Summary
El protocolo que presentamos describe una plataforma para la identificación de pequeñas moléculas para el tratamiento de la enfermedad hepática. Se presenta una descripción paso a paso detallando cómo iPSCs se diferencian en células con características de hepatocitos en placas de 96 pocillos y utilizar las células para detectar pequeñas moléculas con potencial actividad terapéutica.
Abstract
La capacidad de las células madre humanas pluripotentes inducidas (iPSCs) se diferencian en células similares a hepatocitos (HLCs) proporciona nuevas oportunidades para el estudio de errores innatos en el metabolismo hepático. Sin embargo, para proporcionar una plataforma que apoya la identificación de pequeñas moléculas que potencialmente pueden utilizarse para tratar la enfermedad hepática, el procedimiento requiere un formato de cultura que es compatible con la proyección de miles de compuestos. Aquí, describimos un protocolo usando las condiciones de cultivo totalmente definidos, que permiten la diferenciación reproducible de iPSCs humano a hepatocitos como las células en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. También ofrecemos un ejemplo del uso de la plataforma a los compuestos de la pantalla por su capacidad para bajar la apolipoproteína B (APOB) producido a partir de derivados de iPSC hepatocitos generados a partir de un paciente de hipercolesterolemia familiar. La disponibilidad de una plataforma que sea compatible con el descubrimiento de medicamentos debería permitir a los investigadores identificar nuevas terapias para enfermedades que afectan el hígado.
Introduction
Éxito en la identificación de los medicamentos que pueden usarse para atacar una enfermedad rara se basa en el desarrollo de los análisis que pueden utilizarse para la investigación. Hipótesis o pantallas basado en destino (farmacología inversa) son útiles, pero requieren una comprensión detallada de la base molecular de la enfermedad. Pantallas fenotípicas (farmacología clásica) evitar la necesidad de una comprensión detallada de las vías bioquímicas, pero en lugar de otro confían en el desarrollo de modelos que reflejan con exactitud la fisiopatología de la enfermedad. A pesar del entusiasmo de los enfoques basados en el objetivo, análisis de drogas de primera clase aprobado por la FDA revelan que pantallas fenotípicos han sido mucho más exitosa1. El objetivo general de este método es establecer una plataforma de alto rendimiento de detección pueden utilizarse para identificar pequeñas moléculas para el tratamiento de la enfermedad hepática metabólica. Se han descrito varios modelos en vitro incluyendo primarias hepatocitos, células de hepatoma y de células progenitoras hepáticas2. Sin embargo, la mayoría de estos modelos tienen limitaciones, y hay una necesidad de nuevos modelos que pueden recapitular con exactitud la fisiopatología metabólica hepática deficiencias en la cultura. Recientemente, las células de vástago pluripotent humanas combinadas con la edición de genes han ofrecido una oportunidad para modelar las más raras de las enfermedades raras en la cultura sin la necesidad de acceso a pacientes directamente3. Mientras que el uso de iPSCs específico para cada paciente como una herramienta para descubrir pequeñas moléculas para el tratamiento de las enfermedades hepáticas raras es razonable conceptualmente, hay solamente algunos informes demostrando la factibilidad de este enfoque4. Sin embargo, recientemente hemos establecido una plataforma que utiliza hepatocitos derivados de iPSC para identificar con éxito fármacos que pueden reutilizar para el tratamiento de las deficiencias en el metabolismo del hígado5.
Este protocolo explica el proceso de diferenciación humana iPSCs a hepatocitos como las células en placas de 96 pocillos y usarlos para una biblioteca de moléculas pequeñas de la pantalla. También describe el análisis de punto final con hipercolesterolemia como un ejemplo de enfermedad hepática metabólica. Este enfoque puede ser útil para estudiar el papel y la aplicación de moléculas pequeñas en el contexto de enfermedad infecciosa del hígado, enfermedades hepáticas metabólicas, toxicidad de la droga y otros trastornos del hígado.
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Protocol
1. cultura de humanos inducida por las células de vástago Pluripotent
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Capa recombinante proteína de fusión Fc E-Cadherin humana (E-cad-Fc) u otras matrices adecuados para hPSC cultura 6
- Diluya en E-cad-Fc a 15 μg/mL Phosphate-Buffered solución salina de Dulbecco que contiene calcio y magnesio (DPBS (+)).
- Platos de cultivo de tejidos de suspensión de 100 mm con 5 mL de diluido E-cad-Fc la capa, incubar a 37 ° c por al menos 1 h. Retire sustrato y reemplazar con 5 mL de medio (por ejemplo, mTeSR1 denominado M-medio en adelante)7.
Nota: El medio de cultivo utilizado en este protocolo se prepara siguiendo los protocolos publicados7. Sin embargo, varias otras preparaciones de medios de comunicación se han descrito, o están disponibles comercialmente, que son probablemente compatibles con el procedimiento. - Recuperar un frasco de iPSCs criopreservados en nitrógeno líquido. Descongelarse a 37 ° c hasta que quede de un cristal de hielo. Suavemente pipetear las células en un tubo cónico de 15 mL estéril que contiene 4 mL de medio M.
- Centrifugar a 300 x g por 5 minutos quite el sobrenadante y resuspender suavemente las células con 5 mL de medio suplementado con 10 μm de Y-27632, un inhibidor selectivo de la Rho-associated, bobina en espiral que contiene proteína quinasa (ROCK).
- Retire el medio de M de paso 1.1.2 y transferir 5 mL de células de paso 1.1.4 a platos de cultivo de tejidos de suspensión de 100 mm E-cad-Fc-revestida.
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Mantenimiento de iPSCs humano en la cultura
- Una vez iPSCs llegar a alrededor de 80% de confluencia, eliminar el medio de cultivo y lavado una vez con el calcio y magnesio libres DPBS (-). Aspire la DPBS (-) y añadir una cantidad suficiente de solución de EDTA 0,02% a cubrir las placas e incubar hasta 3 min a temperatura ambiente.
Nota: En el 80% de confluencia, la placa debe contener alrededor de 2 x 107 células. Es importante no cubran las células y para asegurar que las células mantienen una morfología indiferenciada. La pluripotencia de las células puede determinarse mediante tinción con marcador Tra-1-60 de la célula de vástago o equivalente8. - Tan pronto como las células comienzan a liberar, quitar la solución de EDTA 0,02% y el plato con 10 mL de medio M para liberar las células de la inundación. Ayudar a la separación de iPSCs mediante pipeteo suave.
Nota: El tiempo medio de incubación para las células separar es alrededor de 3 minutos, pero esto debe ser determinado empíricamente para cada línea de iPSC. Las células deben ser liberadas como pequeños racimos que contienen alrededor de 5-10 iPSCs por cluster. - Transferencia de 1/10 de las células suspendidas por fresco plato de cultivo de tejidos E-cad-Fc revestido 100 mm suspensión conteniendo 5 mL de medio M. Incubar los cultivos a 37 ° c debajo del 4% O25% CO2 y cambio el medio día.
Nota: Aunque iPSCs habitualmente se cultivan bajo condiciones de oxígeno fisiológica para promover la pluripotencia, iPSCs puede también cultivarse utilizando oxígeno ambiente.
- Una vez iPSCs llegar a alrededor de 80% de confluencia, eliminar el medio de cultivo y lavado una vez con el calcio y magnesio libres DPBS (-). Aspire la DPBS (-) y añadir una cantidad suficiente de solución de EDTA 0,02% a cubrir las placas e incubar hasta 3 min a temperatura ambiente.
2. diferenciación de iPSCs humano a hepatocitos como células en placas de 96 pocillos
Nota: Esta sección describe la diferenciación de iPSCs en un formato que es compatible con la investigación. Utilizando este enfoque, es posible inducir iPSCs humana para distinguir y formar hepatocitos como las células en 20 días. Mientras que esto es conveniente para la mayoría de los ensayos, la longitud de la cultura puede ampliarse para mejorar la madurez de las células.
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Placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos con la matriz de la membrana basal reducido factor de crecimiento de la capa
- Preparar el Caldo diluyendo la matriz a 2 mg/mL con medio de cultivo tisular DMEM/F12 estéril helada. La matriz se dividen en alícuotas μL 250 y almacenar a-80 ° c hasta que la necesite. Enfriar 10 mL de DMEM/F12 en hielo durante 30 minutos recuperar un 250 μL alícuota de acción matriz de 2 mg/mL y deshielo en hielo.
- La matriz se combinan con 10 mL de DMEM/F12 frío mezclando suavemente con una pipeta previamente enfriada para hacer la concentración final de 0.05 mg/mL.
- Transferir 100 μL de matriz diluido en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Incubar a 37 ° c, 4% O25% CO2 para por lo menos 1 h. Deseche la matriz y sustituir con 50 μL de medio de M por pozo. Mantenga a 37 ° C, 4% O25% CO2 hasta que se necesite.
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Células de la placa para la diferenciación
- La cultura iPSCs en placas de 100 mm hasta las células acercan a 80% de confluencia. Asegúrese de que la placa contiene alrededor de 2 x 107 células. Determinar el número de células por citometría de flujo de células o hemocitómetro.
Nota: Con experiencia, se puede juzgar la calidad de las células iPSCs por microscopía; sin embargo, cerca del 98% de las células debe expresar marcadores de pluripotencia como el epitopo TRA-1-60 cuando se mide por FACS o immunostaining. Es importante que las células siguen siendo activamente dividir y no están cubiertas. - Para cosechar las iPSCs de cada placa de 100 mm, aspirar el medio de cultivo y lavar con 5 mL de DPBS (-). Sustituir el lavado con 3 mL de solución de la separación de la célula (e.g., accutase) e incubar durante unos 2 minutos a 37 ° C, 4% O25% CO2.
Nota: Es importante seguir el desprendimiento de las células por microscopía. No digerir con accutase. El objetivo es liberar las células como pequeños grupos con un mínimo tratamiento. - Tan pronto como las células empiezan a separar, la cosecha añadiendo 7 mL de medio M. Pipeta varias veces para disociar las colonias celulares en pequeños grupos de alrededor de 3-6 células (figura 1A).
- Recoger las iPSCs en un tubo de centrífuga estériles de 15 mL y centrifugar a 300 x g por 5 minutos quite el sobrenadante y Resuspenda el precipitado de células en 5 mL de medio M.
- Distribuir uniformemente las células en placas de 96 pocillos recubiertos de matriz por Pipetear 50 μL de las células de suspensión en cada pozo. Para configurar cada placa de 96 pocillos, utilice una placa de 100 mm de iPSCs con células en aproximadamente 80% confluencia que contiene alrededor de 5 x 106 células para la diferenciación. Utilice una pipeta multicanal para acelerar este proceso. Cultura de las células durante la noche a 37 ° c, 4% O25% CO2.
Nota: Es importante que un número igual de células se deposita en cada pozo para diferenciaciones reproducibles.
- La cultura iPSCs en placas de 100 mm hasta las células acercan a 80% de confluencia. Asegúrese de que la placa contiene alrededor de 2 x 107 células. Determinar el número de células por citometría de flujo de células o hemocitómetro.
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Inducir la diferenciación de las células
- Examinar las placas de 96 pocillos por microscopia para asegurarse de que las células cubren bien al menos el 70% de la superficie de cada individuo. Si la cobertura es inferior al 70%, sustituir el medio por medio fresco e incubar durante 24 h a 37 ° c, 4% O25% CO2adicional.
Nota: Células durante más de 48 h de incubación después de la galjanoplastia sin inducir diferenciación comúnmente reduce la eficacia de la diferenciación. Diferenciación también ocurrirá con oxígeno ambiente, aunque la eficacia puede ser afectada. - Día 1 a día 2 de diferenciación, sustituir el medio de cultivo con RPMI suplementado con 2% B27 (sin insulina), Activin A de 100 ng/mL y 10 ng/mL BMP4 FGF2 de 20 ng/mL. Añada 100 μL de medio por pozo e incubar a 37 ° c, en ambiente O25% CO2 con un cambio medio diario por 2 días.
Nota: Tratar con un gran número de placas de 96 pocillos requieren el uso de una pipeta asistida o robot. pipetas de 12 canales y 96 canales son ideales para el cambio medio diario. - Para el día 3 a 5 días de diferenciación, reemplace el medio de cultivo con RPMI había suplementado con 2% B27 (sin insulina) y 100 ng/mL Activin A. Culture las células a 37 ° c, en ambiente O25% CO2 con cambio medio diario durante 3 días.
- En día 5, de la diferenciación antes de reemplazar con medio de cultivo fresco, tratar cada pozo con solución de EDTA de 0.02% μL 100 por 30 s, luego retire y reemplace con medio de cultivo fresco.
Nota: Si la diferenciación al endodermo es eficiente, la monocapa de diferenciar las células es propensa a la peladura de la placa. Un breve tratamiento con solución de EDTA 0.02% ayuda a aliviar la separación de la célula. Este tratamiento no afecta la diferenciación a hepatocitos. - Para la diferenciación entre los días 6 a 10, sustituir el medio de cultivo RPMI / 2% B27 (con insulina) suplementado con BMP4 de 20 ng/mL y 10 ng/mL FGF2 e incubar a 37 ° c, 4% O25% CO2 para 5 días con cambio diario de media. Esta etapa induce a las células a diferenciarse en células progenitoras hepáticas.
- Para la diferenciación entre los días 11 a 15, sustituir el medio de cultivo RPMI / 2% B27 (con insulina) complementado con HGF de 20 ng/mL. Incubar a 37 ° c, 4% O25% CO2 para 5 días con cambio diario de media.
- Para la diferenciación entre los días 16 a 20, sustituir el medio de cultivo con un medio de cultivo de la célula de hepatocitos (HCM) suplementado con 20 ng/mL de Oncostatina M (OSM). Incube las células a 37 ° c, en ambiente O25% CO2 con cambio medio diario por 5 días.
Nota: La reproducibilidad de la diferenciación entre pocillos individuales eficientemente puede ser determinada midiendo el nivel relativo de albúmina, AFP o APOB secretada al medio por ELISA (véase 3.2).
- Examinar las placas de 96 pocillos por microscopia para asegurarse de que las células cubren bien al menos el 70% de la superficie de cada individuo. Si la cobertura es inferior al 70%, sustituir el medio por medio fresco e incubar durante 24 h a 37 ° c, 4% O25% CO2adicional.
3. pequeña molécula proyección
Nota: A continuación describe el procedimiento utilizado para identificar compuestos que pueden utilizarse para bajar el nivel de APOB en el medio del hepatocito-como las células derivadas de la hipercolesterolemia familiar iPSCs. Una descripción del modelo y su uso en la identificación de medicamentos para reducir el colesterol ha sido descrita en detalle previamente5,9. En el ejemplo actual, se revisaron 1.000 compuestos de la biblioteca de la colección compuesto de Carolina del Sur (SC3). Cada uno de ellos fue probado en una concentración de 2 μg/mL.
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Tratamiento de iPSC - hepatocitos derivados con moléculas pequeñas
- Diluir la biblioteca compuesta principal para generar placas de acción de trabajo con los compuestos en una concentración de 20 μg/mL en 2% DMSO y almacenar a-20 ° c.
- Preparar suficientes placas de 96 pocillos de hepatocitos derivados de iPSC para permitir que cada compuesto a probar.
Nota: El número de compuestos que se proyectarán dictará el número de placas de 96 pocillos que se requieren. En general, un solo bien debería estar preparado para cada compuesto, además de más pozos para las muestras de control. Los pozos más externos de la placa se evitan comúnmente para reducir la posibilidad de efectos de borde que puede corromper la interpretación. Éxitos pueden identificarse utilizando el método z-score sin necesidad de utilizar repeticiones. Si se incluyen las repeticiones, es más apropiado utilizar la prueba t. - Al final de la diferenciación (véase 20, día 2.3.7), sustituir el medio de cultivo con 100 μL de HCM fresco20 ng/ml de Oncostatina M. Incubar a 37 ° c, 4% O25% CO2 para exactamente 24 h. recuperar el medio de cultivo en una placa de 96 pocillos fresca y almacenar a-20 ° c. Utilice este ejemplo para calcular el nivel de APOB en el medio antes de la adición de drogas.
- Agregar 90 μL de HCM fresco 20 ng/ml de Oncostatina M en cada pozo. Añadir 10 μL de cada compuesto de la bolsa de trabajo después de mezclar por pipeteo. Agregar DMSO al 0,2% para el control de pozos para coincidir con la concentración final en las muestras tratadas e incubar a 37 ° c, ambiente O25% CO2 para exactamente 24 h. recoge el medio de cultivo y almacenar a-20 ° c. Utilice este ejemplo para determinar el nivel de APOB después del tratamiento con compuestos.
- Opcional - las células restantes pueden procesarse para la inmunotinción, viabilidad celular y análisis de niveles de mRNA utilizando métodos estándar.
Nota: Esta pantalla fue diseñada para identificar fármacos que tuvo un rápido efecto sobre los niveles APOB. Sin embargo, dependiendo del modelo de la enfermedad, análisis aguas abajo o mecanismo de acción de los fármacos, puede ser beneficioso tratar la muestra por varios días.
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Determinar los niveles APOB por ELISA
- Determinar la concentración de apolipoproteína B (APOB) de ambos las pre- y post-drogas tratadas muestras usando un kit de desarrollo humano de APOB ELISA siguiendo los protocolos del fabricante.
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Preparar las siguientes soluciones
- Tampón de lavado, compuesto por un 0,05% Tween 20 en PBS, pH 7,4. Almacenar a 4 ° c hasta su uso.
- Tampón de incubación, conformada por 0,05% Tween 20 y 0.1% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS, pH 7,4. Almacenar a 4 ° c hasta su uso.
- Preparar anticuerpos APOB (mAB 20/17) diluyendo 2 μg/ml en PBS, pH 7,4. Añada 100 μL del anticuerpo diluido por pozo e incubar a 4 ° c durante la noche.
- Quitar el anticuerpo de las placas de ensayo y lavar bien dos veces con 200 μL de PBS, pH 7,4.
- Agregar 200 μL/pocillo del 0,05% Tween 20, 0.1% albúmina sérica bovina (BSA) en PBS, pH 7,4 y se incuba en una plataforma de agitación durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Preparar una curva estándar de 8 puntos con 0,05% Tween 20 y 0.1% de BSA en PBS, pH 7,4 con las siguientes concentraciones de APOB: 300 ng/mL, 200 ng/mL, ng/mL 175, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL y 50 ng/mL.
- Diluir las muestras prueba 1:4 con 0,05% Tween 20 y 0.1% de BSA en PBS, pH 7,4.
- Después de 1 h de bloqueo con tampón de incubación, deseche el búfer y lavar las placas de ensayo cinco veces con 200 μL de 0.05% Tween 20 en PBS, pH 7,4.
- Totalmente elimine cualquier tampón de lavado residual y transferencia 90 μL de las muestras diluidas y de los niveles APOB con las placas de ensayo. Incubar a temperatura ambiente en un agitador durante 1 hora.
- Descartar la muestra y lave con 200 μL 0,05% Tween 20 en PBS, pH 7,4 por pozo. Repita los lavados un total de 5 veces. Añada 100 μL por pozo de mAB LDL 11-biotina 1:1,000 diluido en 0,05% Tween 20 y 0.1% de BSA en PBS, pH 7,4. Incubar a temperatura ambiente en una plataforma de agitación durante 1 hora.
- Desechar el reactivo y lavado con 200 μL por pozo lavado Tampón 5 veces. Añada 100 μL por pocillo del anticuerpo de estreptavidina-HRP (1:1, 000 dilución con tampón de incubación), luego incubar a temperatura ambiente en una plataforma de agitación durante 1 hora.
- Desechar el reactivo y lavado con 200 μL 0.05% Tween 20 en PBS, pH 7,4 por pozo. Repita los lavados un total de 5 veces. Completamente eliminar el tampón de lavado residual de las placas de ensayo añada 100 μL por pocillo de la solución de tetrametilbenzidina (TMB) e incube a temperatura ambiente durante 8 minutos.
- Sin remover el Substrato TMB, directamente añadir 100 μL por pocillo de solución (HCl 1N).
- Determinar la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de placas.
- Se puede establecer una curva estándar utilizando el método de regresión logística de cuatro parámetros, a continuación, utiliza para definir la concentración de APOB en cada muestra10.
- Examinar la droga previo: cociente de la droga después de APOB en cada muestra para identificar compuestos con potencial para bajar APOB los niveles en el medio.
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Representative Results
Generación de hepatocitos - como células: La figura 1 describe el calendario de los cambios que ocurren durante la diferenciación de iPSCs humano a hepatocitos como las células. La cultura de iPSCs E-Cad-FC proporciona aproximadamente 2 mm colonias de diámetro que expresan el marcador de pluripotent OCT4 (figura 1A-B). La morfología de las células en una matriz de E-cadherina serán ligeramente diferente a las cultivadas en otras superficies. Tienden a tener una morfología aplanada con una mayor superficie citoplasmática (figura 1A). Aunque células madre humanas pluripotentes pueden ser cultivadas eficientemente en un número de diferentes matrices11, la cultura de iPSCs en matriz de E-cadherina se cree que aumentar la homogeneidad de la población de células pluripotentes y permite sin enzima manipulación de las células durante el paso12. Sin embargo, varias matrices alternativas, incluyendo la matriz de la membrana del sótano, Lamininas, vitronectina y fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), también pueden usarse para mantener iPSCs humana y todos deben ser compatibles con el procedimiento descrito13. En todos los casos, puede confirmarse la pluripotencia celular Tra-1-60 o equivalente8.
Para iniciar la diferenciación, deben recogerse las iPSCs como pequeños racimos (figura 1A). Al principio de la diferenciación, las células plateadas deben cubrir aproximadamente el 80% de la superficie de la placa. Después de 5 días de tratamiento con factores de crecimiento, las células expresan proteínas que característicamente se expresan en el endodermo definitivo como SOX17 y FOXA2 (figura 1B). En esta etapa, más 90% de las células por lo general expresan estos marcadores. Después de 5 días más de la diferenciación, el endodermo se convierte en un destino hepático, y además FOXA2, las células expresan HNF4a, que puede ser identificado por el resto del proceso de diferenciación (figura 1B). Como las células adoptan un destino hepático, debe cubrir la superficie de la placa como una monocapa. Después de la adición de HGF, las células comienzan a expresar las proteínas que se encuentran en los hepatocitos fetales incluyendo AFP (figura 1B). Se observan gotitas de lípidos dentro del citoplasma de las células. Al final de la diferenciación, las células adoptan una morfología cuboidal con un núcleo con nucleolos prominentes y un citoplasma grande con múltiples gotitas de lípidos. Un subconjunto de las células similares a hepatocitos será multi-nucleated. La mayoría de las células expresa un amplio repertorio de proteínas del hepatocito como albúmina (figura 1B)14.
Pantalla de alto rendimiento efectivo con hipercolesterolemia como un modelo de la enfermedad: Hipercolesterolemia refleja excesiva concentración de colesterol-lipoproteína de baja densidad (LDL-C) en el suero. En hipercolesterolemia familiar (FH), el aumento del nivel del suero LDL-C es debido principalmente a mutaciones en el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) que interviene en la absorción de LDL-C para la remoción de los hepatocitos. Anteriormente hemos descrito la generación de iPSCs de un paciente con hipercolesterolemia familiar homocigótica y su uso en la generación de hepatocitos que refleja enfermedad hepática del paciente en la cultura9. Se demostró que estas células podrían utilizarse con éxito como una plataforma de descubrimiento de fármacos. Cuando una biblioteca de drogas ~ 2.500 se proyectó, se encontró que los glucósidos cardiacos tuvo una inesperada habilidad para reducir C-LDL en los hepatocitos derivados de iPSC, hepatocitos humanos primarios y en ratones con hígados humanizados. Por otra parte, al examinar registros médicos de pacientes, encontramos que el colesterol los niveles cayeron en pacientes que se les prescribió un glucósido cardíaco para el tratamiento de enfermedades del corazón. Estos estudios confirmaron que hepatocitos derivados de iPSC podrían utilizarse con éxito en las pantallas de identificar terapias.
Con el fin de proporcionar una plataforma que sea compatible con la investigación, es importante que las diferenciaciones son reproducibles y que se reduce al mínimo variación de pozo a pozo. La figura 2 muestra los resultados de inmunotinción en cada pocillo de una placa de 96 pocillos para detectar HNF4a y albúmina en el día 20 de diferenciación. Como puede verse en la figura, la distribución de estas proteínas del hepatocito es similar en todos los pocillos.
El componente central de la proteína de C-LDL es APOB. Aquí, hemos utilizado iPSCs a pantalla de APOB bajar compuestos proporcionar un ejemplo de uso de hepatocitos derivados de iPSC de molécula pequeña proyección (Figura 3A). APOB puede medirse fácilmente en solución por ELISA. Desde que ELISA se puede realizar en gran número de muestras, puede utilizarse como base para una pantalla. La idoneidad de cualquier ensayo para detección de alto rendimiento se determina mejor mediante el uso de una medida llamada el factor Z (o Z')15. Este parámetro estadístico calcula la eficacia de un ensayo para distinguir entre las muestras de control positivo y negativo. Un ensayo con un factor de Z > 0,5 se considera compatible con una pantalla de15. Como puede verse en la figura 3B, el Z' de la prueba de APOB = 0,73, que confirma la idoneidad de la utilización de la plataforma de descubrimiento de fármacos.
Identificación de compuestos que tienen la capacidad de reducir los niveles de APOB en el medio de cultivo de iPSC - derivada de hepatocitos: para determinar si la plataforma podría utilizarse para identificar nuevos compuestos que afectan a los niveles APOB, defendimos a 1.000 moléculas pequeñas de la colección compuesto de Carolina del Sur (SC3) representante conjunto Lite (RSL). El RSL fue generado por el centro de Carolina del sur MUSC para descubrimiento terapéutico, incluye compuestos que son estructuralmente muy diversos y refleja la biblioteca de los padres.
La droga posterior: cociente de la droga de APOB se determinó para cada compuesto (figura 3) e identificación de hits fue alcanzada por el z-score de análisis (figura 3D)16. En este caso, se consideraron pequeñas moléculas que reducen APOB con un z-score ≤-2.0 como potenciales hits. Cuando proyección 1.000 pequeñas moléculas, el número de golpes posibles con un z-score ≤ 2.0 suele ser relativamente manejable. Sin embargo, al realizar una pantalla más grande, se basaría en una veintena más conservador de ≤-3.0, basada en la regla 3-sigma, para aumentar la confianza en objetivos potenciales. En este ejemplo, se identificaron 24 hits potenciales con una relación APOB que varió de 0.86 a 0.44 (Figura 4A). Un análisis secundario fue realizado en muestras cuatriplicadas (n = 4 réplicas biológicas) excluye compuestos que tenían un impacto negativo en la viabilidad celular y determinar qué compuestos podrían reducir reproducible APOB en el medio. De los compuestos originales de 24 candidatos, cuatro fueron encontrado para ser reproducible (p ≤0. 05) (Figura 4B-C). En otro estudio, se encontraron 2 de estos compuestos negativamente afecta viabilidad de las células, lo que sugiere que la reducción observada en APOB era probable que una sea consecuencia de la pérdida de la célula. Los restantes dos compuestos se considerarían a buenos candidatos para estudios de seguimiento.
Figura 1 : Step-wise diferenciación hepática de iPSCs humana. (A) Morfología de colonias de iPSC inmediatamente antes de la cosecha (panel izquierdo) y iPSCs después de recoger las células de diferenciación (panel derecho) - después del tratamiento de accutase, las células deben ser disociadas en 3-6 celdas/cluster. Barra de escala = 50 μm. (B) tabla que muestra las condiciones de cultivo en cada etapa de la diferenciación (superior). Inmunotinción (paneles inferiores) fue realizada para identificar la expresión del marcador en cada etapa de la diferenciación. Los paneles muestran OCT4 y DAPI manchado núcleos en iPSCs, SOX17 y FOXA2 endodermo definitivo, HNF4a y FOXA2 en células progenitoras hepáticas, HNF4a y AFP en células similares a hepatocitos inmaduras, y HNF4a y albúmina en relativamente maduro hepatocitos como las células. Barras de escala = 100 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Diferenciación hepática homogénea de iPSCs humana en placas de 96 pocillos. Inmunotinción se realizó en cada pozo individual de una placa de 96 pocillos que contienen hepatocitos derivados de iPSC en el día 20 de diferenciación para detectar (A) albúmina y ()B) HNF4a. Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Proyección de molécula pequeña con hepatocitos humanos derivados del iPSC. (A) Descripción esquemática del enfoque utilizado para identificar compuestos que pueden reducir los niveles de ABOB en el medio de hepatocitos derivados de iPSC. (B) gráfico mostrando theresults de un ensayo de ELISA para detectar el nivel de APOB en el medio de 87 pozos (n = 87) de hepatocitos derivados de iPSC (azul) o no diferenciada iPSCs (naranja). Estos datos se utilizaron para calcular un factor de Z (Z' = 0.73). (C) gráfico que muestra la droga posterior: ratios de drogas antes de la concentración de APOB en el medio de cultivo de hepatocitos derivados de iPSC trataron durante 24 h con 998 compuestos del conjunto RSL SC3 . (D) gráfico que muestra puntuaciones z de los datos presentados en (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Validación de primarias éxitos. (A) tabla compuestos identificados en la pantalla principal como poder reducir la APOB. (B, C) Gráficos de barras que muestra el impacto de los compuestos de la droga: cociente de concentración de APOB de pre-droga ()B) y viabilidad de las células (C) en los hepatocitos derivados de iPSC tratados con compuestos en el análisis de seguimiento. Barras de error reflejan ± SEM (n = 4 réplicas biológicas); * p ≤0. 05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Objetivo basado en el descubrimiento de medicamentos, donde se identifican pequeñas moléculas que influyen en la actividad de una proteína específica, ha sido el foco de muchos esfuerzos de investigación existentes. Aunque este enfoque ha proporcionado numerosos productos farmacéuticos, pantallas basados en revertir un fenotipo, la farmacología clásica, han tenido más éxito en la identificación de compuestos de primera clase que han sido clínicamente eficaz1. Una desventaja para el descubrimiento de medicamentos fenotípica es que depende de la disponibilidad de modelos de la enfermedad correspondiente. Esto puede ser un reto cuando no están disponibles modelos de celulares de la enfermedad, o cuando especies animales comunes de investigación capaces de recapitular los síntomas clínicos. Sin embargo, la capacidad para generar iPSCs de las células somáticas de un paciente ha proporcionado nuevas oportunidades para la enfermedad humana de modelo en la cultura3. Para algunas enfermedades, como enfermedades genéticas raras, los pacientes pueden ser pocos en número y difícil de acceder y consentimiento. Sin embargo, con el advenimiento de la ingeniería del genoma, es relativamente sencillo introducir mutaciones causativas en el genoma de iPSC, lo que es posible modelar las más raras de las enfermedades raras.
Una vez iPSCs en la mano, es necesario para producir un tipo de célula apropiada en la cual se manifiestan los síntomas de la enfermedad. Por ejemplo, enfermedades que afectan a la función neuronal pueden requerir la generación de neuronas o glía17, mientras que aquellos que afectan al hígado pueden necesitar hepatocitos9,18 o células epiteliales biliares para estudian19, 20 , 21. este requisito introduce una serie de advertencias al considerar el uso de iPSCs de descubrimiento de fármacos. En primer lugar, es importante entender las bases celulares de la enfermedad. Esto puede ser difícil, especialmente cuando las células adopten características basadas en ubicación o entorno. Esto puede ser cierto para los hepatocitos que tienen diferencias en los perfiles de expresión génica y función enzimática que dependen de su localización dentro del lobulillo hepático. En segundo lugar, trabajar con las células en el aislamiento puede evitar que el estudio de las enfermedades que reflejan una alteración a la estructura del tejido tales como cirrosis, comunicación célula-célula como enfermedad neuromuscular o aquellos que son influenciados por la inflamación tales como inflamatorio enfermedad intestinal.
Para estudiar la enfermedad del hígado, varios grupos de investigación han descrito protocolos para generar hepatocitos como las células iPSCs13,22,23,24,25. Mientras que la mayoría de estos protocolos es eficiente, la limitación de la técnica es que las células no recapitulan completamente la función de hepatocitos frescos. Esto significa que es importante determinar si las células generaron de iPSCs pantalla las funciones necesarias para evaluar el impacto de una determinada mutación. Entre los genes cuya expresión no es totalmente igual que encuentran en los hepatocitos frescos son los codificación CYP450 proteínas25,26. Varias de estas proteínas tienen un papel en el metabolismo de la droga y la respuesta de xenobiótico. Esto es importante cuando se considera el diseño de una pantalla porque muchos medicamentos requieren la generación de metabolitos activos, y esto podría verse afectado en los hepatocitos derivados de iPSC. Esfuerzos para mejorar la calidad de los hepatocitos están siendo activamente perseguidos27. A pesar de las salvedades, varios estudios han demostrado que iPSCs derivadas de pacientes con errores innatos en el metabolismo hepático puede utilizarse con éxito para generar células similares a hepatocitos que reflejan la fisiopatología de la enfermedad en la cultura9 , 18 , 28 , 29.
Para que las pantallas tener éxito, es importante asegurar la diferenciación homogénea de los hepatocitos de las iPSCs. Diferenciaciones en placas de 96 pocillos no producir hepatocitos de alta calidad, es más comúnmente debido a la mala calidad de iPSCs parental o cultura de iPSCs en óptimas condiciones. Pluripotencia de iPSCs debe ser cuidadosamente mantenida por cultura en un medio de alta calidad con cambios diarios tal como se describe en el protocolo 1.2. La densidad de las células pluripotentes en la placa de cultivo debe ser vigilada con cuidado, porque si las células se convierten en confluentes tienden a perder pluripotencia y diferenciarse espontáneamente. También encontramos que cultivar las células en concentraciones fisiológicas de oxígeno promueve la pluripotencia y es beneficioso durante algunas etapas de la diferenciación. Sin embargo, si no hay equipo adecuado, es posible utilizar oxígeno ambiente tanto inducir la diferenciación a las células pluripotentes de la cultura. Sugerimos definir sistemáticamente la pluripotencia de iPSCs stock midiendo la expresión de varios marcadores de pluripotencia como OCT-3/4, NANOG, TRA-1-60 antes de realizar diferenciaciones amplia independientemente de las condiciones de cultivo. También hemos observado que cuando las células del endodermo en alta eficacia, tienen una tendencia a pelar de la superficie de las placas como las hojas de la célula. Hemos encontrado que tratar brevemente el endodermo derivado de iPSC células con solución de EDTA 0.02% pueden ayudar a reducir la separación de la célula. Finalmente, la concentración óptima de células necesarios para la eficientes diferenciaciones puede diferenciar entre líneas de iPSC y puede afectar la separación de la célula. Por esta razón, es importante determinar empíricamente la concentración de células necesarias para diferenciaciones eficientes, especialmente cuando se trabaja con una nueva cultura de iPSC.
En Resumen, hemos descrito un protocolo de diferenciación escalonada que genera hepatocitos como las células iPSCs que son compatibles con pantallas químicas. El hepatocito-como las células se producen como monocapas en placas de 96 pocillos, y el proceso es eficaz y reproducible. Demostramos la factibilidad de investigación compuestos por su capacidad para bajar los niveles de APOB en el medio de cultivo. El formato de diferenciación es compatible con múltiples ensayos incluyendo qRT-PCR, ELISA y alta proyección de imagen de contenido. Creemos que el campo encuentra el enfoque útil para identificar potencial terapéutica y para la identificación farmacológica de las vías que afectan a la diferenciación del hepatocito y la función en las futuras aplicaciones5,30.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (DK55743, DK087377, DK102716 y HG006398 a S.A.D). Nos gustaría agradecer al Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop y Jing Ran sus contribuciones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
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