Summary
Здесь мы представляем протокол к изоляции и культивировать мышиных перитонеальных тучных клеток. Мы также обсудим два протокола для их функциональных характеристик: флуоресцентных изображений внутриклеточных бесплатно Ca2 + концентрации и пробирного дегрануляции основе колориметрические количественная оценка выпущенной β-hexosaminidase.
Abstract
Тучные клетки (MCs), как часть иммунной системы, играют ключевую роль в защите принимающей страны против нескольких возбудителей и в инициировании аллергических иммунного ответа. Активация MCs через cross-linking поверхности IgE связана с высоким сродством IgE рецептором (FcεRI), а также путем стимулирования несколько других рецепторов, инициирует подъем уровня свободного внутриклеточных Ca2 + ([Ca2 +]я) что способствует высвобождение медиаторов воспалительных и аллергических. Идентификация молекулярных компонентов, участвующих в этих сигнальных путей имеет решающее значение для понимания регулирования MC функции. В этой статье мы опишем протокол для изоляции типа МКН, перитонеальный лаваж мышиных соединительной ткани и культивирование перитонеальный MCs (ЧВК). Культур MCs от различных моделей мыши нокаут по этой методике представляют собой полезный подход к идентификации белков, участвующих в MC, сигнальные пути. Кроме того мы также описать протокол для одной ячейки фура-2 изображений как важный метод количественного определения Ca2 + сигнализации в MCs. флуоресценции основе мониторинга [Ca2 +]я является надежным и обычно используется подход к Изучите Ca2 + сигнализации событий, включая вход работает магазин кальция, который имеет первостепенное значение для MC активации. Для анализа MC дегрануляции мы описываем пробирного релиз β-hexosaminidase. Количество β-hexosaminidase, выпустила в среду культуры считается дегрануляции маркера для всех три различных секреторных подмножества описанных в MCs β-hexosaminidase могут быть легко количественно по его реакции с colorigenic субстрата в микротитровальных пластины колориметрического анализа. Этот высоко воспроизводимый метод с точки зрения затрат и не требует специализированного оборудования. В целом, предоставленный протокол демонстрирует высокий урожай МКН, выражая типичный MC поверхностных маркеров, отображение типичных морфологических и Фенотипические особенности MCs и демонстрирует высокую воспроизводимость ответы на secretagogues в Ca2 +- изображений и дегрануляции анализов.
Introduction
МКН играть заметную роль во время врожденного и приобретенного иммунного ответа. В частности MCs участвовать в убийстве патогенов, таких как бактерии и паразиты и также ухудшить потенциально токсичных эндогенного пептидов или компоненты яды (для обзора см. Галли et al. 20081). Физиологическая роль МКН в врожденная и адаптивного иммунитета является предметом оживленных дискуссий. Таким образом многочисленные расхождения данных в исследованиях, выполненных с различными моделями мышь MC-недостаточным требует систематической переоценки иммунологической функции помимо специальные2МКН. Зрелые MCs преимущественно локализуются в ткани и органы, такие, как кожи, легких и кишечника и обычно находятся только в небольших количествах в крови. MCs являются производными от кроветворных прекурсоров, таких как MC прародителями и завершить их дифференцировки и созревания в микросреды почти все васкуляризированной тканей1. Т-клеток, полученных фактор интерлейкина (IL) -3 выборочно способствует жизнеспособности, пролиферации и дифференцирования плюрипотентных населения мыши MCs от их гемопоэтических прародителями3. Стволовых клеток фактора (SCF) производится структурных клеток в тканях и играет решающую роль в развитии MC, выживания, миграции и функции4. Свойства отдельных MCs может отличаться в зависимости от их способность синтезировать и хранить различные протеазы или протеогликанов. В мышей так называемой соединительной ткани тип MCs отличаются от слизистой MCs согласно анатомической локализации, морфология и содержание гепарина и протеаз5.
В MCs, увеличение свободной цитозольной Ca2 + ([Ca2 +]я) является необходимым для дегрануляция и производства эйкозаноидов, а также для синтеза цитокинов и активация факторов транскрипции в ответ на антиген и различные secretagogues6. Главная задача течению этих стимулов — фосфолипаза C, который гидролизует фосфатидилинозитол 4,5-Бисфосфат диацилглицерол (DAG) и инозитол 1,4,5-trisphosphate. Даг активирует Протеинкиназа С и IP3 освобождает ионы Ca2 + от эндоплазматического ретикулума. Истощение этих магазинов активирует Ca2 + приток через плазматическую мембрану Ca2 + каналы, ведущие к хранить запись оперированных кальция (SOCE). Этот процесс вызвал путем взаимодействия Ca2 +-датчик, стромы взаимодействия молекулы-1 (Stim1), в эндоплазматический ретикулум с Orai17 , а также через активацию Переходный рецепторный потенциал канонические (Термизатор) канала белки (для обзора см. Freichel и др. 20148) в плазматической мембраны.
Для изучения физиологической роли этих каналов, несколько фармакологических (применение блокаторы кальциевых каналов) или генетические подходы обычно используются. В последнем случае, подавление экспрессии белка достигается путем ориентации мРНК (нокдаун) или геномной ДНК редактирования с глобальной или ткани конкретных9 исключить экзона кодирования поры, образуя Субблок канала (нокаут). Наличие окон с достаточной точностью для этих каналов является ограниченной. Кроме того, бросовым подход требует тщательного контроля ее эффективность с помощью, например., Западная пятно анализа и препятствует отсутствие специфических антител для целенаправленных канал протеина во многих случаях. Таким образом использование моделей мышей нокаут до сих пор рассматривается как золотой стандарт для такого анализа. Предпочтительным в vitro модель для исследования функций MC является выращивание ЧВК, которые могут быть изолированы ex vivo как полностью зрелые населения (в отличие от дифференциации МКН в vitro от, например., клетки костного мозга)10 . По сравнению с MCs костного производных (BMMCs), которые также часто используются для изучения MC функции в пробирке, стимуляция FcεRI и бета hexosaminidase релиз увеличивается спецавтотехнике и 100 раз в компании "ПМКС", соответственно. В этой статье мы опишем способ изоляции и культивирование мышиных ЧВК, который позволяет получить после 2 недель культивирования большое количество чистого соединительной ткани типа МКН, достаточного для дальнейшего анализа.
Несмотря на недавний прогресс в разработке и применении показателей генетически закодированный кальция их использование по-прежнему ограничивается трудностями в доставке генов в клетки-мишени, конкретно, в весьма специализированных клеток, таких как основной культурный MCs. Кроме того эта группа Люминесцентные индикаторы для [Ca2 +]я измерений по-прежнему не хватает ratiometric красители с высоким динамическим диапазоном. По этим причинам предпочтительным методом для ratiometric [Ca2 +]я измерения по-прежнему является использование флуоресцентных красителей «Фура-2»11.
В настоящее время наиболее часто используемый подход для оценки MC активации и дегрануляции измерения β-hexosaminidase деятельности. Β-hexosaminidase, аллергических посредника, является одним из компонентов MC гранул, которые совместно выпущенные с гистамина в постоянной пропорции от MCs12. Β-hexosaminidase легко и точно измерять через его реакции с конкретного субстрата, который производит измеримые количество colorigenic продукт, который легко обнаружить в Гонав колориметрические assay. Сообщается, что в этой статье, применение этого метода для анализа ЧВК дегрануляции в ответ на различные стимулы.
Агрегирование высокоспецифичные рецепторы плазмалеммарного IgE (FcɛRI) активирует в MCs универсальный внутриклеточных сигнальный путь, приводит к высвобождению содержание секреторных гранул в окружающем пространстве внеклеточного. Помимо специфического антигена, многие другие раздражители могут активировать MCs выпустить разнообразных иммуномодулирующих посредников, таких как дополнение anaphylatoxins (например., C3a и С5а)13, эндотелина вазоконстриктора пептид 1 (ЭТ1)14 , а также многочисленные Катионный вещества и препараты, провоцируя pseudoallergic реакций (например., icatibant)15 путем привязки к MRGPRX216. Внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в MRGPR-индуцированной MCs дегрануляции характеризуются плохо по сравнению с FcɛRI опосредованной внутриклеточная сигнализация; Эти пути только начал интенсивно изучаться в течение последних нескольких лет17 после идентификации рецептор16. В основном каналы иона плазматической мембраны, участвующих в вход кальция, следуют MRGPRX2 стимуляции по-прежнему следует понимать. Таким образом настоящей статьи также фокусируется на сигнализацию внутриклеточного кальция и дегрануляции MCs стимулировали с агонисты MRGPR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные процедуры выполнялись согласно немецкого законодательства руководящие принципы ухода и использования лабораторных животных (официально утверждена Карлсруэ регионального Совета).
1. PMC изоляции и культивирования внутрибрюшинного промывание
| 1 | Лед |
| 2 | 10 мл-шприцы |
| 3 | 27 G иглы |
| 4 | 20 G иглы |
| 5 | Блок из пенопласта и контакты |
| 6 | Коллекции трубок (50 мл пластиковых пробирок) |
| 7 | 70% этанол |
| 8 | RPMI среднего (предварительно охлажденным и хранится на льду) |
| 9 | PMC-средний: RPMI средний + 20% FCS (плода телячьей сыворотки) + 1% раствора пенициллина стрептомицина (ручка-стрептококк) |
| 10 | Фосфат Дульбекко в буфер солевой раствор - DPBS (без Ca2 + и Mg2 +) |
| 11 | Культура колбы (25 см) |
| 12 | Факторы роста запасов решения (IL-3: 1 мкг/мкл; SCF: 2,5 мкг/мл) |
| 13 | Пипетки серологические (10 мл) |
| 14 | Стерильные пипетки советы (20-200 мкл) |
| 15 | Горяева |
| 16 | Скамейка центрифуги |
| 17 | Ножницы и щипцы |
| 18 | CO2 камеры для мышей |
| 19 | Открыть капот стерильные |
| 20 | Закрыта стерильной Худ |
| 21 | Инкубатор клеток (37 ° C и 5% CO2) |
| 22 | Передача пипетки (20-200 мкл) |
Таблица 1: Материалы для шага 1.
-
PMC изоляции, внутрибрюшинного промывание
- До изоляция клетки Подготовьте материалы, перечисленные в таблице 1.
- Использовать 8-14 недельных самцов мышей для изоляции PMC. Усыпить мыши на CO2 ингаляции и подтвердить смерть, утрата рефлексов. Спрей мышь с 70% этанола и закрепить его на блока пены с помощью булавки (спинной стороне вниз). Удалите кожу брюшной мыши с помощью ножниц тупой край. Избегайте повреждения брюшной полости.
Примечание: Мы используем обычно этот протокол для мышей C57BL/6Н штамм генетическим фоном. - Придать 7 мл ледяной RPMI средних и 5 мл воздуха в брюшной полости, используя шприц 10 мл с иглой 27 G. Вставьте иглу тщательно в брюшине и не перфорировать любого из органов. Используйте место в регионе эпидидимальных жира для снижения риска перфорации органа.
- После инъекции встряхните мышь за 1 мин до отсоединения брюшной клеток в среду RPMI. Не трясите мыши слишком сильно, чтобы избежать повреждения внутренних органов и загрязняя брюшной полости с кровью.
- Повторное использование 10-мл шприц, вооружив его с новой канюли 20 G. Сдвиг внутренние органы в одну сторону, наклоняя блок пену и осторожно похлопывая его на скамейке для упрощения средних аспирации от другой стороны. Вставьте иглу 20 G, наклонной вверх и аспирационная жидкость из брюшной полости, осторожно и медленно (~0.5 мл/сек) чтобы избежать засорения на внутренние органы. Соберите как можно больше жидкости можно (обычно 5-6 мл).
- Извлеките иглу от шприца и передавать собранные клеток подвеска в коллекции трубку на льду. Если существует видимой крови загрязнение, отказаться от образца трубки.
- Центрифуга трубки с суспензию клеток в ~ 300 x g за 5 мин. Под капотом стерильные аспирационная супернатант. Для каждой мыши, объединить образец окатышей в 4 мл холодной (4 – 10 ° C) PMC среднего и передачи суспензию клеток в культуре колбу 25 см2 . Добавьте факторы роста Ил-3 и SCF окончательный концентрации 10 нг/мл и 30 нг/мл, соответственно. Место флакон, содержащий ячейки в инкубатор (37 ° C и 5% CO2) и проинкубируйте ~ 48 ч до следующей процедуры.
-
PMC-культура
- День 2 (~ 48 ч после изоляции): средние изменения
- Чтобы удалить супернатант и non сторонник клетки (эритроциты и мертвые клетки), аспирационная среднего из колбы, поместив кончик пипетка Пастера на краю колбу и держа колбу почти горизонтально. Добавьте 4 мл подогретым PMC среды на мышь. Добавьте факторы роста Ил-3 (10 нг/мл) и ФСД (30 нг/мл). Место флакон, содержащий ячейки в инкубатор (37 ° C и 5% CO2).
- День 9: Ячейка колки
- Передача суспензию клеток от колбу культуры клеток в 50 мл трубки пластмассовые центрифуги. Мойте колбу три раза с 10 мл предварительно разогретую (37 ° C) Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS), сбора суспензии клеток с отсоединенной клетки в том же 50 мл пластиковых центрифуга трубки. Подсчет клеток концентрации с Горяева и рассчитать общее количество клеток.
- Центрифуга суспензию клеток на ~ 300 x g 5 минут и удалить супернатант. Восстановите Пелле в подогретым среднего PMC (37 ° C) для получения клеток концентрации 1 x 106 клеток/мл. Суспензию клеток передавать новой культуры колбу 25 см2 . Утилизируйте старый флакон с фибробластов, придерживаясь в нижней.
- Добавьте факторы роста Ил-3 (10 нг/мл) и ФСД (30 нг/мл) и место флакон, содержащий ячейки в инкубатор (37 ° C и 5% CO2).
- 12 – 15 дней: мобильных измерений
- Если планируется любые эксперименты с раздражение рецепторов FcɛRI, предварительной обработки клеток на ночь с 300 нг/мл МГЭ анти DNP в стандартной среде культуры. Приступить к шаг 2 и шаг 3.
- День 2 (~ 48 ч после изоляции): средние изменения
2. измерение концентрации флуориметрический внутриклеточных свободного кальция в компании "ПМКС"
- До измерения Подготовьте материалы, перечисленные в таблице 2. Кроме того, подготовить изображения установки, состоящей из: инвертированный микроскоп флуоресценции; Цель: 40 X / 1,3 масла; Фура 2 набора фильтров; ПЗС-камеры; Источник света возбуждения; Программа приобретения изображений; Гравитация, кормили решение системы приложений.
| 1 | PMC (12-15 дней) 1 x 106 клеток/мл |
| 2 | Конканавалина А |
| 3 | Фура-2 AM |
| 4 | Плюрониевого F-127 20% раствор |
| 5 | Круглые очки скользит крышка; ø 25 мм; № 1 |
| 6 | Стоковый раствор DNP-HSA (динитрофенола человеческого сывороточного альбумина) |
| 7 | Стоковый раствор анти-DNP-антитела (IgE) |
| 8 | Плоское дно плиты (12 скважин) |
| 9 | Стоковый раствор составные 48/80 |
| 10 | Обложка, хорошо изображений камер |
| 11 | Горяева |
| 12 | Передача пипетки (20-200 мкл) |
Таблица 2: Материалы для шага 2.
-
Подготовка изображений фура-2
- Выполнить подсчет клеток с помощью Горяева и регулировка концентрации клеток до 1 x 106 клеток/мл. Разделите колонии ЧВК, нежно дозирование (3 – 5 раз) суспензии клеток с кончиком пипетки 1 мл.
- Подготовить Ca2 +-содержащих HEPES буфер солевой раствор (Ca2 +- HBSS) состоит из 135 мм NaCl, 6 мм KCl, 2 мм CaCl2, 1,2 мм MgCl2, 10 мм HEPES и глюкозы 12 мм. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 с 3 M NaOH.
- Подготовить конканавалина А покрытием слайды дозирования 1 капля раствора (0,1 мг/мл в H2O) конканавалина А на каждые 25 мм раунд покровным стеклом под капотом стерильные. Оставить капли на обложке скользит по крайней мере 1 мин, а затем удалить большую часть решения с пипеткой и пусть скользит крышка просушите 45 мин тщательно пресс скользит крышка конканавалина А лечение на изображений камеры резиновые (см. Таблицу материалы) до они придают получить микроскопии изображений камеры.
Примечание: Поли-L-лизин покрытием слайдов может использоваться в качестве альтернативы. - Распустить флуоресцентные Ca2 + краситель фура-2 утра (1 мм) в диметилсульфоксида (ДМСО). Храните это решение, защищенном от света.
- Разбавить фура-2 AM Стоковый раствор в Ca2 +- HBSS к окончательной концентрации 5 мкм для того, чтобы подготовить буфере «загрузки». Дополнение с 5 мкл/мл 20% плюрониевого F-127 в ДМСО.
- Смесь 500 мкл «загрузки буфера» с 500 мкл суспензии клеток PMC. Пипетка смесь в тепловизионной камеры и инкубации клеток для 20-30 мин при комнатной температуре в темноте.
- Настройка гравитации, кормили системы приложений с различными решениями согласно протокола стимуляции. Дополнение 1 шприц с 40 мл Ca2 +- HBSS раствора, шприц 2 с 40 мл Ca2 +- HBSS раствора, содержащего 100 нг/мл ДНП, шприц 3 с 40 мл Ca2 +- HBSS раствора, содержащего подворье 48/80 50 мкг/мл шприц 4 с 40 мл номинально Ca2 +-бесплатно-HBSS решения и шприц 5 с 40 мл номинально Ca2 +-бесплатно-HBSS раствор, содержащий 2 мкм увеличивается.
- Подготовьте 40 X нефти высокой апертуры погружения цель, поместив небольшое падение погружения нефти на нем.
- Смонтируйте системы приложений на сцене инвертированным микроскопом. Тепловизионные камеры с загруженной клетки в системе приложений и для предотвращения их перемещения во время записи. Включите пропускаемого света и сосредоточиться клетки.
- Промойте клетки три раза с Ca2 +- HBSS буфера с помощью системы самотечных приложений.
- Инкубировать клетки в Ca2 +- HBSS за 5 мин для фура-2 AM де этерификации.
- Промойте клетки еще один раз перед началом съемки, чтобы удалить любой потенциально утечка Люминесцентную краску.
-
Клеток
- Запустите программу приобретения изображений в режиме физиологических приобретения. Откройте окно Настройка и отрегулируйте фокус и оптимальное приобретение время (которое должно быть одинаковым для возбуждения с 340 Нм и 380 Нм и обычно колеблется от 50 – 150 мс).
Примечание: Свести к минимуму воздействие фура-2 загружен ячейку для любой свет, чтобы избежать Фотообесцвечивание красителя. - Изображение изображение ссылкой и пометить клетки как регионы интереса (ROI). Марк последний ROI в районе, где нет клетки присутствуют и определить его как фон.
- Завершите установку и начать измерение с коэффициентом приобретение 5 s.
Примечание: Клетки будут поочередно освещаться с возбуждением, свет 340 Нм и 380 Нм и испускаемого флюоресценция (> 510 нм) будут собраны с использованием ПЗС-камеры. Образы флуоресценции сигналы F340 Нм и F380 Нм, а также отношение (F340 Нм/F380 Нм) будет отображаться в трех окнах. Графики времени курс индивидуальных интенсивности флуоресценции ROIs означает, что значения будут отображаться также непрерывно. - Добавление решения в номер надлежащего цикла, согласно дизайн эксперимента:
- В меру антиген индуцированной высота [Ca2 +],якак показано на рисунке 2, 2B, применяют раствор шприц 2 после цикла 20 и остановить запись после цикла 150.
- Для измерения высоты подворье 48/80-индуцированной [Ca2 +]i,как показано на рис. 2C, применяют раствор шприц 3 после цикла 20 и остановить запись после цикла 150.
- Для измерения высоты [Ca2 +],я вызвал SOCE, как показано в рисунке 2D, применять раствор шприц 4 после цикла 10, применять раствор шприцем 5 после цикла 70, применять раствор шприц 4 после цикла 120, применять раствор шприцем 1 после цикла 150 и остановить запись после цикла 220.
- После окончания измерения, преобразуйте результаты в соотношении таблицу, содержащую измерения интенсивности для длин волн возбуждения с и без коррекции фон, а также значения соотношения с и без коррекции фон для каждого ROI и каждая точка измерения времени. В программе приобретения, последовательно нажмите кнопки: «начало резец», «пометить все», «перевести все», «физиология измерений», «Ok, «Ok». Сохраните файлы как таблицы и стеки изображений для анализа в автономном режиме.
- Запустите программу приобретения изображений в режиме физиологических приобретения. Откройте окно Настройка и отрегулируйте фокус и оптимальное приобретение время (которое должно быть одинаковым для возбуждения с 340 Нм и 380 Нм и обычно колеблется от 50 – 150 мс).
3. бета hexosaminidase измерения выпуска в компании "ПМКС"
| 1 | PMC (12-15 дней) 1 x 106 клеток/мл |
| 2 | Стоковый раствор анти-DNP-антитела (IgE) |
| 3 | Стоковый раствор DNP-HSA |
| 4 | Стоковый раствор составные 48/80 |
| 5 | Ionomycin |
| 6 | 96-луночных плита, v образный снизу |
| 7 | 96-луночных пластины, плоское дно |
| 8 | Пластиковых пробирок (15 мл) |
| 9 | Пипетки серологические |
| 10 | Инкубатор клеток (37 ° C и 5% CO2) |
| 11 | Скамейка центрифуги |
| 12 | Микротитровальных плита читатель для измерения оптической плотности |
| 13 | Многоканальные пипетки (20-200 мкл) |
| 14 | Горяева |
Таблица 3: Материалы для шага 3.
- До измерения Подготовьте материалы, перечисленные в таблице 3.
Примечание: β-hexosaminidase освобожден от MCs после их стимуляции гидролизует p нитрофенил ацетил D-глюкозамина (pNAG) в p нитрофенола и N-ацетил D-глюкозамина. Количество β-hexosaminidase в образце пропорциональна количество p нитрофенола, который будет сформирован. В среде высоких рН раствора «стоп», p нитрофенола существует как полностью депротонированная p-nitrophenolat и может быть обнаружен, его поглощения света в 405 нм. - Подготовка Tyrode в раствор, содержащий 130 мм NaCl, 5 мм KCl, 1,4 мм CaCl2, 1 мм MgCl2, 10 мм HEPES, 5,6 мм глюкозы и BSA 0,1%. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 с 3 M NaOH.
- Приготовляют раствор лизиса, добавив 1% объем Тритон X-100 Tyrode решения.
- Готовят раствор стоп, состоящий из 200 мм глицин и скорректировать рН до 10,7 с NaOH.
- Приготовляют раствор pNAG решение (4-нитрофенил 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) путем растворения pNAG в лимонной кислоты 0,4 М до конечной концентрации 4 мм.
- Рассчитать количество необходимых для assay клетки (выполнить пробу в двух экземплярах). Использование 200000 ЧВК за хорошо. Используйте 2 скважин как негативный контроль (Tyrode в раствор без каких-либо secretagogues как DNP или составные 48/80) и 2 скважин как позитивные элементы управления (Tyrode в раствор с 10 мкм Ionomycin) для каждого генотипа.
- Перевести клетки в 15 мл пластиковых пластиковых пробирок, Отpегулиpуйте уpовень до 15 мл с Tyrode в раствор и центрифуги на 200 x g 4 мин удалить супернатант с пипетка Пастера и Ресуспензируйте клетки в Tyrode и решение 2 х 106 клеток / мл.
- Передавать 100 мкл суспензии клеток за хорошо 96-луночных V-хорошо днище. Добавьте 25 мкл стимуляции или решение управления для каждой скважины (согласно схемы дозирования, показано на рисунке 3A). Инкубируйте клетки для 45 минут при 37 ° C и 5% CO2.
- Остановите реакции, поместив 96-луночных пластины на льду на 5 мин. Затем центрифуга пластину на 4 ° C на 4 мин на 120 x g. Передача 120 мкл супернатанта, используя многоканальные пипетки на 96-луночных тарелку с плоским дном и поместите его на льду. Осторожно прикасайтесь ячейки гранулы, но полностью удалить супернатант.
- Мкл 125 буфера lysis клетки гранул. Инкубации клеток гранулы для 5 мин при комнатной температуре и Ресуспензируйте их после инкубации, неоднократные дозирование (примерно в 5 раз).
- Пипетка 25 мкл раствора pNAG (4 мм) в требуемый скважинах новой пластинкой 96-луночных с плоским дном. Добавьте 25 мкл от каждого супернатант подготовленный pNAG решения, а также 25 мкл каждого lysate клетки.
- Инкубировать реакции партий за 1 ч при 37 ° C. После инкубации Пипетка 150 мкл стоп решения для каждой скважины, чтобы остановить реакции.
- Анализировать пластину с Считыватель микропланшетов с помощью параметра двойной длины волны в 405 нм с ссылкой 630 Нм для автоматического фон вычитание. В программе приобретения, поставьте галочку в поле «Ссылка» и выберите в меню элемент программы «Поглощения», «630 Нм» из раскрывающегося списка. При слишком высокой оптической плотности образцов, подготовьте соответствующие разрежения зонда перед заново определить размеры.
- Рассчитайте процент выпуска β-hexosaminidase по следующему уравнению:
Релиз [%], где процент выпуска конкретных бета hexosaminidase, [супернатант] это фон исправлены поглощение супернатанта, и [лизатных] — фон исправлены поглощения соответствующих lysate клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ЧВК были изолированы от 3 дикого типа мыши (C57BL/6Н), внутрибрюшинного промывание и далее культивировали в среде RPMI дополнены с FCS 20% и 1% перо-стрептококк в присутствии факторы роста (IL-3 на 10 нг/мл) и СКФ в 30 нг/мл в стерильных увлажняется условий на 37 ° C и 5% CO2. Средство было изменено на 2 и 9 дни после изоляции клеток. Морфология клеток была проанализирована с помощью передачи света DIC изображений (см. Рисунок 1A, B). Клетки контрастность и детализацию продемонстрировал жизнеспособность хорошие клеток. После 2 недель культивирования в этих условиях был получен однородное население 1,5 x 107 клеток. Анализ потока цитометрии клеток окрашенных совместно с анти IgE антител, конъюгированных с FITC и анти c комплект антитело проспряганное с PE показали 98,6% FITC положительные и 99,8% PE позитивных клеток (рис. 1C). 98,5% культивируемых клеток были двойной положительный для FITC и PE (рис. 1C), демонстрирует типичные черты зрелой МКН.
Для дальнейшего функционального анализа полученных клеток флуориметрический [Ca2 +]я индикатору люминесцентная фура-2 были проведены измерения. Загружен клетки фура-2 были поочередно освещаться с 340 Нм и 380 Нм возбуждения свет каждые 5 s и флуоресценции > 510 Нм был зарегистрирован с помощью ПЗС-камеры. Постоянно контролируется отношение флуоресценции (F340/F380). Применение ДНП (100 нг/мл) в PMC инкубированы всю ночь с 300 нг/мл МГЭ анти DNP вызывали произносится повышение уровня [Ca2 +]я , который медленно сгнил до половины максимального за несколько минут (рис. 2A, B). Изменчивость клеток ответов был относительно низким (рис. 2A, B). Раздражение рецепторов MRGPRB2 с 50 мкг/мл подворье 48/80 с один и тот же протокол время также существенно увеличили [Ca2 +]я в Фура-2-загружен ЧВК с очень похожи средняя амплитуда ответа (рис. 2C). Для анализа SOCE в ЧВК, применялся протокол «повторное добавление»: 10 циклов после начала измерения внешних Ca2 + был удален и во время циклов 70-120, увеличивается (2 мкм), ингибитор эндоплазматического ретикулума АТФазы, был применяется для истощения внутриклеточных Ca2 + магазинов и для максимального активации SOCE. Переходное [Ca2 +]я повышение отражены Ca2 + освобождение от внутриклеточного Ca2 + магазинов в номинально Ca2 +-бесплатная раствор для ванн (Рисунок 2D). Восстановление внешней Ca2 + концентрации до 2 мм, после цикла 150 в результате известных увеличение уровняi [Ca2 +] благодаря Ca2 + приток через каналы SOCE (Рисунок 2D). Этот компонент Ca2 + ответ был сильно ингибировала присутствии 10 мкм ГСК 7975A, известный как блокировщик Крак, в то время как Ca2 + освобождение от внутриклеточного Ca2 + магазинов оставался неизменным (рис. 2D ).
На следующем шаге мы протестировали изолированных ЧВК способность пройти дегрануляции после сшивки FcɛRI высоким сродством рецепторов или раздражение рецепторов MRGPRB2. Для этой цели была выполнена assay ß-hexosaminidase выпуска. Клетки были добавлены к V-дно 96-луночных пластины (2 x 105 клеток/а) и стимулировали по схеме показано на рисунке 3A 45 мин при температуре 37 ° C. Центрифугировали пластину и после удаления супернатанта, гранулы были лизированы. ß-hexosaminidase содержание отдельных supernatants и Пелле лизатов был проанализирован их реакции с pNAG в течение 1 ч инкубации при температуре 37 ° C. Количество продуктов реакции был обнаружен нелабильном и процент выпущенных ß-hexosaminidase была рассчитана (см. Рисунок 3B). Самопроизвольный отпуск был очень низкой (1%), тогда как ответы к сильным дегрануляции раздражители, такие как 10 мкм Ionomycin и составные 48/80 на 50 мкг/мл были более 40% и 60%, соответственно. Дегрануляции ответы DNP стимуляции были дозозависимый диапазоне концентрации 10-300 нг/мл. Вместе эти данные явно свидетельствуют о хорошее функциональное состояние изолированных ЧВК.
Рисунок 1 : Характеристика первичных культивированный мышиных дикого типа ЧВК, выполняются с помощью DIC микроскопии и потока cytometry анализ. (A, B) Представитель изображений, полученных с помощью 20 X plasDIC цель ЧВК, культивируемых в 25 см2 Пластиковые флаконы 1 h после изоляции клеток внутрибрюшинного промывание (A) и на 9 день культивирования (B). Масштаб баров в правом нижнем углу показывают 100 µm. (C) cytometry анализ потоков ЧВК (искусственный 12 дней по выше описанной протокол) совместно витражи с анти IgE антител, конъюгированных с Fluorescein Изотиоцианаты (FITC) и анти c комплект антитело проспряганное с фикоэритрин (PE). Участок плотность клеток делится на четыре квадранта: Q1, PE выше уровня/FITC аутофлюоресценция ниже уровня аутофлюоресценция; Q2, PE выше уровня/FITC аутофлюоресценция уровнем аутофлюоресценция; Q3, PE ниже уровня/FITC аутофлюоресценция ниже уровня аутофлюоресценция; Q4, PE ниже аутофлюоресценция уровень/FITC аутофлюоресценция уровнем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Запись [Ca2 +] я в Фура-2 загружен ЧВК, изолированные от мышей дикого типа. [Ca 2 + [ ],я представлены как соотношение F340/F380 флуоресцирования. (A) представитель следы [Ca2 +]я время курс индивидуальных ЧВК (n = 38) стимулируется с ДНП (100 нг/мл). (B) время курс ДНП (100 нг/мл)-вызывали [Ca2 +]я фасада. Каждая точка данных показывает средние значения, полученные из 38 отдельных ячеек в группе а. Компания "ПМКС" были предварительно обработанных на ночь с 300 нг/мл МГЭ анти DNP. (C) время курс средние значения соединения 48/80-индуцированной [Ca2 +]я высот в компании "ПМКС" (n = 60). (D) время курс значения [Ca2 +]я изменений во внутриклеточном Ca2 +-хранить истощения, вызванных применением 2 мкм увеличивается (ТГ) в номинально Ca2 +-бесплатное решение, а затем магазин действовали приток кальция после повторного добавления 2 мм Ca2 + в растворе ванна в контрольной группе (n = 44) из компании "ПМКС" (черные квадраты) и в присутствии 10 мкм в раствор для ванн (синий квадрат) ГСК 7975A (n = 41). В B, C и D погрешностей показывают Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Бета hexosaminidase релиз колориметрических измерений несколькими хорошо с ЧВК, изолированные от мышей дикого типа. (A) схема стимуляции 96-луночных пластины дозирование для выполнения анализа бета hexosaminidase; Результаты представлены в панели, что б. «Spontan» соответствует дозирование раствора Tyrode без добавления каких-либо secretagogues; IM = Ionomycin; CP 48/80 = составные 48/80. (B) бар графа иллюстрирующие процент ß-hexosaminidase выпуска в базальных условиях (Spont), после стимуляции с Ionomycin (IM), динитрофенол человеческого сывороточного альбумина (DNP) и составные 48/80 (Cp 48/80) с указанной концентрации. Проба была выполнена в двух экземплярах; планки погрешностей показывают Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MC модели могут успешно использоваться для изучения MC дегрануляции, хемотаксис, сцепления, а также разъяснению внутриклеточных сигнальных путей участвует в активации MC. Некоторые исследователи, использование человека MCs модели, такие как увековечена линии (LAD2 и HMC1) или человека MCs производные от шнура крови клетки-предшественники (CD133 +) и прогениторных клеток периферической крови (CD34 +). Другие предпочитают грызунов MC модели, такие как увековечил (Крыса базофильная лейкоз RBL - 2H 3 MC линия) или первичные культивированный (мыши кости-костного мозга производные BMMCs MCs, ЧВК) модели. Мышиных первичных MCs может использоваться для анализа функции MC в многочисленных «нокаут» мыши моделей, которые являются золотой стандарт подхода к исследованию физиологических функций конкретных генов и белков закодированный. Дефицит фармакологических средств для достаточной селективностью и потенции делает этот метод особенно ценными для исследования механизмов передачи сигнала, MC активации18. Мышиных ЧВК являются фенотипа соединительной ткани, что экспонаты Зрелые морфологии и высокой детализации. Они не только хорошо реагируют на антигеном сшивки FcεRI как BMMCs, но также активируются агонисты несколько дополнительных рецепторов например эндотелина 1 или составные 48. Однако выход ЧВК обычно значительно ниже по сравнению с BMMCs и обычно не является достаточным для выполнения западную помарку или другой метод, который требует большое количество клеток. Были описаны несколько методов для очистки ЧВК и изоляции. К примеру Percoll градиентного центрифугирования было сообщено приносить высокую чистоту клетки19; Однако количество клеток, полученные с помощью этого метода обычно является относительно низким. В протоколе, описанные здесь наиболее важным этапом является стремление суспензию клеток от брюшной полости. Во избежание заражения крови образца и аспирационных максимальное количество средних возможно необходимо получить большое количество ЧВК высокой чистоты. С мыши штаммов, только получил максимальное количество PMC укороченные (11-12 дней) периода культивирования. Оставляя эти клетки в условиях культуры для более длительного времени приводит только к сокращению количества клеток.
В настоящем исследовании, мы опишем простой протокол для изоляции зрелых MCs, что делает возможным получить высоки чисто MC населения от мыши брюшной полости. Полученные клетки характеризуются высокой однородности и демонстрируют типичные MC функции, такие как выражение определенных маркер рецепторов (KIT и FcεRI). Эти клетки ясно демонстрируют характеристику MC degranulate и увеличить их [Ca2 +]я в ответ на FcɛRI и MRGPR активации.
MC, сигнализации, тесно связано с [Ca2 +]i уровень определяется Ca2 + освобождение от внутриклеточного магазинов и Ca2 + вход через каналы плазматической мембраны. [Ca2 +] я высота активирует комплекс внутриклеточных сигнальных путей, триггер MC дегрануляции. Как и другие не возбудимых клеток, основным Ca2 + приток каналом в MCs является SOCE активированную истощение Ca2 +-магазины. Выявление каналов, участвующих в этом сигнальный путь имеет решающее значение для понимания регулирования MC функции. Для идентификации молекулярных компонентов SOCE путь microfluorometric техника использования флуоресцентных Ca2 + индикаторы и электрофизиологические подход «фиксации» играют важную роль. Однако повышение уровня [Ca2 +]я является суммой Ca2 + выпуска и SOCE. Различать эти два этапа Ca2 + мобилизации, ранее был разработан так называемый «Ca2 + повторное добавление» протокол (см. Обзор птица et al. 200820). В этом протоколе, внешних раствор соли перешли от одной содержащие нормальные [ОК]2 +o (1 – 2 мм) для номинально Ca2 +-бесплатные решения. В этих условиях клетки лечат увеличивается пустые Ca2 + магазинов и таким образом полностью активировать SOCE. В отсутствие внеклеточного Ca2 +увеличивается лечения вызывает переходных [Ca2 +]я высоты, отражающие выпуска Ca2 + ионов от внутриклеточного Ca2 + магазинов. Повторное добавление внеклеточного Ca2 + приводит к увеличению [Ca2 +],я представляющие SOCE. В этой статье мы представляем успешного использования данного подхода для характеризации SOCE в MCs. Для мониторинга [Ca2 +]я изменений, фура-2 был использован в качестве индикатора кальция. В его acetoxymethyl форме фура-2 могут быть легко загружены в ЧВК. Использование этой ratiometric краситель позволяет сравнивать не только амплитуд [Ca2 +]я фасады, но и различия в базальных [Ca2 +]я уровнях, это особенно важно для анализа дикого типа/нокаут клетки. По сравнению с генетически закодированный флуоресцентных красителей, один из главных недостатков фура-2 является его высокое накопление в различных клеточных органелл и тем самым загрязнение цитоплазматических флуоресценции.
Фура-2 изображений требует техники двойной возбуждения. Как правило это технически гораздо легке для использования чем двойной выбросов технику, которая требует не только использование источника света инициированные, но дополнительно участия фильтра колесо или изображения разделителя в пути света выбросов. Описывается протокол может использоваться для Ca2 + изображения других не возбудимых клеток.
Ключевой особенностью MCs является их высокое содержание электронно плотные секреторных гранул, которые заполнены с большим количеством посредников и иммуномодулирующим веществ. MC Активация приводит к быстрого выпуска преформированных гранул соединений. Доступны несколько подходов для анализа MC дегрануляции в пробирке , в том числе обнаружения radiolabeled серотонин, гистамин обнаружения с использованием антител (ELISA) и увеличения поверхности с помощью плазматической мембраны Электрофизиологические «фиксации» клетки емкости измерения. В настоящем документе мы описываем практическое применение анализа с использованием нескольких хорошо колориметрические обнаружения в vitro выпустила β-hexosaminidase. Этот assay основан на способности β-hexosaminidase гидролизуют клемме N-ацетил-D-hexosamine остатков в N-ацетил-β-D-hexosaminides21. Β-hexosaminidase выпускается совместно с гистамина, но и с другими посредниками, например катепсин D или ФНО и таким образом может использоваться в качестве коррелята дегрануляции от нескольких типов секреторные пузырьки в MCs12,22.
В описанной технике ЧВК были стимулируется при 37 ° C с различными secretagogues, следуют их реакции с β-hexosaminidase субстрата оценки supernatants, а также гранулы β-hexosaminidase содержание. В качестве субстрата использовался 4-нитрофенил N-ацетил β-D-glucosaminide. Он был гидролизуется до N-ацетил D-глюкозамина и p- нитрофенола. Количество p- нитрофенола нелабильном количественно путем поглощения света в 405 нм. В некоторых модификациях релиз assay ß-hexosaminidase, 4-methylumbelliferil-N-ацетил -бета- глюкозамина используется как субстрат. После ферментативного гидролиза вещество генерирует fluorometrically обнаружить соединение. Мы степени дегрануляции в процентах релиза, нормированная на общее содержание. Это позволило нам избежать изменчивость, представил различные числа клеток и их гранулированных содержимого между различными препаратами клеток. Мы не сделали вычесть Самопроизвольный отпуск (наблюдается при отсутствии MCs secretagogues) из чистой стимулировали дегрануляции, поскольку Самопроизвольный отпуск отдельно сообщается из-за ее важности в качестве показателя жизнеспособности MC. Чтобы избежать высокой изменчивости в результатах анализа, важно отделить очень тщательно supernatants и гранулы после центрифугирования стимулируется клетки. Важно также, чтобы избежать любых пузырьков в нескольких хорошо пластины перед выполнением колориметрические измерения. Существенное ограничение описано метода является, что результат является представлены не как абсолютное значение, но в процентном отношении выпустила посредника.
В отличие от методов прямого обнаружения выпустила серотонина или гистамин сообщил является гораздо более экономически эффективным и не требует специализированного оборудования. Кроме того описывается техника высокую воспроизводимость, не должны выполняться в радиоактивных лаборатории и не требует покупки дорогих антител. Таким образом это может быть отличной альтернативой более дорогостоящим и сложным методам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы признать Julia Geminn для оказания технической помощи в подготовке тучных клеток и культивирования. Эта работа была поддержана трансрегиональных совместный исследовательский центр (TR-SFB) 152.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
References
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
- Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Galli, S. J., et al. Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
- Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
- Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150 (2014).
- Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
- Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
- Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
- Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
- Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
- Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).
- Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
- Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
- Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
- Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569 (2014).
