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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57194
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

Summary

Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt eine Plattform zur Identifizierung von kleiner Molekülen für die Behandlung von Lebererkrankungen. Eine schrittweise Beschreibung präsentiert Details wie iPSCs in Zellen mit Hepatozyten Eigenschaften in 96-Well Platten zu differenzieren und die Zellen verwenden, um Bildschirm für kleine Moleküle mit möglichen therapeutischen Tätigkeit.

Abstract

Die Fähigkeit, menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in Hepatozyten-ähnliche Zellen (GLT) differenzieren bietet neue Möglichkeiten, angeborene Fehler bei der hepatischen Metabolismus zu studieren. Das Verfahren erfordert jedoch um eine Plattform zu bieten, die die Identifikation von kleinen Molekülen unterstützt, die potenziell zur Behandlung von Erkrankungen der Leber, eine Kultur-Format, die kompatibel mit screening-Tausende von Verbindungen ist. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit vollständig definierten Kulturbedingungen, wodurch die reproduzierbare Differenzierung der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnlichen Zellen in 96-Well-Zellkultur-Platten. Wir bieten auch ein Beispiel für die Nutzung der Plattform zu Bildschirm-Verbindungen für ihre Fähigkeit, Apolipoprotein B (APOB) senken aus iPSC-abgeleitete Hepatozyten erzeugt eine familiäre Hypercholesterinämie Patienten hergestellt. Die Verfügbarkeit einer Plattform, die kompatibel mit Wirkstoffforschung sollte erlauben Forschern, neuen Therapeutika für Krankheiten zu identifizieren, die die Leber betreffen.

Introduction

Erfolg bei der Identifizierung von Medikamenten, die verwendet werden, um eine seltene Krankheit gezielt stützt sich auf die Entwicklung von Assays, die für das Screening verwendet werden können. Hypothese oder zielbasierte Bildschirme (umgekehrte Pharmakologie) sind nützlich, aber erfordern ein detailliertes Verständnis der molekularen Grundlagen der Krankheit. Phänotypische Bildschirme (klassische Pharmakologie) vermeiden die Notwendigkeit für ein detailliertes Verständnis der biochemischen Bahnen, aber stattdessen verlassen Sie sich auf die Entwicklung von Modellen, die genau die Pathophysiologie der Erkrankung widerspiegeln. Trotz Begeisterung für Ziel-basierte Ansätze zeigen Analysen der FDA-Zulassung in erstklassige Medikamente, dass phänotypischen Bildschirme weitaus erfolgreicher1gewesen sein. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist eine Plattform für Hochdurchsatz-screening, die verwendet werden können, um kleine Moleküle für die Behandlung der metabolischen Lebererkrankungen zu identifizieren. Mehrere in-vitro- Modelle wurden einschließlich primäre Hepatozyten, Hepatom Zellen und Leber Progenitor Zellen2beschrieben. Jedoch die meisten dieser Modelle haben Einschränkungen, und besteht ein Bedarf für neue Modelle, die genau die Pathophysiologie des metabolischen Leber Mängel in der Kultur rekapitulieren kann. Vor kurzem haben menschliche pluripotente Stammzellen kombiniert mit dem Bearbeiten von Gen bot Gelegenheit, sogar die seltensten der seltenen Krankheiten in der Kultur ohne die Notwendigkeit, Patienten Zugang zu modellieren direkt3. Während der Einsatz von patientenspezifischen iPSCs wie ein Werkzeug, um kleine Moleküle für die Behandlung von seltenen Erkrankungen der Leber entdecken konzeptionell angemessen ist, gibt es nur wenige Berichte zeigen die Machbarkeit dieses Ansatzes4. Allerdings haben wir vor kurzem eine Plattform geschaffen, mit denen iPSC-abgeleitete Hepatozyten um erfolgreich Medikamente zu identifizieren, die für die Behandlung von Mängeln im LEBERSTOFFWECHSEL5verwendet werden können.

Dieses Protokoll erklärt den Prozess der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnlichen Zellen in 96-Well Platten zu unterscheiden und mit ihnen eine Bibliothek mit kleinen Molekülen auf den Bildschirm. Es beschreibt auch die Endpunktanalyse mit Hypercholesterinämie als Beispiel für metabolische Lebererkrankungen. Dieser Ansatz sollte zur Untersuchung der Rolle und der Anwendung von kleinen Molekülen im Rahmen der infektiöse Lebererkrankungen, metabolische Lebererkrankungen, medikamententoxizität und anderen Lebererkrankungen nützlich sein.

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Protocol

(1) Kultur der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

  1. Beschichtung von rekombinanten menschlichen E-Cadherin Fc Fusionsprotein (E-Cad-Fc) oder andere Matrizen für hPSC Kultur geeignet 6
    1. Verdünnen Sie E-Cad-Fc mit Dulbeccos Phosphate-Buffered Kochsalzlösung enthält Calcium und Magnesium (DPBS (+)) bis 15 μg/mL.
    2. Mantel 100 mm Federweg Gewebekultur Gerichte mit 5 mL der verdünnten E-Cad-Fc und Inkubation bei 37 ° c für mindestens 1 h Substrat entfernen und ersetzen mit 5 mL Medium (z. B. mTeSR1, die fortan als M-Medium bezeichnet)7.
      Hinweis: In diesem Protokoll verwendeten Kulturmedium ist nach veröffentlichten Protokolle7zubereitet. Jedoch mehrere andere Medien-Präparate sind beschrieben worden, oder sind im Handel erhältlich, die wahrscheinlich kompatibel mit dem Verfahren sind.
    3. Rufen Sie ein Fläschchen mit kryokonservierten iPSCs aus flüssigem Stickstoff. Tauen Sie bei 37 ° c auf, bis eine kleine Eiskristall übrig bleibt. Sanft pipette Zellen in ein steriles 15 mL konische Röhrchen mit 4 mL des Mediums M.
    4. Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 5 min. Überstands entfernen und sanft wieder auszusetzen Zellen mit 5 mL des Mediums mit 10 µM Y-27632, ein selektiver Inhibitor der Rho-assoziierten, coiled-Coil enthaltenden Proteinkinase (ROCK) ergänzt.
    5. Entfernen Sie das M-Medium aus Schritt 1.1.2 und übertragen Sie 5 mL Zellen von Schritt 1.1.4 auf E-Cad-Fc-beschichtet 100 mm Federung Gewebekultur Gerichte.
  2. Aufrechterhaltung der menschlichen iPSCs in Kultur
    1. Angekommen iPSCs um 80 % Konfluenz Kulturmedium zu entfernen und waschen einmal mit Kalzium und Magnesium frei DPBS (-). Aspirieren Sie des DPBS (-) und fügen Sie eine ausreichende Menge von 0,02 % EDTA-Lösung für die Abdeckplatten, dann bis zu 3 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      Hinweis: Am Zusammenfluss von 80 % sollte die Platte ca. 2 x 107 Zellen enthalten. Es ist wichtig, nicht zu die Zellen überwuchern und um sicherzustellen, dass die Zellen eine undifferenzierte Morphologie behalten. Die Pluripotenz der Zellen kann durch Färbung mit Stammzell-Marker Tra-1-60 oder gleichwertige8bestimmt werden.
    2. Sobald die Zellen beginnen zu lassen, entfernen Sie die 0,02 % EDTA-Lösung und überfluten Sie die Schüssel mit 10 mL des Mediums M zu die Zellen zu lösen. Unterstützen Sie die Ablösung des iPSCs durch sanft pipettieren.
      Hinweis: Die durchschnittliche Inkubationszeit für Zellen zu trennen ist ca. 3 min, aber dies muss für jede Zeile der iPSC empirisch bestimmt werden. Die Zellen freigegeben werden soll, als kleine Cluster mit rund 5-10 iPSCs pro Cluster.
    3. 1/10 der suspendierten Zellen pro frische E-Cad-Fc beschichteten 100 mm Federung Gewebekultur Schale mit 5 mL M-Medium zu übertragen. Inkubation der Kulturen bei 37 ° c weniger als 4 % O25 % CO2 und Änderung des Mediums täglich.
      Hinweis: Obwohl iPSCs routinemäßig unter physiologischen sauerstoffbedingungen Pluripotenz zu fördern kultiviert werden, können iPSCs auch mit ambient Sauerstoff angebaut werden.

(2) Differenzierung der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnliche Zellen auf 96-Well-Platten

Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt die Differenzierung der iPSCs in einem Format, die kompatibel mit Screening ist. Bei dieser Vorgehensweise ist es möglich, menschliche iPSCs zu differenzieren und Hepatozyten-ähnliche Zellen bilden in 20 Tagen zu induzieren. Während dies für die meisten Tests geeignet ist, kann die Länge der Kultur erweitert werden, um die Reife der Zellen zu verbessern.

  1. 96-Well-Zellkultur-Platten mit reduzierten Wachstumsfaktor Basalmembran Matrix Beschichtung
    1. Bereiten Sie das Lager durch Verdünnung der Matrix bis 2 mg/mL mit eiskalten sterile DMEM/F12 Gewebekultur Medium. Teilen Sie die Matrix in 250 μl-Aliquots und lagern bei-80 ° c bis erforderlich. Chill-10 mL DMEM/F12 auf Eis für 30 min. Abrufen einer 250 μL Aliquot von 2 mg/mL Matrix Lager und Tauwetter auf Eis.
    2. Kombinieren Sie die Matrix mit 10 mL kalte DMEM/F12 durch Mischen, vorsichtig mit einer vorgekühlt Pipette Endkonzentration von 0,05 mg/mL zu machen.
    3. 100 μl verdünnter Matrix in jede Vertiefung einer 96-Well-Zellkultur-Platte zu übertragen. Bei 37 ° c inkubieren, 4 % O25 % CO2 für mindestens 1 h verwerfen die Matrix und ersetzen mit 50 μL der M-Medium pro Bohrloch. Lagerung bei 37 ° C, 4 % O25 % CO2 bis benötigt.
  2. Platte-Zellen zur Differenzierung
    1. Kultur die iPSCs auf 100-mm-Platten, bis die Zellen 80 % Zusammenfluss nähern. Stellen Sie sicher, dass die Platte ca. 2 x 107 Zellen enthält. Zellzahlen von Zelle Durchflusszytometer oder Hemocytometer zu bestimmen.
      Hinweis: Mit Erfahrung kann die Qualität der Zellen iPSCs Mikroskopie beurteilt werden; Allerdings sollte in der Nähe von 98 % der Zellen Pluripotenz Markierungen wie die TRA-1-60-Epitop FACS oder Immunostaining gemessen äußern. Es ist wichtig, dass die Zellen aktiv teilenden bleiben und nicht überwuchert.
    2. Um die iPSCs aus jeder 100-mm-Platte zu ernten, das Kulturmedium abgesaugt und spülen Sie mit 5 mL des DPBS (-). Ersetzen Sie die Spülung mit 3 mL der Zelle Ablösung Lösung (z.B. Accutase) und inkubieren Sie für ca. 2 min bei 37 ° C, 4 % O25 % CO2.
      Hinweis: Es ist wichtig, die Loslösung der Zellen von Mikroskopie zu folgen. Tun Sie nicht über Digest mit Accutase. Ziel ist es, die Zellen als kleine Cluster mit minimalen Behandlung zu veröffentlichen.
    3. Sobald die Zellen beginnen sich zu trennen, durch Zugabe von 7 mL des Mediums M zu ernten. Pipette mehrmals distanzieren die Zelle Kolonien in kleine Gruppen von rund 3 bis 6 Zellen (Abbildung 1A).
    4. Sammeln Sie die iPSCs in einem sterilen Zentrifugenröhrchen 15 mL und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min. Überstands zu entfernen und erneut aussetzen der Zelle Pellet in 5 mL M-Medium.
    5. Verteilen Sie gleichmäßig die Zellen auf 96-Well-Matrix-beschichteten Platten durch pipettieren 50 μL der Aussetzung Zellen in jedem Brunnen. Um jede 96-Well-Platte einzurichten, verwenden Sie eine 100-mm-Platte von iPSCs mit Zellen bei ca. 80 % Konfluenz enthält ca. 5 x 106 Zellen um die Differenzierung setup. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um diesen Prozess zu beschleunigen. Kulturzellen Sie über Nacht bei 37 ° c, 4 % O25 % CO2.
      Hinweis: Es ist wichtig, dass eine gleiche Anzahl von Zellen in jedem Bohrloch zu gewährleisten reproduzierbare Differenzierungen hinterlegt ist.
  3. Differenzierung der Zellen induzieren
    1. Prüfen Sie die 96-Well-Platten Mikroskopie um sicherzustellen, dass die Zellen zu mindestens 70 % der Fläche des einzelnen gut abdecken. Wenn die Abdeckung weniger als 70 % ist, ersetzen Sie das Medium mit frischem Medium und inkubieren Sie für weitere 24 h bei 37 ° c, 4 % O25 % CO2.
      Hinweis: Inkubation der Zellen für mehr als 48 h nach Beschichtung ohne Differenzierung häufig reduziert die Effizienz der Differenzierung. Differenzierung tritt auch mit ambient Sauerstoff, obwohl die Effizienz möglicherweise betroffenen.
    2. Tag 1 bis Tag2 der Differenzierung, ersetzen das Kulturmedium mit RPMI ergänzt mit 2 % B27 (ohne Insulin), 100 ng/mL Activin A, 10 ng/mL BMP4 und 20 ng/mL FGF2. Fügen Sie 100 μL des Mediums pro Bohrloch und Inkubation bei 37 ° c, Umgebungstemperatur O25 % CO2 mit einer täglichen mittleren Änderung für 2 Tage.
      Hinweis: Umgang mit einer großen Anzahl von 96-Well Platten erfordern den Einsatz einer assistierten Pipette oder Roboter. 12-Kanal und 96-Kanal Pipetten sind ideal für tägliche mittlere Veränderung.
    3. Für Tag3 bis Tag 5 der Differenzierung ergänzt ersetzen das Kulturmedium mit RPMI Zellen bei 37 ° c, Umgebungstemperatur O25 % CO2 mit täglichen mittlere Änderung für 3 Tage mit 2 % B27 (ohne Insulin) und 100 ng/mL Activin A. Culture.
    4. Auf Differenzierung 5.Tag, vor dem Austausch mit frischem Nährmedium, behandeln jedes gut mit 100 μL 0,02 % EDTA Lösung für 30 s, dann entfernen und ersetzen mit frischem Nährmedium.
      Hinweis: Wenn die Differenzierung zum Entoderm effizient ist, ist der Monolage Zellen zu unterscheiden anfällig für Peeling von der Platte. Eine kurze Behandlung mit 0,02 % EDTA Lösung lindert Zelle ablösen. Diese Behandlung beeinflusst nicht die Differenzierung in Hepatozyten.
    5. Zur Differenzierung zwischen Tagen 6 bis 10 ersetzen Sie das Kulturmedium mit RPMI / 2 % B27 (mit Insulin) mit 20 ng/mL BMP4 und 10 ng/mL FGF2 ergänzt und Inkubation bei 37 ° c, 4 % O25 % CO2 für 5 Tage mit täglicher mittlerer Wechsel. Dieser Phase induziert Zellen in Leber Vorläuferzellen zu unterscheiden.
    6. Zur Differenzierung zwischen Tage 11 bis 15 ersetzen Sie das Kulturmedium mit RPMI / 2 % B27 (mit Insulin) ergänzt mit 20 ng/mL HGF. Inkubation bei 37 ° c, 4 % O25 % CO2 für 5 Tage mit täglicher mittlerer Wechsel.
    7. Zur Differenzierung zwischen Tagen 16 bis 20 ersetzen Sie das Kulturmedium mit einem Hepatozyten Zellkulturmedium (HCM) mit 20 ng/mL von Oncostatin-M (OSM) ergänzt. Inkubieren Sie die Zellen an 37 ˚C Umgebungstemperatur O25 % CO2 mit tägliche mittlere Änderung für 5 Tage.
      Hinweis: Die Reproduzierbarkeit der Differenzierung zwischen den einzelnen Brunnen kann effizient durch Messung der relativen Höhe von Albumin, AFP oder APOB ELISA ins Medium sezerniert ermittelt werden (siehe 3.2).

3. kleines Molekül Screening

Hinweis: Im folgenden beschreibt das Verfahren verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die verwendet werden, um die APOB im Medium der Hepatozyten-wie Zellen aus familiärer Hypercholesterinämie iPSCs zu senken. Eine Beschreibung des Modells und seine Verwendung bei der Identifizierung von Cholesterin-senkenden Medikamenten beschrieben worden im detail vorher5,9. Im aktuellen Beispiel wurden 1.000 Verbindungen aus South Carolina Compound-Sammlung (SC3) Bibliothek gezeigt. Jeder Verbindung wurde bei einer Konzentration von 2 µg/mL getestet.

  1. Behandlung von iPSC - abgeleitete Hepatozyten mit kleinen Molekülen
    1. Verdünnen Sie die zusammengesetzten Hauptbibliothek um Platten arbeiten Bestände mit Verbindungen in einer Konzentration von 20 μg/mL in 2 % DMSO und bei-20 ° c zu erzeugen.
    2. Bereiten Sie genügend 96-Well-Platten der iPSC-abgeleitete Hepatozyten ermöglichen jede Verbindung getestet werden.
      Hinweis: Die Anzahl der Verbindungen zu siebenden bestimmen die Anzahl der 96-Well Platten, die erforderlich sind. Ein einzelnes sollte in der Regel jedes zusammengesetzte, plus zusätzliche Brunnen für jede Kontrollproben gut vorbereitet sein. Die Regionen in äußerster Vertiefungen der Platte vermieden werden häufig die Möglichkeit, Randeffekte zu reduzieren, die Auslegung beschädigen kann. Treffer zu erkennen mit der Z-Score-Methode ohne Wiederholungen verwenden. Wenn Wiederholungen enthalten sind, ist es sinnvoller, den t-Test verwenden.
    3. Nach Abschluss der Differenzierung (Tag 20, siehe 2.3.7) ersetzen das Kulturmedium mit 100 μL frische HCMmit 20 ng/mL Oncostatin m ergänzt. Bei 37 ° c inkubieren, 4 % O25 % CO2 für genau 24 h abrufen das Kulturmedium in eine frische 96-Well-Platte und speichern bei-20 ° c. Verwenden Sie dieses Beispiel, um das Niveau der APOB in das Medium vor der Zugabe des Medikaments zu berechnen.
    4. Fügen Sie 90 μL frische HCM mit 20 ng/mL Oncostatin m in jedem Brunnen ergänzt. Fügen Sie 10 μL jeder Verbindung von der Arbeit bestand nach dem Mischen von pipettieren. 0,2 % Steuern Brunnen entsprechend die Endkonzentration in den behandelten Proben und bei 37 ° c inkubieren DMSO hinzufügen, ambient O25 % CO2 für genau 24 h das Kulturmedium zu sammeln und bei-20 ° c lagern. Verwenden Sie dieses Beispiel, um das Niveau von APOB nach einer Behandlung mit Verbindungen zu bestimmen.
    5. Optional - die verbleibenden Zellen für Immunostaining, Zellviabilität oder Analysen der mRNA-Niveaus mit Standardmethoden verarbeitet werden können.
      Hinweis: Dieser Bildschirm wurde entwickelt, um Medikamente zu identifizieren, die eine rasche Wirkung auf APOB hatte. Je nach Krankheitsmodell, nachgeschaltete Assays oder Medikament Wirkmechanismus kann es vorteilhaft, die Probe für mehrere Tage zu behandeln sein.
  2. APOB von ELISA zu bestimmen
    1. Apolipoprotein B (APOB) Konzentration von beiden die Pre- und Post-Medikamenten behandelten Proben mit einem menschlichen APOB ELISA-Development-Kit des Herstellers-Protokolle zu bestimmen.
    2. Die folgenden Lösungen vorbereiten
      1. Waschpuffer, komponiert von 0,05 % Tween 20 in PBS, pH 7.4. Bei 4 ° c bis zur Verwendung aufbewahren.
      2. Inkubation Puffer, bestehend aus 0,05 % Tween 20 und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) mit PBS-Puffer, pH 7.4. Bei 4 ° c bis zur Verwendung aufbewahren.
    3. Bereiten Sie APOB (mAB 20/17) Antikörper durch Verdünnen bis 2 µg/mL mit PBS-Puffer, pH 7.4 vor. Fügen Sie 100 μL der verdünnten Antikörper pro Bohrloch und über Nacht bei 4 ° c inkubieren.
    4. Entfernen Sie den Antikörper von den Assay-Platten und waschen Sie auch zweimal mit 200 μl PBS, pH 7.4.
    5. Fügen Sie 200 μl/Well von 0,05 % Tween 20, 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) mit PBS-Puffer, pH 7,4 und auf einer schütteln Plattform für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    6. Bereiten Sie eine standard 8-Punkt-Kurve mit 0,05 % Tween 20 und 0,1 % BSA mit PBS-Puffer, pH 7.4 mit der folgenden Konzentrationen von APOB: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL und 50 ng/mL.
    7. Verdünnen Sie die Test-Proben 1:4 mit 0,05 % Tween 20 und 0,1 % BSA mit PBS-Puffer, pH 7.4.
    8. Nach 1 h Inkubation Puffer zu blockieren, den Puffer zu verwerfen und waschen die Assay-Platten fünfmal mit 200 μL von 0,05 % Tween 20 in PBS, pH 7.4.
    9. Vollständig zu entfernen Sie alle restlichen waschen-Puffer und übertragen Sie 90 μL der verdünnten Proben und die APOB-Standards an der Assay-Platten. Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Boston-Shaker für 1 h.
    10. Verwerfen Sie die Probe und Waschen mit 200 μL 0,05 % Tween 20 in PBS, pH-Wert 7,4 pro Bohrloch. Die Waschungen insgesamt 5 Mal zu wiederholen. Fügen Sie 100 μL pro Well von mAB LDL 11-Biotin verdünnten 1:1,000 in 0,05 % Tween 20 und 0,1 % BSA mit PBS-Puffer, pH 7.4. Inkubation bei Raumtemperatur auf einem schütteln Plattform für 1 h.
    11. Das Reagenz zu verwerfen und mit 200 μl pro gut waschen Puffer 5 Mal waschen. Fügen Sie 100 μL pro Well Streptavidin-HRP Antikörper (1:1 000 Verdünnung mit Inkubation Puffer), dann bei Raumtemperatur auf einem schütteln Plattform für 1 h inkubieren.
    12. Das Reagenz zu verwerfen und Waschen mit 200 μL 0,05 % Tween 20 in PBS, pH-Wert 7,4 pro Bohrloch. Die Waschungen insgesamt 5 Mal zu wiederholen. Vollständig entfernen Sie die restliche Wäsche Puffer aus der Assay-Platten 100 μL pro Well Tetramethylbenzidin (TMB) Substratlösung hinzufügen und bei Raumtemperatur für 8 min inkubieren.
    13. Ohne die TMB-Substrat fügen Sie direkt 100 μL pro Well Stopp-Lösung (1N HCl hinzu).
    14. Bestimmen die Extinktion bei 450 nm mit einem Teller-Reader.
    15. Eine Standardkurve kann festgestellt werden, mit Hilfe der vier Parameter logistische Regression Methode, dann verwendet, um die Konzentration von APOB in jeder Probe10definieren.
    16. Untersuchen Sie die Pre-Droge: Post-Medikament Verhältnis von APOB in jeder Probe, Verbindungen mit dem Potenzial zur Senkung von APOB identifizieren Ebenen im Medium.

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Representative Results

Generation von Hepatozyten - wie Zellen: Abbildung 1 beschreibt den Zeitrahmen der Änderungen, die während der Differenzierung der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnliche Zellen auftreten. Die Kultur der iPSCs auf E-Cad-Fc bietet ca. 2 mm Durchmesser-Kolonien, die den pluripotenten Marker OCT4 Ausdrücken (Abbildung 1A-B). Die Morphologie der Zellen auf eine E-Cadherin-Matrix angebaut werden leicht unterscheiden sich von denen auf anderen Oberflächen kultiviert. Sie neigen dazu, eine abgeflachte Morphologie mit einer größeren cytoplasmatische Fläche (Abbildung 1A). Obwohl menschliche pluripotente Stammzellen effizient auf eine Reihe von verschiedenen Matrizen11kultiviert werden können, die Kultur der iPSCs auf einer E-Cadherin-Matrix wird geglaubt, um die Homogenität der pluripotente Zellenbevölkerung zu erhöhen und ermöglicht enzymfreien Manipulation der Zellen im Abschnitt12. Jedoch mehrere alternative Matrizen, einschließlich Basalmembran Matrix, Laminins, Vitronectin und Maus embryonalen Fibroblasten (MEF), können auch zur menschlichen iPSCs pflegen und alles sollte mit der beschriebenen Vorgehensweise13kompatibel sein. In allen Fällen kann die Zelle Pluripotenz von Tra-1-60 oder gleichwertige8bestätigt werden.

Um die Differenzierung zu initiieren, sollten die iPSCs als kleine Cluster (Abbildung 1A) erhoben werden. Zu Beginn der Differenzierung sollte die vergoldeten Zellen ca. 80 % der Fläche der Platte abdecken. Nach 5 Tagen Behandlung mit Wachstumsfaktoren, die Zellen zum Ausdruck bringen Proteine, die bezeichnenderweise in das endgültige Entoderm wie SOX17 und FOXA2 ausgedrückt werden (Abbildung 1 b). Zu diesem Zeitpunkt zum Ausdruck bringen mehr als 90 % der Zellen in der Regel diese Marker. Nach weiteren 5 Tagen der Differenzierung das Entoderm wandelt eine hepatische Schicksal, und neben FOXA2, die Zellen express HNF4a, die für den Rest von den Differenzierungsprozess (Abbildung 1 b) identifiziert werden können. Wie die Zellen nehmen eine hepatische Schicksal, sollten sie die Oberfläche der Platte als eine Monolage decken. Nach Zugabe von HGF beginnen die Zellen, Proteine zum Ausdruck bringen, die fetale Hepatozyten einschließlich AFP (Abbildung 1 b) befinden. Lipid-Tröpfchen können in das Zytoplasma der Zellen beobachtet werden. Bei der Fertigstellung der Differenzierung übernehmen die Zellen eine quaderförmigen Morphologie mit einem Kern mit prominenten nukleolen und eine große Zytoplasma mit mehreren Lipid-Tröpfchen. Eine Teilmenge der Hepatozyten-ähnliche Zellen werden Multi-kernhaltigen. Die meisten Zellen express ein umfangreiches Repertoire von Hepatozyten Proteine wie Albumin (Abbildung 1 b)14.

Wirksame Hochdurchsatz Schirm mit Hypercholesterinämie als ein Krankheitsmodell: Hypercholesterinämie spiegelt übermäßige Konzentrationen von geringer Dichte Lipoprotein-Cholesterin (LDL-C) im Serum. In familiäre Hypercholesterinämie (FH) ist das höhere Niveau des Serums LDL-C vor allem auf Mutationen in den Low density Lipoprotein-Rezeptor (LDLR), die, der Aufnahme von LDL-C für die Abfertigung durch die Hepatozyten vermittelt. Zuvor haben wir beschrieben, dass die Generation der iPSCs eines Patienten mit homozygoter familiärer Hypercholesterinämie und deren Einsatz bei der Schaffung von Hepatozyten, die der Patient Lebererkrankung in Kultur9gespiegelt. Es konnte gezeigt werden, dass diese Zellen erfolgreich als Plattform für die Wirkstoffforschung verwendet werden könnte. Wenn eine Bibliothek von ~ 2.500 Medikamenten gezeigt wurde, ergab, dass Herzglykoside eine unerwartete Fähigkeit zu niedrigeren LDL-C in iPSC-abgeleitete Hepatozyten, primären humanen Hepatozyten und bei Mäusen mit vermenschlichten Leber hatte. Darüber hinaus bei der Prüfung Patientenakten fanden wir, dass Cholesterin Niveaus fiel bei Patienten, die ein Herz-Kreislauf-Glykosid zur Behandlung von Herzerkrankungen verschrieben wurden. Diese Studien bestätigt, dass iPSC-abgeleitete Hepatozyten erfolgreich in Bildschirme verwendet werden könnten, um Therapeutika zu identifizieren.

Um eine Plattform zu bieten, die kompatibel mit Screening ist, ist es wichtig, dass die Differenzierungen reproduzierbar sind und Variation von Brunnen zu Brunnen minimiert wird. Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse der Immunostaining auf jedem Bohrloch einer 96-Well-Platte, HNF4a und Albumin am Tag 20 der Differenzierung zu erkennen. Wie in der Abbildung ersichtlich, ist die Verteilung dieser Hepatozyten Proteine in alle Wells ähnlich.

Die zentrale Protein-Komponente des LDL-C ist APOB. Hier haben wir iPSCs zum Bildschirm für APOB Verbindungen zu senken, um ein Beispiel mit iPSC-abgeleitete Hepatozyten für kleines Molekül screening (Abbildung 3A) verwendet. APOB kann leicht in Lösung von ELISA gemessen werden. Da ELISA über die große Zahl der Proben durchgeführt werden kann, kann es als Grundlage für einen Bildschirm verwendet werden. Die Eignung jeder Assay für Hochdurchsatz-Screening wird am besten anhand einer Messung der Z-Faktor genannt bestimmt (oder Z')15. Dieser statistische Parameter berechnet die Wirksamkeit von einem Assay, zwischen positiven und negativen Kontrollproben zu unterscheiden. Ein Test mit einem Z-Faktor > 0,5 ist vereinbar mit einem Bildschirm15. Wie in Abbildung 3 b, Z' den APOB-Assay = 0,73, die die Eignung der Nutzung der Plattform für die Wirkstoffforschung bestätigt.

Identifizierung von Verbindungen, die die Fähigkeit zur unteren APOB Ebenen in das Kulturmedium des iPSC haben - Hepatozyten abgeleitet: um festzustellen, ob die Plattform verwendet werden könnte, um neuartige Substanzen zu identifizieren, die APOB Ebenen auswirken, haben wir 1.000 kleine Moleküle aus der South Carolina Compound-Sammlung (SC3) repräsentative Set Lite (RSL) gezeigt. Die RSL wurde durch die MUSC South Carolina Zentrum für therapeutische Entdeckung generiert und enthält Verbindungen, die strukturell unterschiedlich sind und spiegeln die übergeordnete Bibliothek.

Die Post-Droge: Pre-Medikament Verhältnis von APOB war bestimmt für jede Verbindung (Abbildung 3) und Identifikation der Treffer gelang durch die Z-Score Analyse (Abbildung 3D)16. In diesem Fall galten kleine Moleküle, die APOB mit einem Z-Wert ≤-2.0 als potenzielle Treffer reduziert. Beim screening 1.000 kleine Moleküle, ist die Anzahl der potenziellen Treffer mit einem Z-Wert von ≤ 2,0 in der Regel relativ überschaubar. Jedoch, wenn Sie einen größeren Bildschirm durchführen, würden wir setzen auf ein konservativer Wert von ≤-3.0, basierend auf der 3-Sigma-Regel, um Vertrauen in potenzielle Ziele zu erhöhen. In diesem Beispiel haben wir 24 möglichen Treffern mit einem APOB-Verhältnis von 0,86 bis 0,44 (Abb. 4A) variiert. Ein sekundäre Assay erfolgte auf vierfach Proben (n = 4 biologische Wiederholungen) Verbindungen ausschließen, die einen negativen Einfluss auf Zellviabilität hatte und um festzustellen, welche Verbindungen in das Medium reproduzierbar APOB senken könnte. Der ursprüngliche 24 Kandidaten Verbindungen, vier erwiesen sich reproduzierbar (p ≤0.05) (Abbildung 4 b-C). Auf weitere Studie 2 dieser Verbindungen erwiesen sich als negativ beeinflussen Zellviabilität, was darauf hindeutet, dass der beobachtete Rückgang der APOB dürfte eine Folge des zellverlustes. Die verbleibenden beiden Verbindungen würden gute Kandidaten für Follow-up Studien gelten.

Figure 1
Abbildung 1 : Schrittweise hepatische Differenzierung der menschlichen iPSCs. (A) Morphologie der iPSC Kolonien unmittelbar vor der Ernte (links) und iPSCs nach dem Sammeln Zellen zur Differenzierung (Rechte Abbildung) - nach der Accutase Behandlung, die Zellen sollten in 3-6 Zellen/Cluster getrennt werden. Maßstabsleiste = 50 µm. (B) Tabelle zeigt Kulturbedingungen in jedem Stadium der Differenzierung (oben). Immunostaining (untere Platten) wurde durchgeführt, um Marker Ausdruck in jedem Stadium der Differenzierung zu identifizieren. Tafeln zeigen OCT4 und DAPI Kerne in iPSCs, SOX17 und FOXA2 im endgültigen Entoderm, HNF4a und FOXA2 in hepatischen Vorläuferzellen, HNF4a und AFP in unreifen Hepatozyten-ähnliche Zellen befleckt und HNF4a und Albumin in relativ Reifen Hepatozyten-wie Zellen. Skalieren von Balken = 100 µm (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Homogene Leber Differenzierung der menschlichen iPSCs in 96-Well Platten. Immunostaining erfolgte auf jede einzelne Vertiefung einer 96-Well-Platte mit iPSC-abgeleitete Hepatozyten am Tag 20 der Differenzierung zu erkennen (A) Albumin und (B) HNF4a. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Kleines Molekül Screening mit humanen Hepatozyten iPSC abgeleitet. (A) schematische Übersicht über den Ansatz verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die das Niveau der ABOB im Medium der iPSC-abgeleitete Hepatozyten reduzieren können. (B) Graph zeigt luden ein ELISA-Assays, das Niveau der APOB im Medium der 87 Brunnen zu erkennen (n = 87) der iPSC-abgeleitete Hepatozyten (blau) und/oder undifferenzierten iPSCs (Orange). Diese Daten wurden verwendet, um den Z-Faktor zu berechnen (Z' = 0,73). (C) Diagramm, das nach dem Medikament: Pre-Droge-Verhältnisse der Konzentration von APOB in das Kulturmedium des iPSC-abgeleitete Hepatozyten für 24 h mit 998 Verbindungen aus dem SC3 RSL Satz behandelt. (D) Diagramm, Z-Scores von Daten in (C) vorgestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Validierung von primären Treffern. (A) Tabelle mit Verbindungen identifiziert, auf dem primären Bildschirm als APOB reduzieren. (B, C) Balkendiagramme zeigen die Auswirkungen der Verbindungen auf Post-Medikament: Pre-Medikament APOB-Konzentration-Verhältnis (B) und Zellviabilität (C) in iPSC-abgeleitete Hepatozyten mit Verbindungen im Follow-up-Analyse behandelt. Fehlerbalken reflektieren ± SEM (n = 4 biologische Wiederholungen); * p ≤0.05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Ziel basiert Arzneimittelforschung, wo kleine Moleküle identifiziert werden, die Einfluss auf die Aktivität eines bestimmten Proteins, wurde der Fokus vieler bestehende Screening-Bemühungen. Obwohl dieser Ansatz hat zahlreiche Arzneimittel, basierend auf Umkehr ein Phänotyp, klassischen Pharmakologie, Bildschirme zur Verfügung gestellt wurden erfolgreicher bei der Identifizierung von First-in-Class-Verbindungen, die klinisch wirksame1gewesen sein. Ein Nachteil phänotypischen Arzneimittelforschung ist, dass es stützt sich auf die Verfügbarkeit von geeigneten Krankheitsmodelle. Dies kann eine Herausforderung sein, wenn Zelle Modelle der Krankheit nicht verfügbar sind, oder wenn gemeinsame Forschung Tierarten nicht zu die klinischen Symptomen zu rekapitulieren. Jedoch hat die Möglichkeit, iPSCs aus somatischen Zellen des Patienten zu generieren neue Möglichkeiten mit Modell menschlichen Krankheit Kultur3bereitgestellt. Für einige Krankheiten, wie seltenen genetischen Erkrankungen werden Patienten gering an Zahl und schwer zu zugreifen und Zustimmung. Mit dem Aufkommen des Genoms Engineering ist jedoch relativ einfach einzuführen ursächliche Mutationen in der iPSC-Genom, macht es möglich, auch die seltensten der seltenen Krankheiten zu modellieren.

Sobald iPSCs in der hand sind, ist es notwendig, eine entsprechende Zelle Art zu produzieren, in der die Symptome der Krankheit manifestieren. Krankheiten, die neuronale Funktion können beispielsweise die Erzeugung von Neuronen oder Gliazellen17, erfordern, während möglicherweise die Auswirkungen auf die Leber Hepatozyten9,18 oder biliären Epithelzellen für19, studieren 20 , 21. diese Anforderung führt eine Reihe von Einschränkungen bei der Anwendung von iPSCs für die Arzneimittelforschung. Erstens ist es wichtig zu verstehen, die zelluläre Basis der Erkrankung. Dies kann schwierig sein, besonders wenn Zellen Eigenschaften basierend auf dem Standort oder Umgebung anzunehmen. Dies könnte zutreffen, für Hepatozyten, die Unterschiede in den gen-expressionsprofile und enzymatischen Funktion, die ihre Position innerhalb der Leber Lobule abhängig sind. Zweitens arbeiten mit Zellen isoliert kann verhindern, dass das Studium der Krankheiten, die reflektieren eine Unterbrechung Gewebestruktur wie Leberzirrhose, Zell-Zell-Kommunikation wie neuromuskuläre Erkrankungen oder diejenigen, die durch eine Entzündung, wie z. B. beeinflusst werden entzündliche Darm-Krankheit.

Um Lebererkrankungen zu untersuchen, haben mehrere Forschergruppen Protokolle, um Hepatozyten-wie Zellen aus iPSCs13,22,23,24,25generieren beschrieben. Während die meisten dieser Protokolle effizient, ist die Einschränkung der Technik, dass Zellen nicht vollständig die Funktion des frischen Hepatozyten rekapitulieren. Das heißt, es ist wichtig, festzustellen, ob Zellen aus iPSCs Anzeige der Funktionen notwendig generiert, um die Auswirkungen einer bestimmten Mutation zu bewerten. Unter den Genen, deren Ausdruck nicht entspricht, die in frischen Hepatozyten gefunden sind die Codierung CYP450 Proteine25,26. Einige dieser Proteine haben Rollen in arzneimittelstoffwechsel und XENOBIOTIKA Antwort. Dies ist wichtig, wenn das Design eines Bildschirms in Betracht, weil viele Medikamente die Generation der aktiven Metaboliten erfordern, und dies in iPSC-abgeleitete Hepatozyten betroffen sein könnten. Bemühungen zur Verbesserung der Qualität von den Hepatozyten werden aktiv verfolgte27. Trotz der Vorbehalte haben mehrere Studien gezeigt, dass iPSCs abgeleitet von Patienten mit angeborenen Fehlern in hepatischen Metabolismus erfolgreich eingesetzt werden kann, Hepatozyten-wie Zellen zu generieren, die die Pathophysiologie der Erkrankung in Kultur9 spiegeln , 18 , 28 , 29.

Für Bildschirme, um erfolgreich zu sein ist es wichtig, die homogene Differenzierung von den Hepatozyten aus die iPSCs zu gewährleisten. Wenn Differenzierungen in 96-Well Platten nicht um hochwertige Hepatozyten zu erzielen, ist es am häufigsten aufgrund der schlechten Qualität der elterlichen iPSCs oder Kultur der iPSCs unter suboptimalen Bedingungen. Pluripotenz iPSCs muss sorgfältig von Kultur in einem qualitativ hochwertigen Medium mit täglichen Änderungen beibehalten werden, wie im Protokoll 1.2 beschrieben. Die Dichte der pluripotenten Zellen in der Kulturschale sollten sorgfältig überwacht werden, weil wenn die Zellen über Zusammenfluss werden sie dazu neigen zu verlieren Pluripotenz und spontan zu unterscheiden. Wir finden auch, dass Kultivierung der Zellen in physiologischen Sauerstoffkonzentrationen Pluripotenz fördert und ist in einigen Phasen der Differenzierung von Vorteil. Jedoch wenn entsprechende Ausrüstung nicht verfügbar ist, ist es noch möglich, ambient Sauerstoff verwenden, um sowohl die pluripotenten Zellen Kultur und Differenzierung zu induzieren. Wir empfehlen, regelmäßig definieren die Pluripotenz der Lager iPSCs durch Messung Ausdruck mehrere Pluripotenz Markierungen einschließlich OCT-3/4, NANOG und TRA-1-60 vor der Durchführung umfangreiche Differenzierungen unabhängig von Kulturbedingungen. Wir haben auch festgestellt, dass wenn die Zellen mit hohem Wirkungsgrad Entoderm bilden, sie eine Tendenz haben, von der Oberfläche der Platten als Zelle Blätter schälen. Wir haben festgestellt, dass es kurz behandeln das iPSC-abgeleitete Entoderm Zellen mit 0,02 % EDTA-Lösung helfen können, um Zelle Loslösung zu reduzieren. Schließlich die optimale Konzentration der Zellen für effiziente Differenzierungen erforderlich iPSC Linien unterscheiden kann und Zelle Ablösung auswirken kann. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Konzentration der Zellen für effiziente Differenzierungen erforderlich, besonders beim Arbeiten mit einer neuen Kultur der iPSC empirisch zu ermitteln.

Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir eine schrittweise Differenzierung Protokoll beschrieben, die Hepatozyten-wie Zellen aus iPSCs erzeugt, die mit chemischen Bildschirmen kompatibel sind. Die Hepatozyten-ähnliche Zellen werden als Monolayer in 96-Well Platten produziert, und das Verfahren ist effizient und reproduzierbar. Wir zeigen die Machbarkeit von screening-Verbindungen für ihre Fähigkeit, die Konzentrationen von APOB in das Kulturmedium zu senken. Die Differenzierung-Format ist kompatibel mit mehrere Tests wie ELISA, qRT-PCR und hohe Content Bildgebung. Wir glauben, dass das Feld den Ansatz identifizieren potenzielle Therapeutika hilfreich sein wird und für die pharmakologische Identifizierung von wegen die Hepatozyten Differenzierung und Funktion in zukünftigen Anwendungen5,30.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 und HG006398, S.A.D) unterstützt. Wir möchte Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop und Ran Jing für ihre Beiträge danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes  Corning 430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes Corning 430591
96-wells tissue culture plate  Corning 3595
Anti-human Albumin Dako A 0001
Anti-human FOXA2(6C12) Novus Biological H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha Santa Cruz SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody Santa Cruz SC-9081
Anti-human SOX17 R&D AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin  Invitrogen 0050129SA
B-27 Supplement, serum free  Invitrogen 17504044
BMP4 Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase  Invitrogen A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay  Promega 7572
DPBS+(calcium, magnesium) Invitrogen 14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium) Invitrogen 14190-144
DMEM/F-12, HEPES  Invitrogen 11330057
ELISA human APOB ELISA development kit Mabtech 3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) Invitrogen PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)  Lonza CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF) Invitrogen PHC0321
L-Glutamine  Invitrogen 25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Invitrogen 11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC5015
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen 15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1  STEMCELL technologies 5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix  Invitrogen A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES  Invitrogen 22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) Primorigen Biosciences S2071
TMB-ELISA Substrate Solution Thermo Scientific  34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%  Lonza 17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302

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References

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Tags

Entwicklungsbiologie Ausgabe 135 induzierte pluripotente Stammzellen Zellen Zellkultur Hepatozyten Differenzierung High Throughput Screening Hepatozyten-ähnlichen Zellen Hypercholesterinämie
Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung
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Liu, J. T., Lamprecht, M. P., Duncan, S. A. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (135), e57194, doi:10.3791/57194 (2018).

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