Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Identifikation af dopamin D1-Alpha Receptor inden for gnavere kernen Accumbens af en innovativ RNA In Situ opdagelse teknologi

Published: March 27, 2018 doi: 10.3791/57444
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Summary

Identifikation af dopamin D1-alpha receptor i kernen accumbens er kritisk for afklaring D1 receptor dysfunktion under en central nervesystemet sygdom. Vi udførte en roman RNA i situ hybridisering assay for at visualisere enkelt RNA molekyler i en bestemt hjerne område.

Abstract

I det centrale nervesystem er D1-alpha subtype receptor (Drd1α) den mest rigelige dopamin (DA) receptor, som spiller en vigtig rolle i reguleringen af neuronal vækst og udvikling. Mekanismerne bag Drd1α receptor abnormiteter mægle adfærdsmæssige reaktioner og modulerende arbejder hukommelsesfunktion er imidlertid stadig uklart. Ved hjælp af en roman RNA i situ hybridisering assay, identificeret den nuværende undersøgelse dopamin Drd1α receptor og tyrosin hydroxylase (TH) RNA udtryk fra DA-relaterede kredsløb i nucleus accumbens (NAc) område og substantia nigra region (SNR), henholdsvis. Drd1α udtryk i NAc viser en "diskret dot" farvning mønster. Klart sex forskelle i Drd1α udtryk blev observeret. Derimod viser TH en "klynge" farvning mønster. Med hensyn til TH udtryk vises hunrotter en højere signal udtryk pr. celle i forhold til handyr. De metoder, der præsenteres her give en roman i situ hybridisering teknik for at undersøge ændringer i dopamin system dysfunktion under progression af centrale nervesystem sygdomme.

Introduction

Dysfunktion af striatal dopamin system er involveret i udviklingen af kliniske symptomer observeret i flere neurokognitive sygdomme. Dopamin D1 receptorer findes i det præfrontale cortex (PFC) og striatal regioner af hjernen og påvirke stærkt kognitive processer1, herunder arbejder hukommelse, tidsmæssige forarbejdning og lokomotiv adfærd2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. tidligere undersøgelser belyst, at ændringer af dopamin D1 receptorer var forbundet med progression af opmærksomhed underskud hyperaktivitet lidelse (ADHD)8, neurokognitive symptomer på skizofreni9, 10 og stress modtagelighed11. Specifikt, i skizofreni vist positron emissions tomografi (PET) undersøgelser, at bindende evne til dopamin D1 receptorer i de præfrontale cortex var stærkt relateret til kognitiv underskud og tilstedeværelsen af negative symptomer11. Dendritiske væksten af excitatoriske neuroner i præfrontal cortex reguleret af dopamin D1 receptor lindrer stress modtagelighed. Derudover kunne knockdown af D1 receptor i mediale præfrontale kortikale (mPFC) neuroner forbedre sociale nederlag stress-induceret sociale unddragelse12.

Her introducerer vi en ny teknik af RNA i situ hybridisering til at visualisere enkelt RNA molekyler i en celle med frisk frosset vævsprøver. Den nuværende teknik har flere fordele i forhold til metoder, der findes i den aktuelle litteratur. Først, den nuværende procedure bevarer den rumlige og morfologiske sammenhæng af væv og blev udført på frisk frosset vævsprøver, således at andre procedurer, der kræver friske, ikke-indlejrede væv kan kombineres med de nuværende metoder. Lignende procedurer i formalin-fast og paraffin-embedded væv har illustreret, at enkelt transskription opløsning kan opnås ved hjælp af en RNA i situ hybridisering teknik13. Påvisning af RNA på enkelt transskription plan giver overlegen følsomhed til lav kopi nummer udtryk samt mulighed for at sammenligne genekspression i forbindelse med individuelle celler, der ikke kan opnås ved andre metoder til påvisning af nukleinsyre såsom polymerase kædereaktion (PCR) teknikker. Desuden, fastholder den nuværende metode billeder med en høj signal-støj-forholdet gennem meget specifikke RNA-sonder, der er hybridiseret at enkelt mål RNA udskrifter, og sekventielt bundet med en kaskade af signal forstærkning molekyler i afsløring system. Endelig, den nuværende teknologi giver mulighed for at evaluere flere biologiske systemer med sine mål-specifikke proprietære sonder, snarere end at begrænse vores undersøgelse til kun én klasse af system-relaterede mærker såsom protein påvisning af Immunhistokemi metoder.

I vores undersøgelse brugte vi denne roman RNA i situ hybridisering til at evaluere Drd1α receptor udtryk i nucleus accumbens (NAc) og tyrosin hydroxylase (TH) udtryk i substantia nigra (SNR) af både mandlige og kvindelige F344/N rotter. Den innovative RNA i situ hybridisering aktiveret os til at undersøge mekanismerne påvirker både DA optagelsen og DA release samtidigt, forbedre vores forståelse af striatal DA systemets kompleksitet. Her, vi beskrive proceduren for frisk frosset hjernen skiver og give metoder til analyse af data for forskellige farvning mønstre: "diskret dot" eller "klynger".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den eksperimentelle protokollen blev godkendt af Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of South Carolina (føderale assurance nummer: A3049-01).

1. forberedelse af frisk frosset hjernen sektioner

  1. Bruge F344/N rat stamme: tre rotter af hvert køn, 13 måneder i alder, kropsvægt ca 320 g.
  2. Justere Sevofluran koncentration på 5% (overdosis af Sevofluran). Fortsætte Sevofluran eksponering efter vejrtrækning stopper for en ekstra minut.
  3. Hug hovedet af rotten og fjerne hjernen.
  4. Dykke rotte hjernen i flydende kvælstof til 15 s inden for 5 min af væv høst.
  5. Reagensglasset hjernen til-20 ° C i en kryostaten for 1 h.
  6. Skær 30 µm sektioner og overføre på glassene (jf Tabel af materialer).
  7. Vælge sektioner fra nucleus accumbens region, ca. 2,76 mm til 2.28 mm foran Bregma14.
  8. Løbende skive rotte hjernen fra lugtekolben gennem regionen nucleus accumbens ifølge stereotaxisk hjerne struktur af rotten.
  9. Montere prøver på diasene. Holde sektionerne på-20 ° C i 10 min til tørre.
  10. Straks fordybe dias i den pre-kølet 4% PARAFORMALDEHYD i 1 time ved 4 ° C.
  11. Objektglassene i en stigende ethanol gradient ved stuetemperatur (RT): 50% EtOH for 5 min; 70% EtOH for 5 min; og 100% EtOH i 5 min.
  12. Gentag med friske 100% EtOH.
  13. Placere dias på absorberende papir og lufttørre.
  14. Tegne en barriere omkring hver sektion med en barriere pen (Se Tabel af materialer). Lad barrieren, tørre helt i 1 min.

2. forbehandling af hjernen sektioner

  1. Tænd ovnen og Indstil temperaturen til 40 ° C.
  2. Tilsæt 3 dråber (90 µL) forbehandling 4 reagens (Se Tabel af materialer) på hver hjerne sektion (én afdeling per dias).
  3. Inkuber sektioner for 30 min på RT.
  4. Dykke dias i 1 x PBS for 1 min på RT. gentagelse med frisk 1 x PBS.
    Bemærk: Dias skal ikke bo i 1 x PBS længere end 15 min.

3. RNA In Situ hybridisering Multiplex fluorescenstest

  1. Varm target sonden i 10 min ved 40 ° C i et vandbad og derefter afkøles til RT.
  2. Placer RNA reagens (fx Amp 1-4 FL) på RT.
  3. Fjern overskydende væske fra dias med absorberende papir og sted tilbage på dias rack (Se Tabel af materialer).
  4. Tilsæt 3 dråber (90 µL) af Drd1α sonde (C1) på prøve skive. Der inkuberes i 2 timer ved 40 ° C.
  5. Dykke dias i 1 x vaskebuffer i 2 minutter på RT. gentagelse med frisk 1 x vaskebuffer.
  6. Fjern overskydende væske fra dias med absorberende papir og sted tilbage på dias rack (Se Tabel af materialer).
  7. Tilsæt 3 dråber (90 µL) af Amp 1-FL på prøve skive. Inkuber i 30 min. ved 40 ° C.
  8. Dykke dias i 1 wash buffer for 2 min på RT. gentagelse med friske 1wash buffer.
  9. Fjern overskydende væske fra dias med absorberende papir og sted tilbage på dias rack (Se Tabel af materialer).
  10. Tilsæt 3 dråber (90 µL) af Amp 2-FL på prøve skive. Inkuber i 15 min. ved 40 ° C.
  11. Dykke dias i 1 x vaskebuffer i 2 minutter på RT. gentagelse med frisk 1 x vaskebuffer.
  12. Fjern overskydende væske fra dias med absorberende papir og sted tilbage på dias rack (Se Tabel af materialer).
  13. Tilsæt 3 dråber (90 µL) af Amp 3-FL på prøve skive. Inkuber i 30 min. ved 40 ° C.
  14. Dykke dias i 1 x vaskebuffer i 2 min på RT. gentagelse med frisk 1 x vaskebuffer.
  15. Fjern overskydende væske fra dias med absorberende papir og sted tilbage på dias rack (Se Tabel af materialer).
  16. Tilsæt 3 dråber (90 µL) af Amp 4-FL-Alt A på prøve skive. Inkuber i 15 min. ved 40 ° C.
  17. Dykke dias i 1 x vaskebuffer i 2 minutter på RT. gentagelse med frisk 1 x vaskebuffer.
  18. Fjern overskydende væske fra dias og umiddelbart sted 2 dråber af montering reagens (Se Tabel af materialer) på hvert afsnit.
  19. Placere en 22 mm 22 mm coverslip (Se Tabel af materialer) over hver hjerne sektion.
  20. Gemme diasene i mørke ved 2-8 ° C indtil tør.
  21. Tænd Konfokal mikroskop og skifte til et 60 X mål.
  22. Få Z-stak billeder med en Konfokal mikroskop. Supplerende videoen for en detaljeret procedure Konfokal Imaging.
  23. Erhverve billeder af Drd1α mærket celler i regionen nucleus accumbens (Excitation: 488 nm; Emission: 515/30 nm).
    Bemærk: Lad ikke hjernen sektioner tørre ud mellem inkubation trin.

4. dataanalyse

  1. Semi-kvantitativt analysere det farvning mønster: "diskret prikker".
    1. For at identificere den enkelte celle fra billedet, udføre DAPI farvning som nukleare markør. Det er imidlertid stadig vanskeligt at analysere visse dele af hjernevæv, da den har flere typer af celler med uregelmæssig form af kerner og/eller celler. Her, tildele to erfarne forskere separat hver celle fra billeder til at definere celle regionen.
    2. Visuelt score hver celle inden for de repræsentative Konfokal billeder baseret på antallet af prikker per celle ved hjælp af de specifikke kriterier (figur 1B).
    3. Fastslå det samlede celle nummer i hver kategori og dividere med cellen total antal x100 til at oprette relative hyppighed grafer, der viser den procent hyppighed af celler inden for hver kategori til alle væv sektioner (figur 2A) og for hanner og hunner separat (figur 2E).
    4. Dele summen af celler i alle forudgående kategorier af cellen total antal x100 til at bestemme den kumulative frekvens af celler for alle væv sektioner (figur 2B) og hanner og hunner adskilt (figur 2F).
  2. Statistisk analyser "diskret prikker" farvning mønster (valgfrit).
    1. Undersøge antallet af prikker per celle til at give en kategorisk variabel, der er ordenstal i naturen (dvs. antallet af celler, der falder ind under hver rang kategori fra laveste celle udtryk (1) til højeste celle udtryk (9)) for yderligere statistiske analyser.
    2. Efter en gennemgang af beskrivende statistik, bruge tre vigtigste tilgange: en Mantel-Haenszel statistik, en Mann-Whitney U test og en Kruskal-Wallis test. Selvom den præcise statistiske tilgang vil være afhængig af kan det eksperimentelle design og forskning spørgsmål af interesse, en statistisk beslutningstræ (figur 4) støtte i beslutninger vedrørende sin analytiske tilgang.
  3. Kvantificere signal intensiteten i regionen af interesse (ROI) for farvning mønster: "klynger".
    1. Beregne signal intensiteten af hvert billede ved hjælp af følgende ligning:
      Signal intensitet = samlede intensiteten af ROI billede - (gennemsnitlige baggrundskoncentrationer intensitet × samlede billedområde)
    2. Tæl antallet af celler i ROI billede til at beregne den omtrentlige signal udtryk pr. celle. Gruppe forskelle i signal intensitet/billede samt antallet af celler/billede kan være af interesse at overveje mekanismer, der kan bidrage til gruppe forskelle ses i signal udtryk/celle (figur 3B-3D).
  4. Statistisk analyser "klynger" farvning mønster (valgfrit).
    1. Undersøge signal udtryk/cellen for at give en kontinuerlig variabel for yderligere statistisk analyse. Brug to tilgange, herunder en uafhængig prøve t-test og variansanalyse (ANOVA), baseret på antallet af mellem fag faktorer inkluderet i designet. En statistisk beslutningstræ (figur 4) kan støtte i at træffe beslutninger vedrørende den mest passende statistisk metode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den nuværende undersøgelse observerede en "diskret prikker" farvning mønster for RNA udtryk i dopamin D1-alpha receptorer (Drd1α) af NAc i F344/N rotter (figur 1A). Enkelte fluorescens signaler blev let identificeres og kan ses som enkelt "prikker", som hver repræsenterer en enkelt RNA udskrift i cellen. Billeder fra NAc, der viser de "diskrete prikker" farvning mønster, vurderet vi det dynamiske område af udtryk ved hjælp af en semi-kvantitative analyse (figur 1A, figur 2A& 2B). Hver celle blev scoret fra "0-9" baseret på antallet af prikker per celle. Denne "hybridiserede signal"-score (H-score) metode kan således vurdere omfang og variabilitet i Drd1α udtryk på tværs af individuelle celler.

Den semi-kvantitative tilgang til den "diskrete prik" farvning mønster giver en kategorisk variabel, der er ordenstal i naturen (dvs. antallet af prikker per celle rangeret fra laveste (1) til højeste (9)) for yderligere statistisk analyse. I den foreliggende undersøgelse var vi interesseret i at undersøge effekten af én mellem fag faktor (dvs., sex) på Drd1α udtryk i NAc. For at tage hensyn til den indlejrede datastruktur (dvs. to Z-stak billeder af Drd1α mærket celler i NAc blev opnået for hvert dyr), gennemsnitlige Tæl værdier blev beregnet for hver kategori og brugt til statistisk analyse (mandlige: n= 3, kvinde: Nielsen = 3). I betragtning af vores interesse i at undersøge forskelle i én mellem fag faktor (dvs., sex) med to grupper (dvs mandlige, kvindelige) en Mann-Whitney U blev test udført for at vurdere forskelle i median celletal (figur 2D). En Mann-Whitney U test afslørede en betydelig hovedeffekten af sex [z=-5.8, p≤0.001], med kvindelige dyr viser en nedsat median cellen score i forhold til handyr. Figur 2E og 2F illustrerer hyppigheden af celler i hver kategori ved hjælp af to metoder: relative hyppighed og kumulative frekvens. Hundyr vises et betydeligt skift i distribution, med en større hyppighed af celler i lavere ordnede kategorier i forhold til handyr. En Mantel-Haenszel test af Foreningen blev udført for at undersøge statistisk fordeling, afslører en signifikant effekt af sex [χ2MH(1) = 67,3, p≤0.001]. Således samlet set tyder resultaterne klart sex forskelle i Drd1α udtryk i NAc.

I tilfælde hvor kopi antallet afskriften er meget høj, kan signalerne vises som klynger. Her, tyrosin hydroxylase udtryk (TH) i SNR region viste "klynger" farvning mønster (figur 3A). For at kvantificere denne høj-udtrykker markør, gennemsnit vi først baggrund intensitet fra otte forskellige baggrund områder. Efter angiver tærsklen minimum intensitet over de gennemsnitlige baggrundskoncentrationer intensitet, blev justeret billede intensitet analyseret som signal pr. celle af TH.

I betragtning af vores interesse i at undersøge en mellem fag faktor (dvs., sex), er en uafhængig prøver t-test en passende statistisk metode. Til analysen blev data log-transformeret. For at tage hensyn til den indlejrede datastruktur (dvs. to Z-stak billeder af TH mærket celler i SNR blev opnået for hvert dyr), gennemsnitlige værdier blev beregnet og anvendes til statistisk analyse (mandlige: n= 2, kvinde: n= 3). Hundyr vises en betydelig stigning i gennemsnitlige signal intensitet (figur 3B), tyder på et højere niveau af samlede TH udtryk, i forhold til handyr (t(3) = 3,3, p≤0.05). Dog ingen betydelig sex forskelle blev observeret i enten antallet af celler pr. billede (t(3) = 2.0, p> 0,05; Figur 3 c) eller middelværdien signal udtryk pr. celle (t(3) = 2.0, p> 0,05; Figur 3D). En blandet design ANOVA, overvejer de tre foranstaltninger som en faktor, inden for emnet, også afsløret en betydelig hovedeffekten af sex [F (1,3) = 10.6, p≤0.05].

Figure 1
Figur 1: kriterier for semi-kvantitative analyse på det gennemsnitlige antal prikker pr. celle til farvning mønster: "diskret prikker". A. repræsentative Konfokal billeder (60 X) af Drd1α udtryk på forskellige scores (forstærket 250% skala i forhold til oprindelig billedstørrelse) B. Den særlige "score" kategori for hvert kriterium. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: dopamin D1-alpha receptor (Drd1α) RNA niveau i Nucleus Accumbens region af F344/N rotter. A. relative hyppighed % af hver "score". B. en sigmoide dosis-respons kurve forudsat en velbeskrevet fit (r2= 0,99) med 95% konfidensintervaller (CI; angives med stiplede linjer) var egnet til de kumulative frekvens % af hver "score" kategori. C. repræsentative Konfokal billeder (60 X) af Drd1α udtryk i han- og hunrotter, der har de "diskrete prikker" farvning mønster. D. Repræsentative graf over den gennemsnitlige celle score i han- og hunrotter. Fejllinjer står for standardafvigelsen på middelværdien (SEM). E. relative hyppighed % af hver "score" kategori, sammenligne udtryk i væv fra han- og hunrotter. F. sigmoide dosis-respons-kurver forudsat en velbeskrevet fit (r2s = 0,99) med 95% konfidensintervaller kumulative frekvens % af hver "score" kategori mellem han- og hunrotter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: tyrosin hydroxylase RNA niveau (TH) i Substantia Nigra (SNR) region i F344/N rotter. A. repræsentative Konfokal billeder (60 X; Excitation: 543 nm; Emission: 590/50 nm) af TH udtryk i han- og hunrotter, der har de "klynger" farvning mønster. B-D. Repræsentative analyse af signal intensitet pr. celle. Signal udtryk / celle kan være afledt af kvantificere signal intensiteten af billedet (med intensitet threshold sæt over baggrunden) og dividere den med antallet af celler i billedet. Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien (SEM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Decision Tree til anbefalede statistisk analyse. Beslutningstræet indeholder retningslinjer for fastsættelse af, hvilken statistisk analyse er mest hensigtsmæssige for forskningsspørgsmål af interesse. Beslutningstræet er ikke udtømmende og i nogle tilfælde andre analyser kan være relevant. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol beskriver vi en roman teknik i situ hybridisering til frisk frosset hjernen skiver til at evaluere Drd1α receptor udtryk i nucleus accumbens (NAc) og tyrosin hydroxylase (TH) udtryk i regionen substantia nigra (SNR). Vi leverer også metoder til analyse af data for forskellige farvning mønstre: "diskret dot" eller "klynger".

De kritiske trin til en vellykket multiplex fluorescens RNA i situ hybridisering assay er inkluderet. Når hugger rotten og fjerne hjernen, fryse hjernen i flydende kvælstof indenfor 5 min. holde hjernen sektioner på-20 ° C indtil 4% PARAFORMALDEHYD fiksation. Efter 30 min inkubation af forbehandling 4 skal dias ikke bo i 1 x PBS længere end 15 min. Lad ikke hjernen sektioner tørre ud mellem forstærkning trin. Konfokal imaging er meget nyttigt for at levere høj kvalitetsbilleder viser klare farvning signaler i vævsprøve. Ved hjælp af hybridisering ovnen vil hurtigt og effektivt bringe prøverne til 40 ° C.

De enkelte fluorescens signaler af Drd1α receptor udtryk i NAc blev identificeret som enkelt "prikker," hver især repræsenterer en enkelt RNA udskrift i cellen. Vigtigere, afspejler "dot" størrelse forskelle i assay betingelser, prøveforberedelse, og andre faktorer snarere end Drd1α-RNA udtryk niveauer. Signal intensiteten af individuelle "prikker" er heller ikke relevant for Drd1α-RNA udtryk niveauer. Vi vurderede det dynamiske område af dette udtryk som en semi-kvantitative analyse scorede "0-9" baseret på antallet af prikker per celle, som kan vurdere omfang og variabilitet i Drd1α udtryk. Desuden indeholder undersøgelse af antallet af prikker per celle en kategoriske variable for yderligere statistiske analyser.

Efter undersøgelse af beskrivende statistik anbefaler vores protokol tre vigtigste metoder til statistisk analysere signaler om, at præsenterer den "diskrete prik" farvning mønster, som giver en ordinal variabel for yderligere analyse. Specifikt, anbefales en ikke-parametrisk Mann-Whitney U test, en ikke-parametrisk Kruskal-Wallis test og en Mantel-Haenszel test af foreningen. En Mann-Whitney U test og en Kruskal-Wallis test er mest hensigtsmæssig når behandlingen kun en mellem-fag faktor (f.eks. køn). Derudover kan en Mantel-Haenszel test af foreningen være relevante for behandlingen af ændringer i fordelingen. Mere komplekse statistiske analyser, herunder en generel vurdering ligning eller generelle lineære blandede model kan være hensigtsmæssigt, når yderligere faktorer er inkluderet. Anbefalingerne er ikke udtømmende, og den præcise statistiske tilgang vil være afhængig af forsøgsdesign og forskningsspørgsmål af interesse.

Men i tilfælde hvor kopi antallet afskriften er meget høj, signalerne kan vises som klynger. Her, TH udtryk i regionen SNR viste "klynger" farvning mønster. For at kvantificere den høj-udtrykker TH markør, justeret vi billedet intensiteten baseret på fastlæggelse af tærsklen minimum intensitet over de gennemsnitlige baggrundskoncentrationer intensitet, og analyseret som signal pr. celle af TH. Signaler, der præsenterer "klynge" farvning mønster, som TH i SNR, statistisk kan analyseres ved hjælp af en uafhængig prøver t-test eller ANOVA at sammenligne grupper.

Der er begrænsninger i denne roman RNA i situ hybridisering assay. For den "diskrete dot" farvning mønster, omfatter disse hvordan du kan definere en enkelt celle mere præcist. I vores undersøgelse for at identificere den enkelte celle fra billedet, udført vi DAPI farvning som nukleare markør. Det er imidlertid stadig vanskeligt at analysere visse dele af hjernevæv, da den har flere typer af celler med uregelmæssig figurer af kerner og/eller celler. Her, tildele to erfarne forskere separat hver celle fra billeder til at definere celle regionen. For "klynger" farvning mønster, bør specifikke software vælges setup tærskel eller automatiske celle kendskabet.

Således, den innovative RNA i situ hybridisering assay aktiveret os til at undersøge mekanismerne påvirker både DA optagelsen og DA release samtidigt, bedre forståelse af kompleksiteten af striatal DA system. Samlet set forskere ville drage fordel af den roman RNA i situ hybridisering teknik når undersøger dysfunktionelle ændringer dopaminerge markører i løbet af fremkomsten og udviklingen af hjernen lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der er ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

De nuværende værker blev støttet af nationale kontorer i Health (NIH) tilskud HD043680, MH106392, DA013137 og NS100624. Delvis Fonden blev leveret af en NIH T32 uddannelse grant i biomedicinsk-adfærdsmæssige videnskab.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HybEZ Oven system Advanced Cell Diagnostics  310010
RNAscope Probe - Rn-Drd1a Advanced Cell Diagnostics  317031 Color channel 1, Green
RNAscope Probe - Rn-Th-C2 Advanced Cell Diagnostics  314651-C2 Color channel 2, Orange
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit Advanced Cell Diagnostics  320850
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratory H-4000
SuperFrost Plus Slides Fisher Scientific 12-550-154% 
4% paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
Sevoflurane Merritt Veterinary Supply 347075
Tissue-Tek vertical 24 slide rack Fisher Scientific NC9837976
Tissue-Tek staining dish Fisher Scientific NC0731403
Precision General Purpose Baths ThermoFisher Scientific TSGP28
Pretreatment 4 Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
ProLong Gold anti-fade reagent Life Technologies P36930
Amp 1-FL Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
Amp 2-FL Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
Amp 3-FL Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
Amp 4-FL-Alt A Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
EZ-C1 software package Nikon Instruments version 3.81b
SAS/STAT Software SAS Institute, Inc., version 9.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
  2. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  3. Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
  4. Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
  5. Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
  6. Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).
  7. Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neuroscience. 255, 246-254 (2013).
  8. Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
  9. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
  10. Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
  11. Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
  12. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
  13. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).

Tags

Neurovidenskab sag 133 RNA hybridisering dopamin D1-alpha receptor (Drd1α) i situ neurovidenskab biologiske køn rotte
Identifikation af dopamin D1-Alpha Receptor inden for gnavere kernen Accumbens af en innovativ RNA <em>In Situ</em> opdagelse teknologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H., Illenberger, J. M.,… More

Li, H., Illenberger, J. M., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology. J. Vis. Exp. (133), e57444, doi:10.3791/57444 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter