Summary
ここで提示されたプロトコルでは、肝疾患の治療のための小さい分子を識別するためのプラットフォームについて説明します。ステップバイ ステップの説明は、96 ウェル プレートで肝細胞特性を持つ細胞に Ips を区別するために、潜在的な治療上の活動と小分子のスクリーニング、セルを使用する方法の詳細が表示されます。
Abstract
ひと誘導多能性幹細胞 (Ips) を分化肝細胞様細胞 (HLCs) 能力は、先天性肝代謝を研究する新たな機会を提供します。ただし、肝疾患を治療するためにされる可能性がありますすることができます小さな分子の同定をサポートするプラットフォームを提供するためにプロシージャは何千もの化合物をスクリーニングと互換性のある文化形式を必要です。ここでは、完全に定義された培養条件、96-well ティッシュの培養皿の肝細胞様細胞に人間 Ips の再現性のある差別化をできるを使用してプロトコルについて述べる.家族性高コレステロール血症患者から生成された iPSC 由来肝細胞由来アポリポ蛋白 B (APOB) を下げるため画面化合物の機能のためにプラットフォームを使用する例もあります。創と互換性のあるプラットフォームの可用性は、肝臓に影響を与える病気の治療薬を識別するために研究者をようにします。
Introduction
まれな疾患を対象とする使用ことができます薬を識別する成功はスクリーニングに使用することができるアッセイの開発に依存しています。仮説またはターゲット ベースの画面 (逆薬理学) は有用だが、疾患の分子基盤の解明を必要とします。表現型画面 (古典的な薬理学) 生化学的経路の詳細な理解の必要性を避けるが、疾患の病態生理を正確にミラー化モデルの開発に頼る。ターゲット ・ ベースのアプローチのための熱意にもかかわらずは、FDA のファーストクラスで医薬品の分析は、表現型の画面がはるかに成功した1をされている明らかにします。このメソッドの全体的な目標は、高スループット スクリーニングのためのプラットフォームを確立する代謝性肝疾患の治療のための小さい分子を識別するために使用することができますです。肝, 肝癌細胞と肝前駆細胞2を含むいくつかの生体外モデルを記載されています。しかし、これらのモデルのほとんどは、制限があります、文化肝代謝不足の病態を要約することができます正確に新しいモデルの必要性があります。最近では、ひと多能性幹細胞遺伝子編集と組み合わせるモデルもアクセス患者することがなく文化のまれな病気のたぐいまれな機会を提供している直接3。患者特有の Ips の使用は、まれな肝疾患の治療のための小分子を発見するツールは概念的には合理的なアプローチ4の可能性を示す報告は少ないがあります。ただし、iPSC 由来の肝細胞を正常に肝代謝5欠陥の治療のための用途に使用することができます薬を識別するために使用するプラットフォームを開設します。
このプロトコルは 96-well 版の肝細胞様細胞にヒトの Ips を区別し、低分子化合物のライブラリを選別するに使用するプロセスを説明します。代謝性肝疾患の例としてエンドポイントによる高コレステロール血症についても説明します。このアプローチは、役割と伝染性肝疾患、代謝性肝疾患、薬物の毒性、その他の肝疾患のコンテキストで小さな分子の応用に関する研究に役立つはずです。
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Protocol
1. 人間の文化誘導多能性幹細胞
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組換えひと E カドヘリン Fc 融合タンパク質 (E-cad-Fc) または他の行列の hPSC 文化に適したコーティング6
- ダルベッコ Phosphate-Buffered 食塩カルシウムとマグネシウム (DPBS (+)) が含まれていると 15 μ g/mL に E-cad-Fc を希釈します。
- 5 ml の希釈 E-cad-Fc の 100 mm サスペンション ティッシュの培養皿をコートし、少なくとも 1 h. 削除基板の 37 ° C で孵化させなさい媒体 (例えば、今後 M 媒体と呼ばれる mTeSR1) の 5 mL と交換7。
注:このプロトコルで使われる培養培地は、次の公開プロトコル7を用意しています。ただし、いくつかの他のメディアの準備が記載されている、または利用できる商業的に、プロシージャ可能性があります互換性のあります。 - 液体窒素による凍結 Ips のバイアルを取得します。小さな氷の結晶が残っているまで、37 ° C で解凍します。優しく M 培地 4 mL を含む滅菌 15 mL の円錐管に細胞をピペットします。
- 5 分は上澄みを除去し、やさしく再中断 5 ml の培、Rho 関連、コイルド コイル含む蛋白質キナーゼ (ロック) の選択的阻害剤の Y-27632 の 10 μ m の細胞のために、300 × g で遠心分離機します。
- 1.1.2 のステップから M 媒体を取り外し、100 mm サスペンションの電子 cad Fc コーティング ティッシュの培養皿にステップ 1.1.4 からセルの 5 mL。
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人間 Ips の文化を維持します。
- Ips に達すれば周り 80% の confluency 培養培地を削除し、カルシウムで 1 回洗浄し、マグネシウム無料 DPBS (-)。DPBS (-) を吸引し、プレートをカバーし、室温で最大 3 分間インキュベート 0.02 %edta 溶液の十分な量を追加します。
注:80% の合流でプレートは約 2 × 107セルを含める必要があります。セルにはびこるにない細胞が未分化の形態を保持できるようにすることが重要です。細胞の多能性幹細胞のマーカー トラ-1-60 または同等の8との汚損によって決定できます。 - セルを解放し始める、0.02 %edta 溶液を削除、セルを解放する M 培地 10 mL で皿の洪水します。軽くピペッティングして Ips の分遣隊を支援します。
注:デタッチするセルの平均培養時間はおよそ 3 分、これは iPSC 行ごとに、経験的に決定する必要があります。セルの周りを含む小さなクラスターとして発表されるべきクラスターあたり 5-10 Ips。 - 新鮮な E-cad-Fc コート 100 ミリメートル懸濁液培養皿 M 培地 5 mL を含むあたり浮遊細胞の 1/10 に転送します。37 ° C 下で 4 %o で文化を孵化させなさい25% CO2と日々 変化する媒体。
注:Ips は、多能性を促進するために酸素の生理学的な条件の下で日常的に培養、Ips は周囲の酸素を使用するもと成長します。
- Ips に達すれば周り 80% の confluency 培養培地を削除し、カルシウムで 1 回洗浄し、マグネシウム無料 DPBS (-)。DPBS (-) を吸引し、プレートをカバーし、室温で最大 3 分間インキュベート 0.02 %edta 溶液の十分な量を追加します。
2. 96 ウェル プレートでの肝細胞のような細胞に人間 Ips の分化
注:このセクションでは、スクリーニングと互換性のある形式で Ips の分化について説明します。このアプローチを使用すると、それは区別し、20 日間で肝細胞様細胞を形成する人間の Ips を誘導することが可能です。これはほとんどの試金のために適していますが、文化の長さは、細胞の成熟度を改善するために拡張できます。
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減らされた成長因子基底膜マトリックス 96-well ティッシュの培養皿をコーティング
- マトリックスを 2 mg/mL の氷冷滅菌 DMEM/F12 組織培養培地で希釈することによって在庫を準備します。250 μ 因数に行列を分割し、必要になるまで-80 ° C で保存します。DMEM/F12 30 分取得のため氷の上の 10 mL 250 μ 因数 2 mg/mL マトリックス株式と雪解けを冷やす氷の上。
- 冷たい DMEM/F12 の 10 mL と優しく 0.05 mg/mL の最終的な集中にあらかじめ冷やしたピペットを使用して混合することによってマトリックスを組み合わせます。
- 96 ウェル培養プレートの各ウェルに 100 μ L 希薄マトリックスを転送します。37 ° C で孵化させなさい、4% O25% CO2少なくとも 1 h. の行列を破棄し、ウェルあたり 50 μ L の M 中に置き換えます。37 ° c、4% O25% CO2必要になるまで格納します。
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細胞分化の
- セル アプローチ 80% 合流まで 100 mm プレートに Ips の文化.プレートに約 2 x 10 の7セルが含まれていることを確認します。セル フローサイトまたは検定によって細胞の数を決定します。
注:顕微鏡での経験と、Ips 細胞の品質を判断できます。ただし、セルの 98% 近くは、TRA 1 60 エピトープ FACS や免疫染色法によって測定したときのような多能性マーカーを表現しなければなりません。細胞は積極的にわかれたまま、生えていないことが重要です。 - 各 100 mm プレートから Ips を収穫するには、培養培地を吸引、DPBS (-) の 5 mL ですすいでください。細胞剥離液 (例えばaccutase) の 3 mL でリンスを置き換えるし、37 ° C、4% O25% CO2で約 2 分間インキュベートします。
注:顕微鏡による細胞の剥離を従うことが重要です。Accutase にダイジェストしすぎないでください。目標は最低限の治療で小さなクラスターとしてセルを解放するためです。 - セルをデタッチし始めると、すぐに M 中の 7 mL を追加して収穫します。周りの小さなクラスターに細胞のコロニーを分離するに数回のピペット 3 6 細胞 (図 1 a)。
- 5 分、上清を除去し、再細胞ペレットを 5 mL M 培地にサスペンド 15 mL 滅菌遠心管 300 × g で遠心分離し、Ips を収集します。
- 懸濁細胞分注 50 μ l を各ウェルに 96 ウェル マトリックス コーティング プレートの上にセルを均等に配る。各 96 ウェル プレートを設定するには、約 80% の confluency 分化をセットアップする約 5 x 10 の6セルが含まれているセルと Ips の 1 つの 100 mm の板を使用します。マルチ チャンネル ピペットを使用して、このプロセスをスピードアップします。37 ° C、4% O25% CO2で一晩培養します。
注:再現可能な分化を確保するため各ウェルに同じ数のセルを堆積ことが重要です。
- セル アプローチ 80% 合流まで 100 mm プレートに Ips の文化.プレートに約 2 x 10 の7セルが含まれていることを確認します。セル フローサイトまたは検定によって細胞の数を決定します。
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細胞の分化を誘導します。
- 細胞が個々 の表面の少なくとも 70% をよくカバーして顕微鏡による 96 ウェルのプレートを確認します。カバレッジが 70% 未満の場合新鮮な媒体、媒体に置き換えるし、37 ° C、4% O25% CO2で追加 24 時間孵化させなさい。
注:よく分化を誘導することがなくめっき後 48 時間以上のための細胞を培養分化の効率が低下します。分化も発生する周囲の酸素を使用して効率かもしれないが影響を受ける. - 分化の日 2 日 1、置き換える培 RPMI 2 %b27 (インスリン) なしで 20 ng/mL FGF2、10 ng/mL、BMP4 100 ng/mL アクチビン A。100 μ L/ウェル中を追加し、37 ° C、アンビエント O25% CO2の 2 日間毎日中型の変更でインキュベートします。
注:96 ウェルのプレートの大きな数を扱う補助ピペットまたはロボットの使用が必要です。96 ch と 12 ch ピペットは毎日培地交換に最適です。 - 分化の日 5 日 3、置換と RPMI 培 (インスリン) なし 2 %b27 と 100 ng/mL アクチビン a. 文化細胞周囲 O25% CO2と 3 日間の毎日の中型の変更で、37 ° C で補った。
- 30 s、し削除、置換の 100 μ L 0.02 %edta 溶液とよく分化新鮮な培地、各治療を交換する前に 5 日目に新鮮な培養液中で。
注:内胚葉への分化が効率的な場合、分化細胞の単層がプレートから剥離しやすいです。0.02 %edta 溶液で簡単な治療は、細胞の剥離を軽減できます。この治療法は、肝細胞への分化には影響しません。 - 10 日間 6 間の差別化、培 RPMI/2% (インスリン) B27 20 ng/mL BMP4 10 ng/mL FGF2 と補われ、37 ° C、4% O25% CO2毎日中型の変更と 5 日間のインキュベートを交換してください。この段階では、肝前駆細胞に分化する細胞を誘導します。
- 15 日 11 の間の分化、20 ng/ml の HGF (インスリン) B27 添加培養液中 RPMI/2% と交換してください。37 ° C、4% O25% CO2毎日中型の変更で 5 日間で孵化させなさい。
- 20 日 16 間の差別化、肝細胞細胞培地 (HCM) 20 ng/ml オンコスタチン M (OSM) の補足と培養液を交換してください。アンビエント O25% CO2と 5 日間の毎日の中型の変更で、37 ° C でセルを孵化させなさい。
注:個々 のウェル間の差別化の再現性は、アルブミン、afp 通信、または APOB elisa 法による媒体に分泌の相対的なレベルを測定することによって効率的に決定できます (3.2 を参照)。
- 細胞が個々 の表面の少なくとも 70% をよくカバーして顕微鏡による 96 ウェルのプレートを確認します。カバレッジが 70% 未満の場合新鮮な媒体、媒体に置き換えるし、37 ° C、4% O25% CO2で追加 24 時間孵化させなさい。
3. 小さな分子のスクリーニング
注:APOB の家族性高コレステロール血症 Ips 由来の肝細胞のような細胞の中でのレベルを下げて使用することができます化合物を特定するための手順を次に示します。モデルとコレステロール低下薬の同定での使い方の説明が記載されているでは以前5,9詳細。現在の例では、サウスカロライナ化合物コレクション (SC3) ライブラリから 1,000 化合物をスクリーニングしました。各化合物は、2 μ g/mL の濃度でテストされました。
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IPSC - 小分子と派生の肝の治療
- 2 %dmso、-20 ° C で店で 20 μ g/mL の濃度で化合物と株式を働いているのプレートを生成するマスターの化合物ライブラリーを希釈します。
- テストするそれぞれの化合物を許可する iPSC 由来の肝細胞の十分な 96 ウェルのプレートを準備します。
注:上映される化合物の数は、必要とされる 96 ウェル プレートの数によって決定されます。一般に、単一も備える必要があります任意のコントロールのサンプルの各化合物は、プラス追加井戸。プレートの外側の井戸は一般的解釈を破損することができますエッジ効果の可能性を減らすために回避されます。ヒットは、複製を使用する必要とせず z スコア法を使用して識別できます。複製が含まれている場合は、t 検定を使用する適しています。 - 分化 (日 20、参照 2.3.7) の完了、時に新鮮な HCM の 100 μ L 培養液に置き換えるオンコスタチン M の 20 ng/mL を添加しました。37 ° C で孵化させなさい、4% O25% CO2 24 時間正確には新鮮なの 96 ウェル プレート、-20 ° C でストアに培養培地を取得します。薬の付加の前に媒体の APOB のレベルを計算するのにには、このサンプルを使用します。
- 20 ng/ml オンコスタチン M の各ウェルに補われる新鮮な HCM の 90 μ L を追加します。ピペッティングにより混合後在庫から各化合物の 10 μ L を追加します。アンビエント O25% CO2まさに 24 時間の培養液を収集し、-20 ° C で保存、処理された試料の最終濃度に一致し、37 ° C で孵化させなさい井戸を制御する 0.2 %dmso を追加します。このサンプルを使用して、化合物投与後 APOB のレベルを調べます。
- オプション - 免疫染色、細胞生存率、または標準的なアプローチを使用しての mRNA のレベルの解析の残りのセルを処理ことができます。
注:この画面は、APOB レベルの急速な効果があった薬を識別するために設計されました。ただし、病モデル、下流の試金、または薬物作用のメカニズムは、によっては複数日のサンプルの治療に有益ながあります。
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Elisa 法による APOB レベルを決定します。
- 両方前と後の薬物治療のサンプルから次の製造元のプロトコル人間 APOB ELISA の開発キットを使ってアポリポ蛋白 B (APOB) 濃度を決定します。
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次の解決策を準備します。
- 洗浄バッファー、0.05% から成る PBS、pH 7.4 でトゥイーン 20。使用するまで 4 ° C で保存します。
- インキュベーション バッファーは、0.05% Tween 20 と 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) の PBS、pH 7.4 で構成されます。使用するまで 4 ° C で保存します。
- Pbs は、pH 7.4 2 μ g/mL に希釈して APOB (mAB 20/17) 抗体を準備します。ウェルあたり希釈の 100 μ L を追加し、4 ° C で一晩インキュベートします。
- 抗体をアッセイ プレートから外し、各 200 μ L の PBS、pH 7.4 で 2 回も洗います。
- 200 μ L/ウェル 0.05% の追加トゥイーン 20、PBS、pH 7.4 で 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) し、常温で 1 h の動揺のプラットホームの間加温します。
- Pbs は、pH 7.4 APOB の下記の濃度 0.05% Tween 20 と 0.1 %bsa を使用して 8 ポイント標準曲線を準備: 300 ng/mL、200 ng/mL、175 ng/mL、150 ng/mL、125 ng/mL、100 ng/mL、75 ng/mL、50 ng/mL。
- Pbs は、pH 7.4 0.05% Tween 20 と 0.1 %bsa を用いたテスト サンプル 1:4 希釈します。
- インキュベーション バッファーによるブロックの 1 時間後バッファーを破棄し、0.05% の 200 μ L を 5 回アッセイ プレートを洗う PBS、pH 7.4 でトゥイーン 20。
- 完全に残留洗浄バッファーを削除し、希釈したサンプルと APOB 基準の 90 μ L をアッセイ プレートに転送します。1 h のシェーカーで室温で孵化させなさい。
- サンプルを破棄し、200 μ 0.05% で洗って pbs は、ウェルあたり pH 7.4 トゥイーン 20。合計 5 回洗浄を繰り返します。Pbs は、pH 7.4 0.05% Tween 20 と 0.1 %bsa に mAB LDL 11 ビオチン希薄縮尺のウェルあたり 100 μ L を追加します。1 h の動揺のプラットホームの室温で孵化させなさい。
- 試薬を破棄し、5 回も洗浄バッファー当たり 200 μ L で洗います。ストレプトアビジン-HRP 抗体のウェルあたり 100 μ L を追加 (1:1, 000 インキュベーション バッファーを使用して希釈)、1 h の動揺のプラットホームの室温でインキュベートし。
- 試薬を破棄し、200 μ 0.05% で洗って pbs は、ウェルあたり pH 7.4 トゥイーン 20。合計 5 回洗浄を繰り返します。完全にアッセイ プレートから残留洗浄液を削除し Tetramethylbenzidin (TMB) 基板の解決のウェルあたり 100 μ L を追加し、8 分間室温でインキュベートします。
- TMB 基板を削除せず直接停止ソリューション (1N HCl) ウェルあたり 100 μ L を追加します。
- 450 で吸光度を決定する nm プレート リーダーを使用しています。
- 4 パラメータ ・ ロジスティック回帰法を使用して、各サンプル10APOB の濃度の定義に使用、標準曲線を確立できます。
- 事前に薬を調べる: APOB を下げる可能性のある化合物を識別するために各サンプルの APOB の後薬剤比率レベル中。
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Representative Results
肝細胞の生成-細胞のような:図 1では、人間の Ips 細胞肝細胞様細胞への分化過程に発生する変更のタイム フレームについて説明します。E-Cad-Fc に Ips の文化提供します約 2 mm OCT4 多能性マーカーを表す直径植民地 (図 1 aB)。E-カドヘリンのマトリックス上に成長した細胞の形態は他のサーフェス上で培養したものをわずかに異なるになります。彼らは大きい細胞質表面領域 (図 1 a) とフラットな形態を持っている傾向があります。ひと多能性幹細胞は、数種類の行列11で効率的に培養することができます、E-カドヘリン行列に Ips の文化多能性細胞人口の同質性を高めると考えられている、により、酵素無料中通路12セルの操作。基底膜マトリックス、laminins、ビトロネクチン、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) などいくつかの代替の行列は、ヒトの Ips を維持するためにも使用でき、すべてが記載された手順13と互換性があります。すべてのケースでは、トラ 1 60 または同等の8細胞多能性を確認できます。
分化を開始するには、Ips は、小さなクラスター (図 1 a) として収集する必要があります。分化の初めには、めっきされたセルは、プレートの表面の約 80% をカバーするべき。成長因子による治療の 5 日後、細胞は SOX17 など FOXA2 決定的な内胚葉に特徴的に表現される蛋白質を表現 (図 1 b)。この段階で、以上、細胞の 90% 通常表現これらのマーカー。分化のより 5 日後肝運命に変換します、内胚葉と FOXA2、ほかのセル エクスプレス HNF4a 分化プロセス (図 1 b) の残りの部分で識別することができます。セルと肝の運命を採用、単分子層とプレートの表面をカバーする必要があります。HGF の付加の後で細胞は AFP (図 1 b) を含む胎児肝細胞に見られる蛋白質を表現し始めます。細胞の細胞質内の脂肪滴を観察できます。差別化の完了時に細胞は核小体と複数の脂質滴と大規模な細胞質を含む立方形態を採用します。一部の肝細胞様細胞は多核になります。細胞の大部分はアルブミン (図 1 b)14を含む肝細胞蛋白質の豊富なレパートリーを表現します。
疾患モデルとして高コレステロール血症を使用して効果的な高スループット画面:高コレステロール血症は、血清中に低密度リポタンパク質コレステロール (LDL-C) の過剰な集中を反映しています。家族性コレステロール血症 (FH)、血清 LDL ‐ C の増加レベルは主に肝細胞によるクリアランスの LDL コレステロールの取り込みを仲介する低比重リポ蛋白受容体 (来す) の突然変異。ホモ接合体家族性高コレステロール血症と文化9の患者の肝臓病をミラー化肝細胞の生成での使用患者から Ips の世代以前説明しました。これらの細胞を創のためのプラットフォームとして正常に使用できることを実証しました。2,500 〜 薬のライブラリが上映された、強心配糖体が iPSC 由来肝細胞、ひと肝細胞、および肝臓ヒト化マウスに LDL-C を下げるため予期しない能力を持っていたことが分かった。また、試験の患者の医療記録に心臓病の治療のための強心配糖体が処方された患者にレベル落ちたのコレステロールを見つけた。これらの研究は、治療を識別するために、画面では iPSC 由来の肝細胞正常に使用できることを確認しました。
スクリーニングと互換性のあるプラットフォームを提供するために分化、再現と坑変動を最小限に抑えることが重要です。図 2は、分化の 20 日目で HNF4a とアルブミンを検出する 96 ウェル プレートの各ウェルに免疫染色の結果を示しています。図に見られる、これらの肝細胞蛋白質の分布、すべての井戸で類似しています。
LDL-C の中央蛋白質成分は APOB です。ここでは、iPSC 由来の肝細胞を用いたスクリーニング (図 3 a) 小さい分子の例を提供するために化合物を下げる APOB の画面に Ips を使いました。APOB は、elisa 法によりソリューションで簡単に測定することができます。ELISA は、サンプル数が多いで実行することができます、画面の基盤として使用できます。Z 因子と呼ばれる測定を用いた高スループット スクリーニングを任意のアッセイの適合性を決定して最良の方法 (または Z')15。この統計的パラメーターは、正と負のコントロールのサンプルを区別するアッセイの有効性を計算します。Z 因子分析 > 0.5 画面15と互換性があると見なされます。図 3 bZ で見ることができる ' APOB アッセイ = 0.73 創のためのプラットフォームを使用しての適合性を確認します。
IPSC の培地の APOB レベルを下げる能力がある化合物の同定-肝細胞を派生: 1,000 小分子からサウスカロライナ化合物コレクション (SC3) 代表的なセット Lite (RSL) を仕切った APOB のレベルに影響する新規化合物を識別するためにプラットフォームを使用できるかどうかを決定します。RSL は治療上の発見のために MUSC サウスカロライナ センターによって生成されたとは構造的に多様な化合物が含まれています、親ライブラリを反映します。
後の薬: APOB の事前に薬比を測定した各化合物 (図 3) と z スコア分析 (図 3 D)16ヒットの同定を行った。この場合は、潜在的なヒット z スコアの ≤ 2.0 APOB の減少小分子が考えられていた。1,000 の小さい分子をスクリーニング、z スコア ≦ 2.0 の潜在的なヒット数は比較的管理しやすい通常。ただし、大きな画面にあたって、我々 が ≤-3.0 のより保守的なスコアに依存します。 潜在的なターゲットの信頼性を高めるため、3 シグマのルールに基づいています。この例では 0.86 から 0.44 (図 4 a) へ変わる APOB 比 24 潜在的なヒットを識別されます。二次分析を行った, サンプル (n = 4 生物学的複製) セル実行可能性に否定的な影響を与えた化合物を除外してどの化合物中で APOB を下げることができる再現性をもって決定します。オリジナルの 24 の候補化合物の 4 つは再現性のあることがわかった (p 0.05) (図 4 b・ C)。さらなる研究にこれらの化合物の 2 が判明した否定的影響を与えるセル実行可能性、APOB で観察される減少だった可能性が高いことを示唆している、セルの損失の結果であります。残り 2 つの化合物は、追跡調査に適してを考えられるでしょう。
図 1: Step-wise 人間 Ips の肝分化します。(A)直前に収穫 (左のパネル)、収集した後 Ips iPSC コロニーの形態細胞分化 (右側のパネル) - accutase 治療後、セルは 3-6 セル/クラスターに分離する必要があります。スケール バー (上) の分化の各段階で 50 μ m (B) 表示す文化条件を =。免疫染色 (下のパネル) を分化の各段階でマーカー式を識別するために行った。パネルは、OCT4 と Ips、SOX17 との決定的な内胚葉、HNF4a と肝前駆細胞、HNF4a と afp 通信は未熟肝細胞様細胞における FOXA2 FOXA2 核を染色 DAPI を示し HNF4a とアルブミンの比較的成熟肝細胞のような細胞です。スケール バー = 100 μ m (B)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 96 ウェル プレートで人間 Ips の同種肝分化します。検出 (A) への分化の 20 日目で iPSC 由来の肝細胞を含む 96 ウェル プレートの各ウェルに免疫染色を行ったアルブミンおよび(B) HNF4a。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 人間 iPSC 由来肝細胞を用いた小分子スクリーニングします。(A) iPSC 由来の肝細胞の中で ABOB のレベルを減らすことができる化合物を識別するために使用されているアプローチの図式的な概観。(B)グラフ表示結果 87 井戸の中で APOB のレベルを検出するための ELISA の試金の (n = 87) (ブルー) iPSC 由来肝細胞の未分化 Ips (オレンジ) および/または。これらのデータは、Z 係数の計算に使用された (Z' = 0.73)。 (C) グラフ後薬: APOB iPSC 由来の肝細胞の培養液中の濃度の比を事前に薬は、SC3 RSL セットから 998 化合物で 24 時間処理しました。(D) (C) で示したデータの z スコアを示すグラフ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: プライマリ ヒット検証します。(A) 表 APOB を減らすためにできることとしてメイン画面に同定された化合物を示します。(B、C)後薬の化合物の影響を示す棒グラフ: 事前に薬 APOB 濃度比(B) とフォロー アップにおける化合物処理 iPSC 由来の肝細胞の細胞生存率 (C)。誤差範囲は ± SEM を反映 (n = 4 の生物的複製); * p 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ターゲット ・ ベース創薬、小さい分子を識別する、特定の蛋白質の活動に影響を与える多くの既存のスクリーニングの努力の焦点となっています。このアプローチは、多数の医薬品、画面反転表現型, 古典的な薬理学に基づいてを提供して臨床的に効果がある1されているファーストクラスの化合物を識別するに成功されています。表現型創薬への不利な点はそれが適切な疾患モデルの可用性に依存していることです。病気の細胞モデルは利用できませんに挑戦であるまたは共通の研究動物種が臨床症状を要約する失敗したときこれあります。ただし、患者さんの体細胞から Ips を生成する機能は、モデル文化3のひと疾患への新しい機会を提供しています。まれな遺伝病など、いくつかの疾患患者番号、およびアクセスし、同意が困難のいくつかことができます。しかし、ゲノム工学の出現で、模型もまれな病気のたぐいまれなこと、iPSC ゲノムに原因となる突然変異を導入する比較的簡単です。
Ips が手にされたら、病気の症状をマニフェストの適切なセル型を生成する必要は。神経機能に影響を与える疾患たとえば、ニューロンやグリア17世代を必要があります肝臓に影響を与えるそれらは肝細胞9,18を必要がありますまたは胆管上皮細胞の研究19,に対し20,21. 創 Ips の使用を検討する際、この要件は多数の注意事項を紹介します。まず、病気の細胞学的基礎を理解することが重要です。細胞の場所や環境に基づく特性を採用する場合は特に、挑戦できます。これはかもしれない遺伝子発現プロファイルの違いを持つ肝細胞と肝小葉の内での位置に依存する酵素の機能にも当てはまります。第二に、単独で任意のセルでの作業は、肝硬変、神経筋疾患などの細胞間コミュニケーションなど炎症によって影響を受けている人などのティッシュの構造の中断を示す疾患の研究を防ぐことができます炎症性腸疾患。
肝疾患を研究するには、いくつかの研究グループは、Ips13,22,23,24,25から肝細胞様細胞を生成するプロトコルを説明しています。これらのプロトコルのほとんどは、効率的な場合、セルいない新鮮な肝細胞の機能を要約して完全に、技法の制限です。つまり、細胞生成 Ips ディスプレイから与えられた突然変異の影響を評価する必要な機能であるかどうかを決定することが重要です。式が完全に一致しない遺伝子の中で新鮮な肝細胞の発見は、CYP450 蛋白質25,26をエンコードします。これらの蛋白質のいくつかは薬物代謝と生体異物応答の役割を持ちます。これは、多くの薬剤を必要とするアクティブな代謝物の生成と iPSC 由来の肝細胞ではこの影響を受ける可能性がありますので、画面のデザインを検討する際に重要です。肝細胞の品質を向上させる努力は積極的に追求された27をされています。警告にもかかわらずいくつかの研究を示している文化9疾患の病態生理をミラー化肝細胞様細胞を生成する、先天性肝代謝患者由来 Ips を正常に使用できます。,18,28,29。
成功するための画面、Ips から肝細胞の均一な分化を確保するため重要です。高品質の肝細胞を生成する 96 ウェル プレートでの分化が失敗すると、いずれかの親の Ips の質の悪さや最適条件下で Ips の文化による最も一般的です。Ips の多能性は、1.2 プロトコルで説明されているように、毎日の変更による高品質媒体文化によって慎重に維持されなければなりません。培養皿で多能性細胞の密度は、多能性を失い自発的に区別するためにセルに合流になる場合が多いため、慎重に監視する必要があります。我々 はまた、生理酸素濃度の細胞を培養多能性を促進し、分化のいくつかの段階で、有益なを見つけます。ただし、適切な機器が使用できない場合は、多能性細胞の培養し、分化誘導の両方に周囲の酸素を使用することも可能です。日常的に培養条件にかかわらず広範な分化を実行する前の 10 月-3/4、NANOG、トラ 1 60 など複数の多能性マーカーの発現を測定することによって株式の Ips の多能性を定義することをお勧め。我々 はまた、セルは、高効率で内胚葉を形成するとき、彼らは細胞シートとして板の表面から鐘の音に傾向があることを観察しました。簡潔に扱う iPSC 由来の内胚葉 0.02 %edta 溶液を細胞が細胞の剥離を減らすために助けることができることがわかった。最後に、効率的な分化に必要な細胞の最適濃度は iPSC ライン間で異なることができるし、細胞の剥離に影響を与えることができます。このため、経験的新しい iPSC 文化を操作する場合に特に効率的な分化に必要な細胞の濃度を決定することが重要です。
要約すると、化学の画面と互換性のある Ips から肝細胞様細胞を生成する段階的分化プロトコルを説明しました。96 ウェル プレートで単分子膜として肝細胞のような細胞が生産し、プロセスが効率的で再現。APOB の培養液中の濃度を下げることの彼らの能力のための化合物をスクリーニングの有効性を示す.微分形式は、ELISA、qRT PCR および高いコンテンツ イメージングを含む複数のアッセイと互換性が。考えています、フィールド電位治療を識別するために有用なアプローチを見つけるが、肝細胞分化および将来のアプリケーション5,30の機能に影響を及ぼす経路の薬理学的同定。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所 (DK55743、DK087377、DK102716、S.A.D に HG006398) によって支えられました。彼らの貢献に対して博士 Behshad Pournasr、博士ジェームズ ・ ヘズロップ ・と蘭静に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
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