Summary
Identificación del receptor de dopamina D1-alfa en el Núcleo accumbens es fundamental para clarificar la disfunción del receptor D1 durante una enfermedad del sistema nervioso central. Se realizó un análisis para un RNA nuevo en situ hibridación para visualizar solo moléculas de ARN en un área específica del cerebro.
Abstract
En el sistema nervioso central, el receptor del subtipo de D1-alfa (Drd1α) es el receptor más abundante de dopamina (DA), que desempeña un papel vital en la regulación del desarrollo y el crecimiento neuronal. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a las anormalidades del receptor Drd1α mediar las respuestas del comportamiento y la modulación de la función de memoria de trabajo aún no están claros. Usando un análisis nuevo RNA en situ el hibridación, el estudio actual identificado dopamina Drd1α del receptor y la tirosina hidroxilasa (TH) RNA expresión de circuitos relacionados con la DA en el Núcleo accumbens (NAc) área y región de nigra del substantia (SNR), respectivamente. Expresión de Drd1α en el NAc muestra un "punto discreto" patrón de tinción. Se observaron diferencias de sexo claro en la expresión de Drd1α. Por el contrario, TH muestra un patrón de coloración "cluster". En cuanto a la expresión de TH, ratas hembra muestran una mayor expresión de la señal por la célula en relación con los animales masculinos. Los métodos presentados aquí ofrecen una técnica novedosa en situ hibridación para investigar cambios en la disfunción del sistema dopamina durante la progresión de enfermedades del sistema nervioso central.
Introduction
Disfunción del sistema de dopamina estriatal está implicada en la progresión de los síntomas clínicos observados en múltiples enfermedades neurocognitivas. Los receptores D1 de dopamina están presentes en la corteza prefrontal (PFC) y regiones estriadas del cerebro y fuertemente influyen en procesos cognitivos1, incluyendo memoria, el procesamiento temporal y comportamiento locomotor2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. estudios anteriores aclaran que los cambios de los receptores de dopamina D1 se asocian con la progresión de atención e hiperactividad déficit trastorno (TDAH)8, los síntomas neurocognitivos en la esquizofrenia9, 10 y estrés sensibilidad11. Específicamente, en la esquizofrenia, estudios de tomografía por emisión de positrones (PET) indican que la capacidad de unión de los receptores D1 de dopamina en las cortezas prefrontales muy fue relacionado con déficit cognoscitivo y la presencia de síntomas negativos11. El crecimiento dendrítico de las neuronas excitatorias de la corteza prefrontal, regulado por el receptor de dopamina D1 alivia la susceptibilidad al estrés biológico. Además, la caída del receptor D1 en las neuronas corticales prefrontal medial (mPFC) podría mejorar la derrota social evitación social inducida por estrés12.
Aquí, presentamos una nueva técnica de RNA en situ hibridación para visualizar solo moléculas de ARN en una célula con las muestras de tejido fresco congelado. La presente técnica tiene varias ventajas sobre los métodos que existen en la literatura actual. En primer lugar, el procedimiento actual conserva el contexto espacial y morfológico de los tejidos y se realizó en muestras de tejido fresco congelado para que otros procedimientos que requieren la fresca, los tejidos no incrustados pueden combinarse con los métodos actuales. Procedimientos similares en los tejidos fijados con formol y embebido en parafina han ilustrado que resolución de transcripción solo se puede conseguir usando una RNA en situ hibridación técnica13. Detección de RNA en el nivel de transcripción solo ofrece una sensibilidad superior a baja copia número expresión así como la oportunidad de comparar la expresión génica a nivel de células individuales que no pueden lograrse por otros métodos de detección de ácidos nucleicos, como técnicas de reacción en cadena (PCR) polimerasa. Además, el método actual mantiene imágenes con un alto cociente signal-to-noise a través de sondas muy específicas de RNA que son hibridadas de las transcripciones del RNA solo objetivo y secuencialmente vinculadas con una cascada de moléculas de amplificación de señal en la detección sistema. Finalmente, la tecnología actual ofrece la oportunidad de evaluar varios sistemas biológicos con sus sondas propietarias específico del destino, en lugar de limitar nuestra investigación a sólo una clase de marcadores relacionados con el sistema tales como la detección de proteínas por métodos de inmunohistoquímica.
En nuestro estudio, utilizamos esta novela RNA en situ hibridación para evaluar Drd1α la expresión del receptor en el Núcleo accumbens (NAc) y la tirosina hidroxilasa (TH) expresión en el nigra del substantia (SNR) de ratas de F344/N machos y hembras. La innovadora RNA en situ hibridación nos permitió investigar los mecanismos que influyen en la absorción DA y DA liberación simultáneamente, mejorando nuestra comprensión de la complejidad del sistema estriado DA. Aquí, describimos el procedimiento para el cerebro congelado rodajas y proporcionar métodos de análisis de datos para diferentes patrones de tinción: "punto discreto" o "clusters".
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Protocol
El protocolo experimental fue aprobado por el cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en la Universidad de Carolina del Sur (número de garantía federal: A3049-01).
1. preparación de secciones del cerebro congelado fresco
- Utilizar la cepa de ratas de F344/N: tres ratas de cada sexo, 13 meses de edad, aproximadamente 320 g del peso del cuerpo.
- Ajustar la concentración de sevoflurano al 5% (sobredosis de sevoflurano). Continúa exposición de sevoflurano después detiene por un minuto adicional.
- Decapitar a la rata y quitar el cerebro.
- Sumergir el cerebro de la rata en nitrógeno líquido durante 15 s a 5 min de la cosecha de tejido.
- Equilibrar el cerebro a-20 ° C en un criostato para 1 h.
- Cortar 30 μm secciones y transferir a diapositivas (véase Tabla de materiales).
- Elegir las secciones de la región de accumbens del núcleo, aproximadamente 2,76 mm a 2,28 mm anterior Bregma14.
- Cortar continuamente el cerebro de la rata del bulbo olfatorio a través de la región de accumbens del núcleo según la estructura de estereotáctica cerebral de la rata.
- Montaje de muestras en las diapositivas. Mantener las secciones a-20 ° C por 10 min secar.
- Inmediatamente sumerja los portaobjetos en el pre enfriado paraformaldehído al 4% durante 1 h a 4 ° C.
- Coloque los portaobjetos en un gradiente creciente de etanol a temperatura ambiente (RT): 50% EtOH por 5 min; 70% EtOH por 5 min; y 100% EtOH durante 5 minutos.
- Repita con fresco 100% EtOH.
- Coloque los portaobjetos en un papel absorbente y secar al aire.
- Dibujar una barrera alrededor de cada sección con un lápiz de la barrera (véase Tabla de materiales). Deje que se seque completamente durante 1 min la barrera.
2. pretratamiento de las secciones de la cerebral
- Encender el horno y la temperatura a 40 ° C.
- Añadir 3 gotas (90 μl) del reactivo 4 pretratamiento (véase Tabla de materiales) en cada sección del cerebro (una parte por diapositiva).
- Incubar las secciones por 30 min a TA.
- Sumerja los portaobjetos de 1 x PBS durante 1 min a RT. repetir con frescos de 1 x PBS.
Nota: Los portaobjetos no deben permanecer en PBS 1 x durante más de 15 minutos.
3. ARN In Situ hibridación fluorescente Multiplex ensayo
- Caliente la punta de prueba del objetivo por 10 min a 40 ° C en un baño de agua y luego enfriar a RT.
- Colocar el reactivo RNA (por ejemplo, Amp FL 1-4) a TA.
- Quitar exceso de líquido de portaobjetos con papel absorbente y coloque nuevamente sobre la parrilla corrediza (véase Tabla de materiales).
- Añadir 3 gotas (90 μl) de sonda Drd1α (C1) en el segmento de muestra. Incubar por 2 h a 40 ° C.
- Sumerja el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado durante 2 minutos en RT. repetir con fresco 1 x de tampón de lavado.
- Quitar exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y coloque nuevamente sobre la parrilla corrediza (véase Tabla de materiales).
- Añadir 3 gotas (90 μl) de Amp 1-FL en el segmento de muestra. Incubar durante 30 min a 40 ° C.
- Sumerja el portaobjetos en el tampón de 1 lavado por 2 min en RT. repetir con el almacenador intermediario fresco 1wash.
- Quitar exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y coloque nuevamente sobre la parrilla corrediza (véase Tabla de materiales).
- Añadir 3 gotas (90 μl) de Amp 2-FL en el segmento de muestra. Incubar por 15 min a 40 ° C.
- Sumerja el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado durante 2 minutos en RT. repetir con fresco 1 x de tampón de lavado.
- Quitar exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y coloque nuevamente sobre la parrilla corrediza (véase Tabla de materiales).
- Añadir 3 gotas (90 μl) de 3 Amp-FL en el segmento de muestra. Incubar durante 30 min a 40 ° C.
- Sumerja el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado durante 2 min a RT. repetir con fresco 1 x de tampón de lavado.
- Quitar exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y coloque nuevamente sobre la parrilla corrediza (véase Tabla de materiales).
- Añadir 3 gotas (90 μl) de Amp 4-FL-Alt A en el segmento de muestra. Incubar por 15 min a 40 ° C.
- Sumerja el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado durante 2 minutos en RT. repetir con fresco 1 x de tampón de lavado.
- Quitar exceso de líquido de diapositivas e inmediatamente Coloque 2 gotas de reactivo de montaje (véase Tabla de materiales) en cada sección.
- Coloque un cubreobjetos de 22 mm 22 mm (véase Tabla de materiales) en cada sección del cerebro.
- Almacenar diapositivas en la oscuridad a 2-8 ° C hasta que se seque.
- Encienda el microscopio confocal y cambiar a un objetivo X 60.
- Obtener imágenes Z-stack con un microscopio confocal. Ver el video suplementario para un procedimiento de detalle de la proyección de imagen confocal.
- Adquisición de imágenes de Drd1α etiquetado de células en la región de accumbens del núcleo (excitación: 488 nm; Emisión: 515/30 nm).
Nota: No deje que el cerebro las secciones secan entre pasos de incubación.
4. Análisis de datos
- Semi-cuantitativamente analizar el patrón de tinción: "puntos discretos".
- Para identificar la celda individual de la imagen, realizar tinción DAPI como marcador nuclear. Sin embargo, es todavía difícil de analizar ciertas partes del tejido cerebral ya que cuenta con varios tipos de células con forma irregular de los núcleos o células. Aquí, dos investigadores experimentados asignan por separado cada célula de imágenes para definir la región de la célula.
- Marcar visualmente cada célula dentro de las imágenes confocales representativas basadas en el número de puntos por celular usando los criterios específicos (figura 1B).
- Determinar el número total de células en cada categoría y dividir por el número total de la célula x100 para crear gráficos de frecuencia relativa que muestra la frecuencia porcentual de células dentro de cada categoría para todas las secciones de tejido (figura 2A) y para machos y hembras por separado (Figura 2E).
- Dividir la suma de las células en todas las categorías anteriores por el número total de la célula x100 para determinar la frecuencia acumulativa de las células para todas las secciones de tejido (figura 2B) y para machos y hembras por separado (figura 2F).
- Analizar estadísticamente los "puntos discretos" (opcional) del patrón de coloración.
- Examinar el número de puntos por la célula para proporcionar una variable categórica que es ordinal en naturaleza (es decir, el número de células que caen en cada categoría de fila de menor expresión de células (1) a la más alta expresión de la célula (9)) para más análisis estadísticos.
- Tras un examen de estadística descriptiva, usar tres enfoques principales: una estadística de Mantel-Haenszel, una prueba U de Mann-Whitney y una prueba de Kruskal-Wallis. Aunque el enfoque estadístico exacto dependerá la pregunta de investigación y diseño experimental de interés, un árbol de decisión estadística (figura 4) puede ayudar en la toma de decisiones con respecto a su enfoque analítico.
- Cuantificar la intensidad de la señal en la región de interés (ROI) para el patrón de tinción: "clusters".
- Calcular la intensidad de la señal de cada imagen utilizando la siguiente ecuación:
Intensidad de la señal = intensidad Total de ROI imagen - (fondo media intensidad × imagen Total área) - Contar el número total de células dentro de la imagen ROI para calcular la expresión aproximada de la señal por la célula. Grupo diferencias en intensidad de señal e imágenes así como el número de células, imagen pueden ser de interés considerar mecanismos que pueden contribuir a las diferencias de grupo en señal expresión celular (figura 3B-3D).
- Calcular la intensidad de la señal de cada imagen utilizando la siguiente ecuación:
- Analizar estadísticamente los "clusters" (opcional) del patrón de coloración.
- Examinar la expresión/célula de la señal para proporcionar una variable continua para su posterior análisis estadístico. Uso dos enfoques, incluyendo una prueba t de muestras independientes y análisis de varianza (ANOVA), basado en el número de factores entre sujetos incluidos en el diseño. Un árbol de decisión estadística (figura 4) puede ayudar en la toma de decisiones sobre el enfoque estadístico más adecuado.
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Representative Results
El presente estudio observó un "puntos discretos" patrón para la expresión de RNA en los receptores de la dopamina D1-alfa (Drd1α) de coloración del NAc en ratas de F344/N (figura 1A). Las señales de fluorescencia individual fueron identificadas fácilmente y pueden ser vistas como solo "puntos," cada uno de los cuales representa una sola transcripción RNA dentro de la célula. Imágenes del NAc que muestran los "puntos discretos" patrón de tinción, determinamos el rango dinámico de expresión utilizando un análisis semicuantitativo (figura 1A, figura 2Ay 2B). Cada célula lo marcó "0-9" basado en el número de puntos por la célula. Esta "señal hibridizada"-score (puntuación H) método así puede evaluar la magnitud y variabilidad de expresión de Drd1α en células individuales.
El enfoque semi-cuantitativo para el "punto discreto" patrón de tinción proporciona una variable categórica que es ordinal en naturaleza (es decir, el número de puntos por la célula clasificado de menor (1) a mayor (9)) para su posterior análisis estadístico. En el presente estudio, estábamos interesados en examinar el efecto de un factor entre sujetos (es decir, sexo) para la expresión de Drd1α en el NAc. Para tener en cuenta la estructura de datos anidados (es decir, dos imágenes de Z-pila del Drd1α etiquetado células en NAc se obtuvieron para cada animal), valores de cuenta promedio fueron calculados para cada categoría y utilizados para el análisis estadístico (masculino: n= 3, mujer: n = 3). Dado nuestro interés por examinar las diferencias en un factor entre sujetos (es decir, sexo) con dos grupos (es decir, hombre, mujer) una U de Mann-Whitney prueba se realizó para evaluar las diferencias en el conteo de mediana (Figura 2D). Una prueba U de Mann-Whitney reveló un efecto principal significativo del sexo [z=-5.8, p≤0.001], con hembras, con una puntuación de la mediana disminuida de la célula en relación con los animales masculinos. Figura 2E y 2F ilustran la frecuencia de células en cada categoría utilizando dos métodos: frecuencia relativa y frecuencia acumulada. Los animales femeninos muestran un cambio significativo en la distribución, con una mayor frecuencia de células en categorías inferiores ordenadas en relación con los animales masculinos. Se realizó una prueba de Asociación de Mantel-Haenszel para analizar estadísticamente la distribución, revelando un efecto significativo del sexo [χ2MH(1) = 67,3, p≤0.001]. Así, en general, los resultados sugieren diferencias de sexo claro en la expresión de Drd1α en el NAc.
En casos donde el número de copia de la transcripción es muy alto, las señales pueden aparecer como racimos. Aquí, expresión de la hidroxilasa de la tirosina (TH) en la región SNR demostró los "clusters" manchas patrón (Figura 3A). Para cuantificar este marcador alto-expresar, en primer lugar un promedio la intensidad de fondo de ocho áreas de fondo diferente. Después de establecer el umbral mínimo de intensidad por encima de la intensidad de fondo promedio, se analizó la intensidad de la imagen ajustada como señal por la célula de TH
Dado nuestro interés en el examen de un factor entre sujetos (es decir, sexo), una prueba t de muestras independientes es un acercamiento estadístico apropiado. Para el análisis, los datos fueron transformados log. Para tener en cuenta la estructura de datos anidados (es decir, dos imágenes de Z-pila del TH etiquetado células en SNR se obtuvieron para cada animal), valores promedio calculados y utilizados para el análisis estadístico (masculino: n= 2, mujer: n= 3). Los animales femeninos muestran un aumento significativo en intensidad de señal promedio (figura 3B), sugestiva de un mayor nivel de expresión total de TH, en relación con los animales masculinos (t(3) = 3.3, p≤0. 05). Sin embargo, no significativo del sexo se observaron diferencias tanto en el número de células por imagen (t(3) = 2.0, p> 0.05; Figura 3) o el medio de expresión por la célula de la señal (t(3) = 2.0, p> 0.05; Figura 3D). Un ANOVA diseño mixto, teniendo en cuenta las tres medidas como un factor de sujeto, también reveló un efecto principal significativo del sexo [F (1,3) = 10.6, p≤0. 05].
Figura 1: criterios de análisis semicuantitativo en el número promedio de puntos por la célula para el patrón de tinción: "puntos discretos". A. imágenes representativas de confocales (60 X) de Drd1α expresión en diferentes puntuaciones (escala de 250% con respecto al tamaño original de imagen amplificada) B. La categoría específica de "puntuación" para cada criterio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: nivel de la dopamina D1 alfa receptor (Drd1α) RNA en la región del núcleo Accumbens de las ratas de F344/N. A. el % de la frecuencia relativa de cada categoría de la "puntuación". B. una curva dosis-respuesta sigmoidea proporciona un ajuste bien descrito (r2= 0.99) con intervalos de confianza del 95% (IC; indicado por la línea punteada) se ajustó a lo % de frecuencia acumulada de cada categoría de la "puntuación". C. representante de imágenes confocales (60 X) de la expresión de Drd1α en ratas machos y hembras, que tienen los "puntos discretos" patrón de tinción. D. Representación gráfica de la puntuación media de la célula en ratas machos y hembras. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). E. el % de la frecuencia relativa de cada categoría de la "puntuación", comparando la expresión en los tejidos de ratas machos y hembras. F. curvas de dosis-respuesta sigmoidea proporcionan un ajuste bien descrito (i2r = 0.99) con intervalos de confianza del 95% para el % de frecuencia acumulada de cada categoría de la "puntuación" entre machos y hembras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: tirosina hidroxilasa RNA nivel (TH) región del Nigra del Substantia (SNR) en ratas de F344/N. A. representativas imágenes confocales (60 X; Excitación: 543 nm; Emisión: 590/50 nm) de la expresión de TH en machos y hembras, que tienen los "clusters" patrón de tinción. B-D. Análisis representativo de la intensidad de la señal por la célula. Expresión de la señal / celular puede derivarse de la cuantificación de la intensidad de la señal de la imagen (con intensidad umbral fijado encima de fondo) y dividiéndolo por el número de células dentro de la imagen. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: árbol de decisión para el análisis estadístico recomendado. El árbol de decisiones proporciona directrices para determinar qué análisis estadístico son más adecuado para la pregunta de investigación de interés. El árbol de decisión no es exhaustivo y en algunos casos, otros análisis pueden ser apropiados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este protocolo, describimos una nueva técnica de hibridación en situ para rebanadas de cerebro congelado evaluar Drd1α la expresión del receptor en el Núcleo accumbens (NAc) y la expresión de tirosina hidroxilasa (TH) en la región de nigra del substantia (SNR). También ofrecemos métodos de análisis de datos para diferentes patrones de tinción: "punto discreto" o "clusters".
Los pasos críticos para un ensayo de fluorescencia multiplex éxito RNA en situ hibridación están incluidos. Una vez que decapitar a la rata y quitar el cerebro, congelar el cerebro en nitrógeno líquido dentro de 5 minutos no las secciones de la cerebral a-20 ° C hasta su fijación de paraformaldehído al 4%. Después de los 30 min de incubación de pretratamiento 4 diapositivas no deben permanecer en PBS 1 x durante más de 15 minutos. No deje que el cerebro las secciones secan entre pasos de amplificación. Proyección de imagen confocal es muy útil para proporcionar imágenes de alta calidad mostrando señales de manchas claras en muestra de tejido. Usando el horno de hibridación rápida y eficientemente llevará las muestras a 40 ° C.
Las señales de fluorescencia individual de la expresión del receptor Drd1α de la NAc fueron identificadas como solo "puntos," que representan una sola transcripción RNA dentro de la célula. Lo importante es "punto" tamaño refleja diferencias en las condiciones de ensayo, preparación de la muestra y otros factores más que los niveles de expresión de ARN-Drd1α. Del mismo modo, la intensidad de la señal de "puntos" no es relevante para los niveles de expresión de ARN-Drd1α. Determinamos el rango dinámico de esta expresión como un análisis semicuantitativo anotada con "0-9" basado en el número de puntos por la célula, que puede evaluar la magnitud y variabilidad de expresión Drd1α. Además, el examen del número de puntos por la célula proporciona una variable categórica para más análisis estadísticos.
Tras el examen de estadística descriptiva, el protocolo recomienda tres enfoques principales para analizar estadísticamente las señales que presentan el "punto discreto" manchas Patrón, el cual proporciona una variable ordinal para su posterior análisis. Específicamente, se recomiendan una prueba no paramétrica U de Mann-Whitney, una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis y una prueba de Asociación de Mantel-Haenszel. Una prueba U de Mann-Whitney y una prueba de Kruskal-Wallis son más apropiados cuando examinar sólo uno entre-temas factor (por ejemplo, sexo). Además, una prueba de Mantel-Haenszel de asociación puede ser apropiada para examinar los cambios en la distribución. Análisis estadísticos más complejos, como una ecuación de estimación generalizada o un modelo mixto lineal general puede ser apropiado cuando se incluyen factores adicionales. Las recomendaciones no son exhaustivas, y el enfoque estadístico exacto dependerá el diseño experimental y la pregunta de investigación de interés.
Sin embargo, en casos donde el número de copia de la transcripción es muy alto, las señales pueden aparecer como racimos. Aquí, la expresión de TH en la región SNR demostró los "clusters" patrón de tinción. Para cuantificar el marcador TH alta expresando, nos ajustar intensidad de imagen basado en el ajuste del umbral de intensidad mínimo por encima de la intensidad media de fondo y analizados como señal por la célula de TH Las señales que presentan el "cluster" patrón de tinción como la TH en el SNR, puede ser analizada estadísticamente mediante el uso de una independiente muestras pruebas t o ANOVA para comparar grupos.
Existen limitaciones de este análisis nuevo RNA en situ el hibridación. Para el "punto discreto" patrón de tinción, se trata de cómo definir con mayor precisión una célula individual. En nuestro estudio, para identificar la celda individual de la imagen, realizamos la coloración de DAPI como marcador nuclear. Sin embargo, es todavía difícil de analizar ciertas partes del tejido cerebral ya que cuenta con varios tipos de células con formas irregulares de los núcleos o células. Aquí, dos investigadores experimentados asignan por separado cada célula de imágenes para definir la región de la célula. Para los "clusters" patrón de tinción, software específico debe ser elegido para configurar umbrales o recognization célula automática.
Así, el innovador RNA en situ hibridación análisis nos permitió investigar los mecanismos que influyen en la absorción DA y DA liberación simultáneamente, mejorar la comprensión de las complejidades del sistema estriado DA. En general, los investigadores podrían beneficiarse de la novela RNA en situ hibridación técnica al investigar cambios disfuncionales en marcadores dopaminérgicos durante la aparición y progresión de los trastornos cerebrales.
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Disclosures
Hay no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los presentes trabajos fueron apoyados por los institutos nacionales de subvenciones de salud (NIH) HD043680, MH106392, DA013137 y NS100624. Fondo parcial fue proveído por una beca de formación de NIH T32 en ciencia biomédica y de conducta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe - Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
| RNAscope Probe - Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |
References
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