Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca^{2 +}-beeldvorming en degranulatie vitrotests

Summary

Hier presenteren we een protocol om te isoleren en te cultiveren lymfkliertest peritoneale mestcellen. Ook beschrijven we twee protocollen voor hun functionele karakterisering: een fluorescerende beeldvorming van intracellulaire gratis Ca^{2 +} concentratie en een degranulatie kwantitatieve analyse gebaseerd op colorimetrische kwantificering van de vrijgegeven β-hexosaminidase.

Abstract

Mastcellen (MCs), spelen als onderdeel van het immuunsysteem, een belangrijke rol bij de verdediging van de gastheer tegen diverse ziekteverwekkers en in de inleiding van de allergische reactie van het immuunsysteem. De activering van MCs via de cross-linking van oppervlak IgE bij hoge affiniteit IgE-receptor (FcεRI), maar ook via de stimulatie van verschillende andere receptoren gebonden, initieert de opkomst van de vrije intracellulaire Ca^{2 +} niveau ([Ca^{2 +}]_ik) dat bevordert de vrijlating van inflammatoire en allergische bemiddelaars/mediators. De identificatie van moleculaire bestanddelen die betrokken zijn bij deze signaalroutes is van cruciaal belang voor het begrijpen van de verordening van MC functie. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de isolatie van lymfkliertest bindweefsel type MCs door peritoneale lavage en teelt van peritoneale MCs (PMCs). Culturen van MCs uit verschillende Muismodellen van de knock-out door deze methodologie vertegenwoordigen een nuttige benadering voor de identificatie van eiwitten die betrokken zijn in MC signalering trajecten. Bovendien, we tevens een protocol voor eencellige Fura-2 imaging zoals een belangrijke techniek voor de kwantificering van Ca^{2 +} signalering in MCs. fluorescentie gebaseerde controle voor [Ca^{2 +}]_ik een betrouwbare is en veelgebruikte aanpak studie Ca^{2 +} signalering gebeurtenissen, met inbegrip van winkel bediende calcium ingang, die van het grootste belang voor de activering van de MC is. Voor de analyse van MC degranulatie beschrijven we een β-hexosaminidase release assay. Het bedrag van de β-hexosaminidase vrijgegeven in het kweekmedium is beschouwd als een degranulatie marker voor alle drie verschillende secretoire deelverzamelingen beschreven in MCs. β-hexosaminidase kan gemakkelijk worden gekwantificeerd door haar reactie met een substraat van de colorigenic in een microtiterplaat plaat colorimetrische bepaling. Deze zeer reproduceerbaar techniek is kosteneffectief en vereist geen gespecialiseerde apparatuur. Over het geheel genomen het verstrekte protocol blijkt een hoge opbrengst weergeven voor MCs uiting van typische MC oppervlakte markeringen, typische morfologische en fenotypische kenmerken van MCs en demonstreren zeer reproduceerbaar reacties op secretagogues in Ca^{2 +}- beeldvorming en degranulatie testen.

Introduction

MCs spelen een prominente rol tijdens aangeboren en verworven immuunrespons. Specifiek, MCs deelnemen aan het doden van ziekteverwekkers, zoals bacteriën en parasieten, en ook degraderen potentieel toxische endogene peptiden of componenten van de boosdoeners (voor recensie zie Galli et al. 2008¹). De fysiologische rol van MCs in aangeboren en adaptieve immuniteit is het onderwerp van een verhit debat. Daarom moeten de talrijke verschillen van de gegevens in de studies met verschillende Muismodellen van de MC-deficiënte systematische herbeoordeling van immunologische functies voor MCs buiten allergie². Volwassen MCs zijn meestal gelokaliseerd in weefsels en organen zoals de huid, longen en darmen, en bevinden zich meestal alleen in kleine aantallen in het bloed. MCs hematopoietische precursoren, zoals MC progenitorcellen, ontlenen en hun differentiatie en rijping in de microenvironments van bijna alle gevacuoliseerd weefsels¹te voltooien. Factor T-cell-derived Interleukine (IL) -3 promoot selectief de levensvatbaarheid, proliferatie en differentiatie van de bevolking van een pluripotente van muis MCs uit hun hematopoietische progenitorcellen³. Stamcel factor (SCF) wordt geproduceerd door structurele cellen in de weefsels en speelt een cruciale rol in de MC ontwikkeling, overleving, migratie en functie⁴. De eigenschappen van afzonderlijke MCs kunnen verschillen afhankelijk van hun vermogen om te synthetiseren en slaan verschillende proteasen of proteoglycans. Bij muizen, zijn de zogenaamde bindweefsel-type MCs mucosal MCs volgens hun anatomische lokalisatie, de morfologie en de inhoud van heparine en proteasen⁵onderscheiden.

In MCs, een stijging van gratis cytosolische Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_ik) is onmisbaar voor de degranulatie en productie van eicosanoiden, alsmede voor de synthese van cytokinen en activering van transcriptiefactoren in reactie op het antigeen en verschillende secretagogues⁶. Een belangrijk downstream doelwit van deze stimuli is phospholipase C, die ontstabiel phosphatidylinositol 4,5-difosfaat tot diacylglycerol (DAG) en inositol-1,4,5-trisphosphate. DAG geactiveerd proteïne kinase C en IP3 releases ionen van Ca^{2 +} van het endoplasmatisch reticulum. Uitputting van deze winkels activeert Ca^{2 +} toestroom via plasmamembraan Ca^{2 +} kanalen, wat leidt tot het opslaan van bediende calcium ingang (SOCE). Dit proces wordt opgeroepen door de interactie van de Ca^{2 +}-sensor, stromale interactie molecuul-1 (Stim1), in het endoplasmatisch reticulum met Orai1⁷ , alsook door middel van de activering van voorbijgaande receptor potentiële canonieke (TRPC) kanaal eiwitten (voor recensie zie Freichel et al. 2014⁸) in het plasma-membraan.

Om te studeren worden de fysiologische rol van deze kanalen, verschillende farmacologische (toepassing van kanaal-blokkers) of genetische benaderingen meestal gebruikt. In het laatste geval, onderdrukking van eiwit expressie wordt bereikt door zich te richten van mRNA (knockdown) of genomic DNA bewerken met globale of weefsel-specifieke⁹ schrapping van een exon codering een porie vormen subeenheid van een kanaal (knock-out). De beschikbaarheid van een blocker met voldoende specificiteit voor deze kanalen is beperkt. Daarnaast de vechtpartij aanpak vereist zorgvuldige controle van haar effectiviteit gebruikt, bijv., westelijke analyse van de vlek, en wordt gehinderd door het ontbreken van specifieke antilichamen voor de gerichte kanaal proteïne in veel gevallen. Dus, het gebruik van knock-out Muismodellen wordt nog steeds beschouwd als de gouden standaard voor een dergelijke analyse. Een voorkeur in vitro model voor het onderzoek van MC functies is de teelt van PMCs die geïsoleerde ex vivo als een volwassen populatie worden kunnen (in tegenstelling tot differentiëren MCs in vitro van, bijv., beenmergcellen)¹⁰ . In vergelijking met het beenmerg afgeleid MCs (BMMCs), die ook gebruikt zijn bij het bestuderen van MC functie in vitro, de stimulatie van FcεRI en bèta-hexosaminidase is versie verhoogd, 8-fold en 100-fold in PMCs, respectievelijk. In dit artikel beschrijven we een methode van isolatie en de teelt van lymfkliertest PMCs, die het mogelijk maakt om te verkrijgen na 2 weken voor het kweken van een groot aantal zuivere bindweefsel Typ MCs, voldoende voor verdere analyse.

Ondanks de recente vooruitgang in de ontwikkeling en toepassing van genetisch gecodeerde calcium indicatoren het gebruik ervan is nog steeds beperkt door moeilijkheden bij de levering van genen aan doelcellen, specifiek, in zeer gespecialiseerde cellen zoals primaire gekweekte MCs. Bovendien ontbreekt deze groep van fluorescerende indicatoren voor [Ca^{2 +}]_ik metingen nog steeds ratiometric kleurstoffen met een hoog dynamisch bereik. Om deze redenen is de aanbevolen methode voor meting van ratiometric [Ca^{2 +}]_ik nog steeds het gebruik van de fluorescente kleurstof "Fura-2"¹¹.

Op dit moment de meest gebruikte aanpak voor de evaluatie van de activering van de MC en degranulatie is het meten van β-hexosaminidase-activiteiten. Β-hexosaminidase, een allergische bemiddelaar, is een van de onderdelen van de MC-submodule die mede vrijgegeven met histamine is in constante verhouding van MCs¹². Β-hexosaminidase kan gemakkelijk en nauwkeurig gemeten worden door de reactie met een specifieke substraat, die produceert een meetbare hoeveelheid een colorigenic product dat gemakkelijk in een microplate colorimetrische bepaling aantoonbaar. In dit artikel, is een toepassing van deze techniek voor de analyse van PMCs degranulatie in reactie op een verscheidenheid van stimuli gemeld.

Samenvoeging van de hoge-affiniteit plasmalemmal IgE-receptor (FcɛRI) wordt geactiveerd in MCs een veelzijdige intracellulaire signalering weg, wat leidt tot een vrijval van secretoire submodule inhoud in de omliggende extracellulaire ruimte. Naast het specifieke antigeen, vele andere stimuli MCs om los van een divers scala aan immunomodulerende bemiddelaars, zoals aanvulling anafylatoxines kunnen activeren (bv., C3a en C5a)¹³, de vasoconstrictor peptide endothelin 1 (ET1)¹⁴ , als ook talrijke kationogene stoffen en drugs veroorzaken pseudoallergic Reacties (bv., icatibant)¹⁵ door binding aan MRGPRX2¹⁶. Intracellulaire signaalroutes die betrokken zijn bij MRGPR-geïnduceerde MCs degranulatie worden slecht gekenmerkt in vergelijking met FcɛRI-gemedieerde intracellulaire signalering; deze trajecten alleen gestart worden intensief bestudeerd tijdens de laatste paar jaar¹⁷ na de receptor identificatie¹⁶. Grotendeels, blijven het plasmamembraan ionenkanalen die betrokken zijn bij de ingang van calcium gevolgd door stimulatie van de MRGPRX2 om te worden begrepen. Dus, dit artikel ook focust op intracellulair calcium signalering en degranulatie van MCs gestimuleerd met MRGPR-agonisten.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Duitse wetgeving voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (officieel goedgekeurd door de regionale Raad van Karlsruhe).

1. PMC isolatie en teelt door intraperitoneaal Lavage

1	Ijs
2	10 mL spuiten
3	27 G naalden
4	20 G naalden
5	Piepschuim blok broches en pins
6	Collectie buizen (50 mL Plastic Centrifuge buizen)
7	70% ethanol
8	RPMI Medium (Pre gekoeld en bewaard op ijs)
9	PMC Medium: RPMI Medium + 20% FCS (foetaal kalfsserum) + 1% penicilline streptomycine-oplossing (Pen-Strep)
10	Dulbecco van fosfaatgebufferde zoutoplossing - DPBS (zonder Ca2 + en Mg2 +)
11	Cultuur kolven (25 cm)
12	Groeifactoren voorraad oplossingen (IL-3: 1 μg/l; SCF: 2,5 μg/mL)
13	Serologische pipetten (10 mL)
14	Pipetten tips steriele (20-200 µL)
15	Hemocytometer
16	Bank Centrifuge
17	Schaar en pincet
18	CO2 kamer voor muizen
19	Open steriele kap
20	Gesloten steriele kap
21	Cel incubator (37 ° C en 5% CO2)
22	Overdracht pipetten (20-200 µL)

Tabel 1: Materialen voor stap 1.

1. PMC isolatie door intraperitoneaal lavage
   1. Voorafgaand aan de isolatie van de cel, bereiden de in tabel 1genoemde materialen.
   2. 8 tot 14 weken oude mannelijke muizen voor PMC isolatie gebruiken. Een muis door CO₂ inademing euthanaseren, en bevestig de dood door verlies van reflexen. Spray de muis met 70% ethanol en repareren op een schuim-blok met behulp van pennen (dorsale zijde naar beneden). Verwijder de ventrale huid van de muis met behulp van de rand van de botte schaar. Te voorkomen beschadiging van de peritoneale holte.
      Opmerking: We gebruiken meestal dit protocol voor muizen met een stam van de genetische achtergrond van C57BL/6N.
   3. 7 mL van het ijskoude RPMI medium en 5 ml van de lucht in de peritoneale holte met een spuit van 10 mL uitgerust met een 27 G naald te injecteren. Duw de naald zorgvuldig in het buikvlies en doen niet alle organen perforate. Gebruik een plek in de regio van de epididymaire vet te verminderen het risico van een orgel perforatie.
   4. Na injectie, schud de muis voor 1 min om peritoneale cellen in het medium van de RPMI los te maken. Niet schudden de muis te sterk, om te voorkomen beschadiging van de interne organen en besmetten de peritoneale holte met het bloed.
   5. De 10 mL spuit hergebruik door het uit te rusten met een nieuwe 20 G canule. Verschuiving van de binnenorganen aan de ene kant door het kantelen van het schuim blok en het zachtjes tikken op de Bank middellange aspiratie om gemakkelijker te maken van de andere kant. Invoegen van een naald van 20 G, schuine rand omhoog en de vloeistof uit de buik gecombineerd voorzichtig en langzaam (~0.5 mL/s) om te voorkomen dat verstopping door de innerlijke organen. Verzamel zo veel vloeistof mogelijk (meestal 5 – 6 mL).
   6. De naald van de spuit verwijderen en de overdracht van de verzamelde celsuspensie in een collectie buis op ijs. Gooi een monsterbuisje als er zichtbaar bloed besmetting.
   7. Centrifugeer de buizen met de celsuspensie bij ~ 300 x g gedurende 5 min. Gecombineerd onder een steriele motorkap het supernatant. Voor elke muis, combineren de monster pellets in 4 mL koud (4-10 ° C) PMC Medium en overdracht de celsuspensie over in een maatkolf van 25 cm² cultuur. Voeg de groeifactoren IL-3 en SCF op de eindconcentraties 10 ng/mL en 30 ng/mL, respectievelijk. Plaats de kolf met de cellen in een incubator (37 ° C en 5% CO₂) en incubeer gedurende ~ 48 h tot en met de volgende procedure.
2. PMC cultuur
   1. Dag 2 (~ 48 h na isolatie): middellange wijzigen
      1. Schakel de cellen van het supernatant en niet-aanhanger (erytrocyten en dode cellen), gecombineerd het medium van de kolf door een Pasteur Pipetteer tip plaatsen aan de rand van de kolf en de kolf bijna horizontaal te houden. Voeg 4 mL voorverwarmde PMC Medium per muis. Toevoegen van de factoren die de groei IL-3 (10 ng/mL) en SCF (30 ng/mL). Plaats de kolf met de cellen in een incubator (37 ° C en 5% CO₂).
   2. Dag 9: Cel splitsen
      1. Breng de celsuspensie uit de cel cultuur kolf in een tube van 50 mL kunststof centrifuge. Wassen van de kolf driemaal met 10 mL pre opgewarmd (37 ° C) Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS), het verzamelen van de celsuspensie met vrijstaande cellen in de dezelfde 50 mL kunststof Centrifugeer buis. Tellen van de concentratie van de cel door een hemocytometer en berekenen van het totale aantal van de cellen.
      2. Centrifugeer de celsuspensie bij ~ 300 x g gedurende 5 min en het supernatant gecombineerd. Herstellen van de pellet in voorverwarmde PMC Medium (37 ° C) te verkrijgen van de cel concentratie 1 x 10⁶ cellen/mL. De celsuspensie overbrengen in een nieuwe cultuur maatkolf van 25 cm² . Gooi de oude kolf met fibroblasten vast te houden aan de onderkant.
      3. Toevoegen van de factoren die de groei IL-3 (10 ng/mL) en SCF (30 ng/mL), en plaats de kolf met de cellen in een incubator (37 ° C en 5% CO₂).
   3. Dagen 12-15: cel metingen
      1. Als alle experimenten met stimulatie van FcɛRI-receptoren zijn gepland, voorbehandeling de cellen overnachting met 300 ng/mL IgE anti-DNP in standaard kweekmedium. Ga verder met stap 2 of stap 3.

2. de meting van de concentratie van fluorimetrische intracellulaire vrij Calcium in PMCs

1. Voorafgaand aan de metingen, voorbereiding van de materialen die zijn vermeld in tabel 2. Ook het bereiden van een Imaging-Setup bestaande uit: omgekeerde fluorescentie Microscoop; Doelstelling: 40 X / 1.3 olieverf; Fura 2 Filter ingesteld; CCD-Camera; Excitatie lichtbron; Imaging acquisitie programma; Zwaartekracht gevoed oplossing toepassing systeem.

1	PMC (12-15 dagen oud) 1 x 106 cellen/mL
2	Concanavalin A
3	Fura-2 AM
4	Pluronic F-127 20%-oplossingligttussen
5	Cover slips glazen ronde; ø 25 mm; Nr. 1
6	Stockoplossing van DNP-HSA (dinitrofenol-menselijke serumalbumine)
7	Stockoplossing van anti-DNP-antilichamen (IgE)
8	Platte bodemplaat (12 wells)
9	Samengestelde 48/80-stockoplossing
10	Dekken goed Imaging Chambers
11	Hemocytometer
12	Overdracht pipetten (20-200 µL)

Tabel 2: Materialen voor stap 2.

2. Imaging Fura-2-voorbereiding
   1. Het uitvoeren van een telling van de cel met behulp van een hemocytometer en aanpassen van de concentratie van de cel tot 1 x 10⁶ cellen/mL. Splitsen de PMCs kolonies door zachtjes pipetteren (3-5 keer) de celsuspensie met een 1 mL pipet tip.
   2. Bereiden een Ca^{2 +}-bevattende HEPES gebufferde zoutoplossing (Ca^{2 +}- HBSS) bestaat uit 135 mM NaCl, 6 mM KCl 2 mM CaCl₂, 1,2 mM MgCl₂, 10 mM HEPES en 12 mM glucose. Breng de pH op 7.4 met 3 M NaOH.
   3. Bereiden van concanavalin A gecoate dia's door pipetting 1 druppel concanavalin A oplossing (0,1 mg/mL in H₂O) op elk 25 mm ronde cover glas onder een steriele motorkap. Laat de druppels op de cover slips voor ten minste 1 min. en deze vervolgens verwijdert de meeste van de oplossing met een pipet en laat de hoes glijdt luchtdroog voor 45 min. zorgvuldig druk de concanavalin A behandeld cover glijdt op het rubber imaging kamer (Zie Tabel van materialen) totdat zij hechten om te verkrijgen microscopie imaging kamers.
      Opmerking: Poly-L-Lysine bedekt dia's kunnen worden gebruikt als alternatief.
   4. Los van de fluorescente Ca^{2 +} kleurstof Fura-2 AM (1 mM) in dimethylsulfoxide (DMSO). Bewaar deze oplossing beschermd tegen licht.
   5. Verdun de Fura-2 AM stockoplossing in Ca^{2 +}- HBSS om een eindconcentratie van 5 µM ter voorbereiding van de "laden buffer". Te vullen met 5 µL/mL 20% pluronic F-127 in DMSO.
   6. Mix 500 µL van de "laden buffer" met 500 µL van de celsuspensie PMC. Pipetteer van het mengsel in de beeldvorming kamer en Incubeer de cellen gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
   7. Instellen van de ernst toepassing systeem met verschillende oplossingen volgens het protocol stimulatie gevoed. Aanvulling 1 spuit met 40 mL van Ca^{2 +}- HBSS oplossing 2 met 40 mL van Ca^{2 +}- HBSS oplossing met 100 ng/mL DNP syringe, syringe 3 met 40 mL van Ca^{2 +}- HBSS oplossing met 50 µg/mL samengestelde 48/80, syringe 4 met 40 mL nominaal Ca^{2 +}-gratis-HBSS oplossing, en 5 met 40 mL nominaal Ca^{2 +}syringe-gratis-HBSS oplossing 2 µM met Thapsigargin.
   8. Een 40 X hoog-diafragma olie onderdompeling doelstelling voor te bereiden door het plaatsen van een kleine daling van onderdompeling olie daarop.
   9. Mount de toepassing-systeem op het podium van de omgekeerde Microscoop. Zet de imaging zaal met de geladen cellen in het systeem van de toepassing en beveiligen om te voorkomen dat beweging tijdens de opname. Zet de doorvallend licht en focus van de cellen.
   10. Spoel de cellen drie keer met Ca^{2 +}- HBSS buffer met behulp van de zwaartekracht-gevoed toepassing systeem.
   11. Incubeer de cellen in Ca^{2 +}- HBSS voor 5 min voor Fura-2 AM ambtshalve verestering.
   12. Spoel de cellen één meer tijd voordat de beeldvorming, als u wilt verwijderen om het even welk potentieel gelekt fluorescente kleurstof.
3. Cel imaging
   1. Start het grafische programma voor de overname in de fysiologische acquisitie-modus. Open het instellingenvenster, en pas de focus en de optimale Acquisitietijd (die eveneens moet gelden voor excitatie met 340 nm en 380 nm en meestal varieert tussen 50-150 ms).
      Opmerking: Minimaliseert de blootstelling van de Fura-2 geladen cel om enig licht te vermijden photobleaching van de kleurstof.
   2. Beeld van een referentie-foto, en de cellen markeren als regio's van belang (ROI). Markeer de laatste ROI in een gebied waar geen cellen aanwezig zijn en dit gedeelte definiëren als de achtergrond.
   3. Voltooi de installatie en start de meting met een 5 s verwerving tarief.
      Opmerking: De cellen zal worden afwisselend verlicht met de lichte excitatie van 340 nm en 380 nm, en de uitgestoten fluorescentie (> 510 nm) zal worden verzameld met behulp van de CCD-camera. De beelden van de fluorescentie signalen F340 nm en F380 nm, alsmede de verhouding (F340 nm/F380 nm) zal in drie vensters worden weergegeven. De grafieken van het tijdsverloop van de intensiteit van de fluorescentie individuele ROIs betekenen waarden ook voortdurend wordt getoond.
   4. Oplossingen op het nummer van de juiste cyclus volgens het ontwerp van het experiment bijvoegen:
      1. Maatregel antigeen-geïnduceerde hoogte van [Ca^{2 +}]_ik, zoals geïllustreerd in Figuur 2A, 2B, van toepassing zijn de spuit 2 oplossing na cyclus 20, en stop opname na cyclus 150.
      2. Voor het meten van de hoogte van [Ca^{2 +}] samengestelde 48/80-geïnduceerde toepassing_i,zoals geïllustreerd in Figuur 2C, van de spuit 3-oplossing na cyclus 20, en stop opname na cyclus 150.
      3. Voor het meten van de hoogte van [Ca^{2 +}]_ik opgeroepen door SOCE, zoals geïllustreerd in Figuur 2D, breng de spuit 4 oplossing na cyclus 10, gelden de spuit 5 oplossing na cyclus 70, breng de spuit 4 oplossing na cyclus 120, Breng de spuit 1 oplossing na cyclus 150, en stoppen met opnemen na cyclus 220.
   5. Na het beëindigen van de meting, zet de resultaten in een tabel van de verhouding met de gemeten intensiteiten voor zowel excitatie golflengten met en zonder achtergrondcorrectie, evenals de waarden van de verhouding met en zonder achtergrondcorrectie voor elke ROI en elk tijdstip van de meting. In het programma van de verwerving, druk achtereenvolgens op de knoppen: "start cutter", "mark allen", "convert alle", "fysiologie metingen", "Ok,"Ok". De bestanden opslaan als tabellen en afbeeldingsstapels voor off-line analyse.

3. beta-hexosaminidase Release meting in PMCs

1	PMC (12-15 dagen oud) 1 x 106 cellen/mL
2	Stockoplossing van anti-DNP-antilichamen (IgE)
3	Stockoplossing van DNP-HSA
4	Samengestelde 48/80-stockoplossing
5	Ionomycin
6	96-wells-plaat, v-vormige bodem
7	96-wells-platen, vlakke bodem
8	Kunststof centrifuge buizen (15 mL)
9	Serologische pipetten
10	Cel incubator (37 ° C en 5% CO2)
11	Bank Centrifuge
12	Microtiterplaat afleesapparaat voor extinctie metingen
13	Meerkanaalspipet (20-200 μl)
14	Hemocytometer

Tabel 3: Materialen voor stap 3.

1. Voorafgaand aan de metingen, bereiden de in tabel 3genoemde materialen.
   Opmerking: β-hexosaminidase na hun stimulatie MCs vrijgelaten ontstabiel p-nitrofenyl-acetyl-D-glucosamine (pNAG) in p-nitrofenol en N-acetyl-D-glucosamine. Het bedrag van de β-hexosaminidase in de steekproef is evenredig aan het bedrag van de p-nitrofenol, die zal worden gevormd. In een omgeving met hoge pH van "Stop Solution" p-nitrofenol bestaat als volledig gedeprotoneerde p-nitrophenolat en kan worden gedetecteerd door de lichtabsorptie op 405 nm.
2. Bereid de Tyrode oplossing met 130 mM NaCl, 5 mM KCl₂CaCl 1.4 mM, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 5,6 mM glucose en BSA 0,1%. Breng de pH op 7.4 met 3 M NaOH.
3. Bereid de lysis-oplossing door het toevoegen van een 1% volume van Triton X-100 tot de Tyrode de oplossing.
4. Bereid de oplossing van de stop samengesteld uit 200 mM glycine en breng de pH op 10,7 met NaOH.
5. Bereid de oplossing van de oplossing (4-nitrofenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) pNAG door het oplossen van pNAG in 0.4 M citroenzuur om een eindconcentratie van 4 mM.
6. Berekent het bedrag van de cellen die nodig zijn voor de bepaling (uitvoeren van de bepaling in tweevoud). Gebruik 200.000 PMCs per putje. 2 putten gebruiken als negatieve controles (Tyrode de oplossing zonder enige secretagogues zoals DNP of samengestelde 48/80) en 2 wells als positieve controle (Tyrode de oplossing met 10 µM Ionomycin) voor elke genotype.
7. Breng de cellen in een centrifugebuis 15 mL kunststof, het volume tot 15 mL met Tyrode de oplossing en centrifugeer bij 200 x g voor 4 min. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet van Pasteur en resuspendeer de cellen in de Tyrode oplossing van 2 x 10⁶ cellen /mL.
8. 100 µL van de celsuspensie per putje overbrengen in een goed, V 96-Wells-bodemplaat. Voeg 25 µL van stimulatie of control-oplossing aan elk putje (volgens de pipetting regeling geïllustreerd in Figuur 3A). Incubeer de cellen gedurende 45 minuten bij 37 ° C en 5% CO₂.
9. Zet de reactie stop door het plaatsen van de 96-wells-plaat op het ijs gedurende 5 minuten. Vervolgens na de plaat bij 4 ° C gedurende 4 minuten op 120 x gcentrifugeren. Breng 120 µL van het supernatans dat met behulp van een meerkanaalspipet op een bodemplaat die flat-96-Wells en plaats deze op het ijs. Zorgvuldig raak de cel pellets, maar volledig gecombineerd het supernatant.
10. 125 µL van lysis buffer aan de cel pellets toevoegen. Incubeer de cel pellets gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en resuspendeer hen na de incubatie door herhaalde pipetteren (ongeveer 5 keer).
11. Pipetteer 25 µL van de oplossing van de pNAG (4 mM) in de vereiste putten van een nieuwe flat-96-Wells bodemplaat. 25 µL uit elke supernatant toevoegen aan de oplossing bereid pNAG, alsmede 25 µL van elke cel lysate.
12. Incubeer de reactie batches gedurende 1 uur bij 37 ° C. Pipetteer 150 µL van stop oplossing aan elk putje aan zet de reactie stop na de incubatie.
13. Analyseren van de plaat met een microplate-lezer met behulp van een dual-golflengte instelling op 405 nm met referentie 630 nm voor automatisch op de achtergrond aftrekken. In het programma van de verwerving, vinkt u het vakje 'Reference' en selecteer in het menu element van "Absorptie"-programma "630 nm" van het drop-down lijst. Als de optische dichtheid van de monsters te hoog is, maak een aangewezen verdunning van de sonde voor het nameten.
14. Bereken het percentage van β-hexosaminidase release volgens de volgende vergelijking:
    
    waar Release [%] het percentage van specifieke bèta-hexosaminidase release is, een [supernatant] is de achtergrond van absorptie van het supernatans dat gecorrigeerd en een [lysate] is de achtergrond van de absorptie van de corresponderende cel lysate gecorrigeerd.

Representative Results

PMCs werden geïsoleerd van 3 wild type muizen (C57BL/6N) door intraperitoneaal lavage en verdere gekweekte in RPMI medium aangevuld met 20% FCS en 1% Pen-Strep in aanwezigheid van groeifactoren (IL-3 bij 10 ng/mL) en SCF op 30 ng/mL onder steriele bevochtigde voorwaarden op 37 ° C en 5% CO₂. Het medium is gewijzigd op dag 2 en 9 na de isolatie van de cel. De morfologie van de cel werd geanalyseerd via licht DIC beeldvorming (Zie Figuur 1A, B). De cel contrast en granulariteit aangetoond dat de levensvatbaarheid van de goede cellen. Na 2 weken van kweken onder deze omstandigheden, is een homogene populatie van 1.5 x 10⁷ cellen verkregen. Stroom cytometry analyse van de cellen samen met anti-IgE antilichaam geconjugeerd met FITC gekleurd en Anti-c-Kit antilichaam geconjugeerd met PE geopenbaard 98,6% van FITC positieve en 99,8% PE positieve cellen (Figuur 1C). 98,5% van de gekweekte cellen werden dubbele positief voor FITC en PE (Figuur 1C), aan te tonen de typische kenmerken van volwassen MCs.

Voor verdere functionele analyse van de verkregen cellen, werden fluorimetrische [Ca^{2 +}]_ik metingen met behulp van Fura-2 tl indicator uitgevoerd. Fura-2 geladen cellen waren afwisselend verlicht met 340 nm en 380 nm excitatie licht elke 5 s en fluorescentie > 510 nm was geregistreerd met behulp van een CCD-camera. De verhouding van de fluorescentie (F340/F380) werd voortdurend gecontroleerd. Toepassing van DNP (100 ng/mL) naar PMC's nachts geïncubeerd met 300 ng/mL IgE anti-DNP opgeroepen een uitgesproken verhoging van het [Ca^{2 +}]_ik niveau, dat langzaam verval maximaal de helft over enkele minuten (Figuur 2A, B). Variabiliteit van cel reacties was relatief laag (Figuur 2A, B). Stimulatie van MRGPRB2 receptoren met 50 µg/mL van samengestelde 48/80 met de dezelfde tijd-protocol ook aanzienlijk toegenomen [Ca^{2 +}]_i in PMCs Fura-2-geladen met een zeer vergelijkbaar gemiddelde amplitude van het response (Figuur 2C). Voor de analyse van de SOCE in PMCs, een "opnieuw toevoeging" protocol werd toegepast: 10 cycli na het begin van de meting, externe Ca^{2 +} werd verwijderd en tijdens cycli 70 – 120, Thapsigargin (2 µM), een inhibitor van de omwenteling van het endoplasmatisch reticulum ATPase, was toegepast voor de uitputting van de intracellulaire Ca^{2 +} winkels en voor maximale activering van SOCE. De voorbijgaande [Ca^{2 +}]_ik verhoging weerspiegeld de Ca^{2 +} release van de intracellulaire Ca^{2 +} winkels in een nominaal Ca^{2 +}-vrije Bad oplossing (Figuur 2D). Herstel de externe Ca^{2 +} concentratie tot 2 mM nadat cyclus 150 in een opvallende stijging van_i niveau [Ca^{2 +}] als gevolg van de Ca^{2 +} toestroom via de kanalen van de SOCE (Figuur 2D resulteerden). Dit onderdeel van de Ca^{2 +} reactie was sterk geremd in aanwezigheid van 10 µM GSK 7975A, bekend als een CRAC-blocker, terwijl de Ca^{2 +} release van de intracellulaire Ca^{2 +} winkels bleef onveranderd (Figuur 2D ).

In de volgende stap testten we het vermogen van de geïsoleerde PMCs ondergaan degranulatie crosslinking van de FcɛRI hoge affiniteit receptoren of stimulatie van de MRGPRB2-receptoren. Voor dit doel, werd een ß-hexosaminidase release assay uitgevoerd. De cellen werden toegevoegd aan een V-bodem 96-wells-plaat (2 x 10⁵ cellen/well) en gestimuleerd volgens de regeling geïllustreerd in Figuur 3A gedurende 45 minuten bij 37 ° C. De plaat werd gecentrifugeerd en na verwijdering van de bovendrijvende substantie, de pellets waren lysed. De inhoud van de ß-hexosaminidase van individuele supernatant en pellet lysates werd geanalyseerd door hun reacties met pNAG tijdens een incubatieperiode van 1 uur bij 37 ° C. Het bedrag van de reactieproducten colorimetrisch werd ontdekt en het percentage van de vrijgegeven ß-hexosaminidase werd berekend (Zie Figuur 3B). De spontane release was zeer laag (1%), terwijl de reacties op sterke degranulatie prikkels zoals 10 µM Ionomycin en samengestelde 48/80 bij 50 µg/mL werden meer dan 40% en 60%, respectievelijk. Degranulatie reacties op DNP stimulatie waren dosisafhankelijk over het concentratiebereik van 10 tot 300 ng/mL. Samen, blijkt deze gegevens duidelijk een goede functionele staat van de geïsoleerde PMCs.

Figuur 1 : Karakterisering van primaire gekweekte lymfkliertest wild type PMCs uitgevoerd met behulp van DIC microscopie en stroom cytometry analyse. (A, B) Representatieve beelden verkregen met behulp van 20 X plasDIC doelstelling van PMCs gekweekt in 25 cm² kunststof kolven 1 h na cel isolatie door intraperitoneaal lavage (A) en op dag 9 van kweken (B). Schaal balken in de juiste lagere hoek geven 100 µm. (C) stroom cytometry analyse van PMCs (gekweekte 12 dagen volgens de hierboven beschreven protocol) mede gekleurd met anti-IgE antilichaam geconjugeerd met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en Anti-c-kit antilichaam geconjugeerd met Phycoerythrin (PE). De cel dichtheid plot is verdeeld in vier kwadranten: Q1, PE boven autofluorescence niveau/FITC onder het niveau van de autofluorescence; Q2, PE boven autofluorescence niveau/FITC boven autofluorescence niveau; Q3, PE hieronder autofluorescence niveau/FITC onder het niveau van de autofluorescence; Q4, PE hieronder autofluorescence niveau/FITC boven autofluorescence niveau. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Voor opname [Ca^{2 +}] _Ik in Fura-2 geladen PMCs geïsoleerd van wild type muizen. [Ca ^{2 +} ]_ik gepresenteerd als fluorescentie F340/F380 verhouding. (A) representatieve sporen van de [Ca^{2 +}]_ik tijdsverloop van individuele PMCs (n = 38) gestimuleerd met DNP (100 ng/mL). (B) tijdsverloop van DNP (100 ng/mL)-[Ca^{2 +}]_ik hoogte opgeroepen. Elk gegevenspunt geeft gemiddelde waarden, verkregen uit 38 afzonderlijke cellen geïllustreerd in deelvenster A. De PMCs werden 's nachts voorbehandeld met 300 ng/mL IgE anti-DNP. (C) tijdsverloop van de gemiddelde waarden van samengestelde 48/80-geïnduceerde [Ca^{2 +}]_ik hoogte in PMCs (n = 60). (D) tijdsverloop van de gemiddelde waarden van [Ca^{2 +}]_ik wijzigingen tijdens intracellulaire Ca^{2 +}-opslaan van uitputting geïnduceerd door toepassing van 2 µM Thapsigargin (Tg) in nominaal Ca^{2 +}-vrije oplossing, gevolgd door de winkel geëxploiteerd calcium instroom na opnieuw toevoeging van 2 mM Ca^{2 +} in Bad-oplossing in de controlegroep (n = 44) van de PMCs (zwarte vierkantjes) en in het bijzijn van 10 µM van GSK 7975A in de bad-oplossing (blauwe vierkantjes) (n = 41). In de B, C en D Toon de foutbalken de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Beta-hexosaminidase release colorimetrische multi goed metingen met PMCs geïsoleerd van wild type muizen. (A) stimulatie regeling van 96-wells-plaat pipetteren voor het uitvoeren van de bèta-hexosaminidase bepaling; resultaten worden gepresenteerd in deelvenster die b. "Droomvrouw" correspondeert pipetteren van Tyrode de oplossing zonder de toevoeging van een secretagogues; IM = Ionomycin; CP 48/80 = samengestelde 48/80. (B) Bar grafiek ter illustratie percentage van ß-hexosaminidase release onder basale omstandigheden (Spont), na stimulatie met Ionomycin (IM), dinitrofenol-menselijk serum albumine (DNP) en samengestelde 48/80 (Cp 48/80) met de aangegeven concentraties. De test werd uitgevoerd in tweevoud; Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

MC modellen kunnen met succes worden gebruikt om te studeren MC degranulatie chemotaxis, adhesie, alsmede over de intracellulaire signaaltransductie signaalroutes betrokken bij MC activering verhelderen. Sommige onderzoekers gebruik menselijke MCs modellen, zoals vereeuwigd lijnen (LAD2 en HMC1) of menselijke MCs afgeleid van koord bloed voorlopercellen (CD133 +) en perifeer bloed voorlopercellen (CD34 +). Anderen verkiezen knaagdier MC modellen, zoals vereeuwigd (rat basofiele leukemie RBL - 2H 3 MC lijn) of primaire gekweekt (muis bot-merg-afgeleide MCs BMMCs, PMCs) modellen. Lymfkliertest primaire MCs kunnen worden gebruikt voor het analyseren van MC functie in talrijke "knock-out" muismodellen, die de gouden standaard benadering van het onderzoek van fysiologische functies van bepaalde genen en gecodeerde eiwitten. Het tekort van farmacologische tools voor voldoende selectiviteit en potentie maakt deze methode vooral waardevol voor het onderzoek van mechanismen van signaaltransductie bij MC activering¹⁸. Lymfkliertest PMCs zijn van het bindweefsel fenotype dat een volwassen morfologie en hoge granulariteit vertoont. Zij reageren alleen niet goed op antigeen crosslinking van FcεRI zoals BMMCs, maar ook worden geactiveerd door agonisten van verschillende extra receptoren zoals endothelin 1 of samengestelde 48. Echter, het rendement van de PMCs is meestal aanzienlijk lager in vergelijking met die van BMMCs en is meestal niet voldoende om een westelijke vlek of een andere techniek die een groot aantal cellen vereist te voeren. Voor de isolatie en zuivering van PMCs zijn verschillende technieken beschreven. Bijvoorbeeld, werd Percoll kleurovergang centrifugeren gemeld aan het rendement van een hoge zuiverheid van de cellen¹⁹; het aantal cellen verkregen met deze techniek is echter meestal relatief laag. In het protocol beschreven hier, is de meest kritische stap de ambitie van de celsuspensie uit de peritoneale holte. Vermijden van vervuiling van het bloed van het monster en de maximale hoeveelheid middellange mogelijk aspirating zijn essentieel om een hoog aantal PMCs van hoge zuiverheid te verkrijgen. Met sommige stammen van de muis, een maximale PMC-nummer wordt alleen verkregen door een verkorte (11-12 dagen) kweken periode. Deze cellen in de kweekomstandigheden verlaten voor een langere tijd slechts tot een vermindering van het aantal cellen leidt.

In de huidige studie, beschrijven we een eenvoudig protocol geschikt voor de isolatie van volwassen MCs die het mogelijk maakt om het verkrijgen van een zeer zuivere MC bevolking uit de muis peritoneale holte. De verkregen cellen worden gekenmerkt door een hoge homogeniteit en vertonen de typische kenmerken van de MC, bijvoorbeeld de expressie van specifieke marker receptoren (KIT en FcεRI). Deze cellen vertonen duidelijk het kenmerk MC degranulate en verhogen hun [Ca^{2 +}]_ik in reactie tot activering van het FcɛRI en MRGPR.

MC signalering is nauw gerelateerd aan de [Ca^{2 +}]_i niveau bepaald door Ca^{2 +} release van intracellulaire winkels en Ca^{2 +} ingang via plasmamembraan kanalen. [Ca^{2 +}] _Ik hoogte activeert een complex van intracellulaire signaalroutes die trigger MC degranulatie. Net als in andere niet-prikkelbaar cellen, de belangrijkste Ca^{2 +} instroom traject in MCs is de SOCE geactiveerd door de uitputting van de Ca^{2 +}-winkels. Identificatie van de kanalen die betrokken zijn bij dit signalering traject is van cruciaal belang voor het begrijpen van de verordening van MC functie. Voor de identificatie van moleculaire bestanddelen van het SOCE traject, hebben de techniek van de microfluorometric met behulp van fluorescerende Ca^{2 +} indicatoren en de "patch-clamp" elektrofysiologische aanpak een prominente rol gespeeld. Hoogte van [Ca^{2 +}]_ik niveau is echter de som van Ca^{2 +} release en SOCE. Het zogenaamde "Ca^{2 +} opnieuw toevoeging" protocol (voor recensie zie vogel et al. 2008²⁰) was om te discrimineren deze twee fasen van Ca^{2 +} mobilisatie, eerder ontwikkeld. In dit protocol, de externe zoutoplossing is overgestapt van een normale [Ca^{2 +}]_o (1-2 mM) met een nominaal Ca^{2 +}-vrije oplossing. Onder deze omstandigheden worden de cellen behandeld met thapsigargin leeg Ca^{2 +} winkels en dus volledig activeren SOCE. Bij het ontbreken van extracellulaire Ca^{2 +}roept thapsigargin behandeling de voorbijgaande [Ca^{2 +}]_ik verhoging, als gevolg van een release van Ca^{2 +} ionen van intracellulaire Ca^{2 +} winkels. De nieuwe toevoeging van extracellulaire Ca^{2 +} leidt tot een toename van [Ca^{2 +}]_ik de SOCE vertegenwoordigen. In dit artikel presenteren we de succesvolle benutting van deze benadering voor de karakterisatie van SOCE in MCs. Als u wilt controleren [Ca^{2 +}]_ik wijzigingen, werd Fura-2 gebruikt als een indicator van calcium. In zijn acetoxymethyl vorm, kan gemakkelijk in PMCs Fura-2 worden geladen. Het gebruik van deze ratiometric kleurstof maakt de vergelijking van niet alleen de amplitudes van [Ca^{2 +}]_ik waterstand, maar ook verschillen in basale [Ca^{2 +}]_ik , die is met name belangrijk voor het analyseren van wild type/knock-out cellen. Vergeleken met genetisch gecodeerde fluorescente kleurstoffen, een van de belangrijkste nadelen van de Fura-2 is de hoge accumulatie op verschillende cellulaire organellen en aldus besmetting van de cytoplasmatische fluorescentie.

De beeldvorming Fura-2 vereist een dubbele excitatie-techniek. Het is meestal technisch veel gemakkelijker te gebruiken dan de dual emissie-techniek die niet alleen het gebruik van een geactiveerde lichtbron, maar bovendien de betrokkenheid van een filterwiel of een afbeelding splitter in de emissie lichtpad vereist. De beschreven protocol kan worden gebruikt voor Ca^{2 +} beeldvorming van andere niet-prikkelbaar cellen.

Een belangrijk kenmerk van MCs is hun hoge gehalte van het elektron-dichte secretoire korrels, die zijn gevuld met grote hoeveelheden van bemiddelaars/mediators en immunomodulerende stoffen. MC activering leidt tot een spoedige vrijlating van voorgevormde submodule verbindingen. Verschillende benaderingen te analyseren MC degranulatie in vitro zijn beschikbaar, met inbegrip van de opsporing van radiolabeled serotonine, histamine detectie met behulp van antilichamen (ELISA) en de opsporing van een stijging van het plasma membraan oppervlakte met behulp van elektrofysiologische "patch-clamp" cel precisiecapaciteit metingen. In het huidige document beschrijven we een praktische toepassing van de bepaling met behulp van multi goed colorimetrische detectie van in vitro vrijgegeven β-hexosaminidase. Deze test is gebaseerd op het vermogen van β-hexosaminidase te hydrolyseren terminal N-acetyl-D-hexosamine residuen in N-acetyl-β-D-hexosaminides²¹. Β-hexosaminidase samen met histamine, maar ook met andere bemiddelaars zoals Cathepsin D of TNF is vrijgegeven en kan dus worden gebruikt als een correlaat voor degranulatie van meerdere soorten secretoire blaasjes in MCs^12,22.

In de beschreven techniek, werden PMCs gestimuleerd bij 37 ° C met verschillende secretagogues, gevolgd door een schatting van supernatant evenals pellets van β-hexosaminidase inhoud van hun reacties met β-hexosaminidase substraat. Als het substraat, werd 4-nitrofenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide gebruikt. Het was gehydrolyseerd tot N-acetyl-D-glucosamine en p- nitrofenol. Het bedrag van de p- nitrofenol was colorimetrisch gekwantificeerd door de lichtabsorptie op 405 nm. In enkele wijzigingen van de ß-hexosaminidase release assay, 4-methylumbelliferil-N-acetyl -bèta- glucosamine wordt gebruikt als substraat. Na een enzymatische hydrolyse genereert de stof een fluorometrically detecteerbare samenstelling. We de omvang van de degranulatie uitgedrukt als een percentage van de release, genormaliseerd naar het totaalgehalte. Hierdoor konden wij voorkomen dat de variabiliteit geïntroduceerd door verschillende cel nummers en hun granulaire inhoud tussen diverse bereidingen van de cel. We deden een spontane release (waargenomen bij gebrek aan MCs secretagogues) van netto gestimuleerd degranulatie, niet aftrekken omdat een spontane release was afzonderlijk gerapporteerd als gevolg van het belang ervan als een indicator van MC levensvatbaarheid. Voorkom hoge variabiliteit in de resultaten van de test, is het belangrijk om te scheiden zeer zorgvuldig het supernatant en pellets na het centrifugeren van de cellen gestimuleerd. Het is ook essentieel om te voorkomen dat de vorming van alle bubbels in de multi goed platen voordat u de colorimetrische metingen uitvoert. Een aanzienlijke beperking van de beschreven methode is dat het resultaat niet als een absolute waarde, maar als een percentage van de vrijgegeven bemiddelaar is vertegenwoordigd.

In tegenstelling tot methoden voor directe opsporing van vrijgegeven serotonine of histamine, de gerapporteerde assay is veel kosteneffectiever en vereist geen gespecialiseerde apparatuur. Bovendien, de beschreven techniek zeer reproduceerbaar is, hoeft niet te worden uitgevoerd in een radioactieve laboratorium en hoeft niet de aankoop van dure antilichamen. Daarom zou het een uitstekend alternatief voor de meer moeilijke en dure technieken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI Medium	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Sigma-Aldrich	A6661
Anti-DNP-Antibody	Sigma-Aldrich	D-8406
Penstrep	Thermo Scientific	15140122
Compound 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	X100
4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside	Sigma-Aldrich	N9376
CoverWell Imaging Chamber	Sigma-Aldrich	GBL635051
96-Well plate, v-shaped bottom	Corning	3896
96-Well plates, flat bottom	Greiner Bio-One	655180
Microtiter plate reader with "i-control" software	Tecan	Nano Quant, infinite M200 Pro
Flat bottom plate	Greiner Bio-One	655180
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
50 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62.547.254
Culture Flasks (25 cm)	Greiner Bio-One	69160
Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1	Menzel	CB00250RA1
Hemocytometer	VWR	631-0696
Inverted Microscope	Zeiss	Observer Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil	Zeiss	440260-9900
HC Filter Set Fura 2	AHF	H76-521
CCD Camera	Zeiss	AxioCam MRm
Monochromatic Light Source	Sutter Instruments	Lambda DG-4
Imaging Acquisition Program	Zeiss	AxioVision 4.8.2
Gravity fed solution application system	Custom Made	4-channel
15 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62,554,502
Bench Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.0R