Summary
Her presenterer vi en protokoll for å isolere og dyrke murine peritoneal mastceller. Beskriver vi også to protokoller for deres funksjonell karakteristikk: en fluorescerende imaging intracellulær gratis Ca2 + konsentrasjon og en omfatter degranulering analysen basert på kolorimetrisk kvantifisering av den utgitte β-hexosaminidase.
Abstract
Mast celler (MCs), spille som en del av immunsystemet, en nøkkelrolle i å forsvare verten mot flere patogener og initiering av allergiske immunrespons. Aktivering av MCs via cross-linking av overflate IgE bundet til høy affinitet IgE reseptor (FcεRI), samt gjennom stimulering av flere andre reseptorer, starter økningen av gratis intracellulær Ca2 + nivået ([Ca2 +]jeg) som fremmer utgivelsen av inflammatoriske og allergiske meglere. Identifikasjon av molekylære bestanddeler involvert i disse signalveier er avgjørende for å forstå regulering av MC-funksjonen. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for isolering typen murine bindevev MCs av peritoneal lavage og dyrking av peritoneal MCs (PMCs). Kulturer av MCs fra ulike knockout musen modeller av denne metodikken representerer en nyttig tilnærming til identifisering av proteiner involvert i MC signalnettverk trasé. Dessuten, vi også beskriver en protokoll for enkelt celle Fura-2 tenkelig som en viktig teknikk for kvantifisering av Ca2 + signalering i MCs. fluorescens-basert overvåking av [Ca2 +]jeg er en pålitelig og brukte tilnærming til studere Ca2 + signalisering hendelser, inkludert lager-opererte kalsium oppføring, som er av største betydning for MC aktivisering. For analyse av MC omfatter degranulering beskriver vi en β-hexosaminidase release analysen. Mengden av β-hexosaminidase utgitt til kultur medium regnes som en omfatter degranulering markør for alle tre forskjellige sekretoriske delsett beskrevet i MCs. β-hexosaminidase kan enkelt kvantifiseres ved sin reaksjon med et colorigenic medium i en være ferdig innen plate kolorimetrisk analysen. Denne svært reproduserbar teknikken er kostnadseffektive og krever ingen spesialisert utstyr. Overall, gitt protokollen demonstrerer en høy avkastning av MCs uttrykke typisk MC overflate markører, vise typiske morfologiske og fenotypiske egenskapene til MCs og demonstrere svært reproduserbar Svar å secretagogues i Ca2 +- bildebehandling og omfatter degranulering analyser.
Introduction
MCs spille en fremtredende rolle under medfødt og ervervet immunreaksjoner. Spesielt MCs delta i drepe patogener, som bakterier og parasitter, og også redusere potensielt giftig endogene peptider eller komponenter av venoms (for gjennomgang se Galli et al. 20081). Fysiologiske rollen MCs i medfødte og adaptive immunitet er gjenstand for opphetet debatt. Derfor krever mange data avvik studier utført med ulike MC-mangelfull musen modeller en systematisk evaluering av immunologiske funksjoner av MCs utover allergi2. Eldre MCs er hovedsakelig lokalisert i vev og organer som huden, lungene og gut, og vanligvis finnes bare i små tall i blodet. MCs avledet fra blodkreft forløpere, som MC progenitors, og fullføre sine differensiering og modning i microenvironments av nesten alle Stangeriaceae vev1. T-cell-derived faktor interleukin (IL) -3 fremmer selektivt levedyktighet, spredning og differensiering av pluripotent innbyggere musen MCs fra deres blodkreft progenitors3. Stamcelle faktor (SCF) er produsert av strukturelle celler i vev og spiller en avgjørende rolle i MC utvikling, overlevelse, migrasjon og funksjon4. Egenskaper for personlige MCs kan variere avhengig av deres evne til å syntetisere og lagre ulike proteaser eller proteoglycans. I mus, er såkalte bindevev-type MCs forskjellig fra mucosal MCs etter deres anatomiske lokalisering, morfologi og innhold av heparin og proteaser5.
I MCs, en økning på gratis cytosolic Ca2 + ([Ca2 +]jeg) er uunnværlig for omfatter degranulering og produksjon av eicosanoids og syntese av cytokiner og aktivering av transkripsjonsfaktorer svar til antigen og ulike secretagogues6. En nedstrøms mål av disse stimuli er fosfolipase C, som hydrolyzes phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate diacylglycerol (DAG) og inositol 1,4,5-trisphosphate. DAG aktiverer protein kinase C og IP3 utgivelser ioner av Ca2 + fra det endoplasmatiske retikulum. Utarming av disse butikkene aktiverer Ca2 + tilstrømningen gjennom plasma membranen Ca2 + kanaler, fører til lagre styres kalsium oppføring (SOCE). Denne prosessen er fremkalt gjennom samspillet av Ca2 +-sensor, stromal samhandling molekyl-1 (Stim1), i det endoplasmatiske retikulum med Orai17 samt gjennom aktivering av forbigående reseptor potensielle kanoniske (TRPC) proteiner (for gjennomgang se Freichel et al. 20148) i plasma membranen.
For å studere brukes fysiologiske rollen av disse kanalene, flere farmakologisk (anvendelse av kanal blokkere) eller genetiske metoder vanligvis. I sistnevnte tilfelle, undertrykkelse av protein uttrykk oppnås ved å målrette mRNA (knockdown) eller genomisk DNA redigering med global eller vev-spesifikke9 sletting i en ekson koding en pore danner delenhet i en kanal (knockout). Tilgjengeligheten av en blokkering med tilstrekkelig spesifisitet for disse kanalene er begrenset. I tillegg knockdown tilnærming krever nøye kontroll på sin effektiviteten bruker, f.eks., Western blot analyse, og er hemmet av mangel på spesifikke antistoffer for målkanalen protein i mange tilfeller. Dermed er bruk av knockout musen modeller fortsatt betraktet som gullstandarden for Slike analyser. En foretrukket i vitro modell for etterforskningen av MC funksjoner er dyrking av PMCs som kan være isolert ex vivo som en fullt moden populasjon (i motsetning til skille MCs i vitro fra, f.eks., bein margtransplantasjon celler)10 . Sammenlignet med benmarg avledet MCs (BMMCs), som er også ofte brukt til å studere MC funksjon i vitro, stimulering av FcεRI og beta-hexosaminidase er versjon økte 8-fold og 100-fold i PMCs, henholdsvis. I denne artikkelen beskriver vi en metode for isolasjon og dyrking av murine PMCs, som tillater for å få etter 2 uker med dyrking mange ren bindevev skriver MCs, tilstrekkelig for videre analyse.
Til tross for framskritt i utvikling og anvendelse av genetisk kodet kalsium indikatorer, er deres bruk fortsatt begrenset av vanskeligheter i levering av gener til målcellene, spesielt i høyt spesialiserte celler som primære kulturperler MCs. I tillegg mangler denne gruppen av fluorescerende indikatorer for [Ca2 +]jeg målinger fortsatt ratiometric fargestoffer med en høy dynamisk område. For disse grunner er den foretrukne metoden for ratiometric [Ca2 +]jeg måling fortsatt bruk av fluorescerende fargestoff "Fura-2"11.
For tiden, de vanligste tilnærming for vurdering av MC aktivisering og omfatter degranulering er måling av β-hexosaminidase aktivitet. Β-hexosaminidase, en allergisk megler, er en av MC granule komponentene som er co utgitt med histamin i konstant andel fra MCs12. Β-hexosaminidase kan lett og nøyaktig måles gjennom sin reaksjon med en bestemt underlaget, som produserer en målbar mengde et colorigenic produkt som er lett synlig i en microplate kolorimetrisk analysen. I denne artikkelen, er bruk av denne teknikken for analyse av PMCs omfatter degranulering svar på ulike stimuli rapportert.
Samling av høy affinitet plasmalemmal IgE reseptoren (FcɛRI) aktiveres i MCs en allsidig intracellulær signalveien, fører til en utgivelse av sekretoriske granule innhold i omkringliggende ekstracellulære plass. I tillegg til spesifikke antigen, mange andre stimuli kan aktivere MCs å løslate en variert rekke immunmodulerende meglere, som utfyller anaphylatoxins (f.eks., C3a og C5a)13, vasoconstrictor peptid endothelin 1 (ET1)14 , så vel som mange kationisk stoffer og narkotika provoserte pseudoallergic reaksjoner (f.eks., icatibant)15 ved binding til MRGPRX216. Intracellulær signalveier involvert i MRGPR-indusert MCs omfatter degranulering kjennetegnes dårlig i forhold til FcɛRI-mediert intracellulær signalering; disse veier bare begynte å studeres intensivt i løpet av de siste par år17 etter reseptor identifikasjon16. I stor grad, gjenstår plasma membranen ion kanalene involvert i kalsium oppføring etterfulgt av MRGPRX2 stimulering å bli forstått. Derfor denne artikkel fokuserer også på intracellulær kalsium signalering og omfatter degranulering av MCs stimulert med MRGPR agonister.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til tysk lovgivning retningslinjer for behandling og bruk av forsøksdyr (offisielt godkjent av Karlsruhe regional council).
1. PMC isolasjon og dyrking av Intraperitoneal Lavage
| 1 | Isen |
| 2 | 10 mL sprøyter |
| 3 | 27 G nåler |
| 4 | 20 G nåler |
| 5 | Styrofoam blokk og pins |
| 6 | Samling rør (50 mL plast sentrifuge rør) |
| 7 | 70% etanol |
| 8 | RPMI Medium (Pre kjølt og holdt på is) |
| 9 | PMC Medium: RPMI Medium + 20% FCS (Fetal kalv Serum) + 1% Penicillin Streptomycin løsning (penn-Strep) |
| 10 | Dulbeccos fosfat bufret saltholdig - DPBS (uten Ca2 + og Mg2 +) |
| 11 | Kultur flasker (25 cm) |
| 12 | Vekstfaktorer lager løsninger (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL) |
| 13 | Serologisk Pipetter (10 mL) |
| 14 | Pipetter tips sterilt (20 til 200 µL) |
| 15 | Hemocytometer |
| 16 | Benken sentrifuge |
| 17 | Saks og tang |
| 18 | CO2 kammer for mus |
| 19 | Åpne sterilt hette |
| 20 | Lukket sterilt hette |
| 21 | Cellen inkubator (37 ° C og 5% CO2) |
| 22 | Overføre Pipetter (20 til 200 µL) |
Tabell 1: Materialer for trinn 1.
-
PMC isolasjon av intraperitoneal lavage
- Før cellen isolasjon, forberede materialet i tabell 1.
- Bruk 8 til 14 uke gammel mannlig mus PMC isolering. Euthanize en mus ved CO2 innånding, og Bekreft at av tap av reflekser. Spray musen med 70% etanol og fikse det på skum blokk med pinner (dorsal side ned). Fjerne ventrale huden museklikk med sløv kanten saks. Unngå skade bukhulen.
Merk: Vi bruker vanligvis denne protokollen for mus med C57BL/6N belastning genetisk bakgrunn. - Injisere 7 mL av iskalde RPMI medium og 5 ml luft i bukhulen bruker en 10 mL sprøyte utstyrt med en 27 G nål. Stikk nålen nøye i peritoneum og ikke stikker hull noen organer. Bruk et sted i regionen epididymal fett for å redusere risikoen for et organ perforering.
- Etter injeksjon, riste musen for 1 min koble peritoneal celler til RPMI medium. Ikke riste musen for sterkt for å unngå skade de indre organene og forurensende bukhulen med blod.
- Bruke 10-mL sprøyten ved å utstyre den med en ny 20 G kanyle. Skifte indre organer til side ved å vippe skum blokken og trykke det forsiktig på benken å forenkle middels aspirasjon fra den andre siden. Sette inn en 20 G nål skråkant opp og Sug opp væske fra magen sakte og forsiktig (~0.5 mL/s) for å unngå tilstopping av indre organer. Samle så mye væske som mulig (vanligvis 5-6 mL).
- Fjerne nålen fra sprøyten og overføre samlet celle suspensjon i en samling rør på is. Kast et eksempel rør hvis det er synlig blod forurensning.
- Sentrifuge rør med cellen suspensjon på ~ 300 x g i 5 min. Sug opp nedbryting under sterilt hette. Hver mus, kombinere eksempel pellets i 4 mL kaldt (4-10 ° C) PMC Medium og overføre celle suspensjon til en 25 cm2 kultur kolbe. Legg vekstfaktorer IL-3 og SCF til den endelige konsentrasjoner 10 ng/mL og 30 ng/mL, henholdsvis. Plasser kolbe som inneholder cellene i en inkubator (37 ° C og 5% CO2) og ruge ~ 48 h til neste prosedyre.
-
PMC kultur
- Dag 2 (~ 48 h etter isolasjon): Medium endring
- Hvis du vil fjerne supernatant og ikke-tilhenger cellene (erytrocytter og døde celler), Sug opp mediet kolbe ved å plassere en Pasteur pipette tips på kanten av flasken og holde flasken nærmest horisontalt. Legge til 4 mL forvarmes PMC Medium per musen. Legge til vekstfaktorer IL-3 (10 ng/mL) og SCF (30 ng/mL). Plass kolbe som inneholder cellene i en inkubator (37 ° C og 5% CO2).
- Dag 9: Cellen deling
- Overføre celle suspensjon fra celle kultur flasken i en 50 mL plast sentrifuge rør. Vask kolbe tre ganger med 10 mL pre varmet (37 ° C) Dulbeccos fosfat-bufret saltvann (DPBS), samle celle suspensjon med frittstående celler i den samme 50 mL plast sentrifuge rør. Telle celle konsentrasjonen av en hemocytometer, og Beregn antall celler.
- Sentrifuge celle suspensjon på ~ 300 x g i 5 min og Sug opp nedbryting. Gjenopprette pellet forvarmes PMC medium (37 ° C) å få celle konsentrasjon 1 x 106 celler/mL. Overføre celle suspensjon til en ny 25 cm2 kultur kolbe. Kast gamle kolbe med fibroblaster følge bunnen.
- Legge til vekstfaktorer IL-3 (10 ng/mL) og SCF (30 ng/mL), og plassere kolbe som inneholder cellene i en inkubator (37 ° C og 5% CO2).
- Dager 12-15: celle målinger
- Hvis noen eksperimenter med stimulering av FcɛRI reseptorer er planlagt, pretreat cellene over natten med 300 ng/mL av IgE anti-DNP i standard kultur medium. Fortsett med trinn 2 eller trinn 3.
- Dag 2 (~ 48 h etter isolasjon): Medium endring
2. fluorometric intracellulær gratis kalsium konsentrasjon måling i PMCs
- Før målingene, forberede materialet oppført i tabell 2. Også forberede en Imaging oppsett består av: invertert fluorescens mikroskop; Mål: 40 X / 1.3 olje; Fura 2 filteret satt; CCD kamera; Eksitasjon lyskilde; Imaging oppkjøpet Program; Tyngdekraften matet løsning programsystem.
| 1 | PMC (12-15 dager gamle) 1 x 106 celler/mL |
| 2 | Concanavalin A |
| 3 | Fura-2 AM |
| 4 | Pluronic F-127 20% løsning |
| 5 | Cover slips briller round; ø 25 mm; Nr. 1 |
| 6 | DNP-HSA (dinitrophenol-menneskelige serum albumin) lagerløsning |
| 7 | Anti-DNP-antistoff (IgE) lagerløsning |
| 8 | Flat bunnplaten (12 brønner) |
| 9 | Sammensatte 48/80 lagerløsning |
| 10 | Dekk godt Imaging Chambers |
| 11 | Hemocytometer |
| 12 | Overføre Pipetter (20 til 200 µL) |
Tabell 2: Materialer til trinn 2.
-
Fura-2 tenkelig forberedelse
- Utføre en celletall bruker en hemocytometer og justere til celle konsentrasjonen til 1 x 106 celler/mL. Dele PMCs koloniene ved forsiktig pipettering (3-5 ganger) cellen suspensjon med 1 mL pipette tips.
- Forberede en Ca2 +-inneholder HEPES bufret salt løsning (Ca2 +- HBSS) består av 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 10 mM HEPES og 12 mM glukose. Justere pH 7,4 med 3 M NaOH.
- Forberede concanavalin A belagt lysbilder av pipettering 1 dråpe concanavalin A løsning (0,1 mg/mL i H2O) på hver 25 mm runde cover glass under sterilt hette. La dråper på dekselet papirlapper for minst 1 min, så fjerne det meste av løsningen med en pipette og la cover papirlapper air-dry for 45 min. Trykk concanavalin A behandlet cover papirlapper på gummi imaging kammer (se Tabell of Materials) til de feste for å få mikroskopi imaging kamre.
Merk: Poly-L-Lysine belagt lysbilder kan brukes som et alternativ. - Oppløse fluorescerende Ca2 + fargestoff Fura-2 AM (1 mM) i dimethyl sulfoxide (DMSO). Lagre denne løsningen beskyttet mot lyset.
- Fortynne den Fura-2 AM lagerløsning i Ca2 +- HBSS til en siste konsentrasjon på 5 µM for å forberede "lasting bufferen". Supplere med 5 µL/mL av 20% pluronic F-127 i DMSO.
- Mix 500 µL av "lasting buffer" med 500 µL av PMC celle suspensjon. Pipetter blandingen i tenkelig kammeret og ruge celler for 20-30 min ved romtemperatur i mørket.
- Definere tyngdekraften matet programmet system med ulike løsninger stimulering protokollen. Supplere sprøyte 1 med 40 mL Ca2 +- HBSS, sprøyte 2 med 40 mL Ca2 +- HBSS som inneholder 100 ng/mL DNP, sprøyte 3 med 40 mL Ca2 +- HBSS som inneholder 50 µg/mL sammensatte 48/80, sprøyte 4 med 40 mL nominelt Ca2 +-gratis-HBSS løsning, og sprøyte 5 med 40 mL nominelt Ca2 +-gratis-HBSS løsning som inneholder 2 µM Thapsigargin.
- Forberede en 40 X høy blenderåpning nedsenking oljeobjektiv ved å plassere en liten dråpe neddyppingsolje på den.
- Montere programmet systemet på scenen av invertert mikroskopet. Sett til tenkelig kammeret lastet cellene i programmet systemet og sikre slik at bevegelse under opptak. Slå på lyset og fokusere cellene.
- Skyll cellene tre ganger med Ca2 +- HBSS buffer ved hjelp av gravitasjon-matet programmet systemet.
- Inkuber cellene i Ca2 +- HBSS for 5 min Fura-2 AM de esterification.
- Skyll cellene en gang før du starter avbilding, for å fjerne noen potensielt lekket fluorescerende fargestoff.
-
Cellen bildebehandling
- Start bilderedigeringsprogrammet oppkjøpet i fysiologiske kjøp. Åpne oppsettvinduet, og justerer fokus og optimal oppkjøpet tid (som skal være den samme for eksitasjon med 340 nm og 380 nm og vanligvis varierer mellom 50-150 ms).
Merk: Minimere avsøring av Fura-2 lastet celle for alle lys for å unngå photobleaching av fargestoffet. - Bilde en referanse bilde, og Merk celler som regioner av interesse (ROI). Merke siste Avkastningen i et område der ingen celler finnes og definere det som bakgrunn.
- Fullføre installasjonen og starte målingen med en 5 s oppkjøpet rate.
Merk: Cellene bli vekselvis belyst med magnetisering lys av 340 nm og 380 nm og slippes ut fluorescens (> 510 nm) samles bruker CCD kameraet. Bilder av fluorescens signaler F340 nm og F380 nm samt forholdet (F340 nm/F380 nm) vises i tre vinduer. Listene over gang løpet av personlige ROIs fluorescens intensitet mener verdier vises også kontinuerlig. - Legg løsninger på riktig syklus nummer ifølge utformingen av forsøket:
- Mål antigen-indusert rettighetsutvidelse [Ca2 +]jeg, som illustrert i figur 2, 2B, bruke sprøyte 2 løsningen etter syklus 20, og Stopp opptak etter syklus 150.
- For å måle sammensatte 48/80-indusert heving av [Ca2 +] brukei,som illustrert i figur 2C, sprøyte 3 løsningen etter syklus 20 og stoppe opptaket etter syklus 150.
- For å måle høyden av [Ca2 +]jeg fremkalt av SOCE, som vist i figur 2D, bruke sprøyte 4 løsningen etter syklus 10, bruke sprøyte 5 løsningen etter syklus 70, bruke sprøyte 4 løsningen etter syklus 120, bruke sprøyte 1 løsningen etter syklus 150 og stoppe registreringen etter syklus 220.
- Etter endt målingen, konvertere resultatene til en ratio tabellen som inneholder de målte intensiteter for både eksitasjon bølgelengder med og uten bakgrunn korreksjon, samt forholdet verdiene med og uten bakgrunn korreksjon for hver avkastning og hver gang målingen. I oppkjøpet program, fortløpende trykker knappene: "start cutter", "merker alle", "konvertere alle", "fysiologi mål", "Ok,"Ok". Lagre filene som tabeller og bildestakker for off-line analyse.
- Start bilderedigeringsprogrammet oppkjøpet i fysiologiske kjøp. Åpne oppsettvinduet, og justerer fokus og optimal oppkjøpet tid (som skal være den samme for eksitasjon med 340 nm og 380 nm og vanligvis varierer mellom 50-150 ms).
3. beta-hexosaminidase Release måling i PMCs
| 1 | PMC (12-15 dager gamle) 1 x 106 celler/mL |
| 2 | Anti-DNP-antistoff (IgE) lagerløsning |
| 3 | DNP-HSA lagerløsning |
| 4 | Sammensatte 48/80 lagerløsning |
| 5 | Ionomycin |
| 6 | 96-brønns plate, v-formet bunn |
| 7 | 96-brønns plater, flat bunn |
| 8 | Plast sentrifuge rør (15 mL) |
| 9 | Serologisk Pipetter |
| 10 | Cellen inkubator (37 ° C og 5% CO2) |
| 11 | Benken sentrifuge |
| 12 | Være ferdig innen plate leseren for optisk densitet målinger |
| 13 | Flerkanals Pipetter (20 til 200 μL) |
| 14 | Hemocytometer |
Tabell 3: Materialer til trinn 3.
- Før målingene, forberede materialet oppført i tabell 3.
Merk: β-hexosaminidase løslatt fra MCs etter deres stimulering hydrolyzes p-nitrophenyl-acetyl-D-glukosamin (pNAG) i p-nitrophenol og N-acetylen-D-glukosamin. Mengden av β-hexosaminidase i eksemplet er proporsjonal med mengden av p-nitrophenol som blir dannet. I en høy pH miljø av "stoppløsning", p-nitrophenol finnes som fullt deprotonated p-nitrophenolat og kan oppdages av sitt lys absorbans ved 405 nm. - Forberede Tyrodes løsning som inneholder 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5,6 mM glukose og BSA 0,1%. Justere pH 7,4 med 3 M NaOH.
- Forberede lysis løsningen ved å legge en 1% mengde Triton X-100 til den Tyrode løsning.
- Forberede stopp løsningen består av 200 mM glysin og justere pH til 10,7 med NaOH.
- Forberede pNAG løsning (4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) løsningen ved å løse opp pNAG i 0,4 M sitronsyre til en siste konsentrasjon av 4 mM.
- Beregne mengden cellene trengs for analysen (utføre analysen i duplikat). Bruk 200.000 PMCs per brønn. Bruk 2 brønner som negative kontroller (Tyrodes løsning uten noen secretagogues som DNP eller sammensatte 48/80) og 2 brønner som positive kontroller (Tyrodes løsning med 10 µM Ionomycin) for hver genotype.
- Overføre cellene til en 15-mL plast sentrifuge tube, Juster volumet til 15 mL Tyrodes løsning og sentrifuge 200 x g 4 min. fjerne nedbryting med en Pasteur pipette og resuspend cellene i Tyrodes løsning 2 x 106 celler /mL.
- Overføre 100 µL av cellen suspensjon per brønn til en 96-brønns V-godt bunnplaten. Legg til 25 µL stimulering eller kontrolløsning hver brønn (ifølge pipettering ordningen illustrert i Figur 3A). Inkuber celler for 45 min på 37 ° C og 5% CO2.
- Stoppe reaksjonen ved å plassere 96-brønns platen på is 5 min. Deretter sentrifuge platen ved 4 ° C i 4 min 120 x g. Overføre 120 µL av nedbryting bruker en flerkanals pipette til en flat bunn 96-brønns plate og plassere den på is. Nøye unngå å berøre celle pellets, men helt Sug opp nedbryting.
- Legge til 125 µL av lyseringsbuffer celle pellets. Inkuber celle pellets for 5 min ved romtemperatur og resuspend dem etter inkubering av gjentatte pipettering (ca 5 ganger).
- Pipetter 25 µL av pNAG løsning (4 mM) i brønnene som kreves av en ny flat bunn 96-brønns plate. Legge til 25 µL fra hver nedbryting forberedt pNAG løsningen som 25 µL av hver celle lysate.
- Inkuber reaksjon kladdene 1t på 37 ° C. Etter inkubasjon, Pipetter 150 µL av stopp løsning til hver brønn for å stoppe reaksjonen.
- Analysere platen med en microplate leseren med en dual-bølgelengde innstillingen ved 405 nm med referanse 630 nm for automatisk subtraksjon. I oppkjøpet program, huke av boksen "Referanse" og "Absorbance" element programmenyen, velg "630 nm" fra det miste-ned listen. Hvis den optiske densitet for prøvene er for høy, forberede en passende fortynning av sonden før remeasuring.
- Beregning av β-hexosaminidase release i henhold til denne formelen:
hvor utgivelsen [%] er prosent av bestemte beta-hexosaminidase utgivelse, en [nedbryting] er bakgrunnen korrigert absorpsjon av nedbryting, og en [lysate] er bakgrunnen korrigert absorpsjon av den tilsvarende cellen lysate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PMCs ble isolert fra 3 vill type mus (C57BL/6N) av intraperitoneal lavage og ytterligere kulturperler i RPMI medium supplert med 20% FCS og 1% penn-Strep i nærvær av vekstfaktorer (IL-3 på 10 ng/mL) og SCF på 30 ng/mL under sterilt fuktet forholdene på 37 ° C og 5% CO2. Mediet ble endret på dager 2 og 9 etter celle isolasjon. Cellen morfologi ble analysert med girkasse lys DIC imaging (se figur 1A, B). Cellen kontrasten og detaljnivå viste god celle levedyktighet. Etter 2 uker med dyrking under disse forholdene, ble en homogen befolkning på 1,5 x 107 celler oppnådd. Flow cytometri analyse av celler med farget med anti-IgE-antistoffer konjugert med FITC og Anti-c-Kit antistoff konjugert med PE avdekket 98.6% FITC positive og 99.8% PE positiv celler (figur 1C). 98.5% av kultivert cellene var dobbel positivt for FITC og PE (figur 1C), viser typisk funksjoner av modne MCs.
Funksjonell analyser innhentet cellene, ble fluorometric [Ca2 +]jeg mål med Fura-2 fluorescerende indikator utført. Fura-2 lastet celler var vekselvis belyst med 340 nm og 380 nm eksitasjon lys hver 5 s og fluorescens > 510 nm ble registrert bruker et CCD kamera. Forholdet mellom fluorescens (F340/F380) var under konstant overvåking. Bruk av DNP (100 ng/mL) til PMC ruges natten med 300 ng/mL IgE anti-DNP utløste en markant høyde [Ca2 +]jeg nivå, som langsomt forfalt til halv maksimalt over flere minutter (figur 2A, B). Variasjonen av cellen svar var relativt lav (figur 2A, B). Stimulering av MRGPRB2 reseptorer med 50 µg/mL av sammensatte 48/80 med samme tid protokollen også betydelig økt [Ca2 +]jeg i Fura-2-loaded PMCs med en svært lik mener amplituden til svar (figur 2C). For analyse av SOCE i PMCs, en "re-tillegg" protokollen ble brukt: 10 etter måling, eksterne Ca2 + ble fjernet og under sykluser 70-120, Thapsigargin (2 µM), en inhibitor av endoplasmatiske retikulum ATPase, var brukes for uttømming av intracellulær Ca2 + butikker og maksimal aktivering av SOCE. Forbigående [Ca2 +]jeg høyden reflektert Ca2 + utgivelsen fra intracellulær Ca2 + butikkene i et nominelt Ca2 +-ledig bad løsning (figur 2D). Gjenopprette eksterne Ca2 + konsentrasjonen til 2 mM etter syklus 150 resulterte i en fremtredende økning av [Ca2 +]jeg nivå fordi Ca2 + kanalene SOCE (figur 2D). Denne komponenten av Ca2 + svaret var sterkt hemmet i nærvær av 10 µM GSK 7975A, kjent som en CRAC blokker, mens Ca2 + utgivelsen fra intracellulær Ca2 + butikkene forble uendret (figur 2D ).
I neste trinn testet vi evne til de isolerte PMCs å gjennomgå omfatter degranulering crosslinking av FcɛRI høy affinitet reseptorer eller stimulering av MRGPRB2 reseptorer. For dette formålet, ble en ß-hexosaminidase release analysen utført. Cellene ble lagt til en V-bunn 96-brønns plate (2 x 105 celler/vel) og stimuleres i henhold til ordningen illustrert i Figur 3A for 45 min på 37 ° C. Platen ble centrifuged og etter fjerning av nedbryting, pellets var lysed. ß-hexosaminidase innholdet i personlige supernatants og pellets lysates ble analysert av deres reaksjoner med pNAG under en 1t inkubasjonen på 37 ° C. Mengden av reaksjon produktene ble oppdaget colorimetrically og andelen utgitt ß-hexosaminidase ble beregnet (se Figur 3B). Spontan utgivelsen var svært lav (1%), mens svarene til sterk omfatter degranulering stimuli som 10 µM Ionomycin og sammensatte 48/80 på 50 µg/mL var over 40% og 60%, henholdsvis. Omfatter degranulering svar til DNP stimulering var doseavhengig over området konsentrasjon på 10-300 ng/mL. Sammen angir disse dataene tydelig en god funksjonell status for de isolerte PMCs.
Figur 1 : Karakterisering av primære kultivert murine vill-type PMCs utført DIC mikroskopi og flyt cytometri analyse. (A, B) Representant bilder får 20 X plasDIC målet med PMCs kultivert i 25 cm2 plast kolber 1t etter cellen aisolering av intraperitoneal lavage (A) og på dag 9 i dyrking (B). Skala barer i høyre nedre hjørne angir 100 µm. (C) flyt cytometri analyse av PMCs (kultivert 12 dager etter ovenfor beskrevet protokollen) co beiset med anti-IgE-antistoffer konjugert med Fluorescein Isothiocyanate (FITC) og Anti-c-kit antistoff konjugert med Phycoerythrin (PE). Cellen tetthet plottet er delt i fire quadrants: Q1, PE over autofluorescence nivå/FITC under autofluorescence nivå; Q2, PE over autofluorescence nivå/FITC over autofluorescence nivå; Q3, PE under autofluorescence nivå/FITC under autofluorescence nivå; Q4, PE under autofluorescence nivå/FITC over autofluorescence nivå. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Opptak av [Ca2 +] jeg Fura-2 lastet PMCs isolert fra vill type mus. [Ca 2 + ]jeg presentert som fluorescens F340/F380 forhold. (A) representant spor av [Ca2 +]jeg tid selvfølgelig personlige PMCs (n = 38) med DNP (100 ng/mL). (B) gang løpet av DNP (100 ng/mL)-utløste [Ca2 +]jeg høyde. Hvert datapunkt angir mener verdier Hentet fra 38 enkeltceller illustrert i panelet A. PMCs var forbehandlet natten med 300 ng/mL av IgE anti-DNP. (C) tid selvfølgelig mener verdiene for sammensatte 48/80-indusert [Ca2 +]jeg høyde i PMCs (n = 60). (D) tid selvfølgelig mener verdiene [Ca2 +]jeg endringer under intracellulær Ca2 +-lagre uttømming av anvendelsen av 2 µM Thapsigargin (Tg) i standardoppløsning Ca2 +-gratis løsning, etterfulgt av butikken drives kalsium tilstrømningen etter re 2 mM Ca2 + i Bad løsning i kontrollgruppen (n = 44) PMCs (svarte firkanter) og i nærvær av 10 µM av GSK 7975A i Bad løsningen (blå ruter) (n = 41). B, C og D viser de standard feil av gjsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Beta-hexosaminidase løslate kolorimetrisk flere godt mål med PMCs isolert fra vill type mus. (A) stimulering ordningen med 96-brønns plate pipettering for å utføre beta-hexosaminidase analysen; resultatene presenteres i panelet B. "Spontan" tilsvarer pipettering av Tyrodes løsning uten tilsetning av alle secretagogues; IM = Ionomycin; CP 48/80 = sammensatte 48/80. (B) Bar diagram illustrerer andelen ß-hexosaminidase release under basale forhold (Spont), etter stimulering med Ionomycin (IM), dinitrophenol-menneskelige serum albumin (DNP) og sammensatte 48/80 (Cp 48/80) med angitte konsentrasjoner. Analysen ble utført i duplikat; viser standard feil av gjsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MC modeller kan brukes å studere MC omfatter degranulering, chemotaxis, vedheft, så vel som å belyse intracellulær signalnettverk signaltransduksjon trasé involvert i MC aktivisering. Noen forskere bruk menneskelige MCs modeller, for eksempel udødeliggjort linjer (LAD2 og HMC1) eller menneskelig MCs avledet fra ledningen blod progenitor celler (CD133 +) og perifert blod progenitor celler (CD34 +). Andre foretrekker gnager MC modeller, som foreviget (rotte basophilic leukemi RBL - 2H 3 MC linje) eller primære kultivert (mus bein margtransplantasjon-avledet MCs BMMCs, PMCs) modeller. Murine primære MCs kan brukes til å analysere MC-funksjonen i mange "knock-out" musen modeller, som gullstandarden tilnærming til utforskning av fysiologiske funksjoner av bestemte gener og kodet proteiner. Underskuddet av farmakologiske verktøy for tilstrekkelig selektivitet og styrke gjør denne metoden spesielt verdifull for etterforskningen av mekanismer for signaltransduksjon ved MC aktivisering18. Murine PMCs er av bindevev fenotypen som viser en moden morfologi og høyt detaljnivå. De bare svarer ikke godt til antigen crosslinking av FcεRI som BMMCs, men er også aktivert av agonister flere ekstra reseptorer som endothelin 1 eller sammensatte 48. Imidlertid avkastningen av PMCs er vanligvis betydelig lavere sammenlignet med Søketrafikken for BMMCs og er vanligvis ikke tilstrekkelig til å utføre en Western blot eller en annen teknikk som krever et stort antall celler. Flere teknikker har blitt beskrevet for isolasjon og rensing av PMCs. For eksempel ble Percoll gradient sentrifugering rapportert å gi en høy renhet av cellene19; antall celler med denne teknikken er imidlertid vanligvis relativt lav. I protokollen beskrevet her, er det viktigste trinnet aspirasjon av cellen suspensjon fra bukhulen. Unngå blod forurensning av prøven og aspirating maksimal mengden middels mulig er viktig å få mange PMCs høy renhetsgrad. Med noen musen stammer, maksimal PMC flere oppnås bare ved en forkortet (11 – 12 dager) dyrking periode. La disse cellene i kultur forhold for lengre tid fører bare til en reduksjon av celle nummer.
I denne studien, beskriver vi en enkel protokoll egnet for isolering av modne MCs som gjør det mulig å få en svært ren MC befolkning fra musen bukhulen. Innhentet cellene er preget av en høy homogenitet og viser vanlige MC-funksjoner, som uttrykk for spesifikk markør reseptorer (KIT og FcεRI). Disse cellene utstillingen tydelig MC karakteristisk for å degranulate og øke deres [Ca2 +]jeg svar på FcɛRI og MRGPR aktivisering.
MC signalnettverk er tett knyttet til [Ca2 +]jeg nivå bestemmes av Ca2 + utgivelsen fra intracellulær butikker og Ca2 + oppføring via plasma membranen kanaler. [Ca2 +] jeg heving aktiverer en rekke intracellulær signalveier som utløser MC omfatter degranulering. Som andre ikke-nervøs celler, er den viktigste Ca2 + tilstrømning sti i MCs SOCE aktivert ved uttømming av Ca2 +-butikker. Identifikasjon av kanalene involvert i denne signalveien er avgjørende for å forstå regulering av MC-funksjonen. For identifisering av molekylære spesialpreparatets SOCE veien microfluorometric teknikken bruker fluorescerende Ca2 + indikatorer og "patch-klemme" elektrofysiologiske tilnærming har spilt en fremtredende rolle. Men er heving av [Ca2 +]jeg nivå summen av Ca2 + utgivelsen og SOCE. For å skille disse to fasene av Ca2 + mobilisering, utviklet tidligere såkalte "Ca2 + re tillegg" protokollen (for gjennomgang se fugl et al. 200820). I denne protokollen, slås eksterne salt løsning fra en inneholder normalt [Ca2 +]o (1-2 mM) til et nominelt Ca2 +-ledig løsning. Under disse forholdene behandlet cellene med thapsigargin tømme Ca2 + butikker og dermed fullt aktivere SOCE. I fravær av ekstracellulære Ca2 +fremkaller thapsigargin behandling forbigående [Ca2 +]jeg høyde, reflekterer en utgivelse av Ca2 + ioner fra intracellulær Ca2 + butikker. The re-tillegg av ekstracellulære Ca2 + fører til en økning av [Ca2 +]jeg representerer SOCE. I denne artikkelen presenterer vi vellykket utnyttelse av denne tilnærmingen for karakterisering av SOCE i MCs. For å overvåke [Ca2 +]jeg endringer, ble Fura-2 brukt som en indikator på kalsium. I sin acetoxymethyl form, kan Fura-2 lett lastes i PMCs. Bruk av denne ratiometric fargestoff tillater sammenligning av ikke bare amplituder [Ca2 +]jeg høyder, men også nivåforskjellene basale [Ca2 +]jeg , som er spesielt viktig for å analysere vill type/knockout celler. Sammenlignet med genetisk kodet fluorescerende fargestoffer, en av de største ulempene av Fura-2 er høy opphopning i forskjellige mobilnettet organeller og dermed forurensning av cytoplasmatiske fluorescens.
Fura-2 avbilding krever en dobbel eksitasjon teknikk. Det er vanligvis teknisk mye enklere å bruke enn dobbelt utslipp teknikken som krever ikke bare bruken av utløste lyskilde, men i tillegg involvering av en filter-hjul eller en bilde splitter i utslipp lys banen. Beskrevet protokollen kan brukes ved Ca2 + avbildning av andre ikke-nervøs celler.
Et særtrekk ved MCs er deres høyt innhold av elektron-tette sekretoriske granulater, som er fylt med store mengder meglere og immunmodulerende stoffer. MC aktivering fører til en rask utgivelse av preformed granule forbindelser. Flere tilnærminger til å analysere MC omfatter degranulering i vitro er tilgjengelig, inkludert påvisning av radiolabeled serotonin, histamin detection bruke antistoffer (ELISA) og påvisning av en økning av plasma membranen overflate ved hjelp elektrofysiologiske "patch-klemme" celle kapasitans målinger. I dagens papir beskriver vi en praktisk anvendelse av analysen med flere godt kolorimetrisk påvisning av i vitro utgitt β-hexosaminidase. Denne analysen er basert på muligheten av β-hexosaminidase å hydrolyze terminal N-acetylen-D-hexosamine rester i N-acetylen-β-D-hexosaminides21. Β-hexosaminidase slippes co med histamin men også med andre meglere som katepsin D eller TNF og kan dermed brukes som en relatere til omfatter degranulering fra flere typer sekretoriske blemmer i MCs12,22.
I beskrevet teknikken, ble PMCs stimulert på 37 ° C med ulike secretagogues, etterfulgt av en vurdering av supernatants samt pelleter av β-hexosaminidase innholdet av deres reaksjoner med β-hexosaminidase substrat. Som underlaget, ble 4-Nitrophenyl N-acetylen-β-D-glucosaminide brukt. Det var hydrolyzed til N-acetylen-D-glukosamin og p- nitrophenol. Mengden av p- nitrophenol var colorimetrically kvantifisert ved lys absorbansen ved 405 nm. I noen endringer til ß-hexosaminidase release analysen, 4-methylumbelliferil-N-acetylen -beta- Glukosamin brukes som et substrat. Etter enzymatisk hydrolyse genererer stoffet en fluorometrically synlig sammensatt. Vi uttrykte omfanget av omfatter degranulering som en prosentandel av utgivelsen, normalisert til innholdet. Dette tillot oss å unngå variasjon introdusert av ulike cellen tallene og detaljert innholdet mellom ulike celle forberedelser. Vi ikke trekker en spontan utgivelse (observert i fravær av MCs secretagogues) fra netto stimulert omfatter degranulering, siden en spontan utgivelse meldte seg på grunn av dens betydning som en indikator på MC levedyktighet. For å unngå høye variasjon i analyseresultatene, er det viktig å skille nøye supernatants og pellets etter sentrifugering stimulert cellene. Det er også viktig å unngå dannelse av bobler i flere godt platene før du utfører kolorimetrisk målinger. En betydelig begrensning av metoden beskrevet er at resultatet vises ikke som et absolutt verdi, men som en prosentandel av utgitt mellommann.
I motsetning til metoder for direkte deteksjon av utgitt serotonin eller histamin, rapportert analysen er mye mer kostnadseffektiv og krever ingen spesialisert utstyr. I tillegg beskrevet teknikken reproduserbare svært, trenger ikke utføres i et radioaktivt laboratorium, og krever ikke kjøp av dyre antistoffer. Det kan derfor være et utmerket alternativ til mer vanskelig og dyrt teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Julia Geminn teknisk assistanse i mast celle forberedelse og dyrking. Dette arbeidet ble støttet av The Transregional samarbeid Research Centre (TR-SFB) 152.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
References
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
- Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Galli, S. J., et al. Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
- Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
- Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150 (2014).
- Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
- Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
- Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
- Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
- Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
- Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).
- Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
- Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
- Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
- Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569 (2014).
