Summary
פרוטוקול המובאת כאן מתאר פלטפורמה לזיהוי מולקולות קטנות לטיפול של מחלת כבד. תיאור שלב אחר שלב מוצגת המפרט איך להבדיל iPSCs לתוך תאים בעלי מאפיינים hepatocyte ב 96-ובכן צלחות, כדי להשתמש בתאים על המסך עבור מולקולות קטנות עם פוטנציאל פעילות טיפולית.
Abstract
היכולת להבחין בתאי גזע pluripotent המושרה אנושי (iPSCs) לתוך תאים, כמו hepatocyte (HLCs) מספק הזדמנויות חדשות ללמוד שגיאות מולדות בחילוף החומרים הכבד. עם זאת, כדי לספק פלטפורמה שתומכת הזיהוי של מולקולות קטנות פוטנציאלי יכול לשמש לטיפול במחלות כבד, ההליך דורש תבנית התרבות תואמת הקרנת אלפי תרכובות. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשתמש בתנאים מוגדרים לגמרי תרבות, אשר מאפשרים את הבידול לשחזור של האדם iPSCs לתאים hepatocyte כמו צלחות תרביות רקמה 96-ובכן. אנו מספקים גם דוגמה לשימוש את הפלטפורמה כדי תרכובות מסך בשל יכולתן להוריד אפוליפופרוטאין B (APOB) המופק נגזר iPSC hepatocytes שנוצר מן המטופל היפרכולסטרולמיה משפחתית. הזמינות של פלטפורמה מתאימה ל גילוי תרופות צריך לאפשר לחוקרים לזהות את הריפוי מחלות המשפיעות על הכבד.
Introduction
הצלחה בזיהוי סמים יכול לשמש למטרה מחלה נדירה מסתמך על התפתחות מבחני שיכול לשמש להקרנה. ההשערה או מסכי קליעה (פרמקולוגיה הפוכה) שימושיות, אך דורשות הבנה מפורטת של הבסיס המולקולרי של המחלה. מסכי פנוטיפי (פרמקולוגיה קלאסית) למנוע את הצורך הבנה מפורטת של משעולים הביוכימי, אך במקום להסתמך על פיתוח מודלים במדויק במראה הפתופיזיולוגיה של המחלה. למרות ההתלהבות עבור גישות קליעה, ניתוחים של ה-FDA אישר הראשון ב- class סמים חושפים כי המסכים פנוטיפי היה הרבה יותר מוצלח1. המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור פלטפורמה עבור תפוקה גבוהה הקרנת זה יכול לשמש כדי לזהות מולקולות קטנות לטיפול של מחלת כבד מטבולית. מספר מודלים במבחנה תוארו כולל hepatocytes העיקרי, הפטומה היא תאים תאים בכבד קדמון2. אולם, רוב המודלים האלה יש מגבלות, יש צורך עבור דגמים חדשים אשר ניתן לסכם במדויק הפתופיזיולוגיה של חילוף החומרים בכבד ליקויים בתרבות. לאחרונה, תאי גזע pluripotent האדם בשילוב עם ג'ין עריכה הציעו הזדמנות לדגמן אפילו הנדירים של מחלות נדירות בתרבות ללא הצורך לחולים גישה ישירות3. בעת השימוש iPSCs החולה הספציפי כפי כלי כדי לגלות מולקולות קטנות לטיפול של מחלות כבד נדירה סביר מבחינה מושגית, יש רק כמה דוחות הממחיש את הכדאיות של גישה זו4. עם זאת, לאחרונה הקמנו פלטפורמה שהיו הנגזרות iPSC hepatocytes בהצלחה לזהות תרופות שניתן יהיה לשנות את ייעודו לטיפול של ליקויים מטבוליזם בכבד5.
פרוטוקול זה מסביר את התהליך של הבחנה אנושית iPSCs לתאים hepatocyte כמו צלחות 96-ובכן ושימוש בהם למסך ספריה של מולקולות קטנות. הוא גם מתאר את הניתוח קצה היפרכולסטרולמיה כדוגמא של מחלת כבד מטבולית. גישה זו צריך להיות שימושי ללמוד את התפקידים ואת היישום של מולקולות קטנות בהקשר של מחלת כבד זיהומיות, מחלות כבד מטבולית, רעילות התרופה ובהפרעות כבד אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. התרבות של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent
-
ציפוי רקומביננטי חלבון כימרי Fc E-קדהרין אנושי (E-cad-Fc) או אחרים מטריצות מתאים לתרבות hPSC 6
- לדלל E-cad-Fc כדי 15 μg/mL עם Dulbecco Phosphate-Buffered מלוחים המכילים סידן ומגנזיום (DPBS (+)).
- מעיל 100-מ מ הבולם מנות תרביות רקמה עם 5 מיליליטר מדולל E-cad-Fc, דגירה-37 הלעפה תרוטרפמט לפחות 1 ה' הסר המצע ולהחליף עם 5 מיליליטר בינונית (למשל, mTeSR1 כאל M-בינוני מעתה ואילך)7.
הערה: המדיום תרבות בשימוש פרוטוקול זה מוכן לאחר שפורסמה בפרוטוקולים7. עם זאת, מספר תכשירים מדיה אחרים שתוארו, או זמינים מסחרית, כי הם כנראה תואם ההליך. - אחזר בקבוקון של cryopreserved iPSCs של חנקן נוזלי. הפשרת-הלעפה תרוטרפמט 37 עד גביש קרח קטן נשאר. בעדינות פיפטה תאים לתוך סטרילי 15-mL חרוט צינור המכיל 4 מ"ל של M-המדיום.
- צנטריפוגה ב g 300 x 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע, בעדינות להשעות מחדש תאים עם 5 מ של המדיום בתוספת 10 מיקרומטר של Y-27632, מעכב סלקטיבי של רו-הקשורים, סליל מפותל המכילה חלבון (רוק).
- להסיר את M-בינוני שלב 1.1.2, ולהעביר 5 מ של תאים מהשלב 1.1.4 ל ההשעיה 100-מ מ E-cad-Fc-מצופה תרביות רקמה מנות.
-
שמירה על iPSCs האדם בתרבות
- ברגע iPSCs מגיע סביב 80% confluency, הסר בינוני תרבות ולשטוף פעם עם סידן, מגנזיום חופשית DPBS (-). האחות של DPBS (-) ומוסיפים כמות מספקת של 0.02% פתרון EDTA לכסות את הלוחות, ולאחר מכן תקופת דגירה של עד 3 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: ב- 80% הנהרות, הצלחת להכיל בסביבות 2 x 107 תאים. חשוב לא לגדול פרא ולהשתלט על התאים, וכדי להבטיח כי התאים שומרים על מורפולוגיה מובחן. Pluripotency של התאים יכול להיקבע על ידי צביעת תאי גזע סמן העכבר ל- 1-60 או שוות ערך8. - ברגע והתאים מתחילים לשחרר, הסר את הפתרון EDTA 0.02%, להציף את המנה עם 10 מ"ל של M-מדיום כדי לשחרר את התאים. הסיוע של הניתוק בין iPSCs על ידי בעדינות pipetting.
הערה: זמן הדגירה הממוצע עבור תאים לנתק בסביבות 3 דקות, אבל זה צריך להיקבע מדעית עבור כל קו iPSC. התאים שאמור להתפרסם בתור בקבוצות קטנות המכילות סביב 5-10 iPSCs לכל אשכול. - העברת 1/10 של התאים על תנאי לכל טריים E-cad-Fc 100 מ מ מצופה ההשעיה מאכל תרביות רקמה המכיל 5 מ של M-המדיום. דגירה התרבויות-37 הלעפה תרוטרפמט מתחת לגיל 4% או2/5% CO2 ושינוי המדיום מדי יום.
הערה: למרות iPSCs באופן שגרתי מתורבתים בתנאים פיסיולוגיים חמצן כדי לקדם את pluripotency, iPSCs ניתן גם לגדל באמצעות חמצן סביבתי.
- ברגע iPSCs מגיע סביב 80% confluency, הסר בינוני תרבות ולשטוף פעם עם סידן, מגנזיום חופשית DPBS (-). האחות של DPBS (-) ומוסיפים כמות מספקת של 0.02% פתרון EDTA לכסות את הלוחות, ולאחר מכן תקופת דגירה של עד 3 דקות בטמפרטורת החדר.
2. הבידול של האדם iPSCs לתאי Hepatocyte כמו צלחות 96-ובכן
הערה: סעיף זה מתאר את הבידול של iPSCs בתבנית התואמת ההקרנה. באמצעות גישה זו, זה אפשרי לגרום iPSCs האנושי כדי להבדיל ויוצרים תאים דמויי hepatocyte ב- 20 ימים. אמנם זה מתאים עבור רוב מבחני, ניתן להרחיב את האורך של תרבות כדי לשפר את הבגרות של התאים.
-
ציפוי תרביות רקמה 96-ובכן צלחות עם מטריקס קרום המרתף מופחת גורם גידול
- הכן את המניה על ידי דילול המטריקס כדי 2 מ"ג/מ"ל עם קרח DMEM/F12 תרביות רקמה בבסיס, אמצעי סטרילי. לחלק את המטריצה 250 μL aliquots ולאחסן ב-80 הלעפה תרוטרפמט עד הנדרש. מקררים 10 מ"ל של DMEM/F12 בקרח במשך 30 דקות אחזר, μL aliquot של מניות מטריקס 2 מ"ג/מ"ל 250 ו הפשרה על קרח.
- משלבים את המטריקס עם 10 מ"ל של DMEM קר/F12 על ידי ערבוב בעדינות בעזרת פיפטה צוננת מראש כדי להפוך הריכוז הסופי של 0.05 מ"ג/מ"ל.
- העברת μL 100 של מטריקס מדולל כל טוב של צלחת תרביות רקמה 96-ובכן. דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2 לפחות 1 ה למחוק את המטריקס, להחליף μL 50 מ'-בינוני לכל טוב. לאחסן ב 37 מעלות צלזיוס, 4% או2/5% CO2 עד שהוא נדרש.
-
צלחת תאים עבור בידול
- תרבות של iPSCs על צלחות 100-מ מ עד תאי זרימה 80%. ודא כי הצלחת מכיל 2 x 107 תאים. לקבוע את מספרי הטלפון הנייד על-ידי תאים זרימה cytometer או hemocytometer.
הערה: עם ניסיון, האיכות של התאים iPSCs יכולה להישפט על ידי מיקרוסקופ; עם זאת, קרוב 98% של התאים צריך לבטא סמנים pluripotency כמו epitope טרה-1-60 כאשר נמדדת FACS או immunostaining. חשוב כי התאים נשארים החלוקה באופן פעיל, הם לא מגודלת. - כדי לקצור את iPSCs של כל צלחת 100-מ מ, תשאף המדיום תרבות ולשטוף עם 5 מ של DPBS (-). החלף את השטיפה 3 מ"ל של פתרון ניתוק התא (למשל, accutase), תקופת דגירה של בערך 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 4% או2/5% CO2.
הערה: חשוב לעקוב אחרי הניתוק של תאים באמצעות מיקרוסקופ. לא מעל תקציר עם accutase. המטרה היא לשחרר את התאים כמו בקבוצות קטנות עם טיפול מינימלי. - ברגע התאים נתחיל לנתק, הקציר על-ידי הוספת 7 מ של M-המדיום. פיפטה מספר פעמים מביצועם המושבות תא לתוך בקבוצות קטנות של סביב 3-6 תאים (איור 1 א').
- לאסוף את iPSCs לתוך צנטריפוגה סטרילי 15-mL צינור צנטריפוגה ב g 300 x במשך 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע מחדש להשעות בגדר תא ב 5 מ ל ז-בינוני.
- פזר באופן שווה את התאים על גבי לוחות מצופים מטריצה 96-ובכן מאת pipetting 50 μL של תאים ההשעיה לבאר כל. כדי להגדיר את כל צלחת 96-ובכן, להשתמש בצלחת 100-מ מ אחד של iPSCs עם תאים על 80% confluency המכיל בסביבות 5 x 106 תאים כדי להתקין את הבידול. השתמש פיפטה רב-ערוצי כדי לזרז תהליך זה. התרבות התאים בן לילה-הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2.
הערה: חשוב כי מספר שווה של תאים נצבר בכל טוב על מנת להבטיח differentiations לשחזור.
- תרבות של iPSCs על צלחות 100-מ מ עד תאי זרימה 80%. ודא כי הצלחת מכיל 2 x 107 תאים. לקבוע את מספרי הטלפון הנייד על-ידי תאים זרימה cytometer או hemocytometer.
-
זירוז התמיינות של תאים
- לבחון את הצלחות 96-ובכן על ידי מיקרוסקופ כדי להבטיח תאים לפחות 70% מפני השטח של כל אדם טוב. אם הכיסוי הוא פחות מ- 70%, להחליף את המדיום בינונית טרייה, תקופת דגירה של h 24 נוספים הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2.
הערה: המקננת תאים עבור יותר מ- 48 שעות לאחר ציפוי ללא גרימת בדרך כלל התמיינות מפחית את היעילות של בידול. בידול תתרחש גם באמצעות חמצן סביבתי, למרות היעילות עשוי להיות מושפע. - עבור 1 יום 2 יום של בידול, להחליף את המדיום תרבות RPMI בתוספת 2% B27 (ללא אינסולין), 100 ננוגרם למ"ל Activin A, 10 ננוגרם למ"ל BMP4 ו- 20 ng/mL FGF2. להוסיף 100 μL בינוני לכל טוב, דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, אמביינט O2/5% CO2 עם שינוי בינונית מדי יום במשך יומיים.
הערה: התמודדות עם מספר גדול של צלחות 96-ובכן מחייבות השימוש של פיפטה בסיוע או רובוט. פיפטות 12 ערוצים וערוץ 96 הינם אידיאליים עבור שינוי בינונית מדי יום. - יום 3-יום 5 של בידול, החלף המדיום תרבות עם RPMI בתוספת 2% B27 (ללא אינסולין) ו- 100 ננוגרם למ"ל Activin א התרבות תאים בחלק הלעפה תרוטרפמט 37, אמביינט O2/5% CO2 עם שינוי יומי בינונית למשך 3 ימים.
- ביום בידול 5, לפני החלפת טריים תרבות בינונית, לטפל בכל טוב עם 100 μL 0.02% EDTA פתרון עבור 30 s, אז הסרה והחלפה של טרי תרבות בינונית.
הערה: אם בידול האנדודרם יעיל, טפט להבדיל תאים הוא נוטה פילינג מהצלחת. טיפול קצר עם פתרון EDTA 0.02% מסייע להקל על ניתוק התא. טיפול זה לא משפיע על בידול hepatocytes. - עבור בידול בין 6 ימים ל- 10, להחליף את תרבות המדיום עם RPMI / 2% B27 (עם אינסולין) בתוספת 20 ng/mL BMP4 ו 10 ננוגרם למ"ל FGF2, דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2 במשך 5 ימים עם שינוי בינונית מדי יום. בשלב זה גורם לתאים להתמיין ובתאים הכבד.
- עבור בידול בין הימים 11 עד 15, החלף המדיום תרבות עם RPMI / 2% B27 (עם אינסולין) בתוספת 20 ng/mL דבורה שחר. דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2 במשך 5 ימים עם שינוי בינונית מדי יום.
- עבור בידול בין ימים 16 ל-20, החלף המדיום תרבות hepatocyte תא תרבות בינוני (HCM) בתוספת 20 ng/mL של Oncostatin-M (OSM). דגירה התאים-הלעפה תרוטרפמט 37, אמביינט O2/5% CO2 בשינוי בינונית מדי יום במשך 5 ימים.
הערה: הפארמצבטית אבחנה בין בארות בודדים ביעילות יכול להיקבע על ידי מדידה לרמת אלבומין, AFP או APOB ומופרש אל המדיום מאת אליסה (ראה 3.2).
- לבחון את הצלחות 96-ובכן על ידי מיקרוסקופ כדי להבטיח תאים לפחות 70% מפני השטח של כל אדם טוב. אם הכיסוי הוא פחות מ- 70%, להחליף את המדיום בינונית טרייה, תקופת דגירה של h 24 נוספים הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2.
3. ההקרנה מולקולה קטנה
הערה: להלן תיאור ההליך המשמש לזיהוי תרכובות יכול לשמש כדי להוריד את רמת APOB במדיום של תאים hepatocyte דמוי נגזר היפרכולסטרולמיה משפחתית iPSCs. תיאור של הדגם והשימוש הזיהוי של תרופות להורדת כולסטרול שתיארנו ב פירוט בעבר5,9. בדוגמה הנוכחית, הוקרנו תרכובות 1,000 מתוך ספריית אוסף במתחם דרום קרוליינה (SC3). כל המתחם נבחנה על ריכוז של 2 μg/mL.
-
טיפול iPSC - נגזר hepatocytes עם מולקולות קטנות
- לדלל הספרייה מתחם ראשיים לייצר הצלחות של מניות לעבוד עם תרכובות-ריכוז של 20 μg/mL 2% דימתיל סולפוקסיד וחנות ב-20 הלעפה תרוטרפמט.
- להכין מספיק צלחות 96-ובכן נגזר iPSC hepatocytes כדי לאפשר לכל מתחם להיבדק.
הערה: מספר תרכובות שיוקרנו יכתיב את מספר הצלחות 96-ובכן הנדרשים. באופן כללי, סינגל טוב צריכים להיות מוכנים כל בארות מורכבים, בתוספת נוספים עבור כל דגימות הבקרה. הבארות החיצוני ביותר של הצלחת הם נמנעו בדרך כלל כדי לצמצם את האפשרות של אפקטים קצה יכולים להשחית פרשנות. ניתן לזהות פגיעות בשיטת ניקוד-z ללא הצורך להשתמש משכפל. אם משכפל כלולים, זה מתאים יותר להשתמש במבחן t. - בסיום בידול (יום 20, ראה 2.3.7), להחליף את המדיום תרבות μL 100 של HCM טריבתוספת 20 ng/mL של Oncostatin-M. דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2 עבור בדיוק 24 ח' לאחזר המדיום תרבות לתוך צלחת 96-ובכן טריים בחנות ב-20 הלעפה תרוטרפמט. להשתמש דגימה זו כדי לחשב את רמת APOB במדיום לפני התוספת של סמים.
- הוסף μL 90 של HCM טרי בתוספת 20 ng/mL של Oncostatin-M כל טוב. להוסיף 10 μL של כל המתחם מן המלאי לעבוד לאחר ערבוב על-ידי pipetting. להוסיף דימתיל סולפוקסיד 0.2% כדי לשלוט בארות כדי להתאים את הריכוז הסופי הדגימות שטופלו ואת דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, אמביינט O2/5% CO2 עבור בדיוק 24 ה לאסוף המדיום תרבות ולאחסן ב-20 הלעפה תרוטרפמט. השתמש דגימה זו כדי לקבוע את מידת APOB לאחר הטיפול עם תרכובות.
- אופציונלי - ניתן לעבד את התאים הנותרים עבור immunostaining, תא הכדאיות או ניתוחים של רמות ה-mRNA באמצעות גישות סטנדרטי.
הערה: מסך זה נועד לזהות תרופות הייתה השפעה מהירה על APOB רמות. עם זאת, בהתאם המודל של המחלות, מבחני במורד הזרם, או מנגנון הפעולה של התרופה, זה עשוי להיות מועיל להתייחס המדגם במשך מספר ימים.
-
לקבוע רמות APOB מאת אליסה
- לקבוע אפוליפופרוטאין B (APOB) ריכוז של שתי התרופות שלאחר קדם, דגימות שטופלו באמצעות ערכת פיתוח אנושי APOB אליסה בעקבות הפרוטוקולים של היצרן.
-
הכנת את הפתרונות הבאים
- מאגר לשטוף, המורכב 0.05% 20 Tween ב- PBS, pH 7.4. חנות-הלעפה תרוטרפמט 4 עד השימוש.
- מאגר דגירה, מורכב של 0.05% Tween 20 ו- 0.1% שור אלבומין (BSA) ב- PBS, pH 7.4. חנות-הלעפה תרוטרפמט 4 עד השימוש.
- להכין נוגדן APOB (mAB 20/17) על ידי דילול עד 2 µg/מ"ל ב- PBS, pH 7.4. להוסיף 100 μL של הנוגדן מדולל לכל טוב, דגירה-הלעפה תרוטרפמט 4 בן לילה.
- להסיר את הנוגדן הלוחות assay ולשטוף היטב פעמיים עם μL 200 ל- PBS, pH 7.4.
- להוסיף 200 μL/טוב של 0.05% Tween 20, 0.1% שור אלבומין (BSA) ב- PBS, pH 7.4 דגירה על פלטפורמה חזק לשעה בטמפרטורת החדר.
- להכין מעגל מתומן רגיל באמצעות BSA Tween 20 ו- 0.1% 0.05% ב- PBS, pH 7.4 עם ריכוזי APOB הבאים: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ננוגרם למ"ל, 150 ng/mL, ננוגרם למ"ל 125, 100 ננוגרם למ"ל, 75 ng/mL, ו 50 ng/mL.
- לדלל את הבדיקה דגימות 1:4 עם BSA Tween 20 ו- 0.1% 0.05% ב- PBS, pH 7.4.
- לאחר h 1 של חסימת עם מאגר דגירה, לבטל את המאגר, לשטוף צלחות assay חמש פעמים עם 200 μL של 0.05% 20 Tween ב- PBS, pH 7.4.
- לחלוטין להסיר כל מאגר כביסה שיורית, להעביר 90 μL של הדגימות מדולל ותקנים APOB הלוחות וזמינותו. דגירה בטמפרטורת החדר על מטרף לשעה.
- למחוק את הדגימה. ולשטוף עם 200 μL 0.05% 20 Tween ב- PBS, pH 7.4 לכל טוב. חזור שוטף סך של 5 פעמים. הוסף μL 100 לכל טוב של LDL mAB 11-ביוטין 1:1,000 מדולל ב- BSA Tween 20 ו- 0.1% 0.05% ב- PBS, pH 7.4. דגירה בטמפרטורת החדר על פלטפורמה חזק עבור 1 h.
- למחוק הכימית ולשטוף עם μL 200 לאדם טוב כביסה מאגר 5 פעמים. להוסיף μL 100 לכל טוב של נוגדן Streptavidin-HRP (1:1, 000 דילול באמצעות מאגר הדגירה), ואז דגירה בטמפרטורת החדר על פלטפורמה חזק עבור 1 h.
- למחוק הכימית ולשטוף עם 200 μL 0.05% 20 Tween ב- PBS, pH 7.4 לכל טוב. חזור שוטף סך של 5 פעמים. לחלוטין להסיר את המאגר כביסה שיורית הלוחות assay, להוסיף μL 100 לכל טוב של Tetramethylbenzidin (שוייץ) המצע פתרון, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 8 דקות.
- מבלי להסיר את המצע שוייץ, להוסיף ישירות μL 100 לכל טוב של להפסיק פתרון (1N HCl).
- לקבוע את ספיגת ב 450 nm שימוש בקורא צלחת.
- עיקול רגיל ניתן ליצור, באמצעות שיטת ארבע פרמטר רגרסיה לוגיסטית, ואז להשתמש כדי להגדיר את ריכוז APOB כל מדגם10.
- לבחון את התרופה קדם: היחס בין סמים שלאחר APOB בכל מדגם לזהות תרכובות עם פוטנציאל להורדת APOB רמות במדיום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דור של hepatocyte - כמו תאים: איור 1 מתאר את פרק הזמן של השינויים המתרחשים במהלך הבידול של iPSCs האנושי לתאים, כמו hepatocyte. התרבות של iPSCs על ה-Cad-Fc מספק כ- 2 מ מ קוטר מושבות המבטאים את סמן pluripotent OCT4 (איור 1 א'-ב'). המורפולוגיה של תאי צמח על מטריצה של E-קדהרין יהיה שונה במקצת לאלה תרבותי על משטחים אחרים. הם נוטים להיות בעלי מורפולוגיה שעברו שיטוח של גדול cytoplasmic בשטח (איור 1 א'). אמנם גזע pluripotent האנושי יכול להיות תרבותי ביעילות על מספר מטריצות שונות11, התרבות של iPSCs על מטריצה E-קדהרין הוא האמין להגדלת ההומוגניות של אוכלוסיית תאים pluripotent ומאפשר ללא אנזים מניפולציה של התאים במהלך המעבר12. עם זאת, מספר מטריצות אלטרנטיבי, קרום המרתף מטריקס כולל, laminins, vitronectin העכבר מתחלקים fibroblasts (MEF), יכול לשמש גם כדי לשמור על iPSCs האנושי, כל צריך להיות תואם הנוהל המתואר13. בכל המקרים, ניתן לאשר את pluripotency תא Tra-1-60 או שוות ערך8.
ליזום את הבידול, iPSCs צריך להיות נאספים בקבוצות קטנות (איור 1 א'). בתחילת הבידול, התאים מצופה אמור לכסות כ- 80% של פני השטח של הלוח. לאחר 5 ימי טיפול עם גורמי גדילה, התאים אקספרס חלבונים כאופייני הבאות לידי ביטוי האנדודרם סופית כגון SOX17 ו- FOXA2 (איור 1B). בשלב זה, מעל 90% של התאים בדרך כלל מבטאים את ההתחייבויות האלו. לאחר 5 ימים של בידול, ממירה האנדודרם גורל הכבד, בנוסף FOXA2, התאים אקספרס HNF4a, אשר ניתן לזהות תוצרי הלמידה תהליך התמיינות (איור 1B). של התאים לאמץ גורל הכבד, הם צריכים לכסות את המשטח של הצלחת כמו טפט. לאחר תוספת של דבורה שחר, והתאים מתחילים לבטא חלבונים המצויים hepatocytes בעובר כולל AFP (איור 1B). יכול להיות שנצפו טיפות השומנים בתוך הציטופלסמה של התאים. בסיום של בידול, התאים לאמץ מורפולוגיה cuboidal בעלי גרעין המכיל nucleoli הבולטים של הציטופלסמה גדול עם מספר טיפות השומנים. תת-קבוצה של התאים, כמו hepatocyte יהיה רב nucleated. רוב התאים מבטאים את רפרטואר נרחב של חלבונים hepatocyte כולל אלבומין (איור 1B)14.
מסך תפוקה גבוהה יעיל באמצעות היפרכולסטרולמיה כמודל למחלות: היפרכולסטרולמיה משקף ריכוזי מופרז צפיפות נמוכה-כולסטרול ליפופרוטאין (LDL-C) בהסרום. היפרכולסטרולמיה משפחתית (FH), הרמה מוגברת של סרום LDL-C הוא בעיקר לשיפור מוטציות בגן הקולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDLR) המעביר את ספיגת של LDL-C לאישור על ידי hepatocytes. בעבר תארנו את הדור של iPSCs מחולה עם היפרכולסטרולמיה משפחתית homozygous ואת השימוש בהם על מנת לייצר hepatocytes זה שיקוף של המטופל מחלת כבד תרבות9. הוכח כי תאים אלה יכול לשמש בהצלחה כפלטפורמה לגילוי סמים. כאשר ספרייה של סמים ~ 2,500 הוקרן, התברר כי גליקוסיד הייתה יכולת לא צפויה להוריד LDL-C בנגזר iPSC hepatocytes, hepatocytes אנושי ראשוני, וב -עכברים עם humanized כבדי. יתר על כן, על בדיקה לחולה הרפואיים, מצאנו על רמת הכולסטרול רמות נפל בחולים אשר נרשמו עם גליקוזיד הלב לטיפול של מחלות לב. מחקרים אלה אישר כי נגזר iPSC hepatocytes יכול לשמש בהצלחה במסכים כדי לזהות הרפוי.
כדי לספק פלטפורמה התואמת ההקרנה, זה חשוב כי differentiations לשחזור וכי וריאציה טוב עד טוב הוא ממוזער. איור 2 מציג את התוצאות של immunostaining כל טוב של צלחת 96-ובכן לזהות HNF4a, אלבומין ביום 20 של בידול. כפי שניתן לראות באיור, דומה להתפלגות החלבונים האלה hepatocyte על פני כל בארות '.
המרכיב המרכזי חלבון של LDL-C הוא APOB. כאן השתמשנו iPSCs למסך עבור APOB הנמכת תרכובות לספק דוגמה לשימוש hepatocytes נגזר iPSC עבור מולקולה קטנה ההקרנה (איור 3 א). APOB ניתן למדוד בקלות על ידי אליסה בפתרון. מאז אליסה ניתן לבצע מספר רב של דוגמאות, זה יכול לשמש כבסיס עבור מסך. ההתאמה של כל assay להקרנה תפוקה גבוהה נקבעת בצורה הטובה ביותר באמצעות מדידה בשם הגורם Z (או Z')15. פרמטר סטטיסטי מחשבת את האפקטיביות של assay להבחין בין דגימות הבקרה חיוביים ושליליים. Assay עם גורם Z > 0.5 נחשב תואם עם מסך15. כפי שניתן לראות ב- 3B איור, ז ' של וזמינותו APOB = 0.73, שמאשרת את התאמת באמצעות הפלטפורמה לגילוי סמים.
זיהוי של תרכובות זה יש את היכולת להוריד את רמות APOB במדיום תרבות של iPSC - נגזר hepatocytes: כדי לקבוע אם הפלטפורמה יכול לשמש כדי לזהות תרכובות הרומן שמשפיעים על רמות APOB, הוקרנו מולקולות קטנות 1,000 מ אוסף במתחם דרום קרוליינה (SC3) נציג להגדיר לייט (RSL). RSL נוצר על ידי מרכז דרום קרוליינה מסיקה לגילוי טיפולית, הכולל חומרים מגוונים מבחינה מבנית, לשקף את ספריית האב.
הסם שלאחר: סמים טרום יחס של APOB נקבע עבור כל המתחם (איור 3C), זיהוי של כניסות שהושג ע י z-ציון ניתוח (איור 3D)16. במקרה זה, נחשבו מולקולות קטנות מופחתת APOB ≤-2.0 ניקוד-z כמו להיטים פוטנציאלים. בעת הקרנת 1,000 מולקולות קטנות, מספר להיטים פוטנציאלים עם z-ציון של ≤-2.0 הוא בדרך כלל יחסית לניהול. עם זאת, בעת עריכת מסך גדול יותר, אנחנו סומכים על ציון יותר שמרני של ≤-3.0, בהתבסס על הכלל 3-סיגמא, כדי להגביר את האמון מטרות אפשריות. בדוגמה זו, זיהינו להיטים פוטנציאלים 24 עם יחס APOB זה מגוונות של 0.86 ולגובה כדי 0.44 (איור 4A). Assay המשני בוצעה הדוגמאות quadruplicate (n = 4 משכפל ביולוגי) כדי לא לכלול תרכובות הייתה השפעה שלילית על יכולת הקיום תא וכדי לקבוע אילו תרכובות reproducibly תוריד APOB במדיום. של תרכובות המועמד 24 המקורי, ארבעה נמצאו לשחזור (p ≤0.05) (איור 4B-C). על מחקר נוסף, 2 של תרכובות אלו נמצאו באופן שלילי משפיע על התא הכדאיות, רומז כי ההפחתה שנצפו ב- APOB היה סביר להיות תוצאה של איבוד תאים. שתי תרכובות הנותרים ייחשב מועמדים טובים מחקרי מעקב.
איור 1 : Step-wise הבידול הכבד של האדם iPSCs. (א) המורפולוגיה של מושבות iPSC מיד לפני הקציר (החלונית הימנית), iPSCs לאחר איסוף תאים עבור בידול (לוח נכון) - לאחר טיפול accutase, צריכה להיות חלופה מועדפת התאים אל תוך 3-6 תאים/אשכול. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (B) הטבלה מראה תרבות. התנאים בכל שלב של בידול (העליון). Immunostaining (לוחות התחתון) בוצע לזהות ביטוי סמן בכל שלב של בידול. מראות OCT4, דאפי צבעונית גרעינים ב- iPSCs, SOX17 ו- FOXA2 בהאנדודרם סופית, HNF4a ו FOXA2 ב ובתאים הכבד, HNF4a ו- AFP בתאים דמויי hepatocyte ילדותי, HNF4a, אלבומין ב בוגר יחסית כמו hepatocyte תאים. גודל ברים = 100 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : הומוגני הבידול הכבד של האדם iPSCs ב 96-ובכן צלחות. Immunostaining בוצעה כל טוב בודדים של צלחת 96-ובכן המכיל hepatocytes נגזר iPSC ביום 20 של בידול כדי לזהות (א) אלבומין, (B) HNF4a. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : הקרנה מולקולה קטנה באמצעות hepatocytes נגזר iPSC אנושי. (א) סקירה סכמטי של הגישה המשמש לזיהוי תרכובות יכול להפחית את הרמות של ABOB המדיום של hepatocytes iPSC נגזר. (B) הגרף מראה theresults של וזמינותו אליסה לזהות את רמת APOB המדיום של בארות 87 (n = 87) של hepatocytes נגזר iPSC (כחול) ו/או מובחן iPSCs (כתום). נתונים אלה שימשו לחישוב Z-פקטור (Z' = 0.73). (ג) גרף המציג את התרופה שלאחר: סמים טרום יחסי של ריכוז APOB במדיום תרבות של hepatocytes נגזר iPSC שטופלו במשך 24 שעות ביממה עם תרכובות 998 מערכת RSL3 SC. (ד) גרף המציג את z-עשרות רבות של הנתונים המוצגים ב (ג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : אימות של כניסות ראשיות. (א) טבלה המציגה תרכובות זיהו במסך הראשי כמו היכולת להפחית APOB. (ב, ג) בר גרפים המראים את ההשפעה של תרכובות על התרופה שלאחר: סמים טרום APOB ריכוז יחס (B) תא הכדאיות (ג) בנגזר iPSC hepatocytes מטופלים עם תרכובות בניתוח להמשך טיפול. קווי שגיאה לשקף ± SEM (n = 4 משכפל ביולוגי); * p ≤0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היעד המבוסס על גילוי תרופות, שבה מולקולות קטנות מזוהים המשפיעים על הפעילות של חלבון ספציפי, הייתה המוקד של מאמצים רבים ההקרנה הקיים. אף-על-פי גישה זו סיפקה תרופות רבות, מסכי בהתבסס על היפוך של פנוטיפ, פרמקולוגיה קלאסית, היה מוצלח יותר בזיהוי הראשון ב- class שאמורות להיות אפקטיבי קלינית1. חיסרון גילוי תרופות פנוטיפי הוא זה מסתמך על הזמינות של דגמים המתאימים למחלות. זה יכול להיות אתגר כאשר התא מודלים של המחלה אינם זמינים, או כאשר מיני בעלי חיים משותפים של מחקר להיכשל כדי לסכם את הסימפטומים הקליניים. עם זאת, היכולת להפיק iPSCs של תאים סומטיים של המטופל סיפק הזדמנויות חדשות למחלה האדם דגם תרבות3. עבור כמה מחלות, כגון מחלות גנטיות נדירות, חולים יכולים להיות כמה מספרים, שקשה לגשת והסכמה. עם זאת, עם כניסתו של הגנום הנדסה, זה פשוטה יחסית להציג מוטציות סיבתי לתוך הגנום iPSC, כך שניתן ליצור מודל אפילו הנדירים של מחלות נדירות.
לאחר iPSCs ביד, זה הכרחי לייצר סוג של תאים מתאים שבו מניפסט הסימפטומים של המחלה. לדוגמה, המשפיעה על תפקוד עצבי עשוי לדרוש את הדור של נוירונים או עכשיו, דונלד17, ואילו אלה המשפיעים על הכבד עשוי להזדקק hepatocytes9,18 או תאים אפיתל בכיס המרה עבור לומדים19, 20 , 21. דרישה זו מציגה מספר אזהרות כאשר שוקלים את השימוש iPSCs לגילוי סמים. ראשית, חשוב להבין את הבסיס הסלולר של המחלה. זה יכול להיות מאתגר, במיוחד כאשר תאים לאמץ מאפיינים בהתבסס על המיקום או הסביבה. זה יכול להיות נכון hepatocytes שיש הבדלים ביטוי גנים פרופילים, פונקציה אנזימטיות תלויות למיקומן lobule בכבד. שנית, עבודה עם תאים בבידוד יכול למנוע את חקר מחלות משקפות הפרעה במבנה רקמות כגון שחמת, תקשורת כגון מחלה התוקפת, או כאלה מושפעים דלקת כגון דלקתיות מחלת מעיים.
במחקר מחלת כבד, תיארו מספר קבוצות מחקר פרוטוקולים לייצר תאים דמויי hepatocyte iPSCs13,22,23,24,25. בעוד רוב פרוטוקולים אלה הם יעילים, המגבלה של הטכניקה היא כי תאים לא מלא לסכם את תפקוד hepatocytes טריים. פירוש זה חשוב לקבוע התאים שנוצר iPSCs להציג את הפונקציות הנחוצות להעריך את ההשפעה של מוטציה נתון. בין הגנים הביטוי של מי שאינם תואמים באופן מלא למצוא hepatocytes טריים הם אלה קידוד CYP450 חלבונים25,26. מספר החלבונים האלה יש תפקידי סמים חילוף החומרים ואת התגובה xenobiotic. זה חשוב כאשר בוחנים את העיצוב של המסך כי תרופות רבות דורשות את הדור של מטבוליטים פעילים, זה יכול להיות מושפע hepatocytes iPSC נגזר. המאמצים כדי לשפר את האיכות של hepatocytes מתנהגת באופן פעיל ומתפרשים על פני שעות27. למרות ההליכים, מספר מחקרים הראו כי iPSCs נגזר חולים עם שגיאות מולדות בחילוף החומרים הכבד יכול לשמש בהצלחה ליצירת תאים דמויי hepatocyte במראה הפתופיזיולוגיה של המחלה תרבות9 , 18 , 28 , 29.
עבור מסכי להצליח, חשוב להבטיח את הבידול הומוגנית של hepatocytes מ iPSCs. כאשר differentiations ב 96-ובכן צלחות להיכשל תשואות hepatocytes באיכות גבוהה, זה בדרך כלל בשל או איכות ירודה של iPSCs הורים או תרבות iPSCs בתנאים תת אופטימלית. Pluripotency של iPSCs חייב להישמר בקפידה על-ידי תרבות במדיום באיכות גבוהה עם משתנה מדי יום כפי שמתואר פרוטוקול 1.2. הצפיפות של תאים pluripotent בצלחת תרבות צריך לפקח בקפידה, כי אם התאים להיות מעל confluent הם נוטים לאבד pluripotency, להבדיל באופן ספונטני. אנחנו גם מוצאים כי culturing תאי ריכוז חמצן פיזיולוגיים מקדמת pluripotency, מועיל בשלבים מסוימים של בידול. עם זאת, אם הציוד המתאים אינה זמינה, זה עדיין ניתן להשתמש בחמצן אמביינט התרבות של תאים pluripotent והן זירוז בידול. אנו מציעים באופן שגרתי מגדיר את pluripotency של iPSCs המניות על ידי מדידת ביטוי של מספר סמני pluripotency כולל OCT-3/4, NANOG ו- TRA-1-60 לפני ביצוע differentiations נרחבת ללא קשר לתרבות תנאים. גם הבחנו כאשר התאים יוצרים האנדודרם יעילות גבוהה, שיש להם נטייה קלפו מפני השטח של הלוחות כגליונות התא. . מצאנו את זה בקצרה להתייחס האנדודרם נגזר iPSC תאים עם פתרון EDTA 0.02% יכול לסייע בהפחתת ניתוק התא. לבסוף ריכוז אופטימלי של התאים הדרושים עבור differentiations יעיל יכול להיות שונה בין שורות iPSC, יכול להשפיע על ניתוק התא. מסיבה זו, חשוב לקבוע ריכוז התאים הדרושים differentiations יעיל, במיוחד כשאתה עובד עם תרבות חדשה iPSC מדעית.
לסיכום, תארנו פרוטוקול בידול הדרגתיים שיוצר hepatocyte כמו תאים של iPSCs שעולות בקנה אחד עם מסכי כימי. התאים hepatocyte דמוי מיוצרים כמו monolayers ב 96-ובכן צלחות, התהליך יעיל, לשחזור. נדגים את הכדאיות של הקרנת תרכובות ביכולתם להפחית את רמות APOB במדיום תרבות. הפורמט בידול הוא תואם עם מבחני מרובים כולל אליסה, לרביעיית-PCR ההדמיה תוכן גבוהה. אנו מאמינים כי השדה ימצא את הגישה שימושית לזיהוי פוטנציאל therapeutics ו לצורך זיהוי תרופתי משפיע על התמיינות hepatocyte ותפקוד ב-5,יישומים עתידיים30מסלולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (DK55743, DK087377, DK102716 ו- HG006398 כדי S.A.D). ברצוננו להודות ד ר Behshad Pournasr, ד ר ג'יימס Heslop, רן ג'ינג על תרומתם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
- Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
- DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
- Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
- Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
- Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
- Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
- Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
- Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
- Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
- Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).
