Summary
側坐核ドーパミン D1-アルファ受容体の同定は、中枢神経系疾患の中に D1 受容体の機能不全を明らかにするため重要です。特定の脳領域の RNA 分子を可視化する交配アッセイの in situ新規 RNA を行った。
Abstract
中枢神経系 D1 α サブタイプ受容体 (Drd1α) は最も豊富なドーパミン (DA) の受容体で、神経の成長・発達の調節に重要な役割を果たしています。しかし、Drd1α 受容体異常行動応答を仲介してワーキング メモリ機能の変調メカニズムはまだ明らかではありません。交配アッセイの in situ新規 RNA を使用すると、現在の研究特定 RNA 発現核側坐 (NAc) エリアに位置し中脳領域 (SNR)、DA 関連回路から受容体とチロシン水酸化酵素 (TH) ドーパミン Drd1αそれぞれ。NAc の Drd1α 式は、「離散ドット」染色パターンを示しています。Drd1α 式で明確な性差が認められました。対照的に、第 5 回は、「クラスター化された」染色パターンを示します。番目の式について雌ラットはオスの動物と相対的にセルごとのより高い信号式を表示されます。紹介した方法は、中枢神経系疾患の進行中にドーパミン システムの機能不全の変化を調査するため小説の in situハイブリダイゼーション手法を提供します。
Introduction
線条体ドーパミン系機能障害は複数の神経認知症にみられる臨床症状の進行に関与しています。ドーパミン D1 受容体が前頭前皮質 (PFC) と脳の線条体領域に存在し、認知1メモリ、一時的な処理、および機関車の動作2,3を含むに大きく影響,4,5,6,7. 以前の研究は、ドパミン D1 受容体の変化は、注意欠陥多動性障害 (ADHD)8、統合失調症9,の神経認知症状の進行と関連付けられたことを解明10ストレス感受性11。具体的には、統合失調症、陽電子放射断層撮影 (PET) 研究に認知障害や陰性症状11の存在する前頭皮質におけるドパミン D1 受容体の結合能が関連性が高いことが示されました。前頭前皮質のドーパミン D1 受容体による規制で興奮性ニューロンの樹枝状結晶の成長には、ストレス感受性が軽減されます。さらに、内側前頭前皮質 (mPFC) ニューロンの D1 受容体のノックダウンは、社会的敗北ストレス誘発性の社会的回避12を高めることができます。
RNAの in situハイブリダイゼーション新鮮凍結組織サンプルでのセルに単一の RNA 分子を可視化する手法を紹介します。現在の技術では、現在の文献内に存在する方法上の複数の利点を持っています。まず、現在のプロシージャは組織の空間的および形態学的コンテキストを保存し、他のプロシージャは、新鮮なを必要とする、非埋め込まれた組織は、現在の方法と組み合わせることができるように新鮮凍結組織サンプルで行った。ホルマリン固定パラフィン包埋組織における同様の手順は、単一の転写の解像度は、RNAの in situハイブリダイゼーション テクニック13を使用して達成することができます説明しています。単一の転写レベルで RNA の検出は、低コピー数の表現だけでなく、核酸検出の他の方法では達成できない細胞レベルでの遺伝子発現を比較する機会に優れた感度を提供しますポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) のテクニック」などさらに、現在のメソッドは、単一のターゲット RNA 転写産物にハイブリダイズと検出信号増幅の分子カスケードを順番にバインドされている、非常に特定の RNA プローブを介して高い信号対雑音比の画像を維持します。システム。最後に、現在の技術によるタンパク質検出などのシステム関連マーカーの 1 つだけのクラスに私たちの調査を制限するのではなく、そのターゲット固有の専用プローブでは、複数の生物学的システムを評価する機会を提供します免疫組織化学的方法。
私たちの研究では、側坐核 (NAc) Drd1α 受容体の発現と中脳 (SNR) でチロシン水酸化酵素 (番目の) 式を評価する男性と女性/N の F344 ラットの交配その場で新規 RNA を使いました。交配その場で革新的な RNA では、DA 取り込みと DA 放出の両方に同時に影響を及ぼす、線条体ドパミン DA システムの複雑さの理解を向上させるメカニズムを調査することができました。新鮮凍結脳をスライスし、さまざまな染色パターンのためのデータ分析方法を提供するため、我々 はプロシージャを記述するここでは、:「離散ドット」または「クラスター」。
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Protocol
実験プロトコルは、動物のケアおよび使用委員会 (IACUC)、サウスカロライナ州の大学によって承認された (連邦保証番号: A3049-01)。
1. 新鮮な冷凍脳セクションの準備
- N/F344 ラット系統を使用: 各性のラット 3 匹 13 ヵ月齢、本体重量約 320 g。
- 5% (セボフルランの過剰摂取) のセボフルラン濃度を調整します。呼吸停止の追加分、後セボフルラン投与を続行します。
- ネズミの首をはねるし、脳を削除します。
- 水没 15 液体窒素でラット脳組織収穫の 5 分以内で s。
- 1 h 用クライオスタットの-20 ° C と脳を平衡します。
- 30 μ m のセクションをカットし、スライド (材料の表を参照してください) に転送します。
- 核側坐地域、約 2.76 mm ~ 前14前方 2.28 mm からセクションを選択します。
- 継続的にラットの脳定位固定脳の構造によると核側坐地域の嗅球からラット脳をスライスします。
- スライドにサンプルをマウントします。セクションを保つため、-20 ° c で 10 分間乾燥します。
- 4 ° C で 1 時間前に冷蔵 4% のパラホルムアルデヒドのスライドをすぐに没頭します。
- 室温 (RT) で増加するエタノール勾配にスライドを配置: 50% エタノールに 5 分。70% エタノールに 5 分。100% エタノールに 5 分。
- 新鮮な 100% リピート江藤。
- 吸水紙の上のスライドを配置し、空気が乾燥。
- バリア ペンで各セクションに障壁を描画 (材料の表を参照してください)。1 分間完全に乾燥バリアができます。
2. 脳の前処理
- オーブンをオンにし、温度を 40 ° C に設定
- 4 前処理試薬 3 滴 (90 μ L) を追加 (材料表参照) 各脳セクション (スライドごとの 1 つのセクション) に。
- セクション 30 分室温で孵化させなさい
- 新鮮な 1 × PBS で RT。 繰り返し 1 分の 1x PBS でスライドが水没します。
注: スライドに 15 分よりも長く 1x PBS で滞在しないでください。
3. RNA In Situハイブリダイゼーション蛍光多重アッセイ
- 暖かい水のお風呂で 40 ° C で 10 分間のターゲット プローブと右に冷却してから
- RNA 試薬の場所 (例えば、アンプ 1 4 FL) 室温
- スライド ラックの背面吸水紙と場所でスライドから余分な液体を削除する (テーブルの材料を参照してください)。
- サンプルのスライスに Drd1α プローブ (C1) の 3 滴 (90 μ L) を追加します。40 ° C で 2 時間インキュベートします。
- 洗浄バッファー x 新鮮な 1 としたリピートで 2 分間洗浄バッファー x 1 のスライドが水没します。
- スライド ラックの背面吸水紙と場所でスライドから余分な液体を削除する (テーブルの材料を参照してください)。
- サンプルのスライス上アンプ 1 フロリダの 3 滴 (90 μ L) を追加します。40 ° C で 30 分間インキュベートします。
- 新鮮な 1wash バッファーを使用したリピートで 2 分間 1 洗浄バッファーのスライドが水没します。
- スライド ラックの背面吸水紙と場所でスライドから余分な液体を削除する (テーブルの材料を参照してください)。
- サンプルのスライスにアンプ 2 fl (90 μ L) を 3 滴を追加します。40 ° C で 15 分間インキュベートします。
- 洗浄バッファー x 新鮮な 1 としたリピートで 2 分間洗浄バッファー x 1 のスライドが水没します。
- スライド ラックの背面吸水紙と場所でスライドから余分な液体を削除する (テーブルの材料を参照してください)。
- サンプルのスライス上アンプ 3 FL の 3 滴 (90 μ L) を追加します。40 ° C で 30 分間インキュベートします。
- 洗浄バッファー x 新鮮な 1 としたリピートで 2 分間洗浄バッファー x 1 のスライドが水没します。
- スライド ラックの背面吸水紙と場所でスライドから余分な液体を削除する (テーブルの材料を参照してください)。
- アンプ 4-フロリダ-オルト A サンプルのスライス上の 3 滴 (90 μ L) を追加します。40 ° C で 15 分間インキュベートします。
- 洗浄バッファー x 新鮮な 1 としたリピートで 2 分間洗浄バッファー x 1 のスライドが水没します。
- スライドから余分な液体を削除する、すぐに取付試薬 2 滴 (材料表参照) 各セクションに。
- 22 mm 22 mm coverslip の場所 (材料表参照) 各脳セクションの上。
- 乾燥するまで、2-8 ° C で暗闇の中でスライドを保存します。
- 共焦点顕微鏡をオンにし、60 X 目的に切り替えます。
- 共焦点顕微鏡画像を Z スタックを取得します。共焦点レーザー顕微鏡の詳細手順の補足のビデオを参照してください。
- Drd1α 核側坐領域内のセルのラベルの画像を取得 (励起: 488 nm;放出: 515/30 nm)。
注: セクションが潜伏ステップ間乾く脳をてはいけないです。
4. データ解析
- 染色パターンを半定量的に解析:「不連続な点」。
- イメージから個々 のセルを識別するために DAPI 染色として核マーカーを実行します。しかし、まだそれは細胞の核や細胞の不規則な形状の種類を複数持っているので、脳の特定の部分を分析することは困難です。ここでは、2 つの経験豊富な研究者は個別にセル領域を定義する画像から各セルを割り当てます。
- 視覚的に特定の基準 (図 1 b) を使用して、セルごとのドット数に基づく代表的な共焦点画像内の各セルをスコアします。
- 各カテゴリーの総細胞数を決定し、すべてのティッシュ セクション (図 2 a) の男女別各部門内のセルのパーセントの周波数を表示する相対頻度グラフを作成する細胞数 x100 で割ります別に (図 2 e)。
- 個別にすべてティッシュ セクション (図 2 b) と男性と女性のためのセルの累積度数を確認する細胞数 x100 で事前のすべてのカテゴリ内のセルの合計を除算 (図 2 f)。
- 染色パターン (省略可能)「離散ドット」を統計的に分析します。
- 自然 (すなわち、最高の電池式 (9) に最下位セル式 (1) から各ランクのカテゴリに該当するセルの数) の序数は、カテゴリカル変数を提供するセルあたりのドットの数を調べてさらに統計解析。
- 記述統計量の検査の後、3 つの主なアプローチを使用: マントルピース Haenszel 統計, マン-ホイットニーの U 検定やクラスカル-ウォリス検定。正確な統計的手法に依存なりますが興味、統計的決定ツリー (図 4) の実験の設計と研究の質問は 1 つの分析的なアプローチに関する意思決定に役立つ可能性があります。
- 染色パターンの利益 (率 ROI) の領域の信号強度の定量化:「クラスター」。
- 次の式を使用して各画像の信号強度を計算します。
信号強度 = ROI 画像 - (平均背景強度 × 全体のイメージ領域) の合計強度 - セルあたりおおよそ信号式を計算する投資収益率イメージ内のセルの合計数をカウントします。セル/画像の数と同様、信号強度/画像のグループの違いは、信号式/携帯で見られるグループの相違に貢献するかもしれないメカニズムを考慮する興味のある (図 3B-3 D)。
- 次の式を使用して各画像の信号強度を計算します。
- 染色パターン (省略可能)「クラスター」統計的に分析。
- さらに統計分析の連続的な変数を提供する信号式/セルを調べます。デザインに含まれる独立したサンプルの t 検定、分散分析 (ANOVA)、被験者間要因の数に基づいてなど、2 つのアプローチを使用します。統計的決定ツリー (図 4) は、最も適切な統計方法についての意思決定に役立つ可能性があります。
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Representative Results
現在の研究は観察/N の F344 ラット (図 1 a) で NAc のドーパミン D1-アルファ受容体 (Drd1α) における RNA 発現のパターンを汚す「離散ドット」です。個々 の蛍光信号は容易に識別された、セル内の 1 つの RNA 転写産物を表す単一の「ドット」として見ることができます。「離散ドット」染色パターンを表示する、NAc からイメージの半定量分析 (図 1 a図 2 a・ 2 b) を使用して、式のダイナミック レンジを評価しました。各セル「0-9」セルあたりのドットの数に基づいてからの得点だった。この「交配させられた信号」-スコア (H スコア) 法評価できる従って範囲と Drd1α 式の変動個々 セルの間で。
染色パターン「離散ドット」の半定量的な手法は、さらに統計分析 (すなわち、最高 (9) に (1) 最低ランクから細胞あたりのドット数) 自然序数は、カテゴリカル変数を提供します。本研究では 1 つの被験者間因子 (すなわちセックス) の NAc Drd1α 発現に及ぼす影響を調べることに興味があるができました。入れ子になったデータ構造 (すなわち、それぞれの動物の標識の NAc 細胞 Drd1α の 2 つの Z スタック画像を得た) のために、平均カウントの値がカテゴリごとに計算し、統計分析のために使用 (男性: n= 3、女性: n= 3)。マン ・ ホイットニーの U 検定、2 つのグループ (すなわち男性、女性) 1 つの被験者間因子 (すなわちセックス) の違いを明らかに我々 の関心与えられた中間細胞数 (図 2 D) の違いを評価するためにテストを行った。マン ・ ホイットニーの U 検定は、オスの動物の相対的な減少は中央細胞の点数を表示する女性の動物とのセックス [z= 5.8 p≤0.001]、有意な主効果を明らかにしました。図 2 eおよび2 fを示す 2 つのメソッドを使用して各カテゴリ内のセルの周波数: 相対度数、累積度数。メスは、オスの動物に対する低い順序カテゴリの細胞のより高い頻度の分布の大きな変化を表示されます。統計的に明らかにセックスの重要な影響、分布を調べる会マントルピース Haenszel テストを行いました [χ2MH(1) = 67.3、 p≤0.001]。したがって、全体的にみて、結果は、NAc の Drd1α 式で明確な性差をお勧めします。
トラン スクリプトのコピー数が非常に高い場合、信号はクラスターとして表示できます。ここでは、snr のチロシン水酸化酵素の発現 (番目の), 染色パターン (図 3 a) は「クラスター」を示した。この高表現マーカーを定量化するには、最初に 8 つの異なる背景領域から背景の強度を平均しました。目のセル当たり信号として分析だった調整画像の輝度平均背景強度の上最小輝度しきい値を設定した後
1 つの被験者間因子 (すなわちセックス) を調べることで我々 の関心を与え、独立したサンプルの t 検定は、適切な統計的手法です。解析、データのログ変換されました。入れ子になったデータ構造 (すなわち、それぞれの動物の標識 sn 細胞番目の 2 つの Z スタック画像を得た) のために、平均値を算出し、統計分析のために使用 (男性: n= 2、女性: n= 3)。メスは平均信号強度 (図 3 b)、オスの動物に対する合計の TH 式のより高いレベルの挑発的な大幅な増加を表示 (t(3) = 3.3 p0.05)。ただし、重要な性の差は認められなかったどちらかのイメージあたりのセル数 (t(3) 2.0 では、 p= > 0.05;図 3)または信号のセルごとの式の平均 (t(3) 2.0 では、 p= > 0.05;図 3 D)。被験者内要因として 3 つの対策を考慮した混合設計の分散分析はまたセックスの有意な主効果を明らかにした [F (1, 3) = 10.6, p0.05]。
図 1: 染色パターンのセルあたりのドットの数の平均値の半定量的解析の条件:「離散ドット」.A.代表的な共焦点画像 (60 X) の異なるスコアで Drd1α 式 (250% 元のサイズを基準にして尺度を増幅) b.各基準の特定「スコア」カテゴリ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: N/F344 ラットの側坐核領域のドーパミン D1-アルファ受容体 (Drd1α) の RNA レベル。A.各「スコア」カテゴリの相対度数 %。B.シグモイド用量反応曲線を提供よく説明フィット (r2= 0.99) 95% 信頼区間と (CI; 点線で示される)「スコア」カテゴリごとの累積度数 % にぴったりだった。C.代表的な共焦点画像 (60 X), 染色パターンは「離散ドット」のある男性と女性のラットにおける Drd1α 式の。+雄および雌ラットでセルの平均スコアの代表的なグラフ。誤差範囲 (SEM) の平均の標準誤差の略します。E.雄および雌ラット組織における発現を比較する「スコア」カテゴリごとの相対頻度 %。F.シグモイド用量反応曲線を提供よく説明フィット (r2s = 0.99) 雄および雌ラット間の「スコア」カテゴリごとの累積度数 % 95% 信頼区間とします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: N/F344 ラットの中脳 (SNR) 地域におけるチロシン水酸化酵素 RNA レベル (TH).A.代表的な共焦点画像 (60 X;励起: 543 nm;放出: 590/50 nm) の雄および雌ラットで、日式の「クラスター」パターンを染色があります。B dセルごとの信号強度の代表的な分析。式の信号/セルは、(背景の上の強度の閾値の設定) を使用してイメージの信号強度を定量化し、画像内のセルの数で割ってから派生することができます。誤差範囲 (SEM) 平均値の標準誤差を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 推奨される統計的なツリーを決定します。デシジョン ツリーは、統計的分析は興味のある研究質問に最適を決定するためのガイドラインを示します。ディシジョン ツリーが完全ではない、いくつかのケースで、他の分析は適切かもしれない。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルに交配その場で新鮮凍結脳スライス (NAc) 側坐核における Drd1α 受容体の発現と中脳 (SNR) 地域におけるチロシン水酸化酵素 (番目の) 式を評価するための手法について述べる。我々 はまたさまざまな染色パターンのためのデータ分析方法を提供:「離散ドット」または「クラスター」。
交配分析その場で成功した多重蛍光 RNA のための重要なステップが含まれています。ラットを decapitating 脳を外し 5 分内で液体窒素で脳をフリーズ一度、-20 ° C で 4% パラホルムアルデヒドの固定までの脳のセクションを保ちます。4 前処理のインキュベーションの 30 分後 15 分以上 1x PBS でスライドに滞在しないでください。脳のセクションは増幅ステップ間を乾燥をさせてください。共焦点レーザー顕微鏡は、組織サンプルで示す明確な染色信号の高品質の画像を提供するため非常に便利です。ハイブリダイゼーション オーブンを使用して迅速かつ効率的にサンプルにもたらす 40 ° C
NAc Drd1α 受容体発現の個々 の蛍光信号はシングル「ドット、」それぞれセル内の単一の RNA 転写産物として識別されました。重要なは、「ドット」のサイズには、アッセイ条件の違い、サンプル準備と他の要因よりもむしろ Drd1α RNA 発現レベルが反映されます。同様に、個々 の「ドット」の信号強度は Drd1α RNA 発現量に無関係です。この式を「0 - 9」程度と Drd1α 式の変動を評価することができます、セル当たりのドット数に基づく得点半定量分析としてのダイナミック レンジを検討しました。さらに、セル当たりのドット数の検討は、さらに統計分析のカテゴリカル変数を提供します。
次の記述統計量の検討、我々 のプロトコルは、染色パターンは、さらなる分析の序数変数を提供する「離散点」を示す信号の統計的な分析に 3 つの主要なアプローチをお勧めします。具体的には、ノンパラ メトリック ・ マン-ホイットニーの U 検定、ノンパラ メトリック クラスカル-ウォリス検定、協会のマントルピース Haenszel テストをお勧めします。マン ・ ホイットニーの U 検定やクラスカル-ウォリス検定は、最も適切な 1 つだけを調べる被験者間要因 (例えばセックス)。さらに、協会のマントルピース Haenszel テストは、分布の変化を調べるために適切かもしれない。複雑な統計解析を含む一般化推定方程式または一般化線形混合モデルあります適切な追加の要素が含まれる場合です。推奨事項は、網羅されていません、正確な統計的アプローチは実験的なデザインとリサーチ ・ クエスチョンの関心に依存になります。
ただし、トラン スクリプトのコピー数が非常に高い場合、信号はクラスターとして表示できます。ここでは、TH 式 SNR 領域では, 染色パターンは「クラスター」を示した。TH の高発現マーカーを定量化するには、我々 は画像の輝度平均背景強度の上最小輝度しきい値の設定に基づいており、木の細胞 1 個あたり信号として分析を調整T 検定や分散分析のグループを比較する独立したを使って、SNR の TH を統計的に分析できるよう「クラスター」パターンを染色を示す信号をサンプリングします。
この小説の in situハイブリダイゼーション アッセイの RNA の制限があります。「離散ドット", 染色パターンは、個々 のセルをより正確に定義する方法が含まれます。私たちの研究では、イメージから個々 のセルを識別するために行った DAPI 染色として核マーカーしかし、まだそれは細胞の核や細胞の不規則な形状の複数の種類を持っているので、脳の特定の部分を分析することは困難です。ここでは、2 つの経験豊富な研究者は個別にセル領域を定義する画像から各セルを割り当てます。「クラスター」, 染色パターンは特定のソフトウェアはしきい値またはセルの自動認識をセットアップする選択してください。
したがって、蛍光分析法その場で革新的な RNA では、DA 取り込みと DA 放出の両方に同時に影響を及ぼす、線条体ドパミン DA システムの複雑さの理解の向上のメカニズムを調査することができました。全体的にみて、研究者の恩恵の in situハイブリダイゼーション手法 RNA 出現し、脳障害の進行中にドーパミン作動性マーカーに機能不全の変更を調査するとき。
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Disclosures
宣言する利害の対立がないです。
Acknowledgments
本作品は、国立衛生研究所 HD043680、MH106392、DA013137、および NS100624 の健康 (NIH) の補助金によって支えられました。部分的な基金は、医用生体行動科学 NIH T32 のトレーニングの許可によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe - Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
| RNAscope Probe - Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |
References
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