Summary
여기에 제시 된 프로토콜 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하기 위한 플랫폼을 설명 합니다. 단계별 설명 Ipsc 96 잘 접시에서 hepatocyte 특성을 가진 세포로 분화 하 고 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 활동 화면 셀을 사용 하는 방법을 자세히 제시 합니다.
Abstract
Hepatocyte 모양의 세포 (HLCs)로 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)를 차별 하는 능력 선된 천 성 간 물질 대사 연구에 새로운 기회를 제공 합니다. 그러나, 잠재적으로 간 질환 치료에 사용 될 수 있는 작은 분자의 id를 지 원하는 플랫폼을 제공 하는 절차 화합물의 수천을 심사와 호환 되는 문화 형식이 필요 합니다. 여기, 우리는 hepatocyte 같은 셀 96-잘 조직 문화 접시에 인간의 Ipsc의 재현 차별화를 허용 하는 완전히 정의 된 문화 조건을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 또한 가족성 콜레스테롤 혈 증 환자에서 발생 하는 iPSC 파생 hepatocytes에서 생산 하는 Apolipoprotein B (APOB) 낮은 화면 화합물 그들의 능력에 대 한 플랫폼을 사용 하 여 제공 합니다. 약물 발견과 호환 되는 플랫폼의 가용성 간에 영향을 주는 질병에 대 한 새로운 치료제를 식별 하는 연구를 허용 해야 합니다.
Introduction
희귀 한 질병을 대상으로 사용할 수 있는 약물을 확인 성공 심사에 사용할 수 있는 분석 실험의 발달에 의존 합니다. 가설 또는 대상 기반 화면 (역방향 약리학) 유용 합니다, 하지만 질병의 분자 기준의 상세한 이해를 요구. Phenotypic 화면 (클래식 약리학) 생화학 경로 대 한 자세한 이해에 대 한 필요 하지만 대신 질병의 이상 정확 하 게 반영 하는 모델의 개발에 따라. 대상-기반 접근에 대 한 열정에 불구 하 고 FDA 승인 첫-에서-클래스 약물의 분석 공개 phenotypic 스크린 훨씬 더 성공적인1되었습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 심사 하는 높은 처리량에 대 한 플랫폼을 설정 하 대사 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하 사용 될 수 있다입니다. 여러 생체 외에서 모델 기본 hepatocytes은 세포 및 간 조상 세포2를 포함 하 여 기술 되었다. 그러나, 대부분 이러한 모델의 한계, 있고 정확 하 게 문화에서 대사 간 결함의 이상 정리 수 있습니다 새로운 모델에 대 한 필요가 있다. 최근, 인간의 pluripotent 줄기 세포 유전자 편집 함께 액세스 환자 필요 없이 문화에 희귀 질환의 희귀 한 것도 모델 수 있는 기회를 제공 직접3. 환자 전용 Ipsc의 사용 하면서 희귀 한 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 발견 하는 도구는 개념적으로 합리적으로이 접근4의 타당성을 입증 하는 몇 가지 보고서만 있다. 그러나, 우리는 최근 iPSC 파생 hepatocytes 약물 간 신진 대사5결함의 치료를 위해 repurposed 수 성공적으로 확인을 사용 하는 플랫폼을 설립.
이 프로토콜 hepatocyte 같은 셀 96 잘 접시에 인간의 Ipsc를 차별화 하 고 작은 분자의 라이브러리 화면에 그들을 사용 하 여 과정을 설명 합니다. 그것은 또한 신진 대사 간 질환의 예로 콜레스테롤 혈 증을 사용 하 여 끝점 분석을 설명 합니다. 이 방법은 역할 및 전염 성 간 질환, 간 대사 질환, 약물 독성, 및 다른 간 질환의 맥락에서 작은 분자의 응용 연구에 유용 해야 한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 인간의 문화 유도 만능 줄기 세포
-
재조합 인간 E Cadherin Fc 융합 단백질 (E-cad-Fc) 또는 다른 행렬 hPSC 문화에 대 한 적합 한 코팅 6
- Dulbecco의 Phosphate-Buffered 염 분 칼슘 및 마그네슘 (DPBS (+))와 함께 전자 cad Fc 15 μ g/mL를 희석.
- 100 m m 정지 조직 문화 요리 희석된 전자 cad Fc의 5 mL와 코트 및 적어도 1 h. 제거 기판에 대 한 37 ˚C에서 품 어와 매체 (예를 들어, 이제 M 매체 라고는 mTeSR1)의 5 mL을 바꿉니다7.
참고: 이 프로토콜에 사용 되는 배양은 게시 프로토콜7다음을 준비 하 고 있다. 그러나, 다른 여러 미디어 준비 설명 되었습니다 또는 사용할 수 상업적으로, 절차와 호환이 되는 가능성이 있습니다. - 액체 질소에서 cryopreserved Ipsc의 유리병을 검색 합니다. 작은 얼음 크리스탈 남아 때까지 37 ˚C에서 해 동. M-중간의 4 mL를 포함 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 부드럽게 플라스틱.
- 5 분은 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 다시 셀 Y-27632로 관련, 코일 코일 포함 단백질 키 니 아 제 (바위)의 선택적 억제제의 10 µ M으로 보충 하는 매체의 5 mL을 일시 중단에 대 한 300 x g에서 원심.
- M-중간 단계 1.1.2에서에서 제거 하 고 전자 cad Fc 코팅 100 m m 서 스 펜 션 조직 문화 요리 단계 1.1.4에서에서 셀의 5 mL을 전송.
-
문화에서 인간의 Ipsc 유지
- Ipsc 주위에 도달 되 면 80 %confluency, 문화 매체를 제거 하 고 칼슘과 한 번 세척 및 마그네슘 DPBS (-) 무료. DPBS (-) aspirate 고 0.02 %EDTA 솔루션 커버 플레이트, 다음 실 온에서 최대 3 분 동안 품 어 충분 한 양의 추가 합니다.
참고: 80% 합류에 접시 2 x 107 셀을 포함 해야 합니다. 그것은 중요 하지 자라 다 셀, 셀 undifferentiated 형태 유지 되도록입니다. 세포의 pluripotency 줄기 세포 표식 Tra-1-60 또는 동등한8얼룩에 의해 확인할 수 있습니다. - 마자 셀 출시를 시작으로 0.02 %EDTA 용액을 제거 하 고 셀 출시 M 매체의 10 mL와 함께 요리를 홍수. 부드럽게 pipetting으로 Ipsc의 분리를 지원.
참고: 세포 분리를 위한 평균 부 화 시간은 약 3 분, 그러나이 각 iPSC 라인에 대 한 실험적으로 결정 될 필요가 있다. 셀 주위에 포함 된 작은 클러스터로 나와야 한다 5-10 Ipsc 클러스터 당. - 신선한 전자 cad Fc 코팅된 100 m m 정지 조직 문화 접시 M-중간의 5 mL를 포함 된 당 정지 세포의 1/10을 전송 합니다. 37 ˚C O 4% 아래에서 문화를 품 어2/5% CO2 와 변경 매체 매일.
참고: Ipsc pluripotency 홍보 생리 산소 조건 하에서 교양 정기적으로, 비록 Ipsc 또한 주변 산소를 사용 하 여 성장 될 수 있다.
- Ipsc 주위에 도달 되 면 80 %confluency, 문화 매체를 제거 하 고 칼슘과 한 번 세척 및 마그네슘 DPBS (-) 무료. DPBS (-) aspirate 고 0.02 %EDTA 솔루션 커버 플레이트, 다음 실 온에서 최대 3 분 동안 품 어 충분 한 양의 추가 합니다.
2. 96 잘 접시에 Hepatocyte 같은 셀에 인간의 Ipsc의 차별화
참고: 심사와 호환 되는 형식 Ipsc의 차별화에 설명 합니다. 이 방법을 사용 하 여, 인간의 Ipsc 차별화 하 고 20 일에서 hepatocyte 같은 세포 형성을 유도 하는 것이 가능 하다. 이 대부분 분석 실험에 적합, 문화의 길이 세포의 성숙도 향상 시키기 위해 확장할 수 있습니다.
-
감소 성장 인자 지하실 멤브레인 매트릭스 96-잘 조직 배양 플레이트 코팅
- 매트릭스 2 mg/mL 차가운 살 균 DMEM/F12 조직 문화 매체를 diluting 하 여 재고를 준비 합니다. 250 μ aliquots에 매트릭스를 분할 하 고 필요할 때까지-80 ˚C에 저장. 얼음에 30 분 검색에 대 한 얼음에 DMEM/F12의 10 mL 250 μ 2 mg/mL 매트릭스 재고의 약 수를 재개 진정.
- 0.05 mg/mL의 최종 농도를 미리 냉장된 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 혼합 하 여 차가운 DMEM/F12의 10 mL와 매트릭스를 결합 합니다.
- 96-잘 조직 배양 플레이트의 각 음을 희석된 매트릭스의 100 μ를 전송. 37 ˚C에서 품 어, 4% O2/5% CO2 이상 1 헤에 대 한 행렬을 삭제 하 고 잘 당 50 μ M-중간의 바꿉니다. 37 ° c, 4% O2/5% CO2 필요할 때까지 저장 합니다.
-
플레이트 셀 차별화
- 셀 접근 80% 합류까지 100 mm 접시에 Ipsc 문화. 접시에 약 2 × 107 셀 포함 되어 있는지 확인 합니다. 셀 흐름 cytometer 또는 hemocytometer 핸드폰 번호를 확인 합니다.
참고: 경험, Ipsc 셀의 품질은 현미경;에 의해 재판 될 수 있다 그러나, 세포의 98 %pluripotency 마커 TRA-1-60 epitope FACS 또는 immunostaining에 의해 측정 될 때 같은 표현 한다. 셀 적극적으로 나누어 남아 자란 하지 중요 하다. - 각 100 mm 접시에서 Ipsc 수확, 문화 매체를 발음 하 고 DPBS (-)의 5 mL로 씻어. 세포 분리 솔루션 (예를 들어, accutase)의 3 mL와는 린스를 장착 하 고 37 ° C, 4% O2/5% CO2에서 약 2 분 동안 품 어.
참고: 그것은 현미경으로 세포의 분리를 수행 해야 합니다. Accutase와 다이제스트 이상 하지 않습니다. 목표는 최소한의 치료와 함께 작은 클러스터로 셀을 공개 하는. - 최대한 빨리 셀 분리 하기 시작, M-중간의 7 mL을 추가 하 여 수확. 주위의 작은 클러스터로 셀 식민지를 해리를 여러 번 플라스틱 3-6 셀 (그림 1A).
- 5 분은 상쾌한을 제거 하 고 다시 5 ml M-중간 셀 펠 릿을 일시 중단에 대 한 15 mL 메 마른 분리기 관 300 x g에서 원심 분리기에는 Ipsc를 수집 합니다.
- 각 우물에 96-잘 매트릭스 코팅 접시에 셀 현 탁 액 셀의 pipetting 50 μ에 의해 균등 하 게 배포 합니다. 각 96 잘 접시를 설정 하려면, 주위 5 x 106 세포 분화를 설치를 포함 약 80 %confluency 세포와 Ipsc의 하나 100 mm 접시를 사용 합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여이 과정을 속도를. 37 ˚C, 4% O2/5% CO2에서 하룻밤 셀 문화.
참고: 동일한 수의 셀을 재현할 차별점을 보장 하기 위해 각 잘 입금이 중요 하다.
- 셀 접근 80% 합류까지 100 mm 접시에 Ipsc 문화. 접시에 약 2 × 107 셀 포함 되어 있는지 확인 합니다. 셀 흐름 cytometer 또는 hemocytometer 핸드폰 번호를 확인 합니다.
-
세포의 분화를 유도
- 96 잘 접시 셀 각각의 표면에의 적어도 70%를 잘 커버 되도록 현미경으로 검사 합니다. 범위는 70% 미만, 신선한 매체와 매체를 대체 하 고 37 ˚C, 4% O2/5% CO2에 추가적인 24 h에 대 한 품 어.
참고: 일반적으로 분화를 유도 하지 않고 도금 후 48 h에 대 한 셀을 잠복기 차별화의 효율성을 감소 시킨다. 차별화도 발생 주변 산소를 사용 하 여 효율성에 영향을 받는. 수 있지만 - 차별화의 하루 2 하루 1, 바꿉니다 문화 매체 (인슐린), 없이 2 %B27 보충 RPMI 100 ng/mL Activin A, 10 ng/mL BMP4, 및 20 ng/mL FGF2. 잘 당 매체의 100 μ를 추가 하 고 주변 O2/5% CO2 2 일 동안 매일 매체 변화에 37 ˚C에서 품 어.
참고: 96 잘 접시의 큰 숫자를 다루는 보조 피 펫 또는 로봇의 사용을 해야 합니다. 12 채널 및 96 채널 펫 매일 매체 변화에 이상적입니다. - 차별화의 주 5 일 3, 대체 RPMI와 문화 매체 (인슐린) 없이 2 %B27 100 ng/mL Activin A. 문화 세포 주변 O2/5% CO2 3 일 동안 매일 매체 변화에 37 ˚C에 보충.
- 신선한 문화 매체, 각 치료와 함께 교체 하기 전에 차별화 날 5, 100 μ 0.02 %EDTA 솔루션 30 s, 다음 제거 및 교체에 대 한 잘 신선한 문화 매체와.
참고: Endoderm 차별화 효율적 이면 세포 분화의 단층은 접시에서 필 링을 하는 경향이. 0.02 %EDTA 솔루션 간략 한 치료 세포 분리를 완화 하는 데 도움이 됩니다. 이 치료 차별화 hepatocytes에 영향을 주지 않습니다. - 10 월 6 일 사이 감 별 법, 문화 매체 RPMI / 2% (인슐린)와 B27 20 ng/mL BMP4와 10 ng/mL FGF2 보충 및 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 매일 중간 변화 5 일에 품 어 교체 합니다. 이 단계 세포 간 조상 세포로 분화를 유도 합니다.
- 15 일 11 사이의 차별화, B27 (인슐린)와 보충 문화 매체 RPMI / 2 %20 ng/mL HGF 바꿉니다. 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 매일 중간 변화 5 일에 품 어.
- 20 일 16 사이의 차별화, 문화 매체는 hepatocyte 세포 배양 매체 (호치민시) 20 ng/mL Oncostatin M (OSM)의 보충 바꿉니다. 주변 O2/5% CO2 5 일 동안 매일 매체 변화에 37 ˚C에서 세포를 품 어.
참고: 개별 웰 스 간의 차별화의 재현성 효율적으로 알 부 민, AFP, 또는 APOB ELISA 매체에 분 비의 상대적 수준을 측정 하 여 결정 될 수 있다 (3.2 참조).
- 96 잘 접시 셀 각각의 표면에의 적어도 70%를 잘 커버 되도록 현미경으로 검사 합니다. 범위는 70% 미만, 신선한 매체와 매체를 대체 하 고 37 ˚C, 4% O2/5% CO2에 추가적인 24 h에 대 한 품 어.
3. 작은 분자 검사
참고: 다음에서는 가족성 콜레스테롤 혈 증 Ipsc에서 파생 하는 hepatocyte 같은 셀의 매체에서 APOB의 저수준에 사용 될 수 있는 화합물을 식별 하는 데 사용 하는 절차를 설명 합니다. 모델 및 콜레스테롤 낮추는 약물의 식별에 사용 설명 설명에 자세히 이전5,9. 현재 예제에서는 1000 화합물 사우스 캐롤라이나 복합 컬렉션 (SC3) 도서관에서 상영 했다. 각 화합물 2 μ g/mL의 농도에서 시험 되었다.
-
IPSC-작은 분자와 파생된 hepatocytes의 치료
- 2 %DMSO-20 ˚C에서 저장소 작업 주식 20 μ g/mL의 농도에서 화합물의 접시를 생성 하는 마스터 화합물 라이브러리를 희석.
- 테스트할 각 화합물 수 있도록 iPSC 파생 hepatocytes의 충분 한 96 잘 접시를 준비 합니다.
참고: 상영 하는 화합물의 수는 필요한 96 잘 접시의 수를 쓰게 됩니다. 일반적으로, 단일 잘 준비 되어야 한다 모든 컨트롤 샘플에 대 한 각 추가 플러스 화합물, 웰 스에 대 한. 플레이트의 바깥쪽 우물은 해석 손상 가장자리 효과의 가능성을 줄이기 위해 일반적으로 피 한다. 복제를 사용 하 여 필요 없이 z-점수 방법을 사용 하 여 조회 수를 확인할 수 있습니다. 복제에 포함 되어 있다면, t 검정을 사용 하 여 더 적합 하다. - 차별화 (하루 20, 참조 2.3.7)의 완료에 신선한 호치민시의 100 μ와 문화 매체 대체Oncostatin M의 20 ng/mL으로 보충. 37 ˚C에서 품 어, 4% O2/5% CO2 정확히 24 h. 신선한 96 잘 접시와-20 ˚C에 게 문화 매체를 검색 합니다. 이 샘플을 사용 하 여 약물의 추가 하기 전에 매체에서 APOB의 수준을 계산.
- 20 ng/mL Oncostatin M의 각 음에 보충 하는 신선한 호치민시의 90 μ를 추가 합니다. Pipetting으로 혼합 후 작동 주식에서 각 화합물의 10 μ를 추가 합니다. 치료 샘플에서 최종 농도 일치 하는 37 ˚C에서 품 어 웰 스 제어를 0.2 %DMSO 추가, 주변 O2/5% CO2 정확히 24 h. 문화 매체를 수집 하 고-20 ˚C에 저장. 이 예제를 사용 하 여 화합물과 치료 후 APOB의 수준을 결정 하기 위하여.
- 옵션-immunostaining, 세포 생존 능력, 또는 mRNA 수준의 표준 방법을 사용 하 여 분석을 위해 나머지를 처리할 수 있습니다.
참고: 이 화면은 APOB 수준에 빠른 효과 가진 약물을 식별 하도록 설계 되었습니다. 그러나, 질병 모델, 다운스트림 분석 실험, 또는 약 활동의 기계 장치에 따라서 그것은 여러 날에 대 한 샘플을 치료 도움이 될 수 있습니다.
-
ELISA APOB 레벨 결정
- 두 사전 및 사후 약물 치료 샘플 제조 업체의 프로토콜에 따라 인간의 APOB ELISA 개발 키트를 사용 하 여에서 Apolipoprotein B (APOB) 농도 결정 합니다.
-
다음 솔루션을 준비 하 고
- 0.05%의 구성 워시 버퍼 PBS, pH 7.4에에서 트윈 20. 사용까지 4 ˚C에 저장 합니다.
- 인큐베이션 버퍼, 0.05% 트윈 20 및 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS, pH 7.4에에서 이루어져 있습니다. 사용까지 4 ˚C에 저장 합니다.
- 2 µ g/ml PBS, pH 7.4에에서 diluting 하 여 APOB (20/17 mAB) 항 체를 준비 합니다. 잘 당 희석된 항 체의 100 μ를 추가 하 고 밤새 4 ˚C에서 품 어.
- 분석 결과 격판덮개에서 항 체를 제거 하 고 각 PBS, pH 7.4의 200 μ로 잘 두 번 세척.
- 0.05%의 200 μ/잘 추가 트윈 20, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS, pH 7.4에에서 고 실 온에서 1 h 떨고 플랫폼에 품 어.
- PBS, APOB의 다음 농도와 pH 7.4에에서 0.05% 트윈 20 및 0.1 %BSA 사용 하 여 8 포인트 표준 곡선을 준비: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL, 및 50 ng/mL.
- PBS, pH 7.4에에서 0.05% 트윈 20 및 0.1 %BSA 테스트 샘플 1: 4을 희석.
- 인큐베이션 버퍼와 차단의 1 시간 후 버퍼를 삭제 하 고 5 번와 200 μ 0.05%의 분석 결과 접시 세척 PBS, pH 7.4에에서 트윈 20.
- 완전히 어떤 잔여 세척 버퍼를 제거 하 고 시험 접시에 희석된 샘플 및 APOB 표준의 90 μ를 전송. 1 시간에 대 한 통에 실 온에서 품 어.
- 샘플을 삭제 하 고 200 μ 0.05%로 씻어 PBS, pH 7.4 잘 당에 트윈 20. 세척 총 5 회 반복 합니다. PBS, pH 7.4에에서 0.05% 트윈 20 및 0.1 %BSA mAB LDL 11 biotin 희석된 1:1,000의 당 100 μ를 추가 합니다. 1 h 떨고 플랫폼에 실 온에서 품 어.
- 시 무시 하 고 잘 세척 버퍼 당 200 μ와 5 번 씻어. 추가 Streptavidin HRP 항 체의 당 100 μ (1:1, 000 부 화 버퍼를 사용 하 여 희석), 다음 1 시간을 위한 떨고 플랫폼에 실 온에서 품 어.
- 삭제 시와 200 μ 0.05%로 씻어 PBS, pH 7.4 잘 당에 트윈 20. 세척 총 5 회 반복 합니다. 완전히 시험 접시에서 잔여 세척 버퍼를 제거 하 고 Tetramethylbenzidin (TMB) 기판 솔루션의 당 100 μ 추가 하 고 8 분 동안 실 온에서 품 어.
- TMB 기판 제거 하지 않고 직접 중지 솔루션 (1N HCl)의 당 100 μ를 추가 합니다.
- 450에서 흡 광도 결정 nm 플레이트 리더를 사용 하 여.
- 4 매개 변수 로지스틱 회귀 방법을 사용 하 여 다음 각 샘플10APOB의 농도 정의 하는 데 사용 하는 표준 곡선을 설정할 수 있습니다.
- 사전 마약 검사: APOB 낮은 잠재력을 가진 화합물을 식별 하는 각 샘플에서 APOB의 사후 약 비율 매체 수준.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocyte의 세대 - 세포 처럼: 그림 1 는 hepatocyte 같은 셀에 인간의 Ipsc의 분화 하는 동안 발생 하는 변경의 기간을 설명 합니다. 전자 Cad Fc에 Ipsc의 문화 제공 약 2 mm 직경 식민지 만능 마커 OCT4 표현 (그림 1A-B). 전자 cadherin 매트릭스에 성장 하는 세포의 형태는 약간 다른 다른 표면에 경작 그 있을 것입니다. 그들은 큰 세포질 표면 영역 (그림 1A)와 병합 된 형태를가지고 경향이 있다. 비록 인간의 pluripotent 줄기 세포 다른 행렬11의 수에 효율적으로 경작 될 수 있다, 전자 cadherin 매트릭스에 Ipsc의 만능 세포 인구의 동질성을 증가 하기 위하여 믿어진다 문화와 효소-무료 수 있습니다. 통로12동안 셀의 조작. 그러나, 지하실 멤브레인 매트릭스, laminins, vitronectin, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF) 등 몇 가지 대체 행렬 인간의 Ipsc를 유지 하기 위해 사용할 수 있습니다 그리고 모두 설명된 절차13와 호환 되어야 합니다. 모든 경우에서 셀 pluripotency Tra-1-60 또는 동등한8에 의해 확인할 수 있습니다.
분화를 시작 하는 Ipsc 작은 클러스터 (그림 1A)로 수집 한다. 차별화의 시작 부분에서 도금된 세포 격판덮개의 표면에의 약 80%를 커버 한다. 성장 인자 치료 5 일 후 셀 익스프레스 단백질 SOX17 등 FOXA2 최종 endoderm에서 독특하게 표현 됩니다 (그림 1B). 이 단계에서 이상 세포의 90% 일반적으로 이러한 마커를 표현 한다. 차별화의 5 더 많은 일, 후에 endoderm 변환 간 운명 하 고 FOXA2, 뿐만 아니라 세포 분화 과정 (그림 1B)의 나머지를 통해 확인 될 수 있다 HNF4a 익스프레스. 셀으로 간 운명을 채택, 그들은 한 단층으로 접시의 표면을 커버 한다. HGF의 추가, 후 셀 AFP (그림 1B)를 포함 하 여 태아 hepatocytes에서 발견 되는 단백질을 표현 하기 시작 합니다. 세포의 세포질 내의 지질 작은 물방울을 관찰할 수 있습니다. 차별화의 완료에서 셀 저명한 nucleoli 여러 지질 방울과 큰 세포질을 포함 하는 핵으로 cuboidal 형태를 채택 한다. Hepatocyte 같은 셀의 하위 집합은 다중 nucleated 있을 것입니다. Hepatocyte 단백질 알 부 민 (그림 1B)14등의 광범위 한 레 퍼 토리를 표현 하는 세포의 대부분.
질병 모델 콜레스테롤 혈 증을 사용 하 여 효과적인 높은 처리량 화면: 콜레스테롤 혈 증 저밀도 지단백 콜레스테롤 (LDL-C) 혈 청에서의 과도 한 농도 반영 한다. 가족성 콜레스테롤 혈 증 (FH)에서 혈 청 LDL-콜레스테롤의 증가 수준 돌연변이 hepatocytes에 의해 허가 대 한 LDL-콜레스테롤의 통풍 관을 중재 하는 저밀도 지 단백질 수용 체 (LDLR)에서 주로 예정 이다. 우리는 이전 Ipsc homozygous 가족성 콜레스테롤 혈 증 및 문화9에 환자의 간 질환 미러 hepatocytes 생성에 그들의 사용을 가진 환자에서의 생성을 설명 했습니다. 그것은이 셀 수 있는 약물 발견에 대 한 플랫폼으로 성공적으로 사용할 수을 시연 했다. ~ 2500 약물의 도서관, 상영 때 그것 심장 배당 체 iPSC 파생 hepatocytes, 기본 인간의 hepatocytes, 그리고 인간 답게 된 간은와 쥐 LDL-콜레스테롤을 낮은 예기치 않은 능력 있다고 하는 것이 밝혀졌다. 또한, 검사 환자의 의료 기록에 따라 우리는 심장 질환의 치료에 대 한 심장 glycoside 처방 된 환자에 그 콜레스테롤 수준을 감소 발견. 이러한 연구는 iPSC 파생 hepatocytes 수 성공적으로 스크린에 식별 하는 데 치료 확인.
심사와 호환 되는 플랫폼을 제공, 그는 차별점 재현할 수 있으며 잘 잘 변형 최소화 중요 하다. 그림 2 는 차별화의 하루 20에서 HNF4a 및 알 부 민을 검출 하는 96 잘 접시의 각 음에 immunostaining의 결과 보여 줍니다. 그림에서 볼 수 있듯이 모든 우물에 걸쳐 이러한 hepatocyte 단백질의 분포는 유사 합니다.
LDL-콜레스테롤의 중앙 단백질 구성 요소 APOB는. 여기, 우리는 사용 화면 Ipsc APOB 화합물을 낮추는 hepatocytes iPSC 파생을 사용 하 여 (그림 3A)를 상영 하는 작은 분자에 대 한 예제를 제공 하. APOB은 ELISA에 의해 솔루션에서 쉽게 측정 수 있습니다. ELISA는 많은 수의 샘플에서 수행할 수 있습니다, 이후 화면에 대 한 기준으로 사용할 수 있습니다. Z-팩터 라는 측정을 사용 하 여 높은 처리량 검열을 위한 어떤 분석 결과의 적합성 결정 최고의 (또는 Z')15. 이 통계 매개 변수는 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 샘플 사이 구별 하는 분석 결과의 효과 계산 합니다. Z-요소와 분석 결과 > 0.5 화면15와 호환 되는 것으로 간주 됩니다. 그림 3B, Z에서에서 볼 수 있듯이 ' APOB 분석 결과 = 0.73, 약물 발견에 대 한 플랫폼을 사용 하 여의 적합성을 확인 한다.
IPSC의 문화 매체에 있는 APOB 수준을 낮출 수 있는 화합물 - hepatocytes 파생: APOB 수준에 영향을 주는 새로운 화합물을 식별 하는 플랫폼을 사용할 수 있는지 확인할 하 우리 1000 작은 분자에서는 사우스 캐롤라이나 복합 컬렉션 (SC3) 대표적인 설정 라이트 (RSL) 상영. RSL 치료 발견, MUSC 사우스 캐롤라이나 센터에 의해 생성 된 구조적으로 다양 한 화합물을 포함 하 고 부모 라이브러리를 반영.
-약물: APOB의 사전 마약 비율 각 화합물 (그림 3C)에 대 한 결정 했다 고 안타의 z-점수 분석 (그림 3D)16에 의해 달성 되었다. 이 경우에, 잠재적인 명 중으로 z-점수 ≤-2.0 APOB 감소 작은 분자 고려 되었다. 1000 작은 분자, 심사 때 ≤-2.0의 z 점수와 잠재적인 안타 수는 상대적으로 관리 일반적으로. 그러나, 할 때 더 큰 화면, 우리 ≤-3.0, 더 보수적인 점수에 의존 것이 잠재적인 목표에 대 한 신뢰를 높이기 위해 3 시그마 규칙에 따라. 이 예제에서 우리는 0.44 (그림 4A) 0.86에서 다양 한 APOB 비율 24 잠재적인 안타 확인. 2 차 분석 결과 quadruplicate 샘플에서 수행 되었다 (n = 4 생물 복제) 세포 생존 능력에 부정적인 영향을 미쳤다 화합물을 제외 하 고 어떤 화합물 reproducibly 매체에서 APOB를 낮은 수를 결정 하. 원래 24 후보 화합물의 4 재현 된다는 것을 발견 했다 (p 0.05) (그림 4B-C). 추가 연구, 이러한 화합물의 2 부정적인 영향 세포 생존 능력, APOB에 관찰 된 감소 가능성이 했다 제안에 발견 했다는 셀 손실의 결과 수. 나머지 두 화합물 후속 연구에 대 한 좋은 후보를 여겨질 것입니다.
그림 1 : 현명한 인간의 Ipsc의 간 차별화. (A) 수확 (왼쪽된 패널)과 수집 후 Ipsc 직전 iPSC 식민지의 형태 세포 감 별 법 (오른쪽 패널)-accutase 치료 후, 셀 3-6 셀/클러스터로 해리 한다. 눈금 막대 차별화 (위)의 각 단계에서 50 µ m. (B) 테이블 보여주는 문화 조건 =. Immunostaining (낮은 패널) 차별화의 각 단계에서 마커 식 식별 하기 위해 수행 되었다. 패널 표시 OCT4 및 Ipsc, SOX17 및 최종 endoderm, HNF4a 및 간 조상 세포, HNF4a 고 미 숙 hepatocyte 같은 셀에 AFP FOXA2에에서 FOXA2 핵 스테인드 DAPI 그리고 HNF4a 및 알 부 민에 상대적으로 hepatocyte 같은 세포 성숙. 바 규모 = 100 µ m (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 96 잘 접시에 인간의 Ipsc의 동종 간 차별화. Immunostaining (A)를 감지 하는 차별화의 하루 20 iPSC 파생 hepatocytes 포함 된 96 잘 접시의 각 개별 잘 수행한 알 부 민 및 (B) HNF4a. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 작은 분자 검사 사용 하 여 인간의 iPSC 파생 hepatocytes. (A) iPSC 파생 hepatocytes의 매체에서 ABOB의 수준을 줄일 수 있는 화합물을 식별 하는 데 사용 하는 방법의 개요 개요. (B) 표시 theresults 87 우물의 매체에서 APOB의 수준을 검출 하는 ELISA 분석 결과의 그래프 (n = 87) iPSC 파생 hepatocytes (파란색)의 또는 undifferentiated Ipsc (주황색). 이러한 데이터 Z 요소를 계산 하는 데 사용 되었다 (Z' = 0.73). (C) 그래프 표시 후 약물: iPSC 파생 hepatocytes의 문화 매체에서 APOB의 농도의 비율을 사전 마약 SC3 RSL 설정에서 998 화합물과 24 h에 대 한 치료. (D) 그래프 (C)에 표시 하는 데이터의 z-점수를 보여주는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 기본 안타의 유효성 검사. (A) 테이블 APOB를 줄일 수 있는 것으로 기본 화면에서 확인 된 화합물을 보여주는. (B, C) 후 마약에 화합물의 영향을 보여주는 막대 그래프: 사전 마약 APOB 농도 비율 (B) 세포 생존 능력 (C) iPSC 파생 hepatocytes에 후속 분석에서 화합물과 치료. 오차 막대 반영 ± SEM (n = 4 생물 복제); * p 0.05입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
기반으로 하는 대상 약물 발견, 작은 분자 식별 됩니다 특정 단백질의 활동에 영향을 주는 많은 기존 심사 활동의 초점이 되었습니다. 이 이렇게는 수많은 제약, 반전 형, 고전 학, 바탕 화면을 제공 하 고 있지만 임상 효능1되었습니다 일등석에서 화합물을 식별 하는 것에 더 성공한 되었습니다. Phenotypic 약물 발견에 단점은 적절 한 질병 모델의 가용성에 의존입니다. 이 질병의 셀 모델을 사용할 수 없을 때 도전이 될 또는 일반적인 연구 동물 종의 임상 증상을 정리 하지 못할 때 수 있습니다. 그러나, 환자의 체세포에서 Ipsc를 생성 하는 기능 문화3모델 인간의 질병에 새로운 기회를 제공 했다. 희귀 유전 질환과 같은 일부 질환, 환자 번호에 액세스 하 고 동의 하기 어려운 몇 될 수 있습니다. 그러나, 게놈 엔지니어링의 도래와 함께 그것은 원인이 돌연변이 희귀 질환의 희귀 한 모델 수 iPSC 게놈으로 소개를 상대적으로 간단 합니다.
Ipsc 손이 되 면, 그것은 질병의 증상 참고 적절 한 세포 유형을 생산 하는 데 필요한입니다. 예를 들어 신경 기능에 영향을 미치는 질병 hepatocytes9,18 할 수 그에 영향을 미치는 간 또는 담 즙 상피 세포에 대 한 연구19, 신경 또는 명과17생성 해야 할 수도 있습니다. 20 , 21. 약물 발견에 대 한 Ipsc의 사용을 고려할 때 경고의 수를 소개 하는이 요구 사항. 첫째, 그것은 질병의 세포질 기초를 이해 하는 것이 중요입니다. 셀 위치 또는 환경에 따라 특성을 채택 하는 경우에 특히, 도전 수 있습니다. 이 차이 유전자 식 프로필에 있는 hepatocytes 및 간 lobule 내의 그들의 위치에 의존 하는 효소 기능에 대 한 사실 수 있습니다. 둘째, 어떤 셀 격리 작업 중단 간 경 변, 신경 근육 학 질병 등 셀 통신 등 염증에 의해와 같은 영향을 그 조직 구조를 반영 하는 질병의 연구를 방지할 수 있습니다 염증 성 대 장 질환입니다.
공부 하 고 간 질환, 여러 연구 그룹 Ipsc13,,2223,,2425에서 hepatocyte 같은 세포를 생성 하는 프로토콜을 설명 했습니다. 이러한 프로토콜의 대부분은 효율적인, 기술은 한계가입니다 셀 신선한 hepatocytes의 함수 정리 완전 하지 않습니다. 즉, 셀 Ipsc 디스플레이에서 특정된 변이의 영향을 평가 하는 데 필요한 함수 생성 여부를 결정 하는 것이 중요 하다. 식을 완전히 일치 하지 않는 유전자 중 신선한 hepatocytes에서 발견 되는 CYP450 단백질25,26인코딩. 이 단백질의 여러 약물 대사 및 xenobiotic 응답 역할 있다. 활성 대사 산물의 생성을 필요로 하는 많은 약물이 iPSC 파생 hepatocytes에는 영향을 받을 수 있기 때문에 스크린의 디자인을 고려할 때 중요 하다. hepatocytes의 품질 향상을 위한 노력에는 적극적으로 추구한27되 고 있습니다. 주의 사항에 불구 하 고 여러 연구 결과 증명 Ipsc 환자 선된 천 성 간 물질 대사에서에서 파생 된 문화9 질병의 이상 거울 hepatocyte 같은 세포 생성을 성공적으로 사용할 수 있는 , 18 , 28 , 29.
성공 하려면 스크린,는 Ipsc에서 hepatocytes의 동질적인 차별화를 위해 중요 하다. 96 잘 접시에 차별점 고품질 hepatocytes 항복 실패, 그것은 가장 일반적으로 부모의 Ipsc의 품질이 나 Ipsc 최적의 조건 하에서 문화를 인해. Ipsc의 Pluripotency 프로토콜 1.2에에서 설명 된 대로 매일 변화 높은-품질 매체에서 문화에 의해 신중 하 게 유지 합니다. 문화 접시에 만능 세포의 밀도 합칠 셀 될 경우 그들은 pluripotency를 잃게 하 고 자연스럽 게 차별화 경향이 있기 때문에 신중 하 게 모니터링 해야 합니다. 또한 보면 pluripotency 촉진 생리 산소 농도에서 세포를 배양을 분화의 일부 단계 동안 도움이 됩니다. 그러나, 적절 한 장비를 사용할 수 없는 경우 그것은 여전히 문화 만능 세포와 분화 유도에 주변 산소를 사용할 수 있습니다. 정기적으로 식 등 10 월-3/4, NANOG, TRA-1-60 문화 조건에 광범위 한 차별점을 수행 하기 전에 여러 pluripotency 마커의 측정 하 여 재고 Ipsc의 pluripotency를 정의 하는 것이 좋습니다. 우리는 또한 때 셀에서 높은 효율 endoderm를 형성, 그들은 셀 시트 접시의 표면에서 울리기 경향이 있다 관찰. 우리는 간단히 iPSC 파생 endoderm 0.02 %EDTA 솔루션 셀 셀 분리를 줄이는 데 도움이 치료를 발견 했다. 마지막으로, 효율적인 차별점에 필요한 셀의 최적 농도 iPSC 라인 사이 다 수 있습니다. 세포 분리에 영향을 줄 수 있습니다. 이러한 이유로, 그것은 경험적으로 새로운 iPSC 문화와 함께 작업 하는 경우에 특히 효율적 차별점에 필요한 세포의 농도 결정 하는 것이 중요.
요약, 우리는 화학 화면 호환 되는 Ipsc에서 hepatocyte 같은 세포를 생성 하는 단계별 차별화 프로토콜을 설명 했습니다. Hepatocyte 같은 셀 96 잘 접시, monolayers로 생산과 프로세스는 효율적이 고 재현. 우리 문화 매체에서 APOB의 저수준에 그들의 능력에 대 한 화합물을 심사의 타당성을 보여줍니다. 차별화 형식 여러 분석 ELISA, qRT-PCR, 및 높은 콘텐츠 이미징 등와 호환 됩니다. 우리는 필드 접근 잠재적인 치료제를 식별 하는 데 유용 찾을 것 이다 믿을 hepatocyte 차별화와 미래의 응용 프로그램5,30에 기능에 영향을 미치는 통로의 약리 식별에 대 한.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국가 학회 (DK55743, DK087377, DK102716 및 HG006398에 S.A.D)에 의해 지원 되었다. 우리는 박사 Behshad Pournasr, 닥터 제임스 해 슬 롭 그들의 공헌에 대 한 란 Jing를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
- Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
- DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
- Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
- Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
- Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
- Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
- Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
- Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
- Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
- Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).
