Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

استخدام الإنسان التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة مثل تتمثل الخلايا لاكتشاف المخدرات

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57194
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

Summary

ويصف البروتوكول المعروضة هنا منبر لتحديد الجزيئات الصغيرة لعلاج أمراض الكبد. ويرد وصف خطوة بخطوة تفاصيل كيفية التفريق بين إيبسكس في الخلايا التي تحتوي على خصائص تتمثل في لوحات 96-جيدا، واستخدام الخلايا للشاشة للجزيئات الصغيرة مع الأنشطة العلاجية المحتملة.

Abstract

القدرة على تمييز الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (إيبسكس) إلى الخلايا مثل تتمثل (عملية) يوفر فرصاً جديدة لدراسة أخطاء فطرية في الأيض الكبدي. ومع ذلك، يتطلب الإجراء توفير منبر يعتمد تحديد الجزيئات الصغيرة التي يمكن أن تستخدم لعلاج أمراض الكبد، ثقافة بتنسيق متوافق مع فحص آلاف مركبات. هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام ثقافة محددة تماما الظروف التي تسمح للتفريق بين إيبسكس البشرية إلى الخلايا مثل تتمثل في زراعة الأنسجة 96-جيدا لوحات استنساخه. كما أننا نقدم مثالاً على استخدام المنصة لمركبات الشاشة لقدرتها على خفض الابوليبوبروتين ب (أبوب) تنتج من خلايا الكبد المتولدة من مريض الكوليستيرول عائلية المستمدة من اللجنة التوجيهية. توافر منصة متوافق مع اكتشاف المخدرات ينبغي السماح للباحثين التعرف على علاجات جديدة للأمراض التي تؤثر على الكبد.

Introduction

ويعتمد النجاح في تحديد الأدوية التي يمكن استخدامها لاستهداف مرض نادر على تطوير الاختبارات التي يمكن استخدامها لفرز. الفرضية أو الشاشات المستندة إلى الهدف (عكس الصيدلة) مفيدة ولكن تحتاج إلى فهم تفصيلي للأساس الجزيئي للمرض. شاشات المظهرية (علم الصيدلة الكلاسيكي) تجنب الحاجة إلى فهم تفصيلي للمسارات البيوكيميائية، ولكن بدلاً من ذلك تعتمد على تطوير النماذج التي تعكس بدقة الفسيولوجيا المرضية لهذا المرض. وعلى الرغم من الحماس للنهج المستندة إلى الهدف، تكشف التحاليل المخدرات إدارة الأغذية والعقاقير المعتمدة في الدرجة الأولى أن شاشات المظهرية كانت أكثر نجاحا بكثير1. والهدف العام لهذا الأسلوب إنشاء منبر للإنتاجية العالية الفحص التي يمكن استخدامها لتحديد الجزيئات الصغيرة لعلاج أمراض الكبد الأيضية. وقد وصفت عدة نماذج في المختبر بما في ذلك خلايا الكبد الأولية والخلايا الكبدي و الخلايا السلف الكبد2. ومع ذلك، معظم هذه النماذج على قيود، وهناك حاجة للنماذج الجديدة التي يمكن أن الخص بدقة الفسيولوجيا المرضية لقصور الكبد الأيضية في الثقافة. في الآونة الأخيرة، الخلايا الجذعية pluripotent البشرية جنبا إلى جنب مع تحرير الجينات قد أتاح فرصة لنموذج حتى أندر من الأمراض النادرة في الثقافة دون الحاجة إلى الوصول إلى المرضى مباشرة3. أثناء استخدام إيبسكس الخاصة بالمريض كما أداة لاكتشاف الجزيئات الصغيرة لعلاج أمراض الكبد نادرة معقولة من الناحية المفاهيمية، هناك فقط عدد قليل من التقارير التي تثبت جدوى هذا النهج4. ومع ذلك، أنشأنا مؤخرا منصة التي تستخدم خلايا الكبد المستمدة من اللجنة التوجيهية لتحديد الأدوية التي يمكن إعادة توجيه الغرض منه لعلاج أوجه القصور في الأيض الكبد5بنجاح.

ويوضح هذا البروتوكول عملية التفريق بين إيبسكس البشرية إلى الخلايا مثل تتمثل في لوحات 96-جيدا واستخدامهم للشاشة مكتبة جزيئات الصغيرة. فهو يصف أيضا تحليل نقطة النهاية باستخدام الكوليستيرول كمثال على أمراض الكبد الأيضية. ينبغي أن يكون هذا النهج مفيداً لدراسة دور والتطبيق من الجزيئات الصغيرة في سياق أمراض الكبد المعدية وأمراض الكبد الأيضية وسمية العقاقير وغيرها من اضطرابات الكبد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-ثقافة الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

  1. طلاء الماشوب البشري ه-كادهيرين Fc الانصهار البروتين (E-كندي-Fc) أو المصفوفات الأخرى مناسبة للثقافة هبسك 6
    1. تمييع ه-كندي-Fc إلى 15 ميكروغرام/مل مع دولبيكو 's "فوسفاتيبوفيريد المالحة" التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم (دببس (+)).
    2. معطف أطباق زراعة الأنسجة تعليق 100 ملم مع 5 مل من المخفف ه-كندي-Fc واحتضان في ˚C 37 على الأقل 1 حاء الركازة إزالة واستبدال مع 5 مل متوسطة (مثلاً، mTeSR1 يشار م والمتوسطة من الآن فصاعدا)7.
      ملاحظة: أعد ثقافة الوسيلة المستخدمة في هذا البروتوكول عقب البروتوكولات المنشورة7. بيد عدة الاستعدادات وسائل الإعلام الأخرى وقد وصف، أو متاحة تجارياً، التي يحتمل متوافقة مع الإجراء.
    3. استرداد قنينة إيبسكس cryopreserved من النتروجين السائل. ذوبان الجليد في 37 ˚C حتى تبقى كريستال الثلج صغيرة. بلطف "الماصة؛" الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل عقيمة التي تحتوي على 4 مل م-المتوسطة.
    4. الطرد المركزي في ز 300 x 5 الحد الأدنى إزالة المادة طافية ولطف إعادة تعليق الخلايا مع 5 مل المتوسطة وتستكمل مع 10 ميكرون من Y-27632، مثبط انتقائي كيناز البروتين تحتوي المرتبطة رو، ولفائف ملفوف (روك).
    5. إزالة م المتوسطة من الخطوة 1.1.2، ونقل 5 مل خلايا من الخطوة 1.1.4 إلى تعليق 100 ملم ه كاد-نادي-المغلفة بزراعة الأنسجة الأطباق.
  2. الحفاظ على إيبسكس البشرية في الثقافة
    1. وبمجرد التوصل إلى إيبسكس حول كونفلوينسي 80%، إزالة ثقافة متوسطة ويغسل مرة واحدة مع الكالسيوم والمغنيسيوم مجاناً دببس (-). نضح دببس (-) وإضافة كمية كافية من حل يدتا 0.02 في المائة لتغطية اللوحات، ثم احتضانها ليصل إلى 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: ينبغي أن تتضمن اللوحة في التقاء 80%، حوالي 2 × 107 الخلايا. من المهم عدم كسا الخلايا، ويضمن احتفاظ الخلايا التشكل غير متمايزة. يمكن تحديد بلوريبوتينسي للخلايا بواسطة تلطيخ مع الخلايا الجذعية علامة هيئة تنظيم الاتصالات-1-60 أو ما يعادل8.
    2. بمجرد أن تبدأ الخلايا لإطلاق سراح، إزالة الحل يدتا 0.02 في المائة والفيضانات الطبق مع 10 مل من م المتوسطة للإفراج عن الخلايا. المعونة مفرزة إيبسكس بلطف بيبيتينج.
      ملاحظة: وقت حضانة متوسط الخلايا لفصل حوالي 3 دقيقة، ولكن هذا يحتاج إلى يتحدد تجريبيا لكل خط اللجنة التوجيهية. ينبغي الإفراج عن الخلايا كمجموعات صغيرة تحتوي على حوالي 5-10 إيبسكس كل كتلة.
    3. نقل 1/10 الخلايا المعلقة الواحدة الطازج ه-كندي-نادي المغلفة 100 ملم تعليق زراعة الأنسجة طبق يحتوي على 5 مل م-المتوسطة. احتضان الثقافات في 37 ˚C تحت 4% O2%5 CO2 والتغير المتوسط يوميا.
      ملاحظة: على الرغم من أن إيبسكس بشكل روتيني تستزرع الظروف الفسيولوجية الأكسجين لتعزيز بلوريبوتينسي، إيبسكس يمكن أيضا زراعتها باستخدام الأكسجين المحيطة.

2-التفريق بين إيبسكس البشرية إلى الخلايا مثل تتمثل في لوحات 96-جيدا

ملاحظة: يصف هذا القسم التفريق بين إيبسكس في تنسيق متوافق مع الفحص. باستخدام هذا النهج، من الممكن للحث على إيبسكس البشرية التفريق وشكل الخلايا مثل تتمثل في غضون 20 يوما. بينما هذا مناسبة لمعظم فحوصات، يمكن تمديد طول الثقافة لتحسين نضج الخلايا.

  1. طلاء ألواح زراعة الأنسجة 96-جيدا مع انخفاض عامل نمو الغشاء مصفوفة
    1. إعداد المخزون بتمييع المصفوفة إلى 2 مغ/مل مع DMEM/F12 العقيمة المثلج زراعة الأنسجة المتوسطة. تقسيم المصفوفة إلى 250 ميكروليتر مختبرين وتخزينها في-80 ˚C حتى المطلوبة. تشيل 10 مل من DMEM/F12 على الجليد ل 30 دقيقة استرداد 250 ميكروليتر قاسمة للأسهم مصفوفة 2 مغ/مل وذوبان الجليد على الجليد.
    2. ضم المصفوفة مع 10 مل من البرد DMEM/F12 بالاختلاط بلطف باستخدام ماصة مبردة مسبقاً جعل التركيز النهائي 0.05 مغ/مل.
    3. نقل 100 ميكروليتر من مصفوفة المخفف لكل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة 96-جيدا. احتضان في 37 ˚C، 4% O25% CO2 على الأقل 1 حاء تجاهل المصفوفة واستبدال مع 50 ميكروليتر من M-المتوسطة الواحدة وكذلك. تخزين في 37 درجة مئوية، 4% O2%5 CO2 حتى حاجة.
  2. لوحة خلايا للتمايز
    1. الثقافة إيبسكس على ألواح 100 ملم حتى الاقتراب التقاء 80% من الخلايا. تأكد من أن اللوحة تحتوي على حوالي 2 × 107 الخلايا. تحديد أرقام خلية بخلية تدفق سيتوميتير أو هيموسيتوميتير.
      ملاحظة: مع التجربة، يمكن الحكم على نوعية الخلايا إيبسكس بالفحص المجهري؛ ومع ذلك، ما يقرب من 98 في المائة الخلايا ينبغي التعبير عن علامات بلوريبوتينسي مثل حانمه هيئة تنظيم الاتصالات-1-60 عند قياسه بنظام مراقبة الأصول الميدانية أو إيمونوستينينج. من المهم أن الخلايا تظل الفاصل بنشاط ولا هي متضخمة.
    2. حصاد إيبسكس من كل لوحة 100 ملم، نضح المتوسطة الثقافة وشطف مع 5 مل دببس (-). استبدال الشطف مع 3 مل من محلول مفرزة الخلية (مثلاً، أككوتاسي) واحتضانها لحوالي 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 4% O25% CO2.
      ملاحظة: من المهم أن تتبع مفرزة الخلايا بالفحص المجهري. لا لا على هضم مع أككوتاسي. والهدف الإفراج عن الخلايا كمجموعات صغيرة مع الحد الأدنى من العلاج.
    3. بمجرد أن تبدأ الخلايا في فصل، الحصاد بإضافة 7 مل م-المتوسطة. "الماصة؛" عدة مرات أن تنأى مستعمرات الخلايا في مجموعات صغيرة في جميع أنحاء 3-6 خلايا (الشكل 1A).
    4. جمع في إيبسكس إلى أنبوب 15 مل العقيمة أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في ز 300 x 5 الحد الأدنى إزالة المادة طافية وإعادة تعليق بيليه الخلية في 5 مل م والمتوسطة.
    5. توزيع بالتساوي الخلايا على لوحات المغلفة بمصفوفة 96-جيدا قبل بيبيتينج ميكروليتر 50 تعليق الخلايا في كل بئر. لإعداد كل لوحة 96، حسنا، استخدم لوحة 100 ملم واحد من إيبسكس مع الخلايا في حوالي 80% كونفلوينسي الذي يحتوي على حوالي 5 × 106 خلايا التفريق بين الإعداد. استخدام ماصة متعددة القنوات لتسريع هذه العملية. ثقافة الخلايا بين عشية وضحاها في ˚C 37, 5% 4% O2CO2.
      ملاحظة: من المهم أن تودع عددا متساويا من الخلايا في كل بئر لضمان الاختلاف استنساخه.
  3. الحث على التفريق بين الخلايا
    1. دراسة لوحات 96-جيدا بالفحص المجهري التأكد من أن الخلايا تغطي 70 في المائة على الأقل من سطح كل فرد كذلك. إذا كانت التغطية أقل من 70%، يستعاض عن المتوسط بمتوسطة طازجة واحتضانها 24 ساعة إضافية في ˚C 37، 4% O25% CO2.
      ملاحظة: حضانة الخلايا لأكثر من 48 ساعة بعد الطلاء دون الذي يحفز التمايز عادة يقلل من كفاءة التمايز. التمايز وستحدث أيضا استخدام الأكسجين المحيطة، على الرغم من أن قد تكون الكفاءة المتضررة.
    2. ليوم 1 إلى 2 يوم من التمايز، استبدال المتوسطة الثقافة مع ربمي تكملة مع 2% B27 (بدون الأنسولين)، 100 نانوغرام/مليلتر أضافت A و 10 نانوغرام/مل BMP4 20 نانوغرام/مل FGF2. إضافة 100 ميكروليتر من المتوسطة كل بئر واحتضان في ˚C 37، في المحيط س25% CO2 مع تغير متوسط يومي لمدة يومين.
      ملاحظة: التعامل مع عدد كبير من لوحات 96-جيدا تتطلب استخدام ماصة ساعد أو الروبوت. الممصات 12 قناة وقناة 96 مثالية للتغير المتوسط اليومي.
    3. ليوم 3 إلى يوم 5 من التمايز، تستكمل استبدال المتوسطة الثقافة مع ربمي مع % 2 B27 (بدون الأنسولين) و 100 نانوغرام/مليلتر أضافت أ ثقافة الخلايا في ˚C 37، في المحيط س25% CO2 مع تغير المتوسط اليومي لمدة 3 أيام.
    4. في تمايز يوم 5، قبل استبدال مع الطازجة الثقافة المتوسطة، علاج كل جيدا مع 100 ميكروليتر 0.02% يدتا الحل 30 ثانية، ثم إزالة واستبدال مع الطازجة الثقافة المتوسطة.
      ملاحظة: إذا كان التفريق بين للأنسجة فعالة، أحادي الطبقة التفريق بين الخلايا عرضه لتقشير من اللوحة. علاج قصيرة مع 0.02% يدتا الحل يساعد على تخفيف مفرزة الخلية. لا يؤثر هذا العلاج التمايز إلى خلايا الكبد.
    5. للتفريق بين 6 أيام إلى 10، استبدال المتوسطة الثقافة مع ربمي/2% B27 (مع الأنسولين) وتستكمل مع 20 نانوغرام/مل BMP4 و 10 نانوغرام/مل FGF2 واحتضان في ˚C 37, 5% 4% O2CO2 لمدة 5 أيام مع تغير المتوسط اليومي. هذه المرحلة يدفع الخلايا تفرق في الخلايا الكبدية السلف.
    6. للتفريق بين 11 يوما إلى 15، استبدال المتوسطة الثقافة مع ربمي/2% B27 (مع الأنسولين) تستكمل مع 20 نانوغرام/مليلتر هجف. احتضان في ˚C 37, 5% 4% O2CO2 لمدة 5 أيام مع تغير المتوسط اليومي.
    7. للتفريق بين 16 يوما إلى 20، يستبدل المتوسطة الثقافة متوسطة ثقافة خلية تتمثل (HCM) وتستكمل مع 20 نانوغرام/مليلتر من Oncostatin-M (OSM). احتضان الخلايا في ˚C 37، في المحيط س25% CO2 مع تغير المتوسط اليومي لمدة 5 أيام.
      ملاحظة: إمكانية تكرار نتائج للتفريق بين الآبار الفردية يمكن تحديد كفاءة بقياس المستوى النسبي للزلال أو وكالة فرانس برس APOB يفرزها أليسا في المتوسط (انظر 3.2).

3-صغيرة جزيء الفرز

ملاحظة: فيما يلي وصف للإجراءات المستخدمة لتحديد المركبات التي يمكن استخدامها لتخفيض مستوى أبوب في الأجلين المتوسط وتتمثل مثل الخلايا المستمدة من الكوليستيرول الأسرية إيبسكس. وقد وصفت وصفاً للنموذج واستخدامها في التعرف على الكوليسترول تخفيض الأدوية بالتفصيل سابقا5،9. في المثال الحالي، تم فحص المركبات 1,000 من مكتبة "جمع مجمع ولاية كارولينا الجنوبية" (3من اتفاقية استكهولم). تم اختبار كل مجمع بتركيز 2 ميكروغرام/مل.

  1. المعاملة للجنة التوجيهية-المشتقة من خلايا الكبد مع جزيئات صغيرة
    1. تمييع مكتبة المجمع الرئيسي لإنشاء لوحات مخزون العمل مع المركبات بتركيز 20 ميكروغرام/مل في [دمس] 2% ومخزن في ˚C-20.
    2. إعداد لوحات 96-جيدا ما يكفي من خلايا الكبد المستمدة من اللجنة التوجيهية للسماح لكل مجمع لفحصها.
      ملاحظة: ستحدد عدد المركبات فحص عدد 96-جيدا لوحات المطلوبة. وبصفة عامة، واحد جيد ينبغي أن تعد لكل الآبار المجمع، بالإضافة إلى إضافية لأي عينات مراقبة. عادة يتم تجنب الآبار الأبعد من اللوحة تقليل احتمال وقوع تأثيرات الحافة التي يمكن الفاسدة التفسير. يمكن تحديد عدد الزيارات استخدام الأسلوب الحرز z دون الحاجة إلى استخدام replicates. في حالة تضمين replicates، أنها أكثر ملاءمة لاستخدام الاختبار t.
    3. عند انتهاء التمايز (يوم 20، انظر 2.3.7)، تحل محل المتوسطة الثقافة مع 100 ميكروليتر من HCM جديدةوتستكمل مع 20 نانوغرام/مل م Oncostatin. احتضان في 37 ˚C، 4% O25% CO2 للضبط 24 h. استرداد المتوسطة الثقافة إلى لوحة 96-بئر جديدة ومخزن في ˚C-20. استخدم هذا النموذج لحساب مستوى أبوب في المتوسط قبل الإضافة للمخدرات.
    4. إضافة ميكروليتر 90 من HCM جديدة تستكمل مع 20 نانوغرام/مليلتر من Oncostatin-M في كل بئر. إضافة 10 ميكروليتر من كل مجمع من المخزون العامل بعد الاختلاط بيبيتينج. إضافة [دمس] إلى 0.2 في المائة السيطرة على الآبار تتطابق مع التركيز النهائي في العينات المعالجة واحتضان في 37 ˚C، جمع المتوسطة الثقافة المحيطة س25% CO2 للضبط 24 حاء وتخزين في ˚C-20. استخدم هذا النموذج لتحديد مستوى أبوب بعد العلاج بالمركبات.
    5. اختياري-يمكن معالجة الخلايا المتبقية إيمونوستينينج، وبقاء الخلية، أو تحليلات لمستويات مرناً باستخدام نهج قياسية.
      ملاحظة: تم تصميم هذه الشاشة لتحديد الأدوية التي كان لها أثر سريع على مستويات أبوب. ومع ذلك، اعتماداً على نموذج المرض، وفحوصات المصب، أو إليه عمل المخدرات، قد يكون من المفيد لعلاج العينة لعدة أيام.
  2. تحديد مستويات APOB قبل أليسا
    1. تحديد تركيز الابوليبوبروتين ب (أبوب) من كل ما قبل وما بعد المخدرات تعامل العينات باستخدام مجموعة تطوير أليسا APOB بشرية عقب البروتوكولات الخاص بالشركة المصنعة.
    2. إعداد الحلول التالية
      1. المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، تتألف من 0.05% 20 توين في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4. تخزين في 4 ˚C حتى الاستخدام.
      2. المخزن المؤقت للحضانة، تتألف من 0.05% 20 توين و 0.1% البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4. تخزين في 4 ˚C حتى الاستخدام.
    3. تحضير الأجسام المضادة أبوب (ماب 20/17) بإضعاف إلى 2 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4. إضافة 100 ميكروليتر من جسم المخفف كل بئر واحتضان في 4 ˚C بين عشية وضحاها.
    4. إزالة الضد من لوحات المقايسة وتغسل جيدا مرتين مع 200 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4 كل.
    5. إضافة 200 ميكروليتر/جيدا من 0.05% 20 توين، 0.1% البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4 واحتضان على منصة تهتز ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
    6. إعداد منحنى المعياري 8 نقطة استخدام 0.05% 20 توين و 0.1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4 مع التركيزات التالية من أبوب: 300 نانوغرام/مل، 200 نانوغرام/مليلتر و 175 نانوغرام/مل، 150 نانوغرام/مليلتر، 125 نانوغرام/مل، 100 نانوغرام/مليلتر، 75 نانوغرام/مليلتر و 50 نانوغرام/مل.
    7. تمييع عينات الاختبار 1:4 مع 0.05% 20 توين و 0.1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4.
    8. بعد 1 ساعة من حجب مع المخزن المؤقت للحضانة، تجاهل المخزن المؤقت وغسل الأطباق بالانزيم خمس مرات مع 200 ميكروليتر من 0.05% 20 توين في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4.
    9. تماما إزالة أي مخزن مؤقت الغسيل المتبقية ونقل ميكروليتر 90 من العينات مخففة والمعايير أبوب إلى لوحات المقايسة. احتضان في درجة حرارة الغرفة على شاكر ح 1.
    10. تجاهل العينة وتغسل مع 200 ميكروليتر 0.05% 20 توين في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4 كل بئر. كرر يغسل ما مجموعة 5 مرات. إضافة 100 ميكروليتر الواحدة من ماب LDL 11-البيوتين المخفف 1:1,000 جيدا في 0.05% 20 توين و 0.1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4. احتضان في درجة حرارة الغرفة على منصة تهتز ح 1.
    11. تجاهل الكاشف وتغسل مع 200 ميكروليتر الواحدة وكذلك الغسيل المخزن المؤقت 5 مرات. إضافة 100 ميكروليتر كل بئر جسم ستريبتافيدين-برنامج الصحة الإنجابية (1:1، 000 تمييع استخدام المخزن المؤقت للحضانة)، ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة على منصة تهتز ح 1.
    12. تجاهل الكاشف وتغسل مع 200 ميكروليتر 0.05% 20 توين في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4 كل بئر. كرر يغسل ما مجموعة 5 مرات. تماما إزالة المخزن المؤقت غسيل المتبقية من لوحات المقايسة وإضافة 100 ميكروليتر كل من تيتراميثيلبينزيدين (TMB) الركيزة الحل جيدا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 دقائق.
    13. مباشرة دون إزالة الركيزة TMB، إضافة 100 ميكروليتر كل من وقف الحل (1N HCl) جيدا.
    14. تحديد امتصاص 450 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.
    15. ويمكن إنشاء منحنى قياسي، باستخدام أسلوب "الانحدار اللوجستي المعلمة أربعة"، ثم يستخدم لتحديد تركيز أبوب في كل عينة10.
    16. فحص المخدرات قبل: نسبة المخدرات بعد أبوب في كل عينة لتحديد المركبات مع احتمال انخفاض أبوب المستويات في الأجل المتوسط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الجيل تتمثل - مثل الخلايا: ويصف الشكل 1 الإطار الزمني للتغييرات التي تحدث أثناء التفريق بين إيبسكس البشرية إلى الخلايا مثل تتمثل. ثقافة إيبسكس في ه-كندي-نادي يوفر حوالي 2 مم قطر المستعمرات التي تعبر عن علامة pluripotent OCT4 (الشكل 1 أ-ب). مورفولوجيا الخلايا المزروعة في مصفوفة ه-كادهيرين ستكون مختلفة قليلاً إلى تلك المزروعة على الأسطح الأخرى. أنها تميل إلى أن تكون مورفولوجيا الأرض مع مساحة سطح هيولى أكبر (الشكل 1A). على الرغم من أن الخلايا الجذعية pluripotent البشرية يمكن أن تكون مثقف كفاءة على عدد من مصفوفات مختلفة11، ثقافة إيبسكس في مصفوفة ه-كادهيرين يعتقد أن زيادة تجانس السكان pluripotent الخلايا ويسمح خالية من إنزيم تلاعب الخلايا أثناء مرور12. ومع ذلك، عدة مصفوفات البديلة، بما في ذلك مصفوفة غشاء الطابق السفلي، لامينينس، فيترونيكتين، والخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF)، يمكن أن تستخدم أيضا للحفاظ على إيبسكس البشرية وكلها ينبغي أن تكون متوافقة مع وصف الإجراء13. وفي جميع الحالات، يمكن تأكيد بلوريبوتينسي الخلية بهيئة تنظيم الاتصالات-1-60 أو ما يعادل8.

للبدء التمايز، ينبغي جمع في إيبسكس كمجموعات صغيرة (الشكل 1A). في بداية المفاضلة، ينبغي أن تشمل الخلايا مطلي قرابة 80 في المائة سطح اللوحة. بعد 5 أيام علاج بعوامل النمو، أعرب الخلايا البروتينات التي يتم التعبير عنها مميز في الأنسجة نهائية مثل SOX17 و FOXA2 (الشكل 1B). في هذه المرحلة، ما يزيد عن 90% الخلايا عادة هذه العلامات. بعد 5 أيام من التمايز، يحول الأنسجة لمصير كبدي، وأعرب الخلايا بالإضافة إلى FOXA2، HNF4a، التي يمكن تحديدها طوال الفترة المتبقية عملية التمايز (الشكل 1B). كالخلايا تعتمد مصير الكبد، أنها يجب أن تغطي سطح اللوحة كأحادي الطبقة. بعد إضافة هجف، تبدأ الخلايا للتعبير عن البروتينات التي توجد في الجنين خلايا الكبد بما في ذلك وكالة فرانس برس (الشكل 1B). ويمكن ملاحظة قطرات الدهن داخل السيتوبلازم للخلايا. عند انتهاء التمايز، تعتمد الخلايا مورفولوجيا cuboidal مع نواة تحتوي على نوكليولي بارز والسيتوبلازم كبيرة مع عدة قطرات الدهن. وستكون مجموعة فرعية من الخلايا مثل تتمثل متعدد الأنوية. أعرب معظم الخلايا مرجع واسعة النطاق تتمثل البروتينات بما في ذلك الزلال (الشكل 1B)14.

الشاشة إنتاجية عالية فعالة باستخدام الكوليستيرول كنموذج مرض: ويعكس الكوليستيرول المفرط تركيزات منخفضة الكثافة lipoprotein-الكوليسترول (LDL-C) في المصل. في الكوليستيرول الأسرية (FH)، زيادة مستوى المصل LDL-C يرجع أساسا إلى الطفرات في مستقبلات Low-density lipoprotein (لدلر) الذي يتوسط امتصاص LDL-c لإزالة الألغام بخلايا الكبد. لقد قمنا بوصف جيل إيبسكس من مريض مع الكوليستيرول العائلي متماثل واستخدامها في توليد خلايا الكبد التي لها نسخ متطابقة للمريض أمراض الكبد في الثقافة9سابقا. وثبت أن هذه الخلايا يمكن أن تستخدم بنجاح كمنصة لاكتشاف المخدرات. عندما تم فحص مكتبة ~ 2,500 المخدرات، وجد أن جليكوسيدات القلب قدرة غير متوقعة على خفض LDL-C في خلايا الكبد المستمدة من اللجنة التوجيهية، خلايا الكبد البشرية الأساسية، وفي الفئران مع كبد أنسنة. وعلاوة على ذلك، عند فحص سجلات المرضى الطبية، وجدنا أن الكولسترول انخفضت المستويات في المرضى التي وضعت من أجلها غليكوزيد القلب لعلاج أمراض القلب. وأكدت هذه الدراسات أن خلايا الكبد المستمدة من اللجنة التوجيهية يمكن استخدامها بنجاح في الشاشات للتعرف على المداواة.

من أجل توفير منصة متوافق مع الفحص، المهم أن الاختلاف استنساخه والتقليل إلى أدنى حد من بئر للتباين. ويبين الشكل 2 نتائج إيمونوستينينج في كل من لوحة 96-جيدا للكشف عن HNF4a والزلال في يوم 20 من التفريق جيدا. وكما يتبين في الشكل، توزيع هذه البروتينات تتمثل مماثلة عبر جميع الآبار.

عنصر البروتين وسط LDL-c هو أبوب. هنا، نحن استخدمت إيبسكس للشاشة APOB خفض مركبات لتوفير مثال عن استخدام خلايا الكبد المستمدة من اللجنة التوجيهية لجزيء صغير الفحص (الشكل 3A). يمكن بسهولة قياس APOB في الحل بإليزا. حيث يمكن أن يؤديها أليسا على إعداد كبيرة من العينات، يمكن استخدامه كأساس لشاشة. مدى ملاءمة أي تحليل لفحص عالية الإنتاجية أفضل مصممة باستخدام مقياس يسمى Z-عامل (أو Z ')15. هذه المعلمة الإحصائية حساب فعالية مقايسة التمييز بين عينات السيطرة الإيجابية والسلبية. مقايسة مع عامل Z > 0.5 تعتبر متوافقة مع شاشة15. كما يمكن أن يرى في الشكل 3B، ض ' للانزيم أبوب = 0.73، مما يؤكد مدى ملاءمة استخدام المنصة لاكتشاف المخدرات.

تحديد هوية المركبات التي لها القدرة على انخفاض مستويات أبوب في الأجلين المتوسط والثقافة للجنة التوجيهية - اشتقاق خلايا الكبد: لتحديد ما إذا كان المنهاج يمكن أن تستخدم لتحديد المركبات الرواية التي تؤثر على مستويات أبوب، ونحن فحص الجزيئات الصغيرة 1,000 من جمع مجمع ولاية كارولينا الجنوبية (3من اتفاقية استكهولم) ممثل مجموعة لايت (RSL). RSL تم إنشاؤها بواسطة "مركز ساوث كارولينا موسيقى" "اكتشاف العلاجية"، وتشمل المركبات التي تتنوع هيكلياً وتعكس المكتبة الأصل.

المخدرات بعد: تم تحديد نسبة المخدرات قبل أبوب لكل مجمع (الشكل 3) وتحديد مرات كان حققها z-درجة تحليل (الشكل 3D)16. وفي هذه الحالة، تعتبر الجزيئات الصغيرة التي خفضت APOB مع الحرز z ≤-2.0 كالزيارات المحتملة. عند فحص الجزيئات الصغيرة 1,000، عادة ما عدد الزيارات المحتملة مع درجة z ≤ 2.0 نسبيا يمكن التحكم فيها. ومع ذلك، عند إجراء شاشة أكبر، سوف نعتمد على نقاط أكثر تحفظا من ≤-3.0، استناداً إلى المادة 3-سيغما، زيادة الثقة في الأهداف المحتملة. في هذا المثال، حددنا 24 الزيارات المحتملة مع نسبة أبوب التي تختلف من 0.86 إلى 0.44 (الشكل 4 أ). تحليل ثانوي أجريت على عينات كوادروبليكاتي (n = replicates البيولوجية 4) لاستبعاد المركبات التي كان لها أثر سلبي على استمرارية الخلية وتحديد المركبات التي يمكن أن تقلل من تكاثر أبوب في الأجل المتوسط. من المركبات المرشحة 24 الأصلي، أربعة تبين أن استنساخه (ف ≤0.05) (الشكل 4 باء-ج). إلى مزيد من الدراسة، تم العثور على 2 من هذه المركبات ليؤثر على خلية بقاء سلبيا، مما يوحي بأنه من المرجح أن الانخفاض الملحوظ في أبوب أن تكون نتيجة لفقدان الخلية. المركبين المتبقية تعتبر مرشحا جيدا لمتابعة الدراسات.

Figure 1
الشكل 1 : المجوعات التمايز الكبد من البشر إيبسكس. (A) مورفولوجيا المستعمرات اللجنة التوجيهية فورا قبل الحصاد (اللوحة اليمنى) وإيبسكس بعد جمع الخلايا للتمايز (اللوحة اليمنى)-بعد العلاج أككوتاسي، وينبغي أن يمكن فصل الخلايا إلى خلايا/المجموعة 3-6. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) جدول إظهار الثقافة الشروط في كل مرحلة من التمايز (العليا). وأجرى إيمونوستينينج (أفرقة أقل) لتحديد علامة التعبير في كل مرحلة من التمايز. إظهار لوحات OCT4 و DAPI الملون الأنوية في إيبسكس، SOX17، و FOXA2 في الأنسجة نهائية، HNF4a و FOXA2 في الخلايا الكبدية السلف، HNF4a ووكالة فرانس برس في خلايا غير ناضجة تتمثل الشبيهة، و HNF4a والزلال في ناضجة نسبيا مثل تتمثل الخلايا. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : التمايز الكبدي متجانس من إيبسكس البشرية في لوحات 96-جيدا- أجرى إيمونوستينينج على كل بئر الفردية من صفيحة 96-البئر الذي يحتوي على خلايا الكبد المستمدة من اللجنة التوجيهية في يوم 20 من التمايز للكشف عن (أ) الزلال و (ب) HNF4a. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : فحص جزيء صغير باستخدام خلايا الكبد البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية- (أ) نظرة عامة التخطيطي للنهج المتبع لتحديد المركبات التي يمكن أن تقلل من مستويات أبوب في الأجل المتوسط لخلايا الكبد المستمدة من اللجنة التوجيهية. (ب) الرسم البياني ثيريسولتس تبين من مقايسة إليزا للكشف عن مستوى أبوب في الأجل متوسط الآبار 87 (n = 87) من خلايا الكبد المستمدة من اللجنة التوجيهية (أزرق) و/أو متمايز إيبسكس (برتقالي). واستخدمت هذه البيانات لحساب عامل زي (Z ' = 0.73). (ج) رسم بياني عرض المخدرات بعد: علاج المخدرات قبل نسب تركيز أبوب على المديين المتوسط وثقافة من خلايا الكبد المستمدة من اللجنة التوجيهية 24 ساعة مع مركبات 998 من مجموعة RSL3 اتفاقية استكهولم. (د) رسم بياني عرض z-عشرات البيانات المعروضة في (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : التحقق من عدد الزيارات الأولية. (أ) جدول يبين المركبات التي تم تحديدها في الشاشة الأولى أنها قادرة على الحد من أبوب. (ب، ج) شريط الرسوم البيانية التي توضح تأثير المركبات على المخدرات بعد: نسبة التركز APOB المخدرات قبل (ب) وبقاء الخلية (ج) في خلايا الكبد المستمدة من اللجنة التوجيهية تعامل مع المركبات في تحليل المتابعة. تعبر مجالات الخطأ ± ووزارة شؤون المرأة (n = 4 replicates البيولوجي)؛ * ≤0.05 ف . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الهدف على أساس اكتشاف العقاقير، حيث يتم تحديد الجزيئات الصغيرة التي تؤثر على نشاط البروتين محددة، محط اهتمام العديد من الجهود فرز القائمة. رغم أن هذا النهج قد قدمت عديدة المستحضرات الصيدلانية، شاشات استناداً إلى عكس النمط الظاهري، علم الصيدلة الكلاسيكي، كانت أكثر نجاحا في تحديد المركبات في الدرجة الأولى التي كانت فعالة سريرياً1. وضع غير مؤات لاكتشاف المخدرات المظهرية أنها تعتمد على توافر نماذج المرض المناسب. وهذا يمكن أن يكون تحديا عندما تتوفر نماذج الخلية من المرض، أو عندما تفشل الأنواع الحيوانية البحوث المشتركة الخص الأعراض السريرية. ومع ذلك، القدرة على توليد إيبسكس من خلايا جسدية المريض فرصاً جديدة لنموذج الأمراض البشرية في ثقافة3. لبعض الأمراض، مثل الأمراض الوراثية النادرة، يمكن المرضى قليلة العدد، وصعوبة الوصول وموافقته. ومع ذلك، مع ظهور هندسة الجينوم، أنها بسيط نسبيا استحداث الطفرات المسببة في المجين اللجنة التوجيهية، مما يجعل من الممكن نموذج حتى أندر من الأمراض النادرة.

وبمجرد إيبسكس في متناول اليد، من الضروري لإنتاج نوع خلية مناسبة التي تظهر أعراض المرض. على سبيل المثال، قد تتطلب الأمراض التي تؤثر على الوظيفة العصبية توليد الخلايا العصبية أو إطلاق17، في حين أن تلك التي تؤثر في الكبد قد تحتاج إلى خلايا الكبد9،18 أو الخلايا الظهارية الصفراوية لدراسة19، 20 , 21-هذا المطلب يدخل عدد من المحاذير عند النظر في استخدام إيبسكس لاكتشاف المخدرات. أولاً، من المهم أن نفهم الأساس الخلوي للمرض. هذا يمكن أن يكون تحديا، لا سيما عندما الخلايا تعتمد الخصائص على أساس المكان أو البيئة. يمكن أن يكون هذا صحيحاً لخلايا الكبد التي لديها اختلافات في ملامح التعبير الجيني والانزيميه المهمة التي تعتمد على مواقعها داخل الفصيص الكبد. ثانيا، يمكن أن يمنع العمل مع أي من الخلايا بمعزل عن دراسة الأمراض التي تعكس تعطيل في هيكل الأنسجة مثل تليف الكبد أو خلية خلية الاتصالات مثل الأمراض العصبية العضلية، أو تلك التي تتأثر بالتهاب مثل التهاب أمراض الأمعاء.

ووصف مجموعات بحثية عديدة لدراسة أمراض الكبد، بروتوكولات لتوليد تتمثل مثل الخلايا من إيبسكس13،،من2223،،من2425. في حين أن معظم هذه البروتوكولات بكفاءة، الحد من هذه التقنية أن الخلايا لا الخص تماما وظيفة خلايا الكبد جديدة. وهذا يعني أنه من المهم تحديد ما إذا كانت الخلايا المتولدة من عرض إيبسكس المهام اللازمة لتقييم أثر طفرة معينة. بين الجينات التعبير الذي لا يطابق تماما موجودة في خلايا الكبد جديدة تلك ترميز CYP450 البروتينات25،26. العديد من هذه البروتينات أدوار في المخدرات الأيض ورد إكسينوبيوتيك. هذا مهم عند النظر في تصميم شاشة لأن العديد من الأدوية تتطلب توليد نواتج الأيض نشطة، وهذا يمكن أن تتأثر في خلايا الكبد المستمدة من اللجنة التوجيهية. الجهود الرامية إلى تحسين نوعية خلايا الكبد يجري متابعتها بنشاط27. وعلى الرغم من المحاذير، وأظهرت العديد من الدراسات أن إيبسكس المستمدة من المرضى الذين يعانون من أخطاء فطرية في الأيض الكبدي يمكن استخدامها بنجاح لتوليد خلايا تتمثل تشبه مرآة الفسيولوجيا المرضية لهذا المرض في الثقافة9 , 18 , 28 , 29.

للشاشات لتكون ناجحة، من المهم ضمان التفريق بين متجانسة خلايا الكبد من إيبسكس. عندما تفشل الاختلاف في لوحات 96-جيدا أن تسفر عن خلايا الكبد عالية الجودة، الأكثر شيوعاً نظراً أما لرداءة نوعية إيبسكس الأبوية أو ثقافة إيبسكس في ظروف دون المستوى الأمثل. يجب الحفاظ بلوريبوتينسي إيبسكس بالثقافة في متوسط عالية الجودة مع التغيرات اليومية بعناية كما هو موضح في بروتوكول 1.2. كثافة pluripotent الخلايا في الطبق الثقافة ينبغي أن ترصد بعناية، لحالة تصبح الخلايا على روافد أنها تميل إلى تفقد بلوريبوتينسي وتفرق عفويا. كما نجد أن استزراع الخلايا في تركيزات الأكسجين الفسيولوجية يروج بلوريبوتينسي وهو مفيد خلال بعض المراحل من التمايز. ومع ذلك، في حالة عدم توفر المعدات المناسبة، أنها لا يزال من الممكن استخدام الأكسجين المحيطة للثقافة pluripotent الخلايا ويحفز التمايز على السواء. ونحن نقترح تحديد بلوريبوتينسي إيبسكس الأسهم بشكل روتيني بقياس التعبير عن علامات بلوريبوتينسي متعددة بما في ذلك أكتوبر--3/4 ونانج وهيئة تنظيم الاتصالات-1-60 قبل تنفيذ عملية واسعة الاختلاف بغض النظر عن ظروف الثقافة. وقد لاحظنا أيضا أنه عند تشكيل الخلايا الأنسجة بكفاءة عالية، لديهم ميل جلجلة من على سطح أرض اللوحات كأوراق الخلية. وقد وجدنا أن علاج الأنسجة المستمدة من اللجنة التوجيهية الخلايا مع الحل يدتا 0.02 في المائة يمكن أن يساعد على الحد من مفرزة الخلية بإيجاز. وأخيراً، تركيز الخلايا المطلوبة للاختلاف الكفاءة المثلى يمكن أن تختلف بين الخطوط التوجيهية ويمكن أن يؤثر على الخلية المفرزة. ولهذا السبب، من المهم تجريبيا تحديد تركيز الخلايا اللازمة لكفاءة الاختلاف، لا سيما عند العمل مع ثقافة جديدة في اللجنة التوجيهية.

وباختصار، لقد قمنا بوصف بروتوكول تمايز تدريجي أن يولد تتمثل مثل الخلايا من إيبسكس التي تتوافق مع شاشات الكيميائية. وتنتج الخلايا مثل تتمثل مونولاييرس في لوحات 96-جيدا، والعملية تتسم بالكفاءة واستنساخه. علينا أن نظهر إمكانية فحص المركبات لقدرتها على خفض مستويات أبوب في الأجلين المتوسط والثقافة. تنسيق التمايز متوافق مع فحوصات متعددة بما في ذلك أليسا وبكر قرة وتصوير المحتوى عالية. نعتقد أن الحقل سوف تجد في النهج مفيدة لتحديد العلاجات المحتملة وتحديد المسارات التي تؤثر على تمايز تتمثل ووظيفتها في التطبيقات المستقبلية5،30الدوائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة" (DK55743، DK087377، DK102716، و HG006398 إلى احظ). ونود أن نشكر الدكتور بيهشاد بورنصر، والدكتور جيمس Heslop وجينغ ران لمساهماتها.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes  Corning 430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes Corning 430591
96-wells tissue culture plate  Corning 3595
Anti-human Albumin Dako A 0001
Anti-human FOXA2(6C12) Novus Biological H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha Santa Cruz SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody Santa Cruz SC-9081
Anti-human SOX17 R&D AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin  Invitrogen 0050129SA
B-27 Supplement, serum free  Invitrogen 17504044
BMP4 Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase  Invitrogen A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay  Promega 7572
DPBS+(calcium, magnesium) Invitrogen 14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium) Invitrogen 14190-144
DMEM/F-12, HEPES  Invitrogen 11330057
ELISA human APOB ELISA development kit Mabtech 3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) Invitrogen PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)  Lonza CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF) Invitrogen PHC0321
L-Glutamine  Invitrogen 25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Invitrogen 11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC5015
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen 15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1  STEMCELL technologies 5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix  Invitrogen A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES  Invitrogen 22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) Primorigen Biosciences S2071
TMB-ELISA Substrate Solution Thermo Scientific  34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%  Lonza 17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
  3. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  4. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  5. Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
  6. Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
  7. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  8. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  9. Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
  10. DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
  11. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  12. Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
  13. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
  14. Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
  15. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  16. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  17. Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  18. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  19. Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
  20. Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
  21. Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
  22. Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
  23. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
  24. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  25. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  26. Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
  27. Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
  28. Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
  29. Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
  30. Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 135، التي يسببها الجذعية Pluripotent الخلايا، خلية ثقافة، تتمثل التمايز، عالية الإنتاجية الفرز، تتمثل مثل الخلايا، الكوليستيرول
استخدام الإنسان التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة مثل تتمثل الخلايا لاكتشاف المخدرات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J. T., Lamprecht, M. P.,… More

Liu, J. T., Lamprecht, M. P., Duncan, S. A. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (135), e57194, doi:10.3791/57194 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter