Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لعزل وزراعة الخلايا mast البريتوني مورين. يصف لنا أيضا بروتوكولين لتوصيف وظيفي على: تصوير فلورسنت داخل الخلايا الحرة Ca2 + تركيز ومقايسة تحبب استناداً إلى الكمي اللونية للمفرج عنهم β-هيكسوسامينيداسي.
Abstract
خلايا ماست (MCs)، كجزء من النظام المناعي، وتلعب دوراً أساسيا في الدفاع عن البلد المضيف ضد العديد من مسببات الأمراض، وفي الشروع في الاستجابة المناعية حساسية. تفعيل الإشراف عن طريق العابرة للربط من سطح فريق الخبراء الحكومي الدولي ملزمة تقارب عالية ايغي مستقبلات (FcεRI)، وكذلك من خلال تحفيز مستقبلات أخرى عديدة، يبدأ صعود داخل الخلايا الحرة Ca2 + المستوى ([Ca2 +]أنا) أن يعزز الإفراج عن وسطاء التهابات وحساسية. تحديد المكونات الجزيئية المشاركة في هذه المسارات مما يشير إلى أمر حاسم لفهم تنظيم وظيفة MC. في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكول لعزل نوع النسيج الضام مورين MCs بالغسل البريتوني وزراعة MCs البريتوني (الشركات العسكرية الخاصة). الثقافات للإشراف من خروج المغلوب الماوس نماذج مختلفة من هذه المنهجية تمثل نهجاً مفيداً لتحديد البروتينات المشاركة في MC إشارات المسارات. وبالإضافة إلى ذلك، نحن أيضا وصف بروتوكول لخلية مفردة Fura-2 التصوير كما أسلوب هام للتحديد الكمي ل Ca2 + إشارات في MCs. المستندة إلى الأسفار الرصد [Ca2 +]أنا موثوقة ويشيع استخدام نهج دراسة Ca2 + يشير إلى الأحداث، بما في ذلك دخول الكالسيوم تعمل بالمخزن، الذي يتسم بأهمية قصوى لتفعيل MC. لتحليل تحبب MC، يصف لنا مقايسة إصدار β-هيكسوسامينيداسي. يعتبر مبلغ β-هيكسوسامينيداسي التي تطلق في المتوسط الثقافة كعلامة تحبب لكل ثلاثة مختلفة الافرازية المجموعات الفرعية الموصوفة في الإشراف-β-هيكسوسامينيداسي يمكن بسهولة قياسها كمياً بفعلها مع الركازة كولوريجينيك في ميكروتيتير لوحة مقايسة اللونية. هذا الأسلوب استنساخه بدرجة عالية من حيث التكلفة ويتطلب أي معدات متخصصة. إجمالاً، يوضح البروتوكول قدم عالية غلة من MCs معربا عن علامات السطح MC نموذجية، عرض السمات الشكلية والمظهرية نموذجية للإشراف، وإظهار الردود استنساخه بدرجة عالية على سيكريتاجوجويس في كاليفورنيا2 +- فحوصات التصوير وتحبب.
Introduction
الإشراف دوراً بارزا خلال الاستجابات المناعية الفطرية والمكتسبة. على وجه التحديد، MCs المشاركة في قتل مسببات الأمراض، مثل البكتيريا والطفيليات، وكذلك تتحلل محتملة السمية الببتيدات الذاتية أو مكونات من السموم (لاستعراض انظر جالي et al. 20081). دور الرصد والمراقبة الفسيولوجية في الحصانة الفطرية والتكيف هو موضوع نقاش ساخن. ولذلك، تتطلب التناقضات بيانات عديدة في الدراسات التي يؤديها مع نماذج مختلفة من الماوس MC-تفتقر إلى منهجية إعادة تقييم الوظائف المناعية للإشراف تتجاوز الحساسية2. MCs ناضجة تكون مترجمة معظمها في الأنسجة والأعضاء مثل الجلد والرئة، والأمعاء، وعادة ما تكون موجودة فقط في إعداد صغيرة في الدم. الإشراف مستمدة من السلائف المكونة للدم، مثل MC فروعه، وإتمام تمايز ونضج في ميكرونفيرونمينتس تقريبا جميع الأنسجة فاسكولاريزيد1. عامل المستمدة من الخلايا T انترلوكين (إيل)-3 بشكل انتقائي يعزز الاستمرارية والانتشار، والتفريق بين سكان pluripotent الماوس MCs من فروعه المكونة للدم على3. الخلية الجذعية عامل (SCF) هي التي تنتجها الخلايا الهيكلية في الأنسجة ويلعب دوراً حاسما في التنمية مولودية، والبقاء على قيد الحياة، والهجرة، والدالة4. خصائص الإشراف الفردية قد تختلف تبعاً لقدرتها على تجميع وتخزين مختلف البروتياز أو بروتيوجليكانس. في الفئران، تتميز MCs ما يسمى النسيج الضام-نوع من الإشراف المخاطية وفقا للتعريب التشريحية ومورفولوجيا، والمحتوى من الهيبارين والبروتياز5.
في أنظمة الرصد والمراقبة، أي بزيادة قدرها مجاناً Ca سيتوسوليك2 + ([Ca2 +]أنا) أمر لا غنى عنه تحبب وإنتاج eicosanoids، فضلا عن توليف السيتوكينات وتفعيل عوامل النسخ ردا على مستضد و مختلف سيكريتاجوجويس6. هو المصب هدفا رئيسيا لهذه المحفزات phospholipase جيم، الذي هيدروليزيس فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي دياسيلجليسيرول (همرشولد) واينوزيتول 1,4,5-تريسفوسفاتي. همرشولد ينشط البروتين كيناز ج والنشرات IP3 أيونات Ca2 + من هيولى. استنفاد هذه المحلات ينشط Ca2 + التدفق عبر غشاء البلازما Ca2 + القنوات، مما يؤدي إلى تخزين الكالسيوم تعمل دخول (سوسي). هو أثارت هذه العملية من خلال التفاعل من Ca2 +-استشعار، stromal التفاعل جزيء-1 (Stim1)، في هيولى مع Orai17 وكذلك من خلال تفعيل مستقبلات عابر المحتملة المتعارف عليه في قناة (TRPC) البروتينات (لاستعراض انظر فريتشيل et al. 8من 2014) في غشاء البلازما.
لدراسة دور الفسيولوجية لهذه القنوات، عدة الدوائية (تطبيق محصرات قنوات) أو نهج الوراثية تستخدم عادة. وفي الحالة الأخيرة، يتحقق قمع التعبير البروتين باستهداف مرناً (ضربة قاضية) أو تحرير الحمض النووي مع حذف العمومية أو الخاصة بالانسجة9 إكسون الترميز مسام تشكيل وحدة فرعية قناة (خروج المغلوب). ويقتصر توافر مانع مع خصوصية كافية لهذه القنوات. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب نهج ضربة قاضية تحكم دقيق من الفعالية استخدام، على سبيل المثال-غربية لطخة تحليل، ويعوقها عدم وجود أجسام مضادة محددة للبروتين القناة المستهدفة في كثير من الحالات. وهكذا، لا يزال يعتبر استخدام نماذج الماوس خروج المغلوب كمعيار الذهب لمثل هذا التحليل. نموذج مفضل في المختبر لتحقيق مهام المؤتمر الوزاري هو زراعة الشركات العسكرية الخاصة التي يمكن أن تكون معزولة السابقين فيفو كعدد سكان ناضجة تماما (بدلاً من التمييز بين الإشراف في المختبر ، على سبيل المثال-، خلايا نخاع العظام)10 . مقارنة بنخاع العظام المستمدة MCs (بممكس)، التي تستخدم عادة لدراسة MC الدالة في المختبر، وحفز FcεRI وبيتا-هيكسوسامينيداسي الإصدار هو زيادة 8 إضعاف ومعززات في هذه الشركات، على التوالي. في هذه المقالة، يصف لنا طريقة لعزل وزراعة مورين الشركات العسكرية الخاصة، التي تسمح بالحصول على بعد 2 أسابيع من استزراع عدد كبير من النسيج الضام نقي نوع الإشراف، كافية لمزيد من التحليل.
على الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا في وضع وتطبيق المؤشرات الكالسيوم وراثيا المرمزة، الاستخدام الخاص بهم لا يزال محدودا بصعوبات في إيصال الجينات إلى الخلايا المستهدفة، وعلى وجه التحديد، في خلايا متخصصة للغاية--مثل الأسماك المستزرعة الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، لا تزال هذه المجموعة من المؤشرات نيون [Ca2 +]أنا القياسات تفتقر إلى الأصباغ راتيوميتريك مع مجموعة ديناميكية عالية. لهذه الأسباب، الأسلوب المفضل لقياس راتيوميتريك [Ca2 +]أنا لا يزال استخدام صبغة الفلورسنت "Fura-2"11.
في الوقت الراهن، النهج الأكثر شيوعاً لتقييم تفعيل المنهج النموذجي وتحبب قياس النشاط β-هيكسوسامينيداسي. Β-هيكسوسامينيداسي، وسيط حساسية، هو أحد مكونات الحبيبية مولودية أن المفرج عنهم يشترك مع الهستامين في نسبة ثابتة من الإشراف12. ويمكن قياس β-هيكسوسامينيداسي بسهولة ودقة من خلال فعلها مع الركازة محددة، التي تنتج كمية قابلة لقياس لمنتج كولوريجينيك التي لا يمكن اكتشافها بسهولة في مقايسة اللونية ميكروسكوبية. ويقال في هذا المقال، تطبيق هذه التقنية لتحليل تحبب الشركات العسكرية الخاصة في الاستجابة لمجموعة متنوعة من المحفزات.
تجميع مستقبلات عالية تقارب فريق الخبراء الحكومي الدولي بلاسماليمال (FcɛRI) ينشط في الإشراف مسار إشارات داخل الخلايا تنوعاً، مما يؤدي إلى الإفراج عن محتوى الحبيبية الافرازية في الفضاء خارج الخلية المجاورة. بالإضافة إلى مستضد معين، يمكن تنشيط العديد من المحفزات الأخرى الإشراف على الإفراج عن مجموعة متنوعة من الوسطاء إيمونومودولاتوري، مثل أنافيلاتوكسينس تكملة (مثلاً., C3a و C5a)13, endothelin الببتيد مضيق للأوعية 1 (ET1)14 ، وكذلك العديد من المواد الموجبة والمخدرات آثار ردود فعل بسيودواليرجيك (مثلاً., إيكاتيبانت)15 بالربط إلى MRGPRX216. مسارات الإشارات داخل الخلايا المشاركة في الإشراف التي يسببها مرجبر تحبب تتميز ضعيف بالمقارنة مع FcɛRI بوساطة الإشارات داخل الخلايا؛ وبدأت هذه المسارات فقط إلى دراسة مكثفة خلال السنوات القليلة الماضية17 بعد تحديد مستقبلات16. إلى حد كبير، تبقى قنوات أيون غشاء البلازما المتورطين في إدخال الكالسيوم متبوعاً MRGPRX2 التحفيز يجب أن يفهم. ولذلك، تركز هذه المادة أيضا على إشارات الكالسيوم داخل الخلايا وحفز تحبب للإشراف مع مرجبر يضع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية التشريعات الألمانية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (أقرتها رسميا المجلس الإقليمي كارلسروه).
1-PMC العزلة وزراعة بالغسل داخل
| 1 | الجليد |
| 2 | الحقن 10 مل |
| 3 | إبر ز 27 |
| 4 | إبر ز 20 |
| 5 | كتلة الستايروفوم ودبابيس |
| 6 | مجموعة أنابيب (50 مل البلاستيكية أنابيب الطرد المركزي) |
| 7 | إيثانول 70% |
| 8 | ربمي المتوسطة (قبل مبردة، وأبقى على الجليد) |
| 9 | PMC المتوسطة: المتوسطة ربمي + + 20% FCS (مصل العجل الجنين) محلول "البنسلين والستربتوميسين" 1% (القلم-بكتيريا) |
| 10 | فوسفات دولبيكو في مخزنة المالحة-دببس (دون Ca2 + و Mg2 +) |
| 11 | الثقافة قوارير (25 سم) |
| 12 | عوامل نمو الأسهم الحلول (إيل-3: 1 ميكروغرام/ميكروليتر؛ صندوق إنقاذ الطفولة: 2.5 ميكروغرام/ملليلتر) |
| 13 | الممصات المصلية (10 مل) |
| 14 | نصائح ماصات معقم (20 – 200 ميليلتر) |
| 15 | هيموسيتوميتير |
| 16 | مقاعد البدلاء للطرد المركزي |
| 17 | مقص وملقط |
| 18 | CO2 غرفة للفئران |
| 19 | فتح غطاء معقم |
| 20 | أغلق غطاء معقم |
| 21 | الخلية الحاضنة (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون2) |
| 22 | نقل الماصات (20 – 200 ميليلتر) |
الجدول 1: المواد للخطوة 1.
-
بعد الاجتماع الوزاري العزل بواسطة الغسل داخل
- قبل عزل الخلية، إعداد المواد المدرجة في الجدول 1.
- استخدم 8 إلى 14 أسبوع ذكور الفئران للعزل بعد الاجتماع الوزاري. Euthanize ماوس باستنشاق أول أكسيد الكربون2 ، وتأكيد الوفاة بفقدان ردود الفعل. رش الماوس مع الإيثانول 70% وإصلاحه على كتلة رغوة استخدام دبابيس (الظهرية الجانبية إلى أسفل). قم بإزالة الجلد البطني للماوس باستخدام مقص حافة حادة. تجنب إتلاف التجويف الصفاقى.
ملاحظة: نحن نستخدم عادة هذا البروتوكول للفئران مع خلفية C57BL/6N سلالة وراثية. - حقن 7 مل من المتوسطة ربمي المثلج و 5 مل من الهواء في التجويف الصفاقى استخدام حقنه 10 مل مزودة بإبرة ز 27. دفع الإبرة بعناية في الصفاق وإنثقب لا أي أجهزة. استخدام بقعة في منطقة الدهون البربخيه للحد من خطر ثقب الجهاز.
- بعد الحقن، قم بهز الماوس لمدة 1 دقيقة لفصل الخلايا البريتوني في المتوسط ربمي. لا تهز الماوس أيضا بشدة، لتجنب إتلاف الأجهزة الداخلية وتلوث التجويف الصفاقى بالدم.
- إعادة استخدام المحاقن 10 مل بتزويدها مع قنية ز 20 جديدة. تحول أجهزة الداخلية إلى جانب واحد بإمالة في كتلة الرغوة ولطف التنصت على على مقاعد البدلاء لتسهيل الشفط المتوسط من الجانب الآخر. إدراج إبرة ز 20، مجسم مشطوف الحواف أعلى ونضح السائل من البطن بلطف وببطء (~0.5 مل/ثانية) لتجنب انسداد الأجهزة الداخلية. جمع السوائل قدر ممكن (عادة 5-6 مل).
- إزالة الإبرة من المحاقن ونقل تعليق الخلية التي تم جمعها في أنبوب جمع على الجليد. تجاهل وجود أنبوب عينة إذا كان هناك تلوث الدم مرئياً.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب مع تعليق خلية في ~ 300 x ز لمدة 5 دقائق. تحت غطاء معقم نضح المادة طافية. لكل الماوس، الجمع بين الكريات عينة في 4 مل الباردة (4 – 10 درجة مئوية) "المتوسطة بعد الاجتماع الوزاري" ونقل تعليق خلية قارورة ثقافة 25 سم2 . إضافة عوامل النمو إيل-3 وقدم مكعب معياري للتركيزات النهائية 10 نانوغرام/مليلتر و 30 نانوغرام/ملليلتر، على التوالي. ضع قارورة تحتوي على الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون2) واحتضانها ح ~ 48 حتى الإجراء التالي.
-
ثقافة ما بعد الاجتماع الوزاري
- 2 يوم (ح ~ 48 بعد عزلة): تغيير متوسطة
- لإزالة نضح طافية وغير ملتصقة الخلايا (الكريات الحمراء والخلايا الميتة)، المتوسطة من قارورة وضع تلميح ماصة باستور في حافة قارورة وعقد في قارورة تقريبا أفقياً. إضافة 4 مل من قبل حرارة PMC المتوسطة الواحدة والماوس. إضافة عوامل النمو إيل-3 (10 نانوغرام/مل)، وصندوق إنقاذ الطفولة (30 نانوغرام/ملليلتر). ضع قارورة تحتوي على الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون2).
- يوم 9: خلية تقسيم
- نقل تعليق خلية من قارورة ثقافة الخليوي في أنبوب بلاستيكي للطرد مركزي 50 مل. أغسل قارورة ثلاث مرات مع 10 مل استعد مسبقاً (37 درجة مئوية) دولبيكو للفوسفات مخزنة المالحة (دببس)، وجمع تعليق خلية مع خلايا منفصلة في 50 مل نفس أنبوب الطرد المركزي من البلاستيك. حساب تركيز الخلية هيموسيتوميتير، وحساب إجمالي عدد الخلايا.
- الطرد المركزي من تعليق خلية في ~ 300 x ز لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية. استرداد بيليه في حرارة قبل PMC المتوسطة (37 درجة مئوية) للحصول على خلية تركيز 1 × 106 الخلايا/مل. نقل تعليق خلية قارورة 25 سم2 ثقافة جديدة. تجاهل قارورة قديمة مع الليفية الانضمام إلى الأسفل.
- إضافة عوامل النمو إيل-3 (10 نانوغرام/مل)، وصندوق إنقاذ الطفولة (30 ng/mL)، ووضع في قارورة تحتوي على الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون2).
- 12 – 15 يوما: خلية القياسات
- إذا كان التخطيط لأي تجارب مع تحفيز مستقبلات FcɛRI، بريتريت الخلايا بين عشية وضحاها مع 300 نانوغرام/مليلتر من فريق الخبراء الحكومي الدولي مكافحة-التثقيف في مستنبت القياسي. يمضي قدما الخطوة 2 والخطوة 3.
- 2 يوم (ح ~ 48 بعد عزلة): تغيير متوسطة
2-قياس تركيز فلوروميتريك الكالسيوم الحرة داخل الخلايا في هذه الشركات
- قبل القياسات، إعداد المواد المدرجة في الجدول 2. أيضا، بإعداد "برنامج الإعداد التصوير" تتكون من: Fluorescence المجهر المقلوب؛ الهدف: 40 X/1.3 النفط؛ تعيين عامل تصفية Fura 2؛ كاميرا اتفاقية مكافحة التصحر؛ مصدر الضوء الإثارة؛ تصوير اقتناء البرنامج؛ خطورة تغذية نظام تطبيق الحل.
| 1 | بعد الاجتماع الوزاري (12 – 15 يوما) 1 × 106 خلايا/مل |
| 2 | كونكانافالين A |
| 3 | Fura-2 صباحا |
| 4 | F-127 بلورونيك 20 ٪ الحل |
| 5 | نظارات كشوف تغطية الجولة؛ ø 25 مم؛ رقم 1 |
| 6 | حل الأسهم DNP-هسا (ألبومين المصل الإنسان dinitrophenol) |
| 7 | حل الأسهم المضادة-التثقيف-الأجسام المضادة (IgE) |
| 8 | لوحة مسطحة القاع (12 بئرا) |
| 9 | حل الأسهم 48/80 مركب |
| 10 | وتغطي أيضا التصوير الدوائر |
| 11 | هيموسيتوميتير |
| 12 | نقل الماصات (20 – 200 ميليلتر) |
الجدول 2: المواد للخطوة 2.
-
إعداد تصوير Fura-2
- القيام بعدد خلايا استخدام هيموسيتوميتير وضبط تركيز الخلية إلى 1 × 106 خلايا/مل. تقسيم المستعمرات هذه الشركات بلطف بيبيتينج (3 – 5 مرات) تعليق خلية مع تلميح ماصة 1 مل.
- إعداد Ca2 +-تتضمن حبيس مخزنة الحل الملح (Ca2 +-حبس) يتألف من 135 ملم كلوريد الصوديوم، 6 مم بوكل، كاكل 2 مم2، 1.2 مم مجكل2، 10 مم حبيس، والجلوكوز 12 مم. قم بضبط ال pH إلى 7.4 مع 3 م هيدروكسيد الصوديوم.
- إعداد كونكانافالين A جولة الشرائح المغلفة بقطرة 1 بيبيتينج من حل كونكانافالين A (0.1 مغ/مل ح2س) على كل 25 مم تغطية الزجاج تحت غطاء عقيمة. اترك القطرات على كشوف غطاء لمدة 1 دقيقة على الأقل، ثم إزالة معظم الحل مع ماصة واسمحوا أيردري كشوف الغطاء عن 45 دقيقة بعناية اضغط كشوف الغطاء بمعاملة كونكانافالين على المطاط التصوير الدائرة (انظر الجدول للمواد) حتى يولونها للحصول على الفحص المجهري التصوير الدوائر.
ملاحظة: يمكن استخدام الشرائح بولي-L-يسين المغلفة كبديل. - حل الفلورسنت Ca2 + صبغ Fura-2 صباحا (1 مم) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]). تخزين هذا الحل محمية من الضوء.
- تمييع Fura-2 صباحا حل الأسهم في Ca2 +-حبس لتركيز نهائي من 5 ميكرومتر بغية إعداد "تحميل المخزن المؤقت". الملحق مع 5 ميليلتر/مل من بلورونيك 20% F-127 في [دمس].
- ميكس 500 ميليلتر "تحميل المخزن المؤقت" مع 500 ميليلتر من تعليق خلية بعد الاجتماع الوزاري. "الماصة؛" الخليط إلى غرفة التصوير، واحتضان الخلايا لمدة 20 – 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- إعداد خطورة تغذية نظام التطبيق مع حلول مختلفة طبقاً للبروتوكول التحفيز. تكملة حقنه 1 مع 40 مل من محلول Ca2 +-حبس، المحاقن 2 مع 40 مل من Ca2 +-حبس محلول يحتوي على 100 نانوغرام/مليلتر إدارة التخطيط الوطني، والمحاقن 3 مع 40 مل من Ca2 +-حبس محلول يحتوي على 50 ميكروغرام/مل مجمع 48/80، المحاقن 4 مع 40 مل من اسمياً Ca2 +-الحرة-الحل حبس، والمحاقن 5 مع 40 مل من اسمياً Ca2 +-الحرة-حبس محلول يحتوي على 2 ميكرومتر ثابسيجارجين.
- إعداد هدفا غمر نفط عالية في الفتحة X 40 عن طريق وضع قطره صغيرة من النفط الغمر على ذلك.
- تحميل تطبيق نظام على مرحلة المجهر المقلوب. وضعت دائرة التصوير مع الخلايا المحملة في تطبيق نظام وتأمينه لمنع الحركة أثناء التسجيل. قم بتشغيل الضوء المنقولة والتركيز الخلايا.
- شطف الخلايا ثلاث مرات مع Ca2 +-حبس المخزن المؤقت باستخدام نظام تطبيق الجاذبية.
- احتضان الخلايا في Ca2 +-حبس لمدة 5 دقائق ل Fura-2 ص دي الأسترة.
- شطف الخلايا أكثر من مرة واحدة قبل البدء التصوير، إزالة أي احتمال تسرب صبغة الفلورسنت.
-
تصوير الخلية
- بدء تشغيل البرنامج الحصول على التصوير في وضع اقتناء الفسيولوجية. فتح نافذة برنامج الإعداد، وضبط التركيز ووقت الامتلاك الأمثل (التي ينبغي أن تكون هي نفسها للإثارة مع 340 نانومتر و 380 نانومتر وعادة ما يتراوح بين 50-150 مللي ثانية).
ملاحظة: تقليل التعرض Fura-2 تحميل خلية إلى أي ضوء لتجنب فوتوبليتشينج الصبغة. - الصورة صورة مرجعية، ومارك الخلايا كمناطق للفائدة (العائد على الاستثمار). وضع علامة على عائد الاستثمار الأخير في منطقة حيث لا توجد خلايا موجودة وتعريفه الخلفية.
- إكمال الإعداد، وتبدأ بقياس معدل اقتناء s 5.
ملاحظة: الخلايا سيكون بالتناوب مضيئة مع الإثارة الخفيفة من 340 نانومتر و 380 نانومتر، والأسفار المنبعثة (> 510 نانومتر) سوف يتم جمعها باستخدام الكاميرا CCD. سيتم عرض الصور fluorescence إشارات F340 شمال البحر الأبيض المتوسط و F380 شمال البحر الأبيض المتوسط، فضلا عن النسبة (F340 nm/F380 nm) في windows ثلاثة. الرسوم البيانية بالطبع وقت الشدة fluorescence رويس الفردية يعني سيتم عرض قيم أيضا باستمرار. - إضافة الحلول في عدد دورة السليم وفقا لتصميم التجربة:
- لرفع التدبير المستحثة مستضد [Ca2 +]أنا، تطبيق كما هو موضح في الشكل 2أ 2، حل حقنه 2 بعد دورة 20، والتوقف عن تسجيل بعد دورة 150.
- لقياس الارتفاع الناجم عن مجمع 48/80 [Ca2 +] تطبيقi,كما هو موضح في الشكل 2ج، الحل حقنه 3 بعد دورة 20، والتوقف عن تسجيل بعد دورة 150.
- لقياس الارتفاع من [Ca2 +]أنا أثارت قبل سوسي، كما هو مبين في الشكل 2د، تطبيق الحل حقنه 4 بعد دورة 10، تطبيق الحل حقنه 5 بعد دورة 70، وتطبيق الحل حقنه 4 بعد دورة 120، تطبيق الحل حقنه 1 بعد دورة 150، وإيقاف التسجيل بعد دورة 220.
- بعد الانتهاء من القياس، تحويل النتائج إلى نسبة جدول يحتوي على كثافات محسوبة لكل الأطوال الموجية الإثارة مع أو بدون تصحيح الخلفية، فضلا عن قيم نسبة مع أو بدون تصحيح الخلفية لكل عائد الاستثمار وكل نقطة قياس الوقت. في البرنامج، واقتناء التتالي اضغط الأزرار: "كتر ابدأ"، ووضع علامة على كل شيء "،" تحويل كافة "،" علم وظائف الأعضاء القياسات "،" حسنا، "موافق". حفظ الملفات كالجداول ومداخن صورة للتحليل دون اتصال.
- بدء تشغيل البرنامج الحصول على التصوير في وضع اقتناء الفسيولوجية. فتح نافذة برنامج الإعداد، وضبط التركيز ووقت الامتلاك الأمثل (التي ينبغي أن تكون هي نفسها للإثارة مع 340 نانومتر و 380 نانومتر وعادة ما يتراوح بين 50-150 مللي ثانية).
3-بيتا-هيكسوسامينيداسي الإفراج عن القياس في هذه الشركات
| 1 | بعد الاجتماع الوزاري (12 – 15 يوما) 1 × 106 خلايا/مل |
| 2 | حل الأسهم المضادة-التثقيف-الأجسام المضادة (IgE) |
| 3 | حل الأسهم يمتلكهما التثقيف |
| 4 | حل الأسهم 48/80 مركب |
| 5 | إيونوميسين |
| 6 | 96-جيدا اللوحة السفلي على شكل v |
| 7 | 96-جيدا لوحات مسطحة القاع |
| 8 | أنابيب بلاستيكية للطرد المركزي (15 مل) |
| 9 | الممصات المصلية |
| 10 | الخلية الحاضنة (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون2) |
| 11 | مقاعد البدلاء للطرد المركزي |
| 12 | قارئ لوحة ميكروتيتير لقياس الكثافة الضوئية |
| 13 | ماصة متعددة القنوات (20 – 200 ميكروليتر) |
| 14 | هيموسيتوميتير |
الجدول 3: مواد للخطوة 3.
- قبل القياسات، إعداد المواد المدرجة في الجدول 3.
ملاحظة: هيدروليزيس β-هيكسوسامينيداسي صدر من الإشراف على تحفيز فنيتروفينيل-أسيتيل-د-الجلوكوزامين (بنج) في الرتبة فنيتروفينول ون-أسيتيل-د-الجلوكوزامين. Β-هيكسوسامينيداسي في العينة تبلغ متناسباً مع مقدار فنيتروفينول التي ستشكل. في بيئة عالية حموضة من "التوقف عن الحل"، فنيتروفينول موجود الكامل ديبروتوناتيد فنيتروفينولات، ويمكن الكشف عنها بواسطة امتصاص الضوء في 405 نانومتر. - إعداد تيرودي في محلول يحتوي على 130 مم كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 1.4 مم كاكل2، 1 مم مجكل2، 10 مم حبيس، الجلوكوز 5.6 ملم، وجيش صرب البوسنة 0.1%. قم بضبط ال pH إلى 7.4 مع 3 م هيدروكسيد الصوديوم.
- إعداد حل تحلل بإضافة وحدة تخزين 1% من Triton X-100 الحل تيرودي.
- إعداد الحل إيقاف تتألف من 200 مم جليكاين وضبط درجة الحموضة إلى 10.7 مع هيدروكسيد الصوديوم.
- إعداد الحل الحل (4-نيتروفينيل 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) بنج بتذويب بنج في حامض الستريك 0.4 متر إلى تركيز نهائي من 4 مم.
- حساب كمية الخلايا بحاجة للفحص (القيام الفحص في تكرار). استخدام 200,000 الشركات العسكرية الخاصة لكل بئر. استخدام الآبار 2 كعناصر سلبية (الحل تيرودي دون أي سيكريتاجوجويس مثل DNP أو مجمع 48/80) والآبار 2 كعناصر إيجابية (الحل تيرودي مع 10 ميكرون إيونوميسين) لكل الوراثي.
- نقل الخلايا في أنبوب بلاستيك أجهزة الطرد مركزي 15 مل وضبط مستوى الصوت إلى 15 مل مع الحل تيرودي للطرد المركزي في 200 x ز 4 كحد أدنى إزالة المادة طافية مع ماصة باستور وريسوسبيند الخلايا في حل تيرودي للخلايا 2 × 106 /mL.
- نقل 100 ميليلتر من تعليق الخلية الواحدة وكذلك إلى 96، حسنا الخامس-أسفل لوحة جيدا. إضافة 25 ميليلتر من التحفيز أو حل السيطرة لكل بئر (وفقا لنظام بيبيتينج هو موضح في الشكل 3أ). احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- وقف رد الفعل بوضع لوحة 96-جيدا على الجليد لمدة 5 دقائق. ثم الطرد المركزي لوحة عند 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 120 x ز. نقل 120 ميليلتر من المادة طافية استخدام ماصة متعددة القنوات للوحة مسطحة القاع 96-جيدا ووضعه على الجليد. عناية تجنب لمس الكريات الخلية، ولكن نضح تماما المادة طافية.
- إضافة 125 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل الكريات الخلية. احتضان الكريات خلية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وريسوسبيند لهم بعد الحضانة بتكرار بيبيتينج (حوالي 5 مرات).
- "الماصة؛" 25 ميليلتر من الحل بنج (4 ملم) في الآبار المطلوبة من لوحة مسطحة القاع 96-جيدا جديدة. إضافة 25 ميليلتر من كل المادة طافية إلى الحل بنج المعدة، فضلا عن 25 ميليلتر من كل خلية ليستي.
- احتضان دفعات رد فعل ح 1 في 37 درجة مئوية. وبعد التفريخ، "الماصة؛" 150 ميليلتر حل التوقف لكل بئر التوقف عن رد فعل.
- تحليل اللوحة مع قارئ ميكروسكوبية باستخدام إعداد المزدوج-الطول الموجي في 405 نانومتر مع مرجع 630 نيوتن متر للطرح التلقائي في الخلفية. في برنامج اقتناء، ووضع علامة في الخانة "مرجع"، وفي القائمة عنصر برنامج "امتصاص"، حدد "630 نيوتن متر" من القائمة المنسدلة. إذا كانت كثافة بصرية للعينات عالية جداً، تعد تمييع التحقيق مناسبة قبل هائي.
- حساب النسبة المئوية للإصدار بيتا-هيكسوسامينيداسي وفقا للمعادلة التالية:
حيث الإصدار [%] المئة من الإصدار بيتا-هيكسوسامينيداسي محددة، [المادة طافية] هي الخلفية تصحيح امتصاص المادة طافية، وهو [] الخلفية تصحيح امتصاص الخلية المقابلة ليستي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذه الشركات كانت معزولة من الفئران البرية النوع 3 (C57BL/6N) بالغسل داخل ومثقف كذلك في المتوسط ربمي تستكمل مع السفح 20% و 1% بكتيريا القلم حضور عوامل النمو (إيل-3 الساعة 10 نانوغرام/مل)، وصندوق إنقاذ الطفولة في 30 نانوغرام/مليلتر تحت العقيمة هوميديفيد الأوضاع في 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون2. تم تغيير في المتوسط على أيام 2 و 9 بعد عزل الخلية. مورفولوجيا خلية تم تحليلها باستخدام نقل الضوء على تصوير DIC (انظر الشكل 1أ، ب). التباين الخلية وتقسيمات أثبتت جدوى خلية جيدة. وبعد أسبوعين من استزراع في ظل هذه الظروف، تم الحصول على عدد سكانها 1.5 × 107 خلايا متجانسة. وكشف تحليل التدفق الخلوي الخلايا الملون يشترك مع الأجسام المضادة IgE مترافق مع فيتك والأجسام المضادة-ج-طقم مترافق مع PE 98.6 في المائة من فيتك الإيجابية و 99.8% PE إيجابية الخلايا (الشكل 1ج). 98.5 وكانت في المائة الخلايا المستزرعة إيجابية مزدوجة فيتك و PE (الشكل 1ج)، مما يدل على السمات النموذجية للإشراف ناضجة.
لمزيد من التحليل الوظيفي للخلايا التي تم الحصول عليها، أجريت فلوروميتريك [Ca2 +]أنا القياسات باستخدام مؤشر الفلورسنت Fura-2. Fura-2 تحميل خلايا كانت مضاءة بالتناوب مع 340 نانومتر و 380 نانومتر الإثارة الخفيفة كل 5 s والأسفار > 510 نيوتن متر مسجلة باستخدام كاميرا CCD. وراقب باستمرار نسبة الأسفار (F340/F380). تطبيق لإدارة التخطيط الوطني (100 نانوغرام/ملليلتر) إلى ما بعد الاجتماع الوزاري المحتضنة بين عشية وضحاها مع 300 نانوغرام/مليلتر من فريق الخبراء الحكومي الدولي آثار مكافحة-التثقيف ارتفاع ملحوظ [Ca2 +]أنا المستوى، والتي تدهورت ببطء إلى نصف الحد الأقصى خلال عدة دقائق (الشكل 2أ وب). تقلب الخلية الردود كان منخفضا نسبيا (الشكل 2أ، ب). زيادة تحفيز مستقبلات MRGPRB2 مع 50 ميكروغرام/مل من مجمع 48/80 بنفس الوقت البروتوكول أيضا كبيرة [Ca2 +[i في Fura-2-تحميل هذه الشركات مع سعة يعني مشابهة جداً للاستجابة (الشكل 2-ج). لتحليل سوسي في الشركات العسكرية الخاصة، تم تطبيق بروتوكول "إعادة إضافة": 10 دورات بعد بداية القياس، Ca خارجية2 + تمت إزالتها، وخلال دورات ثابسيجارجين 70-120، (2 ميكرومتر)، كان المانع هيولى ATPase، تطبيق لاستنفاد Ca2 + محلات تجارية داخل الخلايا وتنشيط القصوى من سوسي. عابر [Ca2 +]أنا الارتفاع يعكس Ca2 + إطلاق سراح من Ca2 + محلات تجارية داخل الخلايا في اسمياً Ca2 +-مجاناً حمام الحل (الشكل 2د). استعادة Ca2 + تركيز خارجي إلى 2 مم بعد دورة 150 أدى إلى زيادة بارزة من [Ca2 +] مستوىi بسبب تدفق2 + Ca من خلال القنوات سوسي (الشكل 2د). هذا العنصر من Ca2 + الرد كان أعاق بشدة حضور 10 ميكرون GSK 7975A، المعروف مانع قلعة، بينما ظلت Ca2 + إطلاق سراح من Ca2 + محلات تجارية داخل الخلايا دون تغيير (الشكل 2د ).
في الخطوة التالية، ونحن اختبارا لقدرة هذه الشركات معزولة الخضوع تحبب عند crosslinking مستقبلات عالية تقارب FcɛRI أو تحفيز مستقبلات MRGPRB2. لهذا الغرض، تم إجراء مقايسة الإفراج ß-هيكسوسامينيداسي. إضافة إلى لوحة 96 الخامس-أسفل بئر (2 × 105 خلايا/جيد) الخلايا وتحفز وفقا للمخطط المبين في الشكل 3ألف لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم فصل اللوحة وبعد إزالة المادة طافية، تم تفكيك الكريات. وقد تم تحليل محتوى ß-hexosaminidase supernatants الفردية وبيليه ليساتيس بردود فعلهم مع بنج أثناء ح 1 حضانة عند 37 درجة مئوية. تم الكشف عن كمية المنتجات رد فعل كولوريميتريكالي وحسبت النسبة المئوية للمفرج عنهم ß-هيكسوسامينيداسي (انظر الشكل 3ب). الإفراج عن عفوية كان من منخفضة جداً (1%)، بينما الردود محفزات تحبب قوية مثل 10 ميكرون إيونوميسين ومجمع 48/80 في 50 ميكروغرام/مل بما يزيد على 40% و 60%، على التوالي. وكانت الردود تحبب لتحفيز إدارة التخطيط الوطني تعتمد على الجرعة على مدى تركيز يتراوح بين 10-300 نانوغرام/مل. معا، هذه البيانات تشير بوضوح إلى حالة وظيفية جيدة للشركات العسكرية المعزولة.
الشكل 1 : وصف الابتدائية مثقف مورين البرية نوع هذه الشركات إجراء باستخدام التحليل الخلوي المجهري وتدفق DIC. (أ، ب) الصور التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام 20 X plasDIC الهدف من هذه الشركات مثقف في 25 سم2 قوارير البلاستيك ح 1 بعد عزل الخلية بالغسل داخل (A)، وفي يوم 9 من تثقيف (ب). أشرطة مقياس في يمين الزاوية السفلية تشير إلى 100 ميكرومتر. (ج) الخلوي تحليل لتدفق الشركات العسكرية الخاصة (مثقف 12 يوما وفقا للبروتوكول هو موضح أعلاه) شارك ملطخة بالأجسام المضادة-فريق الخبراء الحكومي الدولي مترافق مع Fluorescein Isothiocyanate (فيتك) ومكافحة-ج-كيت جسم مترافق مع فيكوريثرين (PE). يتم تقسيم الأرض كثافة الخلية في الأرباع الأربعة: Q1، PE فوق مستوى أوتوفلوريسسينسي/فيتك تحت مستوى أوتوفلوريسسينسي؛ Q2، PE فوق مستوى أوتوفلوريسسينسي/فيتك فوق مستوى أوتوفلوريسسينسي؛ Q3، PE تحت مستوى أوتوفلوريسسينسي/فيتك تحت مستوى أوتوفلوريسسينسي؛ س 4، PE تحت مستوى أوتوفلوريسسينسي/فيتك فوق مستوى أوتوفلوريسسينسي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تسجيل من [Ca2 +] أنا Fura-2 تحميل الشركات العسكرية المعزولة من الفئران البرية نوع. [Ca 2 + ]أنا المقدمة كنسبة F340/F380 ومضان. (أ) آثار الممثل [Ca2 +]أنا وقت الدورة التدريبية لهذه الشركات الفردية (n = 38) حفز مع إدارة التخطيط الوطني (100 نانوغرام/ملليلتر). (ب) الدورة الزمنية للتثقيف (100 نانوغرام/مل)-أثارت [Ca2 +]أنا الارتفاع. ويشير إلى كل نقطة بيانات متوسط القيم التي تم الحصول عليها من خلايا فردية 38 يتضح في لوحة أ هذه الشركات كانت pretreated بين عشية وضحاها مع 300 نانوغرام/مليلتر من فريق الخبراء الحكومي الدولي مكافحة-إدارة التخطيط الوطني. (ج) دورة الوقت قيم يعني المستحثة بمجمع 48/80 [Ca2 +]أنا الارتفاع في هذه الشركات (n = 60). (د) دورة الوقت القيم يعني [Ca2 +]أنا التغييرات أثناء Ca داخل الخلية2 +-تخزين استنفاد الناجمة عن تطبيق 2 ميكرومتر ثابسيجارجين (تيراغرام) في اسمياً Ca2 +-مجاناً الحل، متبوعاً بمخزن تعمل تدفق الكالسيوم بعد إعادة إضافة 2 مم Ca2 + في حمام الحل في السيطرة على المجموعة (ن = 44) من الشركات العسكرية الخاصة (المربعات السوداء) وحضور 10 ميكرون من GSK 7975A في الحل حمام (المربعات الزرقاء) (n = 41). في ب وج ود، تظهر أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الإصدار بيتا-هيكسوسامينيداسي اللونية قياسات متعددة جيدا مع الشركات العسكرية المعزولة من الفئران البرية نوع- (أ) خطة التحفيز للوحة 96-جيدا بيبيتينج لأداء الفحص بيتا-هيكسوسامينيداسي؛ وترد النتائج في لوحة يناظر "سبونتان" بيبيتينج لحل تيرودي بدون إضافة أي سيكريتاجوجويس؛ إيم = إيونوميسين؛ Cp 48/80 = مجمع 48/80. (ب) بار الرسم البياني يوضح النسبة المئوية لإطلاق سراح ß-هيكسوسامينيداسي تحت ظروف القاعدية (سبونت)، بعد التحفيز مع إيونوميسين (IM) والإنسان dinitrophenol الزلال (DNP) ومجمع 48/80 (Cp 48/80) مع تركيزات المشار إليه. أنجز المقايسة في التكرار؛ وتظهر أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن استخدام نماذج MC بنجاح لدراسة تحبب MC، إنزيمية، والالتصاق، فضلا عن توضيح مسارات توصيل إشارات تشارك في تفعيل المؤتمر الوزاري داخل الخلايا. بعض الباحثين استخدام نماذج MCs البشرية، مثل خطوط مخلدة (LAD2 و HMC1) أو الإشراف البشرية المستمدة من الحبل الدم الخلايا السلف (CD133 +) وخلايا الدم المحيطية السلف (CD34 +). ويفضل آخرون القوارض نماذج MC، مثل خلد (لوكيميا الفئران basophilic خط MC ربل-2 ح 3) أو الابتدائية مثقف (ماوس المشتقة من نخاع العظام MCs بممكس، هذه الشركات) نماذج. مورين الإشراف الابتدائي يمكن استخدامها لتحليل الدالة MC في العديد من النماذج الماوس "المغلوب"، التي هي نهج معيار الذهب لاستكشاف الوظائف الفسيولوجية لجينات معينة والبروتينات المرمزة. العجز الذي تعاني منه أدوات الدوائية للانتقائية وفاعلية كافية يجعل هذا الأسلوب قيمة خاصة لتحقيق آليات لتوصيل الإشارة عن طريق MC التنشيط18. مورين الشركات العسكرية الخاصة بالنمط الظاهري النسيج الضام الذي يسلك مورفولوجيا ناضجة ومستوى عال. أنها لا تستجيب جيدا مستضد crosslinking من FcεRI مثل بممكس فقط، ولكن يتم تنشيط أيضا من يضع عدة مستقبلات إضافية مثل endothelin 1 أو 48 مجمع. بيد أن العائد من هذه الشركات هو عادة أقل بكثير بالمقارنة بممكس وعادة ما تكون غير كافية لأداء وصمة عار غربية أو أسلوب آخر يتطلب عدد كبير من الخلايا. وقد وصفت عدة تقنيات لعزل وتنقية لهذه الشركات. على سبيل المثال، أفادت التقارير بركل التدرج الطرد المركزي تعطي درجة نقاء عالية من الخلايا19؛ بيد أن عدد الخلايا التي تم الحصول عليها بهذا الأسلوب عادة منخفضة نسبيا. في البروتوكول هو موضح هنا، أن الخطوة الأكثر أهمية هو طموح لتعليق خلية من التجويف الصفاقى. تجنب تلوث الدم العينة ويسفط أقصى مبلغ ممكن المتوسط ضرورية للحصول على عدد كبير من هذه الشركات لدرجة نقاء عالية. يتم فقط الحصول على عدد PMC قصوى مع بعض سلالات الماوس، تقصير (أيام 11-12) الفترة تثقيف. ترك هذه الخلايا في ظروف الثقافة لفترة أطول يؤدي فقط إلى الحد من عدد الخلايا.
في هذه الدراسة، ويمكننا وصف بروتوكول بسيطة مناسبة لعزل الأسماك الناضجة التي تجعل من الممكن الحصول على عدد سكان MC نقية جداً من التجويف الصفاقى الماوس. تتسم بتجانس عالية الخلايا التي تم الحصول عليها ويحمل ميزات MC النموذجية، مثل التعبير عن مستقبلات علامة محددة (كيت و FcεRI). هذه الخلايا تظهر بوضوح الصفة MC ديجرانولاتي وزيادة بهم [Ca2 +]أنا استجابة لتفعيل FcɛRI ومرجبر.
مولودية مما يشير إلى أحكام تتصلi المستوى [Ca2 +] تحديد Ca2 + الإصدار من مخازن داخل الخلايا و Ca2 + الإدخال عن طريق قنوات غشاء البلازما. [Ca2 +] أنا الارتفاع ينشط مجموعة معقدة ممرات داخل الخلايا مما يشير إلى أن تحبب المشغل مولودية. كما هو الحال في الخلايا الأخرى غير منفعل، الرئيسي Ca2 + تدفق المسار في الإشراف سوسي تفعيلها من خلال استنزاف Ca2 +-محلات تجارية. تحديد القنوات التي تشارك في هذا المسار مما يشير إلى أمر حاسم لفهم تنظيم وظيفة MC. للتعرف على مكونات المسار سوسي الجزيئية، تقنية ميكروفلوروميتريك استخدام Ca2 + مؤشرات الفلورسنت والنهج الكهربية "التصحيح-المشبك" قد لعبت دوراً بارزا. بيد أن الارتفاع من [Ca2 +]أنا مستوى هو مجموع Ca2 + الإصدار وسوسي. لتميز هاتين المرحلتين من Ca2 + تعبئة، وما يسمى "Ca2 + إعادة إضافة" البروتوكول (انظر استعراض الطيور et al. 200820) وضعت سابقا. في هذا البروتوكول، ويتم تبديل الحل الملح الخارجية من واحدة تتضمن العادي [Ca2 +[س (1 – 2 مم) إلى اسمياً Ca2 +-مجاناً الحل. في ظل هذه الظروف تعامل الخلايا مع ثابسيجارجين لتفريغ Ca2 + محلات تجارية، وهكذا تماما تنشيط سوسي. في الغياب من Ca خارج الخلية2 +، يستحضر العلاج ثابسيجارجين عابرة [Ca2 +]أنا الارتفاع، مما يعكس إصدار Ca2 + أيونات من Ca2 + محلات تجارية داخل الخلايا. إضافة إعادة Ca خارج الخلية2 + يؤدي إلى زيادة قدرها [Ca2 +]أنا تمثل في سوسي. في هذه المقالة، نقدم نجاح استخدام هذا النهج لتوصيف سوسي في الإشراف. لمراقبة [Ca2 +]أنا التغييرات، استخدم Fura-2 كمؤشر لكالسيوم. في شكله أسيتوكسيميثيل، يمكن بسهولة تحميل Fura-2 في هذه الشركات. يسمح استخدام هذه الصبغة راتيوميتريك مقارنة ليس فقط ستريك [Ca2 +]أنا المرتفعات، ولكن أيضا الاختلافات في القاعدية [Ca2 +]أنا مستويات، وأهمية خاصة لتحليل نوع البرية/خروج المغلوب الخلايا. مقارنة مع الأصباغ الفلورية وراثيا المرمزة، واحدة من أهم معوقات Fura-2 في ارتفاع التراكم في العضيات الخلوية المختلفة ومن ثم تلوث fluorescence هيولى.
تصوير Fura-2 يتطلب أسلوب إثارة مزدوجة. عادة، من الناحية التقنية أسهل بكثير لاستخدام أكثر من تقنية الانبعاث المزدوج الذي يتطلب ليس فقط استخدام مصدر الضوء المشغلة ولكن بالإضافة إلى ذلك إشراك عجلة عامل تصفية أو تقسيم صورة في مسار الانبعاثات الخفيفة. يمكن استخدام بروتوكول وصف ل Ca2 + التصوير من الخلايا الأخرى غير منفعل.
هو إحدى سمات رئيسية للإشراف على محتوى عال من الحبيبات الافرازية إلكترون كثيفة، التي تمتلئ بكميات كبيرة من المواد إيمونومودولاتوري والوسطاء. مولودية التنشيط يؤدي إلى الإفراج سريع عن المركبات الحبيبية بريفورميد. تتوفر عدة نهج لتحليل MC تحبب في المختبر ، بما في ذلك الكشف عن السيروتونين راديولابيليد، الكشف عن الهيستامين باستخدام الأجسام المضادة (ELISA)، والكشف عن زيادة استخدام سطح غشاء البلازما قياسات السعة الخلية الكهربية "التصحيح-المشبك". في هذه الورقة، يصف لنا تطبيق عملي للتحليل استخدام الكشف عن قياس الألوان المتعددة جيدا في المختبر صدر β-هيكسوسامينيداسي. هذا التحليل يستند إلى قدرة β-هيكسوسامينيداسي يتحلل الطرفي ن-أسيتيل-د-بقايا الهيكسوزامين في ن-أسيتيل-β-د-هيكسوسامينيديس21. هو الإفراج عن التعاون مع الهيستامين ولكن أيضا مع الوسطاء الآخرين مثل د كاثيبسين أو تنف β-هيكسوسامينيداسي وهكذا يمكن استخدام كربط تحبب من أنواع متعددة من الحويصلات الافرازية في الإشراف12،22.
في وصف الأسلوب، حفز الشركات العسكرية الخاصة في 37 درجة مئوية مع سيكريتاجوجويس المختلفة، تليها ردود فعلهم مع الركازة β-هيكسوسامينيداسي بتقدير سوبيرناتانتس وكذلك الكريات من محتويات β-هيكسوسامينيداسي. واستخدمت كالركيزة، 4-نيتروفينيل ن-أسيتيل-β-د-جلوكوسامينيدي. قد تحلل إلى ن-أسيتيل-د-الجلوكوزامين وف-نيتروفينول. وكان كمياً مقدار فنيتروفينول كولوريميتريكالي بامتصاص الضوء في 405 نانومتر. في بعض التعديلات للمقايسة الإفراج ß-هيكسوسامينيداسي، 4-ميثيلومبيليفيريل-ن-أسيتيل-بيتا-الجلوكوزامين يستخدم كطبقة سفلية. بعد التحلل المائي الأنزيمي، يولد المضمون مركب فلوروميتريكالي قابلة للاكتشاف. لقد أعربنا عن مدى تحبب كنسبة مئوية من إطلاق سراح، تطبيع للمحتوى الكلي. وهذا سمح لنا بتجنب التقلبات وعرض أرقام الخلية المختلفة ومضمونها محبب بين مختلف الخلايا الاستعدادات. نحن لا طرح نشرة عفوية (لاحظ في غياب الإشراف secretagogues) من صافي تحبب حفز، منذ إطلاق سراح عفوية على حدة نظراً لأهميته كمؤشر لبقاء MC. لتجنب التقلبات العالية في نتائج الفحص، من المهم أن تفصل بعناية فائقة سوبيرناتانتس والكريات بعد الطرد المركزي لحفز الخلايا. كما أنها ضرورية لتجنب تشكيل أي فقاعات في لوحات متعددة جيدا قبل إجراء القياسات اللونية. حد كبير الأسلوب المبين أن النتيجة يمثل ليس كقيمة مطلقة، ولكن كنسبة مئوية من الوسيط المفرج عنهم.
على النقيض من أساليب الكشف المباشر من السيروتونين المفرج عنهم أو الهيستامين، مقايسة المبلغ عنها هو أكثر فعالية من حيث التكلفة ويتطلب أي معدات متخصصة. وباﻹضافة إلى ذلك، الأسلوب الذي وصف تم استنساخه بدرجة عالية ولا تحتاج إلى القيام بها في مختبر مشعة، ولا يتطلب شراء مكلفة للأجسام المضادة. ولذلك، يمكن أن يكون بديلاً ممتازا لتقنيات أكثر تكلفة وصعوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
المؤلف يود أن ينوه جمين جوليا للمساعدة التقنية في إعداد الخلية الصاري واستزراع. وأيد هذا العمل "مركز البحوث التعاونية من بين الأقاليم" (TR SFB) 152.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
References
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
- Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Galli, S. J., et al. Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
- Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
- Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150 (2014).
- Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
- Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
- Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
- Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
- Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
- Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).
- Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
- Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
- Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
- Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569 (2014).
