiviteten kan være berørt. - For dag 1 dag 2 av differensiering, erstatte kultur medium med RPMI med 2% B27 (uten insulin), 100 ng/mL Activin A, 10 ng/mL BMP4 og 20 ng/mL FGF2. Tilsett 100 μL av medium per brønn og ruge på 37 grader, i ambient O2/5% CO2 med en daglig medium endring i 2 dager.
Merk: Håndtere et stort antall 96-brønns plater krever bruk av en automatisk pipette eller robot. 12-kanals og 96-kanals Pipetter er ideelle for daglig medium endring. - Dag 3 til dag 5 av differensiering supplert Erstatt kultur medium med RPMI med 2% B27 (uten insulin) og 100 ng/mL Activin A. Culture cellene på 37 grader, i ambient O2/5% CO2 med daglige medium endring i 3 dager.
- På differensiering dag 5, før erstatte med fersk kultur medium, behandler hver godt med 100 μL 0.02% EDTA løsning for 30 s, deretter fjerne og erstatte med fersk kultur medium.
Merk: Hvis differensiering å endoderm er effektiv, er monolayer av differensiering cellene utsatt for peeling fra platen. En kort behandling med 0,02% EDTA løsning hjelper lindre celle avdeling. Denne behandlingen påvirker ikke differensiering å hepatocytter. - For differensiering mellom dager 6 til 10, erstatte kultur medium med RPMI / 2% B27 (med insulin) supplert med 20 ng/mL BMP4 og 10 ng/mL FGF2 og ruge på 37 grader, 4% O2/5% CO2 i 5 dager med daglige medium endring. Dette stadiet induserer cellene å differensiere i hepatic progenitor celler.
- For differensiering mellom dager 11 til 15, erstatte kultur medium med RPMI / 2% B27 (med insulin) supplert med 20 ng/mL HGF. Ruge på 37 grader, 4% O2/5% CO2 i 5 dager med daglige medium endring.
- For differensiering mellom dager 16 til 20, erstatte kultur medium med en hepatocyte celle kultur medium (HCM) med 20 ng/mL av Oncostatin-M (OSM). Inkuber cellene på 37 grader, i ambient O2/5% CO2 med daglige medium endring i 5 dager.
Merk: Reproduserbarhet av differensiering mellom individuelle brønner kan effektivt bestemmes ved å måle det relative nivået Albumin, AFP eller APOB skilles ut til medium av ELISA (se 3.2).
- Undersøke 96-brønns platene ved mikroskopi slik at cellene dekker minst 70% av overflaten av hver enkelt også. Hvis dekningen er mindre enn 70%, Erstatt medium med fersk medium og Inkuber en ekstra 24 h på 37 grader, 4% O2/5% CO2.
3. små molekyl Screening
Merk: Følgende beskriver fremgangsmåten brukes til å identifisere forbindelser som kan brukes til å senke nivået av APOB i medium for hepatocyte-lignende cellene stammer fra familiær hyperkolesterolemi iPSCs. En beskrivelse av modellen og dens bruk i identifikasjon av kolesterol senking medisiner har blitt beskrevet i detalj tidligere5,9. I dagens eksempel ble 1000 forbindelser fra South Carolina sammensatte samling (SC3) biblioteket vist. Hver sammensatte ble testet i en konsentrasjon av 2 μg/mL.
-
Behandling av iPSC - avledet hepatocytter med små molekyler
- Fortynne master sammensatte biblioteket vil generere plater arbeider aksjer med forbindelser i en konsentrasjon på 20 μg/mL i 2% DMSO og butikk på-20 grader.
- Forberede nok 96-brønns plater iPSC-avledet hepatocytter tillate hver sammensatte skal testes.
Merk: Antall forbindelser å bli vist vil diktere antall 96-brønns plater som kreves. Generelt, bør ett godt være forberedt for hver sammensatte, pluss ytterligere brønner for noen kontroll prøver. Ytterste brønnene av platen er vanligvis unngått for å redusere muligheten for kanteffekter det kanne korrupt tolkning. Treff kan identifiseres ved hjelp av z-skåre metoden uten for å bruke gjentak. Hvis gjentak er inkludert, er det mer hensiktsmessig å bruke t-testen. - Ved ferdigstillelse av differensiering (dag 20, se 2.3.7), erstatte kultur medium med 100 μL frisk HCMmed 20 ng/mL av Oncostatin-M. Ruge på 37 grader, 4% O2/5% CO2 for nøyaktig 24 h. hente kultur medium i en fersk 96-brønns plate og butikk på-20 grader. Bruk eksempelfilen for å beregne hvilket APOB i medium før tillegg av narkotika.
- Legge til 90 μL frisk HCM med 20 ng/mL av Oncostatin-M i hver brønn. Tilsett 10 μL av hver sammensatte fra arbeider lager etter blanding av pipettering. Legg DMSO 0,2% å kontrollere brønner for å matche den endelige konsentrasjonen i de behandlede prøvene og ruge på 37 grader, ambient O2/5% CO2 for nøyaktig 24 h. samle kultur medium og lagre på-20 grader. Bruk eksempelfilen for å bestemme nivået av APOB etter behandling med forbindelser.
- Valgfritt - de gjenværende cellene kan behandles for immunostai-cellen levedyktighet og analyser av mRNA nivåer ved hjelp av standard tilnærmingsmåter.
Merk: Denne skjermen ble utformet for å identifisere legemidler som hadde en rask effekt på APOB nivåer. Avhengig av sykdom modell, nedstrøms analyser, eller narkotika virkningsmekanismen, kan det imidlertid være gunstig å behandle prøven i flere dager.
-
Bestemme APOB nivåer av ELISA
- Bestemme Apolipoprotein B (APOB) konsentrasjon fra både før og etter narkotika behandlet prøvene ved hjelp av en menneskelig APOB ELISA development kit etter produsentens protokoller.
-
Forbereder følgende løsninger
- Vaskebuffer, består av 0,05% mellom 20 i PBS, pH 7.4. Lagre på 4 grader før bruk.
- Inkubasjon buffer, består av 0,05% mellom 20 og 0,1% bovin serum albumin (BSA) i PBS, pH 7.4. Lagre på 4 grader før bruk.
- Klargjør APOB (mAB 20/17) antistoff ved å fortynne til 2 µg/mL i PBS, pH 7.4. Tilsett 100 μL av utvannet antistoffer per brønn og ruge på 4 grader over natten.
- Fjerne antistoffer fra analysen platene og vask godt to ganger med 200 μL av PBS, pH 7.4.
- Legge til 200 μL/brønnen 0,05% mellom 20, 0,1% bovin serum albumin (BSA) i PBS, pH 7.4 og Inkuber på en risting plattform 1t ved romtemperatur.
- Forberede en 8-punkts standardkurve bruke 0,05% mellom 20 og 0,1% BSA i PBS, pH 7.4 med følgende konsentrasjonen av APOB: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL og 50 ng/mL.
- Fortynne den test prøver 1:4 med 0,05% mellom 20 og 0,1% BSA i PBS, pH 7.4.
- 1 h for å blokkere med inkubering buffer, forkaste bufferen og vaskes analysen platene fem ganger med 200 μL på 0,05% mellom 20 i PBS, pH 7.4.
- Fjerne eventuelle gjenværende vaske bufferen og overføre 90 μL fortynnede prøvene og APOB standarder til analysen platene. Inkuber ved romtemperatur på en shaker 1t.
- Forkaste prøven og vask med 200 μL 0,05% mellom 20 i PBS, pH 7.4 per brønn. Gjenta vasker totalt 5 ganger. Tilsett 100 μL per brønn av mAB LDL 11-biotin utvannet 1:1,000 i 0,05% mellom 20 og 0,1% BSA i PBS, pH 7.4. Inkuber ved romtemperatur på en risting plattform 1t.
- Skal kastes og vask med 200 μL per godt vaske bufferen 5 ganger. Tilsett 100 μL per brønn Streptavidin-HRP antistoff (1:1, 000 fortynning med inkubering buffer), deretter ruge ved romtemperatur på en risting plattform 1t.
- Skal kastes og vaskes med 200 μL 0,05% mellom 20 i PBS, pH 7.4 per brønn. Gjenta vasker totalt 5 ganger. Helt fjerne gjenværende vaske bufferen fra analysen platene og tilsett 100 μL per brønn av Tetramethylbenzidin (TMB) substratløsningen og ruge ved romtemperatur for 8 min.
- Uten å fjerne TMB-substratet, direkte Tilsett 100 μL per brønn stopp løsning (1N HCl).
- Bestem absorbansen ved 450 nm likner en plate.
- En standard kurve kan etableres med metoden fire parameteren logistisk regresjon, og brukes til å definere konsentrasjonen av APOB i hvert eksempel10.
- Undersøke før stoffet: etter narkotika forholdet mellom APOB i hver prøve å identifisere forbindelser til å senke APOB nivåer i medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering av hepatocyte - liker celler: Figur 1 beskriver tidsrammen endringene som oppstår under differensiering av menneskelig iPSCs hepatocyte-lignende celler. Kulturen i iPSCs på E-Cad-Fc gir omlag 2 mm diameter kolonier som uttrykker pluripotent markøren OCT4 (figur 1A-B). Morfologi av celler dyrket på en matrise-E-cadherin vil være litt forskjellige fra de kultivert på andre overflater. De pleier å ha en flat morfologi med en større cytoplasmatiske areal (figur 1A). Selv om menneskelig pluripotent stamceller kan effektivt kultivert på en rekke ulike matriser11, kulturen av iPSCs på en E-cadherin matrise er antatt å øke homogenitet av pluripotent celle befolkningen og lar enzym-fri manipulering av cellene under passering12. Imidlertid flere alternative matriser, inkludert kjelleren membran matrise, laminins, vitronectin og mus embryonale fibroblaster (MEF), kan også brukes til å vedlikeholde menneskelig iPSCs og alt skal være kompatibelt med beskrevet prosedyren13. I alle tilfeller kan celle pluripotency bli bekreftet av Tra-1-60 eller tilsvarende8.
For å starte differensiering, skal iPSCs samles som klaser (figur 1A). På begynnelsen av differensiering, skal belagt cellene dekke ca 80% av overflaten av platen. Etter 5 dager behandling med vekstfaktorer, cellene express proteiner som er karakteristisk uttrykt i den definitive endoderm som SOX17 og FOXA2 (figur 1B). På dette stadiet uttrykker over 90% av cellene vanligvis disse markørene. Etter 5 dager med differensiering, endoderm konverteres til en hepatic skjebne, og i tillegg til FOXA2, celler uttrykke HNF4a, som kan identifiseres hele resten av differensiering prosessen (figur 1B). Som cellene vedta en hepatic skjebne, de bør dekker overflaten av platen som en monolayer. Etter HGF begynner cellene å uttrykke proteiner som finnes i fosterets hepatocytter inkludert AFP (figur 1B). Lipid dråper kan observeres i cytoplasma av cellene. Etter ferdigstillelse av differensiering vedta cellene en kubisk morfologi med en kjerne som inneholder fremtredende nucleoli og en stor cytoplasma med flere lipid dråper. Et delsett av hepatocyte som cellene blir flere kjerne. De fleste av celler uttrykke en omfattende repertoar av hepatocyte proteiner inkludert Albumin (figur 1B)14.
Effektiv høy gjennomstrømning skjermen med hyperkolesterolemi som sykdom modell: Hyperkolesterolemi gjenspeiler overdreven konsentrasjoner av lav tetthet lipoprotein-kolesterolet (LDL-C) i serum. Økt er serum LDL-C hovedsakelig på grunn av mutasjoner i lav tetthet lipoprotein reseptor (LDLR) som formidler opptak av LDL-C for klarering av av hepatocytter i familiær hyperkolesterolemi (FH). Vi har tidligere beskrevet generering av iPSCs fra en pasient med homozygous familiær hyperkolesterolemi og deres bruk i generere hepatocytter som speilet pasientens leversykdom i kultur9. Det ble demonstrert at disse cellene kan brukes med hell som en plattform for medisiner. Når et bibliotek med ~ 2500 narkotika ble vist, ble det funnet at cardiac glykosider hadde en uventet evne til å senke LDL-C iPSC-avledet hepatocytter, primære menneskelige hepatocytter, og mus med humanized lever. Videre ved å undersøke medisinske pasientjournaler fant vi at kolesterol nivåer falt som ble foreskrevet en cardiac glycoside for behandling av hjertesykdommer. Disse studiene bekrefter at iPSC-avledet hepatocytter kan med hell brukes i skjermer for å identifisere therapeutics.
For å gi en plattform som er kompatibel med screening, er det viktig at atskillinger er reproduserbare og at godt til godt variasjon er minimert. Figur 2 viser resultatene av immunostaining i hver brønn av en 96-brønns plate å oppdage HNF4a og Albumin på dag 20 av differensiering. Som kan ses i figur, ligner distribusjon av disse hepatocyte proteiner på tvers av alle brønnene.
Sentrale proteinkomponenter LDL-C er APOB. Her har vi brukt iPSCs til skjermen APOB senke forbindelser å gi et eksempel på bruk av iPSC-avledet hepatocytter for små molekyl screening (figur 3A). APOB kan måles lett i løsning av ELISA. Siden ELISA kan utføres på mange prøver, kan det brukes som grunnlag for en skjerm. Hensiktsmessigheten av en analysen for høy gjennomstrømning screening er best bestemmes ved hjelp av en måling kalt Z-faktoren (eller Z')15. Parameterverdien statistiske beregner effektiviteten av analysen skille mellom positive og negative kontroll prøver. En analysen med en Z-faktor > 0,5 anses kompatibel med en skjermen15. Som kan ses i figur 3B, Z' til APOB analysen = 0.73, som bekrefter hensiktsmessigheten av bruke plattformen for medisiner.
Identifikasjon av forbindelser som har kapasitet til lavere APOB nivåer i kultur medium med iPSC - avledet hepatocytter: for å fastslå om plattformen kan brukes til å identifisere romanen forbindelser som påvirker APOB nivåer, vi vist 1000 små molekyler fra i South Carolina sammensatte samling (SC3) representant sett Lite (RSL). I RSL ble generert av MUSIK South Carolina Center for terapeutisk funn, og har forbindelser som er strukturelt forskjellige og reflekterer overordnede biblioteket.
Etter stoffet: pre narkotika forholdet mellom APOB ble fastslått for hver sammensatte (Figur 3 c) og identifikasjon av treff ble oppnådd ved z-skåre analyse (figur 3D)16. I dette tilfellet ble små molekyler som redusert APOB med en z-skåre ≤-2.0 som potensielle treff vurdert. Når screening 1000 små molekyler, er antall potensielle treff med en z-skåre ≤-2.0 vanligvis relativt overkommelig. Men når du utfører en større skjerm, ville vi stole på en mer konservativ score på ≤-3,0, basert på 3-sigma regelen, å øke tilliten potensielle mål. I dette eksemplet identifiserte vi 24 mulige treff med en APOB som varierte fra 0,86 til 0.44 (figur 4A). En sekundær analysen ble utført på quadruplicate prøver (n = 4 biologiske gjentak) til å ekskludere forbindelser som hadde en negativ innvirkning på celle levedyktighet og bestemme som forbindelser kan reproduserbar lavere APOB i mediet. Av de opprinnelige 24 kandidat forbindelsene, fire ble funnet for å være reproduserbare (p ≤0.05) (figur 4B-C). På videre studier, 2 av disse forbindelsene ble funnet å negativt påvirke celle levedyktighet, antyder at den observerte reduksjonen i APOB var trolig en være en konsekvens av cellen. De resterende to forbindelsene betraktes velegnet for oppfølging studier.
Figur 1 : Trinnvis hepatic differensiering av menneskelig iPSCs. (A) Morfologi av iPSC kolonier umiddelbart før harvest (venstre panel) og iPSCs etter samle celler for differensiering (høyre panel) - etter accutase behandling, cellene skal bli atskilt i 3-6 celler/klynge. Skala bar = 50 µm. (B) tabellen viser kultur forhold på hvert stadium av differensiering (øvre). Immunostaining (nedre paneler) ble utført for å identifisere markør uttrykk på hvert trinn av differensiering. Paneler viser OCT4 og DAPI farget atomkjerner i iPSCs, SOX17 og FOXA2 i definitive endoderm, HNF4a og FOXA2 i hepatic stamfar celler, HNF4a og AFP i umodne hepatocyte som celler, og HNF4a og Albumin i relativt eldre hepatocyte-lignende celler. Skalere barer = 100 µm (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Homogen hepatic differensiering av menneskelig iPSCs i 96-brønnen plater. Immunostaining ble utført på hver enkelt brønn av en 96-brønns plate som inneholder iPSC-avledet hepatocytter på dag 20 av differensiering å oppdage (A) Albumin og (B) HNF4a. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Små molekyl screening med menneskelige iPSC-avledet hepatocytter. (A) skjematisk oversikt over fremgangsmåten som brukes til å identifisere forbindelser som kan redusere nivået av ABOB i medium hepatocytes iPSC-avledet. (B) graf viser theresults av ELISA analysen å oppdage hvilket APOB i medium 87 brønner (n = 87) hepatocytes iPSC-avledet (blå) og/eller udifferensierte iPSCs (oransje). Disse dataene ble brukt til å beregne en Z-faktor (Z' = 0.73). (C) graf som viser etter stoffet: pre narkotika prosenter av konsentrasjonen av APOB i kultur medium hepatocytes iPSC-avledet behandlet for 24 timer med 998 forbindelser fra SC3 RSL settet. (D) graf som viser z-resultater av dataene som vises i (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Validering av primære treff. (A)-tabell som viser forbindelser i den primære skjermen som kunne redusere APOB. (B, C) Søylediagrammer viser virkningen av forbindelser etter legemiddel: pre narkotika APOB konsentrasjon forholdet (B) og celle levedyktighet (C) i iPSC-avledet hepatocytter behandlet med forbindelser i oppfølging analyse. Feilfelt gjenspeiler ± SEM (n = 4 biologiske gjentak); * p ≤0.05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mål basert stoffet funnet, hvor små molekyler identifiseres som påvirker aktiviteten til et bestemt protein, har vært fokus for mange eksisterende screening innsats. Selv om denne tilnærmingen har gitt mange legemidler, skjermer basert på snu en fenotype, klassisk farmakologi, har vært mer vellykket i å identifisere første i klassen forbindelser som har vært klinisk effektiv1. En ulempe til fenotypiske medisiner er at den er avhengig av tilgjengelighet av riktig sykdom modeller. Dette kan være en utfordring når cellen modeller av sykdommen er utilgjengelig, eller når felles forskning dyrearter unnlater å recapitulate kliniske symptomene. Muligheten til å generere iPSCs fra pasientens somatiske celler har imidlertid gitt nye muligheter til modell menneskelig sykdom i kultur3. For noen sykdommer, som sjeldne genetiske sykdommer, kan pasienter få i antall, og vanskelig å få tilgang og samtykke. Men med ankomsten av genomet engineering er det relativt enkelt å introdusere forårsaker mutasjoner i iPSC genomet, gjør det mulig å modellere selv de sjeldneste av sjeldne sykdommer.
Når iPSCs er i hånden, er det nødvendig for å produsere en riktig celle type der symptomene på sykdommen manifest. For eksempel krever sykdommer nevrale funksjonen generering av nerveceller eller glia17, mens de påvirke leveren må hepatocytter9,18 eller biliær epitelceller for studere19, 20 , 21. dette kravet introduserer en rekke begrensninger når det gjelder bruk av iPSCs for medisiner. Først er det viktig å forstå mobilnettet grunnlaget for sykdommen. Dette kan være utfordrende, spesielt når celler vedta egenskaper basert på plassering eller miljø. Dette kunne være sant for hepatocytter som har forskjeller i genet uttrykket profiler og enzymatiske funksjon som er avhengige av deres plassering i leveren lobule. Andre arbeider med celler isolert kan hindre studier av sykdommer som gjenspeiler et avbrudd i vevet struktur som skrumplever, celle-celle kommunikasjon som neuromuscular sykdommen eller de som er påvirket av betennelse som inflammatorisk tarmsykdom.
For å studere leversykdom, har flere forskningsgrupper beskrevet for å generere hepatocyte-lignende celler fra iPSCs,13,,22,,23,,24,,25. Mens de fleste av disse protokollene er effektiv, er begrensning av teknikken at cellene ikke fullt recapitulate funksjonen frisk hepatocytes. Dette betyr at det er viktig å bestemme om celler generert fra iPSCs display funksjonene nødvendig å evaluere virkningen av en gitt mutasjon. Blant gener som uttrykket ikke samsvarer fullt som finnes i frisk hepatocytter er de koding CYP450 proteiner25,26. Flere av disse proteinene har narkotika metabolisme og xenobiotic oval svaret. Dette er viktig når utformingen av en skjerm fordi mange legemidler krever generering av aktive metabolitter, og dette kan bli påvirket i iPSC-avledet hepatocytter. Innsats for å forbedre kvaliteten på hepatocytter blir aktivt forfulgt27. Til tross for advarsler, har flere studier vist at iPSCs avledet fra pasienter med medfødte feil i hepatic metabolismen kan brukes med hell til å generere hepatocyte-lignende celler som speil i patofysiologien av sykdom i kultur9 , 18 , 28 , 29.
For skjermer skal lykkes, er det viktig å sikre at homogen differensiering av hepatocytter fra iPSCs. Når atskillinger i 96-brønnen plater unnlater å gi høy kvalitet hepatocytter, er det vanligvis skyldes enten den dårlige kvaliteten på foreldrenes iPSCs eller kultur for iPSCs under sub-optimale forhold. Pluripotency av iPSCs må nøye opprettholdes av kulturen i et høykvalitets medium med daglige endringer som beskrevet i protokollen 1.2. Tettheten av pluripotent celler i kultur parabol bør overvåkes nøye, fordi hvis cellene blir over confluent de pleier å miste pluripotency og differensiere spontant. Vi finner også at dyrking cellene i fysiologiske Oksygenkonsentrasjoner fremmer pluripotency og er gunstig i noen stadier av differensiering. Men hvis egnet utstyr ikke er tilgjengelig, er det fortsatt mulig å bruke ambient oksygen både kultur pluripotent cellene og indusere differensiering. Vi anbefaler rutinemessig definere pluripotency av lager iPSCs ved å måle uttrykk for flere pluripotency indikatorer inkludert OCT-3/4, NANOG og TRA-1-60 før du utfører omfattende atskillinger uansett oppdrettsforholdene. Vi har også observert at når cellene danner endoderm med høy effektivitet, har de en tendens til å skrallende fra overflaten av platene som cellen ark. Vi har funnet at kort behandle iPSC-avledet endoderm celler med 0,02% EDTA løsning kan bidra til å redusere celle avdeling. Endelig optimal konsentrasjon av celler kreves for effektiv atskillinger kan variere mellom iPSC linjer og kan påvirke celle avdeling. Derfor er det viktig å bestemme empirisk konsentrasjonen av nødvendig for effektiv atskillinger, spesielt når du arbeider med en ny iPSC kultur.
I sammendraget, har vi beskrevet en step-wise differensiering protokoll som genererer hepatocyte som celler fra iPSCs som er kompatible med kjemiske skjermer. Hepatocyte-lignende cellene er produsert som monolayers i 96-brønnen plater, og prosessen er effektiv og reproduserbar. Vi viser muligheten for screening forbindelser for deres evne til å senke nivået av APOB i kultur medium. Differensiering-formatet er kompatibelt med flere analyser inkludert ELISA, qRT PCR og høy innhold bildebehandling. Vi tror at feltet vil finne nyttig for å identifisere potensielle therapeutics tilnærming og farmakologiske identifikasjon av påvirker hepatocyte differensiering og funksjonen i fremtidige anvendelser5,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 og HG006398 til S.A.D). Vi vil gjerne takke Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop og Ran Jing for deres bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
- Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
- DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
- Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
- Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
- Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
- Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
- Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
- Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
- Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
- Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).
