Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu isolieren und kultivieren murinen peritonealen Mastzellen. Wir beschreiben auch zwei Protokolle für ihre funktionelle Charakterisierung: eine fluoreszierende Imaging der intrazellulären freien Ca2 + Konzentration und eine Degranulation Assay anhand der kolorimetrischen Quantifizierung der veröffentlichten β-Hexosaminidase.
Abstract
Mastzellen (MCs), Rolle als Teil des Immunsystems, eine zentrale bei der Verteidigung der Gastgeber gegen mehrere Krankheitserreger und bei der Auslösung der allergischen Immunantwort. Die Aktivierung des MCs über die Vernetzung der Oberfläche IgE, hohe Affinität IgE-Rezeptoren (FcεRI) sowie durch die Stimulation von mehreren anderen Rezeptoren gebunden, initiiert den Aufstieg des freien intrazellulären Ca2 + Levels ([Ca2 +]ich) Das fördert die Freisetzung von entzündlichen und allergischen Mediatoren. Die Identifizierung von molekularen Bestandteile dieser Signalwege beteiligt ist entscheidend für das Verständnis der Verordnung der MC-Funktion. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung von murinen Bindegewebe Typ MCs von peritoneal Lavage und Anbau von peritonealen MCs (PMCs). Kulturen von MCs aus verschiedenen Knockout-Maus-Modellen durch diese Methode darstellen einen sinnvoller Ansatz zur Identifizierung von Proteinen in MC Signalwege beteiligt. Darüber hinaus wir auch beschreiben ein Protokoll für die einzelne Zelle Fura-2 imaging wie eine wichtige Technik für die Quantifizierung von Ca2 + Signalisierung in MCs. Fluoreszenz-basierte Überwachung [Ca2 +]ich ein zuverlässiges und gängigen Ansatz zur studieren Sie Ca2 + Veranstaltungen, darunter Kalzium Shop betrieben Eintrag, die von größter Bedeutung für die MC-Aktivierung-Signalisierung. Für die Analyse von MC Degranulation beschreiben wir einen β-Hexosaminidase-Release-Assay. Die Höhe der β-Hexosaminidase in das Kulturmedium abgegeben wird als Degranulation Marker für alle drei verschiedenen sekretorischen Teilmengen in MCs. β-Hexosaminidase beschrieben durch seine Reaktion mit einem Colorigenic Substrat in leicht quantifizierbar sind ein Mikrotiter-Platte kolorimetrischen Probe. Diese hoch reproduzierbare Technik ist kostengünstiger und erfordert keine spezielle Ausrüstung. Das angegebene Protokoll zeigt insgesamt eine hohe Ausbeute von MCs typischen oberflächenmarker MC zum Ausdruck zu bringen, anzeigen typischen morphologischen und phänotypischen Merkmale der MCs und hoch reproduzierbare Reaktionen auf Secretagogues in Ca2 +- Nachweis Bildgebung und Degranulation Assays.
Introduction
MCs spielen eine herausragende Rolle bei angeborenen und erworbenen Immunantwort. Insbesondere MCs teilnehmen an der Tötung von Krankheitserreger wie Bakterien und Parasiten, und auch potentiell toxischen endogene Peptide oder Komponenten der Gifte (für Überprüfung siehe Galli Et Al. 20081) abgebaut. Die physiologische Rolle von MCs in angeborenen und der adaptiven Immunität ist Gegenstand hitziger Debatten. Daher erfordern zahlreiche Daten Diskrepanzen in den Studien mit verschiedenen MC-defizienten Maus-Modellen eine systematische Neubewertung der immunologischen Funktionen von MCs über Allergie2. Reife MCs sind meistens in Geweben und Organen wie Darm, Haut und Lunge beschränkt und sind in der Regel nur in geringen Stückzahlen im Blut gefunden. MCs stammen aus hämatopoetischen Vorläufer, wie z. B. MC Stammväter, und füllen Sie ihre Differenzierung und Reifung in die Mikroumgebungen von fast allen vaskularisierte Gewebe1. T-Cell-derived Factor Interleukin (IL)-3 fördert gezielt die Lebensfähigkeit, Proliferation und Differenzierung von pluripotenten Einwohner Maus MCs aus ihrer hämatopoetischen Vorläuferzellen3. Stem Cell Factor (SCF) entsteht durch strukturelle Zellen in den Geweben und spielt eine entscheidende Rolle in der MC-Entwicklung, überleben, Migration und Funktion4. Die Eigenschaften der einzelnen MCs können je nach ihrer Fähigkeit zu synthetisieren und verschiedenen Proteasen oder Proteoglykane zu speichern. Bei Mäusen sind die so genannten Bindegewebe-Typ MCs von Schleimhaut MCs entsprechend ihrer anatomischen Lokalisation, Morphologie und Inhalte von Heparin und Proteasen5unterscheiden.
In MCs, ein Anstieg von freien cytosolischen Ca2 + ([Ca2 +]ich) ist unentbehrlich für die Degranulation und Produktion von Eicosanoids sowie für die Synthese von Zytokinen und Aktivierung von Transkriptionsfaktoren in Reaktion auf Antigen und verschiedenen Secretagogues6. Eine nachgeschaltete Hauptziel dieser Reize ist Phospholipase C, die Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1,4,5-Trisphosphate hydrolysiert. DAG aktiviert Proteinkinase C und IP3 gibt Ionen von Ca2 + aus dem endoplasmatischen Retikulum frei. Raubbau an diesen Geschäften aktiviert Ca2 + Zustrom durch Plasmamembran Ca2 + Kanäle, was zu betriebenen Kalzium Eintrag (SOCE) speichern. Dieser Prozess wird hervorgerufen durch das Zusammenspiel von Ca2 +-Sensor, Stromale Interaktion Molekül-1 (Stim1), in dem endoplasmatischen Retikulum mit Orai17 sowie durch die Aktivierung von Transienten Rezeptor potenzielle kanonische (TRPC) Kanal Proteine (für Überprüfung siehe Freichel Et al. 2014-8) in der Plasmamembran.
Zur Untersuchung werden die physiologische Rolle dieser Kanäle, mehrere pharmakologische (Anwendung des Kanal-Blocker) oder gentechnische Ansätze in der Regel verwendet. Im letzteren Fall wird die Unterdrückung der Proteinexpression durch gezielte mRNA (Zuschlag) erreicht oder genomischer DNA mit globalen oder gewebespezifische9 löschen ein Exon Codierung eine Pore bilden Untereinheit eines Kanals (Knockout) bearbeiten. Die Verfügbarkeit eines Blockers mit ausreichender Spezifität für diese Kanäle beschränkt. Darüber hinaus der Knockdown Ansatz erfordert sorgfältige Kontrolle über seine Effektivität verwenden, z. B.., Western blot Analyse, und durch das Fehlen von spezifischen Antikörpern für die gezielte Kanal-Protein in vielen Fällen behindert wird. So ist die Verwendung von Knockout-Maus-Modellen nach wie vor als Goldstandard für eine solche Analyse betrachtet. Eine bevorzugte in Vitro Modell zur Untersuchung von MC-Funktionen ist der Anbau von PMCs, die isolierte ex Vivo als voll ausgereifte Population werden können (im Gegensatz zu differenzieren MCs in Vitro aus, zB., Knochenmarkzellen)10 . Im Vergleich zu dem Knochenmark abgeleitet MCs (BMMCs), die auch häufig verwendet werden, zu studieren, MC-Funktion in Vitro, die Stimulation der FcεRI und Beta-Hexosaminidase Release 8-fach und 100fach PMCs, bzw. erhöht. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von murinen PMCs, die es erlaubt, um zu erhalten, nach 2 Wochen der Kultivierung einer hohen Anzahl von reinen Bindegewebe MCs, ausreichend für die weitere Analyse geben.
Trotz der jüngsten Fortschritte in der Entwicklung und Anwendung von genetisch codierte Kalzium Indikatoren ist deren Nutzung noch durch Schwierigkeiten bei der Lieferung von Genen an Zielzellen, insbesondere in hoch spezialisierten Zellen wie primäre kultivierten MCs begrenzt. Darüber hinaus fehlt diese Gruppe von fluoreszierenden Indikatoren für [Ca2 +]ich Messungen noch ratiometrischen Farbstoffe mit einem hohen Dynamikumfang. Aus diesen Gründen ist die bevorzugte Methode für ratiometrischen [Ca2 +]ich Messung noch die Verwendung von fluoreszierenden Farbstoff "Fura-2"11.
Derzeit die am häufigsten verwendete Ansatz für die Bewertung von MC-Aktivierung und Degranulation ist die Messung der Aktivität der β-Hexosaminidase. Β-Hexosaminidase, eine allergische Mediator ist eine MC Modul Komponenten, die in einem konstanten Verhältnis von MCs-12zusammen mit Histamin freigegeben ist. Β-Hexosaminidase ist leicht und präzise durch die Reaktion mit einem speziellen Substrat messbar erzeugt eine messbare Menge eines Colorigenic Produkts, das in einer Mikrotestplatte kolorimetrischen Probe leicht nachweisbar ist. In diesem Artikel wird eine Anwendung dieser Technik für die Analyse von PMCs Degranulation in Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen berichtet.
Aggregation von der hohen Affinität plasmalemmal IgE-Rezeptor (FcɛRI) wird im MCs eine vielseitige intrazellulären Signalweg führt zu einer Freisetzung von sekretorischen Granulat Inhalt in den extrazellulären Raum aktiviert. Neben den spezifischen Antigen, können viele andere Reize aktivieren MCs um vielfältige immunmodulatorische Mediatoren wie Ergänzung Anaphylatoxins freizugeben (zB., C3a und C5a)13, Vasokonstriktor Peptid Endothelin 1 (ET1)14 , als auch zahlreiche kationischen Substanzen und Drogen pseudoallergische Reaktionen zu provozieren (zB., Icatibant)15 durch Bindung an MRGPRX216. Intrazelluläre Signalwege MRGPR-induzierte MCs Degranulation beteiligt sind schlecht im Vergleich zu FcɛRI-vermittelten intrazelluläre Signale gekennzeichnet; Diese Wege erst während der letzten paar Jahre17 nach der Rezeptor Identifikation16intensiv untersucht werden. Weitgehend, bleiben die Plasmamembran Ionenkanäle beteiligt Kalzium Eintrag gefolgt von MRGPRX2 Anregung verstanden werden. Daher der vorliegende Artikel konzentriert sich auch auf intrazellulären Calcium-Signalisierung und Degranulation der MCs mit MRGPR Agonisten stimuliert.
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Protocol
Alle tierische Verfahren wurden nach den deutschen Rechtsvorschriften Leitlinien zur Pflege und Verwendung von Labortieren (offiziell genehmigt durch das Regierungspräsidium Karlsruhe) durchgeführt.
1. PMC Isolierung und Kultivierung von intraperitoneale Lavage
| 1 | Eis |
| 2 | 10 mL Spritzen |
| 3 | 27 G Nadeln |
| 4 | 20 G Nadeln |
| 5 | Styropor-Block und Stifte |
| 6 | Röhrchen (50 mL Zentrifuge Kunststoffrohre) |
| 7 | 70 % igem ethanol |
| 8 | RPMI Medium (Pre gekühlt und auf Eis gehalten) |
| 9 | PMC-Medium: RPMI Medium + 20 % FCS (fetalen Kälberserum) + 1 % Penicillin-Streptomycin Lösung (Pen-Strep) |
| 10 | Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung - DPBS (ohne Ca2 + und Mg2 +) |
| 11 | Kulturflaschen (25 cm) |
| 12 | Wachstumsfaktoren Lager Lösungen (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL) |
| 13 | Serologische Pipetten (10 mL) |
| 14 | Pipetten Spitzen steril (20-200 µL) |
| 15 | Hemocytometer |
| 16 | Bank-Zentrifuge |
| 17 | Scheren und Pinzetten |
| 18 | CO2 -Kammer für Mäuse |
| 19 | Offene steriler Haube |
| 20 | Steriler Haube geschlossen |
| 21 | Zelle Inkubator (37 ° C und 5 % CO2) |
| 22 | Pipetten (20-200 µL) übertragen |
Tabelle 1: Materialien für die Schritt 1.
-
PMC-Isolierung durch intraperitoneale lavage
- Bereiten Sie vor der Zelle isoliert die Materialien, die in Tabelle 1aufgeführt.
- Verwenden Sie 8 bis 14 Wochen alten männlichen Mäusen für PMC-Isolierung. Einschläfern Sie eine Maus durch CO2 Einatmen, und bestätigen Sie den Tod durch Verlust von Reflexen. Sprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol und befestigen Sie es an einem Schaumstoffblock mit Hilfe der Pins (dorsale Seite nach unten). Entfernen Sie die ventrale Haut der Maus mit einer stumpfen Kante Schere. Beschädigung der Bauchhöhle zu vermeiden.
Hinweis: Wir verwenden in der Regel dieses Protokoll für Mäuse mit einem C57BL/6N Stamm genetischen Hintergrund. - Injizieren Sie 7 mL eiskaltes RPMI Medium und 5 ml Luft in der Bauchhöhle mit einer 10 mL Spritze mit einer 27 G Nadel ausgestattet. Schieben Sie die Nadel vorsichtig in das Peritoneum und perforieren Sie keine Organe. Verwenden Sie einen Platz in der Region der epididymal Fett zur Verringerung des Risikos von einer Orgel-Perforation.
- Nach der Injektion schütteln Sie die Maus für 1 min peritoneale Zellen in das RPMI Medium lösen. Schütteln Sie die Maus nicht zu stark um schädigen die inneren Organe und verunreinigen die Bauchhöhle mit dem Blut zu vermeiden.
- Wiederverwenden Sie die 10-mL-Spritze, indem Sie mit eine neue Kanüle 20 G auszustatten. Verschieben Sie die inneren Organe auf der einen Seite durch Kippen der Schaumstoffblock und leichtes Klopfen sie auf der Bank, mittlere Aspiration von der anderen Seite zu erleichtern. 20 G Nadel, oben abgeschrägt und Aspirieren Sie die Flüssigkeit aus dem Bauch, langsam und vorsichtig (~0.5 mL/s), Verstopfung durch die inneren Organe zu vermeiden. Sammeln Sie so viel Flüssigkeit wie möglich (in der Regel 5 – 6 mL).
- Entfernen Sie die Nadel von der Spritze und übertragen Sie die gesammelten Zellsuspension in ein Sammelrohr auf Eis zu. Ein Probenröhrchen zu verwerfen, wenn es sichtbare Blut Verschmutzung gibt.
- Zentrifugieren Sie die Rohre mit der Zellsuspension bei ~ 300 X g für 5 min. Aspirieren Sie unter einer sterilen Haube überstand. Für jede Maus kombinieren die Probe Pellets in 4 mL kalt (4 – 10 ° C) PMC Medium und Übertragung der Zellsuspension auf einem 25 cm2 Kultur Kolben. Fügen Sie die Wachstumsfaktoren IL-3 und SCF die Endkonzentrationen 10 ng/mL und 30 ng/mL, beziehungsweise. Legen Sie die Flasche mit der Zellen in einem Inkubator (37 ° C und 5 % CO2) und inkubieren Sie ~ 48 h bis zum nächsten Verfahren.
-
PMC-Kultur
- Tag2 (~ 48 h nach Isolierung): mittlere Änderung
- Zum Entfernen Aspirieren der überstand und nicht-anhaftende Zellen (Erythrozyten und abgestorbene Zellen), das Medium aus der Flasche durch Platzierung einer PIPETTENSPITZE Pasteur am Rand des Kolbens und halten die Flasche fast horizontal. 4 mL vorgewärmten PMC Medium per Mausklick hinzufügen. Fügen Sie die Wachstumsfaktoren IL-3 (10 ng/mL) und SCF (30 ng/mL). Legen Sie die Flasche mit der Zellen in einem Inkubator (37 ° C und 5 % CO2).
- 9. Tag: Zelle teilen
- Übertragen Sie die Zellsuspension aus der Zelle-Kultur-Flasche in ein 50 mL Kunststoff Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Küvette dreimal mit 10 mL vorgewärmt (37 ° C) Dulbecco den Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS), sammeln die Zellsuspension mit den freistehenden Zellen in der gleichen 50 mL Kunststoff Röhrchen Zentrifugieren. Zählen Sie die Zellkonzentration durch eine Hemocytometer und berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen zu.
- Die Zellsuspension bei ~ 300 X g für 5 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt. Wiederherstellen Sie das Pellet in vorgewärmten PMC Medium (37 ° C), die Zelle Konzentration 1 x 106 Zellen/mL zu erhalten. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine neue 25 cm2 Kultur Kolben. Entsorgen Sie die alte Flasche mit Fibroblasten festhalten an der Unterseite.
- Fügen Sie die Wachstumsfaktoren IL-3 (10 ng/mL) und SCF (30 ng/mL), und legen Sie die Flasche mit der Zellen in einem Inkubator (37 ° C und 5 % CO2).
- Tag 12 – 15: Handy-Messungen
- Keine Experimente mit Stimulation der Rezeptoren FcɛRI geplant, Vorbehandeln Sie die Zellen über Nacht mit 300 ng/mL des IgE Anti-DNP in standard Kulturmedium. Fahren Sie mit Schritt 2 oder Schritt 3.
- Tag2 (~ 48 h nach Isolierung): mittlere Änderung
(2) fluorometrisch intrazellulären freien Calcium-Konzentrationsmessung in PMCs
- Bereiten Sie vor den Messungen die Materialien, die in Tabelle 2aufgeführt. Außerdem bereiten Sie ein Imaging-Setup bestehend aus: invertiert Fluoreszenzmikroskop; Ziel: 40 X / 1,3 Öl; Fura-2 Filter festlegen; CCD-Kamera; Erregung Lichtquelle; Imaging-Erwerb Programm; Schwerkraft zugeführt Lösung Anwendungssystem.
| 1 | PMC (12 – 15 Tage alt) 1 x 106 Zellen/mL |
| 2 | Concanavalin A |
| 3 | Fura-2 Uhr |
| 4 | Pluronic F-127 20 % Lösung |
| 5 | Runde Abdeckung rutscht Gläser; Ø 25 mm; Nr. 1 |
| 6 | DNP-HSA (Dinitrophenol-Human Serum Albumin) Stammlösung |
| 7 | Anti-DNP-Antikörper (IgE)-Stammlösung |
| 8 | Flache Bodenplatte (12 Brunnen) |
| 9 | Zusammengesetzte 48/80-Stammlösung |
| 10 | Decken auch Imaging-Kammern |
| 11 | Hemocytometer |
| 12 | Pipetten (20-200 µL) übertragen |
Tabelle 2: Werkstoffe für Schritt 2.
-
Fura-2 bildgebende Vorbereitung
- Durchführen Sie einer Zellzahl unter Verwendung einer Hemocytometer und passen Sie die Zellkonzentration bis 1 x 106 Zellen/mL. Teilen Sie die PMCs-Kolonien, indem sanft pipettieren (3 – 5 mal) die Zellsuspension mit einer PIPETTENSPITZE 1 mL.
- Bereiten Sie eine Ca2 +-mit HEPES gepufferte Salzlösung (Ca2 +- HBSS) bestehend aus 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 10 mM HEPES und 12 mM Glukose. Den pH-Wert 7,4 mit 3 M NaOH einstellen.
- Bereiten Sie Concanavalin A beschichtete Folien durch pipettieren 1 Tropfen Concanavalin A-Lösung (0,1 mg/mL in H2O) auf jeweils 25 mm Runde Deckglas unter einer sterilen Kapuze. Lassen Sie die Tropfen auf der Cover-Zettel für mindestens 1 min, dann entfernen Sie die meisten der Lösung mit einer Pipette und lassen das Deckel rutscht an der Luft trocknen für 45 min. Drücken Sie vorsichtig das Concanavalin A behandelt Deckel rutscht auf der Kautschuk imaging Kammer (siehe Tabelle der Materialien) bis Sie legen um Mikroskopie imaging Kammern zu erhalten.
Hinweis: Poly-L-Lysin beschichtete Folien können als Alternative verwendet werden. - Auflösen der Ca2 + Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 AM (1 mM) in Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Bewahren Sie diese Lösung vor Licht geschützt auf.
- Verdünnen Sie die Fura-2 AM-Stammlösung in Ca2 +- HBSS, eine Endkonzentration von 5 µM um den "Laden-Puffer" vorzubereiten. Ergänzen Sie mit 5 µL/mL 20 % Pluronic F-127 in DMSO.
- Mix 500 µL "Loading Buffer" mit 500 µL Zellsuspension PMC. Pipette die Mischung in die bildgebenden Kammer und die Zellen für 20-30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
- Richten Sie die Schwerkraft zugeführt Anwendungssystem mit unterschiedlichen Lösungen gemäß dem Protokoll der Stimulation. Spritze 1 mit 40 mL Ca2 +- HBSS Lösung ergänzen, Spritze 2 mit 40 mL Ca2 +- HBSS Lösung enthaltend 100 ng/mL DNP, Spritze 3 mit 40 mL Ca2 +- HBSS Lösung enthaltend 50 µg/mL Compound 48/80, 4 mit 40 mL Spritze nominell Ca2 +-frei-HBSS Lösung und Spritze 5 mit 40 mL nominell Ca2 +-frei-HBSS Lösung mit 2 µM Thapsigargin.
- Bereiten Sie ein 40 X High-Blende Öl eintauchen Ziel indem man einen kleinen Tropfen Immersionsöl darauf vor.
- Montieren Sie das Anwendungssystem auf der Bühne des inversen Mikroskop. Setzen der bildgebenden Kammer mit den geladenen Zellen im Anwendungssystem und sichern Sie es um Bewegung während der Aufnahme zu verhindern. Das transmittierte Licht schalten und die Zellen zu konzentrieren.
- Spülen Sie die Zellen dreimal mit Ca2 +- HBSS Puffer mit der Schwerkraft-gefütterten Anwendungssystem.
- Inkubieren Sie die Zellen in Ca2 +- HBSS für 5 min für Fura-2 AM de-Veresterung.
- Spülen Sie die Zellen noch einmal vor Beginn der Bildgebung, um potenziell entfernen sickerte Fluoreszenzfarbstoff.
-
Cell imaging
- Starten Sie das bildgebende Erwerb Programm in der physiologischen Akquisitionsmodus. Das Setup-Fenster zu öffnen, und passen Sie den Fokus und die optimale Erfassungszeit (sollten die gleiche Erregung mit 340 nm und 380 nm und in der Regel bewegt sich zwischen 50 – 150 ms).
Hinweis: Minimierung die Exposition von Fura-2 geladenen Zelle Licht Immunofluoreszenz des Farbstoffs zu vermeiden. - Bild ein Referenzbild, und markieren Sie die Zellen als Regionen von Interesse (ROI). Markieren Sie den letzten ROI in einem Gebiet wo keine Zellen vorhanden sind und definieren es als Hintergrund.
- Abzuschließen Sie die Installation, und starten Sie die Messung mit einem 5 s Abtastrate.
Hinweis: Die Zellen werden abwechselnd mit beleuchtet werden das Anregungslicht von 340 nm und 380 nm und die emittierte Fluoreszenz (> 510 nm) wird mit der CCD-Kamera erfasst werden. Die Bilder der Fluoreszenz Signale F340 nm sowie F380 nm und das Verhältnis (F340 nm/F380 nm) werden in drei Fenstern angezeigt. Die Charts von zeitlichen Verlauf der einzelnen ROIs Fluoreszenzintensität bedeutet Werte auch ständig angezeigt werden. - Fügen Sie Lösungen auf die richtige Zykluszahl nach der Form des Experiments:
- Maßnahme, die Antigen-induzierte Höhe [Ca2 +]ichwie in Abbildung 2A, 2 bdargestellt, gelten Sie die Spritze 2-Lösung nach Zyklus 20 und stoppen der Aufnahme nach Zyklus 150.
- Zur Messung der Compound 48/80-induzierte Höhe [Ca2 +] auftrageni, wie in Abbildung 2C, dargestellt die Spritze 3 Lösung nach Zyklus 20 und stoppen der Aufnahme nach Zyklus 150.
- Um die Höhe der [Ca2 +]ich hervorgerufen durch SOCE, Messen wie in Abbildung 2Ddargestellt, gelten Sie die Spritze 4 Lösung nach Zyklus 10, wenden Sie die Spritze 5-Lösung nach Zyklus 70, wenden Sie die Spritze 4 Lösung nach Zyklus 120, wenden Sie die Spritze 1 Lösung nach Zyklus 150, und stoppen Sie die Aufnahme nach Zyklus 220.
- Nach Beendigung der Mess, umwandeln Sie die Ergebnisse in einem Ratio-Tabelle enthält die gemessenen Intensitäten für Erregung Wellenlängen mit und ohne Untergrundkorrektur sowie die Verhältniswerte mit und ohne Untergrundkorrektur für jeden ROI und jedes Mal Messpunkt. Im Erwerb Programm, drücken Sie nacheinander die Tasten: "Start-Cutter", "alle markieren", "alle konvertieren", "Physiologie Messungen", "Ok,"Ok". Speichern Sie die Dateien als Tabellen und Bild-Stacks für Offline-Analyse.
- Starten Sie das bildgebende Erwerb Programm in der physiologischen Akquisitionsmodus. Das Setup-Fenster zu öffnen, und passen Sie den Fokus und die optimale Erfassungszeit (sollten die gleiche Erregung mit 340 nm und 380 nm und in der Regel bewegt sich zwischen 50 – 150 ms).
(3) Beta-Hexosaminidase Release Messung in PMCs
| 1 | PMC (12 – 15 Tage alt) 1 x 106 Zellen/mL |
| 2 | Anti-DNP-Antikörper (IgE)-Stammlösung |
| 3 | DNP-HSA-Stammlösung |
| 4 | Zusammengesetzte 48/80-Stammlösung |
| 5 | Ionomycin |
| 6 | 96-Well-Platte, v-förmigen Boden |
| 7 | 96-Well-Platten, flachen Boden |
| 8 | Kunststoff-Zentrifuge Röhren (15 mL) |
| 9 | Serologische Pipetten |
| 10 | Zelle Inkubator (37 ° C und 5 % CO2) |
| 11 | Bank-Zentrifuge |
| 12 | Mikrotiter-Platte-Reader für optische Dichtemessungen |
| 13 | Mehrkanal-Pipette (20-200 μl) |
| 14 | Hemocytometer |
Tabelle 3: Materialien für Schritt 3.
- Bereiten Sie vor den Messungen die in Tabelle 3aufgeführten Materialien.
Hinweis: β-Hexosaminidase aus MCs entlassen, nachdem ihre Anregung hydrolysiert p-Nitrophenyl-Acetyl-D-Glucosamin (pNAG) in p-Nitrophenol und N-Acetyl-D-Glucosamin. Die Höhe der β-Hexosaminidase in der Probe ist proportional zur Menge des p-Nitrophenol, die gebildet wird. In einem Umfeld hoher pH-Wert von "Stop Solution" p-Nitrophenol existiert als vollständig deprotonierten p-Nitrophenolat und detektiert werden, durch seine leichte Extinktion bei 405 nm. - Bereiten Sie Tyrode Lösung mit 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5,6 mM Glukose und BSA 0,1 %. Den pH-Wert 7,4 mit 3 M NaOH einstellen.
- Bereiten Sie die Lyse-Lösung durch Zugabe von einem 1 % Volumen von Triton x-100 die Tyrode-Lösung.
- Bereiten Sie die Stopplösung bestehend aus 200 mM Glycin und passen Sie den pH-Wert auf 10.7 mit NaOH.
- Bereiten Sie die pNAG-Lösung (4-Nitrophenyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) durch Auflösen von pNAG in 0,4 M Zitronensäure, eine Endkonzentration von 4 mM.
- Berechnen Sie die Menge der Zellen benötigt für den Assay (führen Sie den Test in zweifacher Ausfertigung). Verwenden Sie 200.000 PMCs pro Bohrloch. Verwenden Sie 2 Brunnen als Negativkontrollen (Tyrode Lösung ohne irgendwelche Secretagogues wie DNP oder zusammengesetzte 48/80) und 2 Brunnen als Positivkontrollen (Tyrode Lösung mit 10 µM Ionomycin) für jeden Genotyp.
- Die Zellen in einer 15 mL Kunststoff Zentrifugenröhrchen zu übertragen, stellen Sie die Lautstärke auf 15 mL mit Tyrode Lösung und Zentrifugieren bei 200 X g für 4 min. Überstands mit einer Pasteurpipette entfernen und Aufschwemmen der Zellen in Tyrodes-Lösung, 2 x 106 Zellen /mL.
- Übertragen Sie 100 µL Zellsuspension pro Bohrloch auf einer 96-Well-V-Boden-well-Platte. Geben Sie 25 µL Stimulation oder Kontrolllösung in jeder (nach dem pipettieren Schema in Abbildung 3dargestellt). Inkubieren Sie die Zellen für 45 min bei 37 ° C und 5 % CO2.
- Die Reaktion zu stoppen, indem man die 96-Well-Platte für 5 min auf Eis. Dann Zentrifugieren Sie die Platte bei 4 ° C für 4 min bei 120 X g. 120 µL des Überstands mit einer Mehrkanal-Pipette auf eine flach-Boden-96-Well-Platte zu übertragen und auf Eis legen. Berühren Sie vorsichtig nicht die Zelle Pellets, aber Aspirieren Sie völlig überstand.
- Die Zelle Pellets 125 µL Lyse Puffer hinzufügen. Inkubieren Sie die Zelle-Pellets für 5 min bei Raumtemperatur und Aufschwemmen sie nach der Inkubation durch wiederholte pipettieren (ca. 5 mal).
- Pipette 25 µL der pNAG-Lösung (4 mM) in den erforderlichen Vertiefungen einer neuen flach-Boden 96-Well-Platte. 25 µL aus jeder überstand die vorbereiteten pNAG Lösung sowie 25 µL jeder Zelle lysate hinzufügen.
- Inkubieren Sie die Reaktion Chargen für 1 h bei 37 ° c Nach der Inkubation pipette 150 µL Stopplösung in jede Vertiefung, die Reaktion zu stoppen.
- Analysieren Sie die Platte mit einer Mikrotestplatte Leser mit einer Dual-Wellenlänge-Einstellung bei 405 nm mit Referenz 630 nm für automatische Hintergrundabzug. Im Übernahme-Programm aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Reference" und wählen Sie im Menü "Extinktion" Programm Element "630 nm" aus der Dropdown-Liste. Wenn die optische Dichte der Proben zu hoch ist, bereiten Sie eine entsprechende Verdünnung der Sonde vor nachmessen.
- Berechnen Sie den Anteil der β-Hexosaminidase Freigabe nach der folgenden Gleichung:
Release [%] Prozent des spezifischen Beta-Hexosaminidase Release ist, ist ein [überstand] Hintergrund Absorption des Überstands korrigiert, und [lysate] ist der Hintergrund Absorption von der entsprechenden Zelle lysate korrigiert.
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Representative Results
PMCs wurden von 3 Wildtyp-Mäusen (C57BL/6N) durch intraperitoneale Lavage isoliert und weiter kultiviert in RPMI Medium ergänzt mit 20 % FCS und 1 % befeuchtet Pen-Strep in Anwesenheit von Wachstumsfaktoren (IL-3 bei 10 ng/mL) und SCF bei 30 ng/mL unter sterilen Bedingungen in 37 ° C und 5 % CO2. Das Medium wurde an den Tagen 2 und 9 nach der Isolierung der Zelle geändert. Die Zellmorphologie wurde analysiert mit Licht DIC Bildgebung (siehe Abbildung 1A, B). Die Zelle Kontrast und Granularität zeigte gute Zellviabilität. Nach 2 Wochen der Kultivierung unter diesen Bedingungen war eine homogene Bevölkerung von 1,5 x 107 Zellen erhalten. Flow-zytometrie-Analyse der Zellen zusammen mit Anti-IgE-Antikörper konjugiert mit FITC befleckt und Anti-c-Kit-Antikörper konjugiert mit PE offenbart 98,6 % der FITC positiv und 99,8 % PE positive Zellen (Abbildung 1C). 98,5 % der kultivierten Zellen waren doppelt positiv für FITC und PE (Abbildung 1C), zeigen typische Merkmale der Reife MCs.
Für weitere funktionale Analyse der gewonnenen Zellen wurden fluorometrisch [Ca2 +]ich Messungen mit fluoreszierenden Indikator Fura-2 durchgeführt. Fura-2 geladene Zellen wurden abwechselnd beleuchtet mit 340 nm und 380 nm Anregung Licht jeden 5 s und Fluoreszenz > 510 nm mit einer CCD-Kamera registriert wurde. Das Verhältnis der Fluoreszenz (F340/F380) wurde ständig überwacht. Anwendung von DNP (100 ng/mL), PMC mit 300 ng/mL des IgE über Nacht inkubiert Anti-DNP evoziert eine ausgeprägte Erhöhung von der [Ca2 +]ich Ebene, die über mehrere Minuten (Abbildung 2A, B) langsam auf die halbe maximale zerfallen. Variabilität der Zell-Reaktionen relativ niedrig war (Abb. 2A, B). Stimulation der MRGPRB2 Rezeptoren mit 50 µg/mL des Compound-48/80 mit der gleichen Zeit-Protokoll auch deutlich erhöht [Ca2 +]i in Fura-2 geladen PMCs mit sehr ähnlichen mittlere Amplitude der Antwort (Abbildung 2C). Für die Analyse der SOCE in PMCs, wurde ein "Re-Zusatz" Protokoll angewendet: 10 Zyklen nach dem Beginn der Messung, externe Ca2 + wurde entfernt, und während der Zyklen 70 – 120 Thapsigargin (2 µM), ein Inhibitor der endoplasmatischen Retikulum ATPase, war für den Abbau der intrazellulären Ca2 + Geschäfte und für die maximale Aktivierung der SOCE angewendet. Die vorübergehende [Ca2 +]ich Höhe reflektiert die Ca2 + Freisetzung aus intrazellulären Ca2 + Stores in einer nominell Ca2 +-kostenlose Bad-Lösung (Abbildung 2D). Wiederherstellung der externen Ca2 + Konzentration bis 2 mM, nach einem prominenten Zuwachs [Ca2 +]i Ebene aufgrund der Ca2 + Zustrom durch die SOCE Kanäle (Abbildung 2D) Zyklus 150 geführt. Diese Komponente der Ca2 + Antwort war stark gehemmt, in Anwesenheit von 10 µM GSK 7975A, bekannt als CRAC-Blocker, während die Ca2 + Freisetzung aus intrazellulären Ca2 + Stores unverändert (Abbildung 2D blieben ).
Im nächsten Schritt haben wir die Möglichkeit der isolierten PMCs Degranulation bei der Vernetzung der FcɛRI hohe Affinität Rezeptoren oder Stimulation der Rezeptoren MRGPRB2 unterziehen getestet. Zu diesem Zweck wurde eine ß-Hexosaminidase-Release-Assay durchgeführt. Die Zellen wurden hinzugefügt, um eine V-Boden-96-Well-Platte (2 x 105 Zellen/na) und stimuliert nach dem Schema dargestellt in Abbildung 3A 45 min bei 37 ° C. Die Platte wurde zentrifugiert und nach dem Entfernen des Überstands wurden die Pellets lysiert. Der ß-Hexosaminidase-Inhalt der einzelnen Überstände und Pellet Lysates wurde während einer 1 h Inkubation bei 37 ° c durch ihre Reaktionen mit pNAG analysiert. Die Menge der Reaktionsprodukte farbmetrisch erkannt wurde und der Prozentsatz der freigesetzten ß-Hexosaminidase wurde berechnet (siehe Abbildung 3B). Die Spontane Freisetzung war sehr niedrig (1 %), während die Antworten auf starke Degranulation Reize wie 10 µM Ionomycin und Compound 48/80 50 µg/ml waren mehr als 40 % und 60 %, beziehungsweise. Degranulation Antworten auf DNP Stimulation waren dosisabhängig über den Konzentrationsbereich von 10 bis 300 ng/mL. Diese Daten zeigen zusammen, ein guter Funktionszustand des isolierten PMCs.
Abbildung 1 : Charakterisierung von primären kultiviert murinen Wildtyp PMCs mit DIC Mikroskopie und Flow-zytometrie-Analyse durchgeführt. (A, B) Repräsentative Bilder mit 20 X plasDIC Ziel von PMCs kultiviert in 25 cm2 Kunststoff Flaschen 1 h nach Zelle Isolierung durch intraperitoneale Lavage (A) und am Tag 9 der Kultivierung (B) erzielt. Maßstabsbalken in der rechten unteren Ecke zeigen 100 µm. (C) Flow Cytometry Analyse von PMCs (kultivierten 12 Tage nach dem oben beschriebenen Protokoll) Co gebeizt mit Anti-IgE-Antikörper konjugiert mit Fluorescein erfolgt (FITC) und Anti-c-kit Antikörper konjugiert mit Phycoerythrin (PE). Die Zelle Dichte Handlung ist in vier Quadranten unterteilt: Q1, PE über Autofluoreszenz Ebene/FITC Autofluoreszenz unterschritten; Q2, PE über Autofluoreszenz Ebene/FITC Autofluoreszenz ü; Q3, PE unter Autofluoreszenz Ebene/FITC Autofluoreszenz unterschritten; Q4, PE unter Autofluoreszenz Ebene/FITC Autofluoreszenz ü. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Erfassung von [Ca2 +[ ] ich Fura-2 geladen PMCs von Wildtyp-Mäusen isoliert. [Ca 2 + []ich als Fluoreszenz-F340/F380-Verhältnis vorgestellt. (A) repräsentative Spuren von dem [Ca2 +]ich zeitlichen Verlauf der einzelnen PMCs (n = 38) stimuliert mit DNP (100 ng/mL). (B) zeitlichen Verlauf der DNP (100 ng/mL)-[Ca2 +]ich Höhe hervorgerufen. Jeder Datenpunkt zeigt Mittelwerte aus 38 Einzelzellen illustriert im Bedienfeld "A. gewonnen Die PMCs wurden über Nacht mit 300 ng/mL des IgE Anti-DNP vorbehandelt. (C) zeitlicher Verlauf der Mittelwerte der Compound 48/80-induzierte [Ca2 +]ich Höhe in PMCs (n = 60). (D) zeitlicher Verlauf der Mittelwerte der [Ca2 +]ich Veränderungen während der intrazellulären Ca2 +-speichern Erschöpfung induziert durch Anwendung von 2 µM Thapsigargin (Tg) in nominell Ca2 +-freie Lösung, gefolgt von Speicher betrieben von Kalzium Zustrom nach erneute Zugabe von 2 mM Ca2 + in Bad-Lösung in der Kontrollgruppe (n = 44) von PMCs (schwarze Quadrate) und in Anwesenheit von 10 µM von GSK 7975A in der Bad-Lösung (blaue Quadrate) (n = 41). In B, C und D zeigen die Fehlerbalken der Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Beta-Hexosaminidase release farbmetrische Multi-auch Messungen mit PMCs von Wildtyp-Mäusen isoliert. (A) Stimulation Schema der 96-Well-Platte pipettieren für die Durchführung der Beta-Hexosaminidase Assay; Ergebnisse werden im Bedienfeld "B."Spontan"zu pipettieren Tyrode Lösung ohne den Zusatz von jeder Secretagogues entspricht; IM = Ionomycin; CP 48/80 = Verbindung 48/80. (B) Bar graph zur Veranschaulichung Prozentsatz der ß-Hexosaminidase Veröffentlichung unter basalen Bedingungen (Spont), nach der Stimulation mit Ionomycin (IM), Dinitrophenol-Human Serum Albumin (DNP) und zusammengesetzte 48/80 (Cp 48/80) mit angegebenen Konzentrationen. Der Test wurde in zweifacher Ausfertigung durchgeführt; Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
MC Modelle können erfolgreich zur Untersuchung MC Degranulation, Chemotaxis, Haftung, sowie intrazelluläre Signaltransduktion Signalwege MC Aktivierung beteiligt zu erhellen. Einige Forscher Verwendung menschlicher MCs-Modelle, wie verewigt Linien (LAD2 und HMC1) oder menschliche MCs aus Cord abgeleitet blood Vorläuferzellen (CD133 +) und Vorläuferzellen des peripheren Blutes (CD34 +). Andere bevorzugen Nagetier MC Modelle, wie z. B. verewigt (Ratte basophile Leukämie RBL - 2H 3 MC Linie) oder primäre kultiviert (Maus Bone-Marrow-derived MCs BMMCs, PMCs) Modelle. Murine primären MCs lässt sich MC-Funktion in zahlreichen "Knock-out" Maus-Modellen, zu analysieren, welche der Gold-Standard-Ansatz für die Erforschung der physiologischen Funktionen von bestimmten Genen und kodierten Proteine sind. Das Defizit der pharmakologischen Werkzeuge für ausreichende Selektivität und Potenz macht diese Methode besonders wertvoll für die Untersuchung der Mechanismen der Signaltransduktion durch MC Aktivierung18. Murine PMCs sind des Phänotyps Bindegewebe, das eine Reife Morphologie und hohe Granularität aufweist. Sie reagieren nicht nur gut auf Antigen-Vernetzung von FcεRI wie BMMCs, aber auch durch Agonisten mehrere zusätzliche Rezeptoren wie Endothelin-1 oder zusammengesetzte 48 aktiviert. Allerdings ist die Ausbeute an die PMCs ist in der Regel deutlich geringer im Vergleich zu BMMCs und ist in der Regel nicht ausreichen, um ein Western-Blot oder eine andere Technik, die eine große Anzahl von Zellen erfordert durchzuführen. Verschiedene Techniken sind für die Isolierung und Reinigung von PMCs beschrieben worden. Beispielsweise wurde die Percoll-Gradienten-Zentrifugierung berichtet, ergeben eine hohe Reinheit des Zellen-19; Allerdings ist die Anzahl der Zellen, die mit dieser Technik erhalten in der Regel relativ gering. In dem hier beschriebenen Protokoll ist die wichtigste Schritt das Streben der Zellsuspension aus der Bauchhöhle. Blut-Kontamination der Probe zu vermeiden und die maximale Höhe der mittleren möglich Absaugen sind entscheidend für eine hohe Anzahl von PMCs von hoher Reinheit zu erhalten. Mit einigen Mausstämme ergibt sich eine maximale Anzahl von PMC nur durch eine verkürzte (11 – 12 Tage) Kultivierung Zeitraum. Diese Zellen in die Kulturbedingungen zu verlassen, für eine längere Zeit nur zu einer Verringerung der Anzahl von Zellen führt.
In der vorliegenden Studie, beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung der Reife MCs, die es ermöglicht, eine hochreine MC-Bevölkerung aus der Bauchhöhle Maus zu erhalten. Die gewonnenen Zellen zeichnen sich durch eine hohe Homogenität und weisen typische MC-Features, z. B. den Ausdruck von spezifischen Marker-Rezeptoren (KIT und FcεRI). Diese Zellen zeigen deutlich das MC-Merkmal zur degranulieren und zur Steigerung ihrer [Ca2 +]ich als Reaktion auf FcɛRI und MRGPR Aktivierung.
MC-Signalisierung von Ca2 + Freisetzung aus intrazellulären Läden und Ca2 + Eintrag Dienstweg Plasmamembran bestimmti Ebene [Ca2 +] eng verwandt ist. [Ca2 +] ich Höhe aktiviert einem Komplex von intrazellulären Signalwege, dass Trigger MC Degranulation. Wie in anderen nicht erregbare Zellen, die Ca2 + Zustrom Hauptweg in MCs ist die SOCE aktiviert durch die Erschöpfung der Ca2 +-speichert. Identifikation der Beteiligten in diesem Signalweg Kanäle ist entscheidend für das Verständnis der Verordnung der MC-Funktion. Für die Identifizierung der molekularen Bestandteile der SOCE Weg die Microfluorometric-Technik, die Verwendung von fluoreszierenden Ca2 + Indikatoren und der "Patch-Clamp" elektrophysiologische Ansatz spielte eine herausragende Rolle. Höhe des [Ca2 +]ich Geschosses ist jedoch die Summe von Ca2 + Release und SOCE. Um diese beiden Phasen des Ca2 + Mobilisierung zu unterscheiden, wurde das so genannte "Ca2 + Re Zusatz" Protokoll (für Überprüfung siehe Vogel Et Al. 200820) zuvor entwickelt. In diesem Protokoll die externen Salzlösung wird geschaltet, von einem normalen [Ca2 +]o (1 – 2 mM) mit einer nominell Ca2 +-Lösung. Unter diesen Bedingungen werden die Zellen mit Thapsigargin Ca2 + Läden leer und somit vollständig aktivieren SOCE behandelt. In Ermangelung einer extrazellulären Ca2 +evoziert Thapsigargin Behandlung die transiente [Ca2 +]ich Höhe, reflektieren eine Freisetzung von Ca2 + -Ionen aus intrazellulären Ca2 + Stores. Die erneute Zugabe von extrazellulären Ca2 + führt zu einer Erhöhung der [Ca2 +]ich Vertreter der SOCE. In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen die erfolgreiche Nutzung dieses Ansatzes für die Charakterisierung der SOCE in MCs. Wenn [Ca2 +]ich Änderungen überwacht werden, wurde Fura-2 als Kalzium-Indikator verwendet. In seiner Acetoxymethyl Form kann leicht PMCs Fura-2 geladen werden. Die Verwendung dieser ratiometrischen Farbstoff erlaubt den Vergleich nicht nur Amplituden [Ca2 +]ich Höhen, aber auch Unterschiede im basalen [Ca2 +]ich , das ist besonders wichtig für die Analyse von Wildtyp/Ko Zellen. Verglichen mit genetisch codierte Fluoreszenzfarbstoffe, einer der größten Nachteile von Fura-2 ist seine hohe Ansammlung in verschiedenen zellulären Organellen und dadurch Verunreinigungen der zytoplasmatischen Fluoreszenz.
Die Fura-2 Bildgebung erfordert eine doppelte Erregung-Technik. In der Regel ist es technisch viel einfacher zu bedienen als die doppelte Emission-Technik, die nicht nur den Verbrauch einer ausgelösten Lichtquelle, sondern zusätzlich die Beteiligung ein Filterrad oder eine Bild-Splitter in den Lichtweg Emission erfordert. Die beschriebenen Protokoll kann für Ca2 + Aufnahmen von anderen nicht erregbare Zellen verwendet werden.
Ein wesentliches Merkmal des MCs wird ihren hohen Gehalt an das Elektron-Dichte sekretorischen Granulat, die mit großen Mengen von Mediatoren und immunmodulatorische Substanzen gefüllt sind. MC-Aktivierung führt zu einer raschen Freisetzung von vorgeformten Körnchen Verbindungen. Verschiedene Ansätze zur MC Degranulation in-vitro- Analyse zur Verfügung, darunter den Nachweis von radioaktiven Serotonin, Histamin-Erkennung mit Antikörpern (ELISA) und den Nachweis einer Erhöhung der Plasmamembran Oberfläche mit Elektrophysiologische "Patch-Clamp" Zelle Kapazität Messungen. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir eine praktische Anwendung des Tests mit mehreren gut farbmetrischen Erkennung von in-vitro- veröffentlicht β-Hexosaminidase. Dieser Assay basiert auf der Fähigkeit des β-Hexosaminidase, hydrolyseneigung Klemme N-Acetyl-D-Hexosamine-Rückstände in N-Acetyl-β-D-Hexosaminides21. Β-Hexosaminidase wird zusammen mit Histamin, sondern auch mit anderen Vermittlern wie Cathepsin D oder TNF freigegeben und kann somit als Korrelat für Degranulation von mehreren Arten von sekretorischen Vesikel in MCs12,22verwendet werden.
In der beschriebenen Technik wurden bei 37 ° C mit verschiedenen Secretagogues, gefolgt von der Einschätzung der Überstände sowie Pellets von β-Hexosaminidase Inhalt durch ihre Reaktionen mit β-Hexosaminidase Substrat PMCs stimuliert. Das Substrat wurde 4-Nitrophenyl-N-Acetyl-β-D-Glucosaminide verwendet. Es wurde zu N-Acetyl-D-Glucosamin und p- Nitrophenol hydrolysiert. Die Höhe der p- Nitrophenol wurde farbmetrisch quantifiziert durch die leichte Absorption bei 405 nm. In einigen Änderungen des ß-Hexosaminidase Release Assays, 4-Methylumbelliferil-N-Acetyl -Beta- Glucosamin dient als Substrat. Nach der enzymatischen Hydrolyse generiert die Substanz fluorimetrisch nachweisbare Verbindung. Wir drückten das Ausmaß der Degranulation als prozentualer Anteil der Veröffentlichung, normiert auf den gesamten Inhalt. Dies erlaubt uns, die Variabilität von unterschiedlichen Zellzahlen und deren körnige Inhalte zwischen verschiedenen Zelle Vorbereitungen eingeführt zu vermeiden. Wir keine spontane Befreiung (beobachtet bei fehlender MCs Secretagogues) von Netto stimuliert Degranulation, subtrahieren, da eine spontane Freisetzung aufgrund seiner Bedeutung als Indikator für MC Lebensfähigkeit separat gemeldet wurde. Um hohe Variabilität in der Untersuchungsergebnisse zu vermeiden, ist es wichtig, sehr genau die Überstände und Pellets nach Zentrifugation der stimulierten Zellen zu trennen. Es ist auch wichtig, die Bildung von Bläschen in die Multi-well-Platten vor der Durchführung der farbmetrischen Messungen zu vermeiden. Eine erhebliche Einschränkung des beschriebenen Verfahrens ist, dass das Ergebnis nicht als absoluter Wert, sondern als prozentualer Anteil der veröffentlichten Mediator vertreten ist.
Im Gegensatz zu den Methoden der direkte Nachweis der freigesetzte Serotonin oder Histamin die gemeldeten Assay ist wesentlich kostengünstiger und erfordert keine spezielle Ausrüstung. Darüber hinaus die beschriebene Technik sehr reproduzierbar ist, muss nicht in einem radioaktiven Labor durchgeführt werden und erfordert nicht den Kauf von teuren Antikörper. Daher wäre es eine hervorragende Alternative zu teuren und schwierigen Techniken.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Julia Geminn für technische Hilfe bei der Vorbereitung der Mastzellen und Kultivierung zu bestätigen. Diese Arbeit wurde durch die transregionalen Sonderforschungsbereich (SFB-TR) 152 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
References
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