Summary
تحديد مستقبلات الدوبامين D1-ألفا في accumbens نواة أمر بالغ الأهمية لتوضيح خلل مستقبلات D1 خلال مرض الجهاز العصبي المركزي. أجرينا الحمض النووي الريبي رواية في الموقع تهجين مقايسة لتصور واحد من جزيئات الحمض النووي الريبي في منطقة محددة من الدماغ.
Abstract
في الجهاز العصبي المركزي، مستقبلات النوع الفرعي D1-ألفا (Drd1α) هي الأكثر وفرة من مستقبلات الدوبامين (DA)، الذي يلعب دوراً حيويا في تنظيم نمو الخلايا العصبية، والتنمية. ومع ذلك، الآليات الكامنة وراء شذوذ مستقبلات Drd1α وساطة الاستجابات السلوكية وتحوير وظيفة الذاكرة العاملة لا تزال غير واضحة. باستخدام الحمض النووي الريبي رواية في الموقع تهجين مقايسة، وحددت الدراسة الحالية التعبير الحمض النووي الريبي hydroxylase (TH) تيروزين ومستقبلات الدوبامين Drd1α من الدوائر ذات الصلة دا في منطقة accumbens (NAc) نواة والمنطقة الرمادية في الدماغ (دائرة الاستخبارات الوطنية)، على التوالي. يظهر التعبير Drd1α في ائتلاف البرنامج الجديد "نقطة منفصلة" تلطيخ النمط. وقد لوحظت الاختلافات بين الجنسين واضحة في التعبير Drd1α. وفي المقابل، يظهر ال نمط المصبوغة "متفاوت المسافات". فيما يتعلق بالتعبير TH، عرض إناث الفئران تعبير إشارة أعلى كل خلية بالنسبة إلى الحيوانات الذكور. الأساليب المقدمة هنا توفر تقنية تهجين رواية في عين المكان للتحقيق في أحداث تغييرات في خلل نظام الدوبامين خلال تقدم أمراض الجهاز العصبي المركزي.
Introduction
الخلل في نظام striatal الدوبامين تشترك في تطور الأعراض السريرية التي لوحظت في العديد من الأمراض عصبي. مستقبلات الدوبامين D1 موجودة في قشرة prefrontal (PFC) ومناطق سترياتال في المخ، وتؤثر بشدة على العمليات الإدراكية1، بما في ذلك العمل في الذاكرة وتجهيز الزمانية والسلوك قاطرة2،3 , 4 , 5 , 6 , 7-أوضحت الدراسات السابقة أن التغييرات من مستقبلات الدوبامين D1 ارتبطت بتطور اهتمام العجز-فرط النشاط الفوضى (إعاقة)8، أعراض عصبي في الفصام9، 10 والإجهاد قابلية11. على وجه التحديد، في مرض الفصام، أشارت دراسات التصوير المقطعي بالبوزيترون (PET) إلى أن القدرة الملزمة من مستقبلات الدوبامين D1 في كورتيسيس prefrontal عالية تتصل بالعجز الإدراكي ووجود الأعراض السلبية11. النمو الجذعية ضادات الخلايا العصبية في قشرة prefrontal ينظم مستقبلات الدوبامين D1 يخفف قابلية الإجهاد. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تعزز ضربة قاضية مستقبلات D1 في الخلايا العصبية الآنسي prefrontal القشرية (mPFC) الأبطال الاجتماعية الناجمة عن الإجهاد الهزيمة الاجتماعية12.
هنا، نحن نقدم تقنية جديدة للجيش النيبالي الملكي في الموقع التهجين لتصور واحد من جزيئات الحمض النووي الريبي في زنزانة مع عينات الأنسجة المجمدة الطازجة. هذا الأسلوب مزايا متعددة أكثر من الأساليب التي توجد داخل الأدبيات الراهنة. أولاً، الإجراء الحالي يحافظ على السياق المكاني والخصائص المورفولوجية للأنسجة وأجرى على عينات الأنسجة المجمدة الطازجة حيث أن إجراءات أخرى تتطلب الطازجة، قد يتم دمج الأنسجة غير مضمن مع الأساليب الحالية. إجراءات مماثلة في الأنسجة الثابتة الفورمالين وجزءاً لا يتجزأ من البارافين قد بينت أنه يمكن التوصل إلى حل النسخ واحد استخدام الجيش الملكي النيبالي في الموقع تهجين تقنية13. الكشف عن الحمض النووي الريبي على مستوى النسخ واحد يوفر حساسية فائقة للتعبير رقم نسخة منخفضة، فضلا عن فرصة لمقارنة التعبير الجيني على مستوى الخلايا الفردية التي لا يمكن تحقيقها بطرق الكشف عن الأحماض النووية الأخرى، مثل تقنيات بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR). بالإضافة إلى ذلك، تحتفظ الطريقة الحالية للصور مع ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء من خلال تحقيقات الجيش الملكي النيبالي محددة للغاية تهجين لنسخ الحمض النووي الريبي هدف واحد، وملزمة بالتتابع بسلسلة من الإشارات التضخيم الجزيئات في الكشف عن النظام. وأخيراً، توفر التكنولوجيا الحالية الفرصة لتقييم النظم البيولوجية متعددة مع بالمسابير الملكية محددة الهدف، بدلاً من الحد من تحقيقاتنا إلى فئة واحدة فقط من علامات المتصلة بالنظام مثل الكشف عن البروتين أساليب إيمونوهيستوتشيميستري.
في دراستنا، استخدمنا هذا الجيش الملكي النيبالي الرواية في الموقع التهجين تقييم التعبير مستقبلات Drd1α في accumbens نواة (NAc) والتعبير تيروزين hydroxylase (ال) في المادة الرمادية (دائرة الاستخبارات الوطنية) لكل من الذكور والإناث من الفئران ن F344/. الجيش الملكي النيبالي مبتكرة في الموقع التهجين مكنتنا من التحقيق آليات التأثير على امتصاص دا والإصدار دا في وقت واحد، وتحسين فهمنا لتعقيدات النظام سترياتال دا. هنا، يمكننا وصف الإجراء للدماغ مجمدة طازجة شرائح وتوفير أساليب تحليل البيانات لمختلف أنماط المصبوغة: "نقطة منفصلة" أو "مجموعات".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأقر البروتوكول التجريبي "العناية بالحيوان" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة كارولينا الجنوبية (ضمان الاتحادي رقم: A3049-01).
1-إعداد أقسام الدماغ المجمدة الطازجة
- استخدام سلالة الجرذ ن F344/: الفئران الثلاثة من كل جنس، 13 شهرا عمر، وزن حوالي 320 ز جسم.
- ضبط تركيز سيفوفلوراني إلى 5% (جرعة زائدة سيفوفلوراني). مواصلة التعرض sevoflurane بعد التنفس توقف دقيقة إضافية.
- قطع رأس الفئران وإزالة الدماغ.
- تغرق في الدماغ الفئران في النتروجين السائل لمدة 15 s ضمن 5 دقائق من الحصاد الأنسجة.
- حجته في الدماغ إلى-20 درجة مئوية في كريوستات على ح 1.
- قص 30 ميكرومتر الأقسام ونقل إلى شرائح (انظر الجدول للمواد).
- اختيار المقاطع من منطقة accumbens النواة، حوالي 2.76 مم مم 2.28 عرفت بريجما14.
- شريحة الدماغ الفئران من لمبة شمي باستمرار عبر منطقة accumbens نواة وفقا لهيكل المخ ستيريوتاكسيك الفئران.
- تحميل عينات على الشرائح. إبقاء الأبواب في-20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة حتى تجف.
- فورا تزج الشرائح في بارافورمالدهيد 4% مبردة مسبقاً ح 1 في 4 درجات مئوية.
- وضع الشرائح في تدرج إيثانول متزايد في درجة حرارة الغرفة (RT): 50% EtOH لمدة 5 دقائق؛ 70% EtOH لمدة 5 دقائق؛ و 100% EtOH لمدة 5 دقائق.
- كرر مع طازجة 100% EtOH.
- ضع الشرائح على ورقة ماصة، والهواء الجاف.
- رسم حاجزاً حول كل قسم بقلم جدار (انظر الجدول للمواد). واسمحوا الجدار جاف تماما لمدة 1 دقيقة.
2-المعالجة المسبقة لأقسام الدماغ
- قم بتشغيل الفرن وتعيين درجة الحرارة إلى 40 درجة مئوية.
- إضافة 3 قطرات (90 ميليلتر) لكاشف 4 المعالجة (انظر الجدول للمواد) في كل قسم الدماغ (مقطع واحد كل شريحة).
- احتضان الفروع لمدة 30 دقيقة في الرايت
- غمر الشرائح في برنامج تلفزيوني x 1 لمدة 1 دقيقة في تكرار الرايت مع برنامج تلفزيوني جديد x 1.
ملاحظة: ينبغي أن لا تبقى الشرائح في 1 x برنامج تلفزيوني لمدة أطول من 15 دقيقة.
3-الجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين الفلورسنت متعدد الإنزيم
- الحارة المسبار المستهدفة لمدة 10 دقائق عند 40 درجة مئوية في حمام مائي، وبارد ثم إلى الرايت
- ضع الكاشف الحمض النووي الريبي (مثلاً، أمبير فلوريدا 1-4) في الرايت
- إزالة السائل الزائد من الشرائح مع ورقة ماصة والمكان مرة أخرى على الرف الشرائح (انظر الجدول للمواد).
- إضافة 3 قطرات (90 ميليلتر) المسبار Drd1α (C1) على شريحة العينة. احتضانها ح 2 عند 40 درجة مئوية.
- غمر الشرائح في 1 × أغسل المخزن المؤقت لمدة دقيقتين في تكرار الرايت مع الطازجة 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
- إزالة السائل الزائد من الشرائح مع ورقة ماصة والمكان مرة أخرى على الرف الشرائح (انظر الجدول للمواد).
- إضافة 3 قطرات (90 ميليلتر) لامبير 1-فلوريدا على شريحة العينة. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
- غمر الشرائح الموجودة في المخزن المؤقت 1 يغسل لمدة 2 دقيقة في تكرار الرايت مع المخزن المؤقت 1wash الطازجة.
- إزالة السائل الزائد من الشرائح مع ورقة ماصة والمكان مرة أخرى على الرف الشرائح (انظر الجدول للمواد).
- إضافة 3 قطرات (90 ميليلتر) لامبير 2-فلوريدا على شريحة العينة. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
- غمر الشرائح في 1 × أغسل المخزن المؤقت لمدة دقيقتين في تكرار الرايت مع الطازجة 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
- إزالة السائل الزائد من الشرائح مع ورقة ماصة والمكان مرة أخرى على الرف الشرائح (انظر الجدول للمواد).
- إضافة 3 قطرات (90 ميليلتر) لامبير 3-فلوريدا على شريحة العينة. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
- غمر شرائح 1 × أغسل المخزن المؤقت لمدة 2 دقيقة في تكرار الرايت مع الطازجة 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
- إزالة السائل الزائد من الشرائح مع ورقة ماصة والمكان مرة أخرى على الرف الشرائح (انظر الجدول للمواد).
- إضافة 3 قطرات (90 ميليلتر) لامبير 4-فلوريدا-البديل ألف على شريحة العينة. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
- غمر الشرائح في 1 × أغسل المخزن المؤقت لمدة دقيقتين في تكرار الرايت مع الطازجة 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
- إزالة السائل الزائد من الشرائح وفورا بوضع 2 قطرات كاشف المتصاعدة (انظر الجدول للمواد) على كل قسم.
- ضع ساترة 22 ملم 22 ملم (انظر الجدول للمواد) على كل قسم الدماغ.
- تخزين الشرائح في الظلام في 2-8 درجة مئوية حتى الجاف.
- قم بتشغيل المجهر [كنفوكل] وقم بالتبديل إلى هدف X 60.
- الحصول على الصور Z-مكدس مع مجهر [كنفوكل]. مشاهدة الفيديو تكميلية على إجراء تفصيل لتصوير [كنفوكل].
- الحصول على صور Drd1α تسمية الخلايا في منطقة accumbens نواة (الإثارة: 488 نانومتر؛ الانبعاثات: 515/30 نانومتر).
ملاحظة: لا تدع الدماغ المقاطع تجف بين الخطوات الحضانة.
4. تحليل البيانات
- شبه كمي تحليل نمط المصبوغة: "نقاط منفصلة".
- لتحديد الخلية الفردية من الصورة، نفذ DAPI تلطيخ كعلامة نووية. ومع ذلك، من الصعب لا يزال تحليل بعض أجزاء من أنسجة المخ نظراً لأنه يحتوي على أنواع متعددة من الخلايا بشكل منتظم من الأنوية و/أو خلايا. هنا، تعيين اثنين من الباحثين ذوي الخبرة بشكل منفصل كل خلية من الصور لتعريف المنطقة الخلية.
- نقاط بصريا كل خلية داخل الصور [كنفوكل] الممثل على أساس العدد النقاط لكل خلية باستخدام معايير محددة (الشكل 1B).
- تحديد عدد الخلايا الإجمالي في كل فئة والقسمة على عدد الخلايا الإجمالية x100 لإنشاء الرسومات التواتر النسبي لعرض نسبة تواتر الخلايا داخل كل فئة لجميع أقسام الأنسجة (الشكل 2A)، والذكور والإناث بشكل منفصل (الشكل 2E).
- تقسيم مجموع الخلايا داخل جميع التصنيفات السابقة حسب عدد الخلايا الإجمالية x100 لتحديد تواتر التراكمي للخلايا لجميع أقسام الأنسجة (الشكل 2) وللذكور والإناث على حدة (الشكل 2 واو).
- تحليل إحصائيا "النقاط المنفصلة" تلطيخ نمط (اختياري).
- فحص عدد النقاط لكل خلية لتقديم متغير قاطع ترتيبي في الطبيعة (أي عدد الخلايا التي تندرج في كل فئة من فئات التصنيف من أدنى خلية التعبير (1) إلى أعلى الخلية التعبير (9)) لمزيد من التحليلات الإحصائية.
- بعد دراسة لإحصاءات وصفية، استخدام الطرق الرئيسية الثلاث: إحصاء رف-هاينسزيل، واختبار مان-ويتني U، واختبار كروسكال-واليس. على الرغم من أن النهج الإحصائي الدقيق سيتوقف على مسألة الفائدة، شجرة قرار إحصائية (الشكل 4) التصميم والبحوث التجريبية قد تساعد في اتخاذ القرارات فيما يتعلق بالنهج التحليلي.
- قياس كثافة إشارة في المنطقة لمصلحة (ROI) لتلوين النقش: "مجموعات".
- حساب كثافة إشارة لكل صورة باستخدام المعادلة التالية:
إشارة كثافة = مجموع كثافة الصورة عائد الاستثمار-(مساحة الصورة الإجمالية × كثافة الخلفية متوسط) - حساب إجمالي عدد الخلايا داخل الصورة عائد الاستثمار لحساب التعبير إشارة تقريبية كل خلية. مجموعة الاختلافات في كثافة إشارة/الصورة، فضلا عن العدد من الخلايا/صورة قد تكون ذات فائدة للنظر في الآليات التي قد تساهم الاختلافات الفريق ينظر في التعبير إشارة/الخلية (الشكل 3B-3D).
- حساب كثافة إشارة لكل صورة باستخدام المعادلة التالية:
- تحليل إحصائيا "المجموعات" تلطيخ نمط (اختياري).
- دراسة التعبير/الخلية إشارة إلى تقديم متغير مستمر لمزيد من التحليل الإحصائي. استخدام نهجين اثنين، بما في ذلك عينة مستقلة اختبار t وتحليل التباين (ANOVA)، استناداً إلى العدد من العوامل من بين المواضيع المدرجة في التصميم. شجرة قرار إحصائية (الشكل 4) قد تساعد في اتخاذ القرارات فيما يتعلق بالنهج الإحصائية الأكثر ملاءمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ولاحظت الدراسة الحالية "نقاط منفصلة" تلطيخ نمط التعبير الجيش الملكي النيبالي بمستقبلات الدوبامين D1-ألفا (Drd1α) في ائتلاف البرنامج الجديد في الفئران F344/N (الشكل 1A). إشارات fluorescence الفردية تم التعرف عليها بسهولة، ويمكن اعتبار واحد "النقاط"، يمثل كل منها نسخة الحمض النووي الريبي واحدة داخل الخلية. للصور من ائتلاف البرنامج الجديد أن عرض "النقاط المنفصلة" تلطيخ نمط، قمنا بتقييم النطاق الديناميكي للتعبير باستخدام تحليل شبه كمي (الشكل 1A، الشكل 2 ألفو 2 باء). وقد سجل كل خلية من "0-9" استناداً إلى العدد النقاط لكل خلية. هذا "إشارة المهجن"-نقاط الأسلوب (ح-نقاط) يمكن وبالتالي تقييم مدى وتقلبه للتعبير Drd1α عبر الخلايا الفردية.
ويوفر نهج "نقطة منفصلة" تلطيخ نمط شبه كمي متغير قاطع ترتيبي في الطبيعة (أي عدد النقاط لكل خلية في المرتبة الدنيا من (1) إلى أعلى (9)) لمزيد من التحليل الإحصائي. في الدراسة الحالية، ونحن مهتمون بدراسة أثر عامل واحد بين المواضيع (أي الجنس) على التعبير Drd1α في ائتلاف البرنامج الجديد. لحساب هيكل البيانات المتداخلة (أي، تم الحصول على صورتين Z-كومة من Drd1α تسمية الخلايا في ائتلاف البرنامج الجديد لكل الحيوانات)، حساب متوسط القيم المحسوبة لكل فئة والمستخدمة للتحليل الإحصائي (الذكور: n= 3، أنثى: n = 3). ونظرا لاهتمامنا بدراسة الاختلافات في عامل واحد بين المواضيع (أي الجنس) مع مجموعتين (أي، ذكر، أنثى) يو مان-ويتني اختبار أجرى تقييم الفروق في عدد الخلايا الوسطية (الشكل 2D). وكشف اختبار مان-ويتني U أثر الرئيسي كبير من الجنس [z=-5.8، ف≤0.001]، مع أنثى الحيوانات عرض خلية متوسط انخفاض درجة بالنسبة إلى الحيوانات الذكور. 2E الشكل و 2 واو توضيح تواتر خلايا في كل فئة باستخدام أسلوبين: التواتر النسبي والتردد التراكمي. عرض أنثى الحيوانات تحولاً كبيرا في التوزيع، مع تردد أكبر من الخلايا في فئات مرتبة أقل بالنسبة للذكور من الحيوانات. وأجرى اختبار هاينسزيل رف رابطة إحصائيا دراسة التوزيع، والكشف عن أثر كبير من الجنس [χ2MH(1) = 67.3، ≤0.001 ف]. وهكذا، وبوجه عام، تشير النتائج إلى الاختلافات بين الجنسين واضحة في التعبير Drd1α في ائتلاف البرنامج الجديد.
في الحالات التي يكون فيها عدد نسخة من محضر عالية جداً، يمكن أن تظهر الإشارات كمجموعات. هنا، أظهرت تيروزين hydroxylase التعبير (ال) في منطقة دائرة الاستخبارات الوطنية "المجموعات" تلطيخ نمط (الشكل 3A). لتحديد مقدار هذا علامة الإعراب عن عالية، نحن أولاً متوسط كثافة الخلفية من ثمانية مجالات أساسية مختلفة. بعد تحديد عتبة أدنى كثافة أعلى كثافة متوسط الخلفية، وقد تم تحليل كثافة الصورة المعدلة كإشارة كل خلية من ث.
نظراً لاهتمامنا بدراسة عامل واحد بين المواضيع (أي الجنس)، واختبار عينات مستقلة تي نهج إحصائية مناسبة. وكانت البيانات للتحليل، وحولت السجل. لحساب هيكل البيانات المتداخلة (أي، تم الحصول على صورتين Z-مكدس ال تسمية الخلايا في دائرة الاستخبارات الوطنية لكل الحيوانات)، حساب متوسط القيم والمستخدمة للتحليل الإحصائي (الذكور: n= 2، أنثى: n= 3). عرض الحيوانات الإناث زيادة كبيرة في إشارة متوسط الشدة (الشكل 3B)، توحي بمستوى أعلى من مجموع ال التعبير، بالنسبة إلى الحيوانات الذكور (t(3) = 3.3، ≤0.05 ف). ومع ذلك، لوحظت أي فروق الجنس كبيرة في أما عدد الخلايا كل صورة (t(3) = 2.0, p> 0.05؛ الرقم 3) أو يعني إشارة تعبير كل خلية (تي(3) = 2.0, p> 0.05؛ 3D الشكل). ANOVA تصميم مختلطة، النظر في التدابير الثلاثة كعامل في هذا الموضوع، كما كشفت أثر الرئيسي كبير من الجنس [و (1، 3) = 10.6، ≤0.05 ف].
رقم 1: معايير لتحليل شبه كمي في متوسط عدد النقاط لكل خلية لتلطيخ نمط: "النقاط المنفصلة". ألف الصور [كنفوكل] الممثل (60 X) التعبير Drd1α في درجات مختلفة (تضخيم حجم 250% نسبة إلى حجم الصورة الأصلي) باء فئة "نقاط" محددة لكل معيار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مستوى الدوبامين D1-ألفا مستقبلات (Drd1α) الجيش الملكي النيبالي في المنطقة Accumbens نواة من الفئران ن F344/- أ % التواتر النسبي لكل فئة من فئات "نقاط". باء منحنى استجابة لجرعة سيجمويدال المقدمة تناسب وصف جيدا (ص2= 0.99) مع فواصل الثقة 95% (CI؛ هو مبين بالخطوط المنقطة) كان يصلح لل % التردد التراكمي لكل فئة من فئات "نقاط". جيم الممثل [كنفوكل] الصور (60 X) التعبير Drd1α في الفئران الذكور والإناث، التي لها "النقاط المنفصلة" تلطيخ النمط. د الرسم البياني الممثل لدرجة يعني خلية في الفئران الذكور والإناث. أشرطة الخطأ الوقوف للخطأ المعياري للوسط (SEM). هاء % التواتر النسبي لكل فئة من فئات "نقاط"، مقارنة التعبير في الأنسجة من الفئران الذكور والإناث. واو منحنيات الاستجابة للجرعة سيجمويدال المقدمة تناسب وصف جيدا (r2s = 0.99) مع فواصل الثقة 95% % التردد التراكمي لكل فئة من فئات "نقاط" بين الفئران الذكور والإناث. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تيروزين hydroxylase الحمض النووي الريبي مستوى (ال) في المنطقة "الرمادية في الدماغ" (الاستخبارات) في الفئران ن F344/- ألف الصور [كنفوكل] الممثل (60 ×؛ الإثارة: 543 نانومتر؛ الانبعاثات: 590/50 نانومتر) TH التعبير في الفئران الذكور والإناث، التي لها "المجموعات" تلطيخ النمط. ب-دال الممثل تحليل كثافة إشارة لكل خلية. يشير التعبير/خلية يمكن أن يستمد من قياس كثافة إشارة للصورة (مع مجموعة عتبة كثافة أعلى الخلفية) وتقسيمه على عدد الخلايا الموجودة داخل الصورة. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط (SEM). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: المقرر شجرة للتحليل الإحصائي الموصى به- شجرة قرار يوفر مبادئ توجيهية لتحديد التحليل الإحصائي الذي هو الأكثر ملاءمة للبحث مسألة الفائدة. شجرة القرارات ليست شاملة، وغيرها من التحليلات وفي بعض الحالات، قد يكون مناسباً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، يمكننا وصف تقنية رواية من التهجين في الموقع لشرائح مجمدة طازجة الدماغ لتقييم التعبير مستقبلات Drd1α في accumbens نواة (NAc) والتعبير تيروزين hydroxylase (ال) في المنطقة الرمادية في الدماغ (دائرة الاستخبارات الوطنية). كما نقوم بتوفير أساليب تحليل البيانات لمختلف أنماط المصبوغة: "نقطة منفصلة" أو "مجموعات".
خطوات حاسمة الأسفار تعدد الإرسال ناجحة الجيش الملكي النيبالي في الموقع مقايسة تهجين يتم تضمين. بمجرد قطع الفئران وإزالة الدماغ، وتجميد الدماغ في النتروجين السائل داخل الحد الأدنى 5 إبقاء أقسام الدماغ في-20 درجة مئوية حتى التثبيت بارافورمالدهيد 4%. وبعد 30 دقيقة الحضانة للمعالجة المسبقة 4، ينبغي أن لا تبقى الشرائح في 1 x برنامج تلفزيوني لمدة أطول من 15 دقيقة. لا تدع الدماغ المقاطع تجف بين الخطوات التضخيم. تصوير [كنفوكل] مفيد جداً لتوفير صور عالية الجودة تظهر إشارات المصبوغة واضحة في عينة الأنسجة. استخدام الفرن التهجين بسرعة وكفاءة تقديم العينات إلى 40 درجة مئوية.
واعتبرت الإشارات الفردية fluorescence التعبير مستقبلات Drd1α في ائتلاف البرنامج الجديد واحد "النقاط" يمثل كل منها نسخة الحمض النووي الريبي واحدة داخل الخلية. الأهم من ذلك، يعكس حجم "النقطة" الاختلافات في ظروف المقايسة وإعداد العينات، وأخرى عوامل بدلاً من مستويات التعبير Drd1α-الجيش الملكي النيبالي. وبالمثل، كثافة إشارة فردية "النقاط" ليس لها صلة بمستويات التعبير Drd1α-الجيش الملكي النيبالي. قمنا بتقييم النطاق الديناميكي لهذا التعبير كإجراء تحليل شبه كمي وسجل مع "0-9" استناداً إلى العدد النقاط لكل خلية، مما يمكن تقييم مدى وتقلبه للتعبير Drd1α. وعلاوة على ذلك، يوفر دراسة عدد من النقاط لكل خلية متغير قاطع لمزيد من التحليلات الإحصائية.
وعقب النظر في إحصاءات وصفية، توصي بروتوكولنا النهج الرئيسية الثلاثة لتحليل الإشارات التي تمثل "نقطة منفصلة" تلطيخ النمط، الذي يوفر متغير ترتيبي لمزيد من التحليل إحصائيا. على وجه التحديد، يوصي باختبار مان-ويتني U nonparametric واختبار كروسكال-واليس nonparametric واختبار هاينسزيل رف للرابطة. اختبار كروسكال-واليس واختبار مان-ويتني U أنسب عند دراسة واحدة فقط بين-مواضيع عامل (مثل الجنس). بالإضافة إلى ذلك، قد يكون من المناسب لدراسة التغيرات في التوزيع اختبار هاينسزيل رف للرابطة. تحليلات إحصائية أكثر تعقيداً، بما في ذلك معادلة تقدير المعمم أو نموذج مختلط الخطي عامة قد يكون مناسباً عندما عوامل إضافية يتم تضمين. التوصيات ليست حصرية، والنهج الإحصائي الدقيق سوف تعتمد على التصميم التجريبي والبحث مسألة الفائدة.
ومع ذلك، في الحالات التي يكون فيها عدد نسخة من محضر عالية جداً، يمكن أن تظهر الإشارات كمجموعات. هنا، أظهر التعبير ال في منطقة دائرة الاستخبارات الوطنية "المجموعات" تلطيخ النمط. لتحديد علامة ال معربا عن عالية، علينا تعديل كثافة الصورة استناداً إلى تحديد عتبة أدنى كثافة أعلى كثافة الخلفية متوسط، وتحليلها كإشارة كل خلية من ث. الإشارات التي تمثل "الكتلة" تلطيخ النمط، مثل ال في دائرة الاستخبارات الوطنية، يمكن تحليلها إحصائيا باستخدام مستقلة عينات تي-الاختبارات أو ANOVA للمقارنة بين المجموعات.
وهناك قيود من هذا الجيش الملكي النيبالي الرواية في عين المكان فحص التهجين. أجل "نقطة منفصلة" تلطيخ نمط، تشمل هذه كيفية تحديد خلية مفردة أكثر دقة. في هذه الدراسة، لتحديد الخلية الفردية من الصورة، أجرينا DAPI تلطيخ كعلامة نووية. ومع ذلك، من الصعب لا يزال تحليل بعض أجزاء من أنسجة المخ نظراً لأنه يحتوي على أنواع متعددة من الخلايا مع الأشكال غير النظامية من الأنوية و/أو خلايا. هنا، تعيين اثنين من الباحثين ذوي الخبرة بشكل منفصل كل خلية من الصور لتحديد منطقة الخلية. "مجموعات" تلطيخ نمط، ينبغي اختيار برامج معينة لإعداد عتبة أو هي خلية التلقائي.
وهكذا، الحمض النووي الريبي مبتكرة في الموقع المقايسة التهجين مكنتنا من التحقيق آليات التأثير على امتصاص دا والإصدار دا في وقت واحد، وتحسين فهم تعقيدات النظام سترياتال دا. عموما، سيستفيد الباحثون من الحمض النووي الريبي الرواية في الموقع تقنية التهجين عند التحقيق مختلة التغييرات على علامات تتميز أثناء ظهور وتطور اضطرابات الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا يوجد أي تضارب في المصالح تعلن.
Acknowledgments
ودعمت الأعمال الحالية بالمعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) المنح HD043680، MH106392، DA013137، و NS100624. صندوق جزئية قدمت منحة تدريب T32 المعاهد الوطنية للصحة في مجال العلوم الطبية الحيوية-السلوكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe - Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
| RNAscope Probe - Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |
References
- Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
- Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
- Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
- Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).
- Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neuroscience. 255, 246-254 (2013).
- Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
- Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
- Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).
