Summary
Identifikation der Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor in dem Nucleus Accumbens ist von entscheidender Bedeutung für die Klärung von D1-Rezeptor Dysfunktion während eine Erkrankung des zentralen Nervensystems. Wir haben einen neuartigen RNA in Situ Hybridisierung-Assay um einzelne RNA-Moleküle in einem bestimmten Hirnareal zu visualisieren.
Abstract
In das zentrale Nervensystem ist der D1-Alpha-Rezeptor Subtyp (Drd1α) die am häufigsten vorkommende Dopamin (DA)-Rezeptor, der spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der neuronale Wachstum und Entwicklung. Die Mechanismen, die Drd1α Rezeptor Anomalien Vermittlung Verhaltensreaktionen und modulierende Working Memory-Funktion sind jedoch noch unklar. Mit einem neuartigen RNA in Situ Hybridisierung Assay, identifiziert die aktuelle Studie Drd1α Dopamin Rezeptor und Tyrosin Hydroxylase (TH) RNA Ausdruck von DA-bezogene Schaltungen in den Nucleus Accumbens (NAc) Bereich und Substantia Nigra Region (SNR), bzw.. Drd1α Ausdruck in der NAc zeigt einen "diskrete Dot" Färbung Muster. Deutliche Geschlechtsunterschiede in Drd1α Ausdruck wurden beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigt TH ein "gruppierte" Färbung Muster. Zu TH Ausdruck angezeigt weibliche Ratten einen höheren Signal Ausdruck pro Zelle im Vergleich zu männlichen Tieren. Die hier vorgestellten Methoden bieten eine neuartige in Situ Hybridisierung Technik für die Untersuchung von Veränderungen der Dopamin-System Funktionsstörung während das Fortschreiten der Erkrankungen des zentralen Nervensystems.
Introduction
Dysfunktion des striatalen Dopamin-Systems beteiligt sich das Fortschreiten der klinischen Symptome bei mehreren neurokognitiven Krankheiten beobachtet. Dopamin-D1-Rezeptoren sind in den präfrontalen Kortex (PFC) und striatalen Regionen des Gehirns und stark beeinflussen kognitive Prozesse1, einschließlich der Verwendung von Speicher, zeitliche Verarbeitung und Lokomotive Verhalten2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. frühere Studien aufgeklärt, dass Änderungen der Dopaminrezeptoren D1 verbunden mit dem Fortschreiten der Aufmerksamkeit Defizit-Hyperaktivität-Störung (ADHS)8, die neurokognitiven Symptome bei Schizophrenie9, waren 10 und Stress Anfälligkeit11. Insbesondere bei Schizophrenie zufolge Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Studien die Bindungsfähigkeit der Dopamin-D1-Rezeptoren in den präfrontalen Cortex hoch mit kognitiven Defiziten und die Anwesenheit von negativen Symptomen11zusammenhing. Das dendritische Wachstum der exzitatorischen Neuronen im präfrontalen Cortex von Dopamin D1-Rezeptor reguliert lindert Stressempfindlichkeit. Darüber hinaus könnte die Knockdown von D1-Rezeptor im medialen präfrontalen kortikalen (mPFC) Neuronen soziale Niederlage Stress-induzierte soziale Vermeidung12verbessern.
Hier stellen wir eine neuartige Technik der RNA in Situ Hybridisierung, einzelnen RNA-Moleküle in einer Zelle mit Tiefkühlfrische Gewebeproben zu visualisieren. Das vorliegende Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber Methoden, die in der aktuellen Literatur vorhanden sind. Zuerst die aktuelle Prozedur bewahrt den räumlichen und morphologischen Kontext des Gewebes und wurde am Tiefkühlfrische Gewebeproben durchgeführt, so dass andere Verfahren, die frische, nicht eingebettete Gewebe mit den aktuellen Methoden kombiniert werden können. Ähnliche Verfahren in Formalin fixiert und Paraffin-eingebetteten Gewebe haben gezeigt, dass einzelne Transkription Auflösung mit einer RNA in Situ Hybridisierung Technik13erreicht werden kann. Erkennung von RNA Ebene der einzelnen Transkription bietet höhere Sensitivität zu niedrigen Kopie Zahlenausdruck sowie die Möglichkeit, Genexpression auf der Ebene einzelner Zellen vergleichen, die von anderen Nukleinsäure-Nachweismethoden nicht erreicht werden kann, wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Techniken. Darüber hinaus unterhält die aktuelle Methode Bilder mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis durch hochspezifische RNA-Sonden, die hybridisiert, einzelnes Ziel-RNA-Transkripte und nacheinander gebunden mit einer Kaskade von Signalmolekülen Verstärkung bei der Erkennung System. Zu guter Letzt bietet die gegenwärtige Technologie die Möglichkeit, mehrere biologische Systeme mit der Target-spezifische proprietären Sonden, anstatt unsere Untersuchung auf nur eine Klasse von systembezogenen Markierungen wie Proteindetektion durch Begrenzung zu bewerten immunhistochemische Methoden.
In unserer Studie haben wir diese neuartige RNA in Situ Hybridisierung, um Drd1α-Rezeptor-Expression in dem Nucleus Accumbens (NAc) und Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Ausdruck in der Substantia Nigra (SNR) zu bewerten sowohl weibliche als auch männliche F344/N Ratten verwendet. Die innovative RNA in Situ Hybridisierung konnten wir Mechanismen beeinflussen DA Aufnahme und DA Freigabe gleichzeitig, ein besseres Verständnis der Komplexität der striatalen DA System zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Vorgehensweise Tiefkühlfrische Gehirn Scheiben und Methoden der Datenanalyse für unterschiedliche Färbung Muster: "diskrete Dot" oder "Cluster".
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Protocol
Experimentelle Protokoll stimmte die Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der University of South Carolina (Bundesrepublik Qualitätssicherung Nummer: A3049-01).
1. Vorbereitung des frischen gefrorene Gehirn Abschnitte
- Verwenden Sie die F344/N Ratten Belastung: drei Ratten beider Geschlechter, 13 Monate alt, Körpergewicht ca. 320 g.
- Passen Sie die Sevofluran Konzentration auf 5 % (Überdosierung von Sevofluran). Sevofluran Exposition nach Atmung stoppt für eine weitere Minute weiter.
- Die Ratte zu enthaupten und das Gehirn zu entfernen.
- Tauchen Sie die Rattengehirn in flüssigem Stickstoff für 15 s innerhalb von 5 min Gewebe Ernte.
- Equilibrate das Gehirn auf-20 ° C in einem Kryostaten für 1 h.
- 30 µm Abschnitte schneiden und übertragen auf Folien (siehe Tabelle der Materialien).
- Der Nucleus Accumbens Region, ca. 2,76 mm 2,28 mm anterior Bregma14Abschnitte auswählen.
- Schneiden Sie Rattengehirn aus den Riechkolben kontinuierlich durch die Nucleus Accumbens Region nach der stereotaktischen Gehirnstruktur der Ratte.
- Montieren Sie die Proben auf die Folien. Halten Sie die Abschnitte bei-20 ° C für 10 min trocknen lassen.
- Sofort Tauchen Sie Folien in die vorgekühlt 4 % Paraformaldehyd für 1 h bei 4 ° C.
- Legen Sie die Folien in einer zunehmenden Ethanol Steigung bei Raumtemperatur (RT): 50 % EtOH für 5 min; 70 % EtOH für 5 min; und 100 % EtOH für 5 Minuten.
- Wiederholen Sie dies mit frischen 100 % EtOH.
- Folien auf Küchenpapier legen und an der Luft trocknen.
- Zeichnen Sie eine Barriere um jeden Abschnitt mit einem Barriere-Stift (siehe Tabelle der Materialien). Lassen Sie die Barriere für 1 min vollständig trocknen.
2. Vorbehandlung des Gehirns Abschnitte
- Schalten Sie den Ofen und stellen Sie die Temperatur auf 40 ° C.
- 3 Tropfen (90 µL) Vorbehandlung 4 Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) auf jedes Gehirn Prüfungsteil (eine pro Folie).
- Die Abschnitte für 30 min bei RT inkubieren
- Tauchen Sie die Folien mit 1 X PBS-Puffer für 1 min bei RT. Repeat mit frischen 1 X PBS.
Hinweis: Dias sollte nicht mit 1 X PBS-Puffer für länger als 15 Minuten bleiben.
3. RNA In Situ Hybridisierung fluoreszierende Multiplex-Assays
- Erwärmen Sie die Ziel-Sonde für 10 min bei 40 ° C im Wasserbad und kühlen Sie ab, RT
- Legen Sie die RNA-Reagenz (z. B. Amp 1-4 FL) bei RT
- Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus Folien mit saugfähigem Papier und Ort wieder auf die Folie-Rack (siehe Tabelle der Materialien).
- Geben Sie 3 Tropfen (90 µL) der Drd1α Sonde (C1) auf die Probe-Scheibe. 2 h bei 40 ° c inkubieren
- Tauchen Sie Folien in 1 x Waschpuffer für 2 Minuten bei RT Repeat mit frischen 1 x Waschpuffer.
- Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Folien mit saugfähigem Papier und Ort wieder auf die Folie-Rack (siehe Tabelle der Materialien).
- Fügen Sie 3 Tropfen (90 µL) von Amp 1-FL auf die Probe-Scheibe. 30 min bei 40 ° c inkubieren
- Tauchen Sie Folien in 1 Waschpuffer für 2 min bei RT. Repeat mit frischen 1wash-Puffer.
- Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Folien mit saugfähigem Papier und Ort wieder auf die Folie-Rack (siehe Tabelle der Materialien).
- Fügen Sie 3 Tropfen (90 µL) des Amp 2-FL auf die Probe-Scheibe. 15 min bei 40 ° c inkubieren
- Tauchen Sie Folien in 1 x Waschpuffer für 2 Minuten bei RT Repeat mit frischen 1 x Waschpuffer.
- Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Folien mit saugfähigem Papier und Ort wieder auf die Folie-Rack (siehe Tabelle der Materialien).
- Fügen Sie 3 Tropfen (90 µL) von Amp 3-FL auf die Probe-Scheibe. 30 min bei 40 ° c inkubieren
- Tauchen Sie Folien in 1 x Waschpuffer für 2 min bei RT. Repeat mit frischen 1 x Waschpuffer.
- Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Folien mit saugfähigem Papier und Ort wieder auf die Folie-Rack (siehe Tabelle der Materialien).
- Fügen Sie 3 Tropfen (90 µL) von Amp 4-FL-Alt A auf die Probe-Scheibe. 15 min bei 40 ° c inkubieren
- Tauchen Sie Folien in 1 x Waschpuffer für 2 Minuten bei RT Repeat mit frischen 1 x Waschpuffer.
- Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus Folien und sofort 2 Tropfen Reagenz Montage (siehe Tabelle der Materialien) auf jedem Abschnitt.
- Ein 22 mm-22 mm-Deckglas zu platzieren (siehe Tabelle der Materialien) über jeden Abschnitt des Gehirns.
- Lagern Sie Folien im Dunkeln bei 2 bis 8 ° C trocken.
- Schalten Sie das konfokale Mikroskop und wechseln Sie zu einem 60 X Objektiv.
- Z-Stapel Bilder mit einem konfokalen Mikroskop zu erhalten. Sehen Sie das ergänzende Video für ein Detail-Verfahren der konfokalen Abbildung.
- Bilder von Drd1α Zellen in der Nucleus Accumbens Region beschriftet (Anregung: 488 nm; Emission: 515/30 nm).
Hinweis: Nicht in lassen Sie Gehirn, die Abschnitte zwischen Inkubationsschritte austrocknen.
(4) Datenanalyse
- Semi-quantitativ analysieren die Färbung Muster: "diskrete Punkte".
- Um die einzelnen Zelle aus dem Bild zu erkennen, führen Sie DAPI-Färbung als nukleare Marker. Es ist jedoch nach wie vor schwierig, bestimmte Teile des Gehirngewebes zu analysieren, da es mehrere Arten von Zellen mit unregelmäßiger Form von Kernen und/oder Zellen hat. Hier ordnen zwei erfahrene Forscher separat jede Zelle von Bildern zu Zelle definieren.
- Punkten Sie optisch jede Zelle innerhalb der repräsentativen konfokale Bilder basierend auf der Anzahl der Punkte pro Zelle anhand spezifischer Kriterien (Abbildung 1 b).
- Bestimmen Sie die Ergebniszelle Anzahl in jeder Kategorie und dividieren durch die Anzahl der Ergebniszelle X100, relative Häufigkeit Diagramme erstellen, die die prozentuale Häufigkeit der Zellen innerhalb jeder Kategorie für alle Gewebeschnitte (Abbildung 2A) und für Männer und Frauen anzeigen separat (Abb. 2E).
- Teilen Sie die Summe der Zellen in allen vorherigen Kategorien durch die Ergebniszelle Anzahl X100 die kumulative Häufigkeit von Zellen für alle Gewebeschnitte (Abb. 2 b) und für Männer und Frauen getrennt zu bestimmen (Abb. 2F).
- Die "diskrete Punkte" Färbung Muster (Optional) statistisch zu analysieren.
- Prüfen Sie die Anzahl der Punkte pro Zelle zu einer kategorialen Variablen, die in der Natur (d. h. die Anzahl der Zellen, die vom niedrigsten Zelle Ausdruck (1) zum höchsten Zelle Ausdruck (9) in jeder Rang Kategorie fallen) ordinal ist für weitere statistische Auswertungen.
- Nach Prüfung der deskriptiven Statistik verwenden drei Ansätze: eine Mantel-Haenszel-Statistik, ein Mann-Whitney U-Test und Kruskal-Wallis-Test. Obwohl der genaue statistische Ansatz abhängig sein wird kann die experimentellen Design und Forschung Frage von Interesse, eine statistische Entscheidungsbaum (Abbildung 4) Hilfe bei Entscheidungen bezüglich des analytischen Ansatzes.
- Quantifizieren der Signalintensität in der Region of Interest (ROI) für das Beflecken Muster: "Cluster".
- Berechnen Sie die Signalstärke der einzelnen Bilder unter Verwendung der folgenden Gleichung:
Signal-Intensität = Gesamtintensität des ROI Bild - (durchschnittliche Intensität × Gesamtbild Hintergrundbereich) - Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen innerhalb von ROI-Bild, um den ungefähren Signal Ausdruck pro Zelle zu berechnen. Gruppenunterschiede in Signal Intensität/Bild sowie die Anzahl der Zellen/Bild möglicherweise von Interesse Mechanismen zu berücksichtigen, die zur Gruppenunterschiede in Signal Ausdruck/Zelle beitragen können (Abb. 3 b-3D).
- Berechnen Sie die Signalstärke der einzelnen Bilder unter Verwendung der folgenden Gleichung:
- Die "Cluster" Färbung Muster (Optional) statistisch zu analysieren.
- Untersuchen Sie die Signal Ausdruck/Zelle, um eine kontinuierliche Variable für weitere statistische Auswertungen zur Verfügung zu stellen. Verwenden Sie zwei Ansätze, inklusive einer unabhängigen Stichproben t-Test und Varianzanalyse (ANOVA), basierend auf der Anzahl der Faktoren zwischen Themen in die Gestaltung einbezogen. Ein statistische Entscheidungsbaum (Abb. 4) kann helfen bei der Entscheidungsfindung bezüglich der am besten geeignete statistische Ansatz.
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Representative Results
Die aktuelle Studie beobachtet eine "diskrete Punkte" Färbung Muster für RNA-Expression in den Dopamin-D1-Alpha-Rezeptoren (Drd1α) von der NAc in F344/N Ratten (Abbildung 1A). Einzelnen Fluoreszenz Signale waren leicht zu erkennen und zu sehen als einzigen "Dots", von denen jede einen einzelnen RNA-Transkript innerhalb der Zelle darstellt. Für Bilder von der NAc, die die "diskrete Punkte" Färbung Muster zeigen, untersuchten wir den dynamischen Bereich des Ausdrucks mit einer semi-quantitative Analyse (Abbildung 1A, Abb. 2Aund 2 b). Jede Zelle wurde von "0-9" basierend auf der Anzahl der Punkte pro Zelle gezählt. Dieses "hybridisierten Signal"-Score (H-Wert) Methode kann damit beurteilen, das Ausmaß und die Variabilität für Drd1α Ausdruck über einzelne Zellen.
Der semi-quantitativen Ansatz für die "diskrete Dot" Färbung Muster bietet eine kategoriale Variable, die in der Natur (d. h. die Anzahl der Punkte pro Zelle vom niedrigsten Rang (1) zum höchsten (9)) zur weiteren statistischen Analyse ordinal ist. In der vorliegenden Studie waren wir untersuchen die Wirkung eines Faktors zwischen Fächern (z.B. Sex) auf Drd1α Ausdruck in der NAc interessiert. Um die verschachtelte Datenstruktur (d. h. zwei Z-Stapel Bilder von Drd1α Zellen in NAc beschriftet wurden für jedes Tier erhalten), durchschnittliche Anzahl Werte berechnet für jede Kategorie und für statistische Analysen verwendet wurden (männlich: n= 3, Weiblich: n = 3). Unser Interesse an untersucht Unterschiede in ein Faktor zwischen Themen (z.B. Geschlecht) mit zwei Gruppen (d.h., männlich, weiblich) ein Mann-Whitney-U wurde Test durchgeführt, um Unterschiede in der mittlere Zellzahl (Abb. 2D) zu beurteilen. Ein Mann-Whitney U Test zeigte einen signifikanten Haupteffekt des Geschlechts [Z= 5,8 p≤0.001], mit weiblichen Tieren zeigt eine geringere mittlere Zelle Punktzahl im Vergleich zu männlichen Tieren. Abb. 2E und 2F illustrieren die Frequenz der Zellen in jeder Kategorie mit zwei Methoden: relative Häufigkeit und die kumulierte Häufigkeit. Weibliche Tiere eine deutliche Verschiebung in der Verteilung, mit größerer Häufigkeit von Zellen im unteren geordnete Kategorien im Vergleich zu männlichen Tieren angezeigt. Ein Mantel-Haenszel-Test des Verbandes wurde durchgeführt, um statistisch untersuchen, die Verteilung, offenbart einen signifikanten Effekt der Sex [χ2MH(1) = 67,3, p≤0.001]. Insgesamt, so deuten die Ergebnisse deutliche Geschlechtsunterschiede in Drd1α Ausdruck in der NAc.
In Fällen wo die Kopienzahl der Niederschrift sehr hoch ist, können die Signale als Cluster angezeigt. Hier zeigte Tyrosin Hydroxylase Ausdruck (TH) SNR-Region die "Cluster" Färbung Muster (Abb. 3A). Zur Quantifizierung dieser hoch exprimierenden Marker gemittelt wir zuerst die Hintergrundintensität aus acht verschiedenen Hintergrundbereiche. Nach der Einstellung der Mindestintensität Schwellenwerts oberhalb der durchschnittlichen Hintergrundintensität, wurde die eingestellte Bildintensität als Signal pro Zelle th. analysiert.
Da unser Interesse bei der Prüfung ein Faktor zwischen Fächern (z.B. Sex), ist ein unabhängige Stichproben t-Test ein geeigneter statistischer Ansatz. Für die Analyse wurden Daten, Log umgewandelt. Um die verschachtelte Datenstruktur (d. h. zwei Z-Stapel Bilder von TH Zellen in SNR beschriftet wurden für jedes Tier erhalten), Durchschnittswerte berechnet und zur statistischen Auswertung verwendet wurden (männlich: n= 2, Weiblich: n= 3). Weibliche Tiere angezeigt einen deutlichen Anstieg durchschnittliche Signalintensität (Abb. 3 b), ein höheres Maß an insgesamt TH Ausdruck im Vergleich zu männlichen Tieren andeutend (t(3) = 3.3, p≤0.05). Allerdings wurden keine signifikanten Geschlechtsunterschiede in entweder die Anzahl der Zellen pro Bild beobachtet (t(3) = 2,0, p> 0,05; Abbildung 3) oder den Mittelwert Ausdruck pro Zelle signalisieren (t(3) = 2,0, p> 0,05; Abbildung 3D). Eine gemischt-Design ANOVA, unter Berücksichtigung der drei Maßnahmen als ein Faktor im Thema offenbart auch ein signifikanten Haupteffekt des Geschlechts [F (1,3) = 10,6, p≤0.05].
Abbildung 1: Kriterien der semi-quantitative Analyse auf die durchschnittliche Anzahl der Punkte pro Zelle zum Färben Muster: "diskrete Dots". A. Vertreter konfokale Bilder (60 X) des Drd1α Ausdrucks bei verschiedenen Partituren (250 % Skala im Vergleich zu Bild Originalgröße verstärkt) B. Die bestimmten "Punkten" Kategorie für jedes Kriterium. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Dopamin D1-Alpha-Rezeptor (Drd1α) RNA-Ebene im Nucleus Accumbens Region F344/N Ratten. A. die relative Häufigkeit % jeder "Score"-Kategorie. B. eine sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurve zur Verfügung gestellt einer gut beschriebenen Passform (R2= 0,99) mit 95 %-Konfidenzintervall (CI; durch die gestrichelten Linien gekennzeichnet) war die kumulative Häufigkeit % jeder "Partitur" Kategorie passen. C. repräsentative konfokale Bilder (60 X) des Drd1α Ausdrucks im männlichen und weiblichen Ratten, die die "diskrete Punkte" Färbung Muster haben. D. Repräsentative Graph der mittleren Zelle Partitur bei männlichen und weiblichen Ratten. Die Fehlerbalken stehen für den Standardfehler von Mittelwert (SEM). E. die relative Häufigkeit % jeder "Score"-Kategorie, Ausdruck in den Geweben von männlichen und weiblichen Ratten zu vergleichen. F. sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurven zur Verfügung gestellt einer gut beschriebenen Passform (R2s = 0,99) mit 95 %-Konfidenzintervall den kumulierten Häufigkeit % jeder "Partitur" Kategorie zwischen männlichen und weiblichen Ratten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Tyrosin-Hydroxylase RNA-Ebene (TH) in der Substantia Nigra (SNR) Region in F344/N Ratten. A. Vertreter konfokale Bilder (60 X; Anregung: 543 nm; Emission: 590/50 nm) Meinungsäußerung TH bei männlichen und weiblichen Ratten, die die "Cluster" Färbung Muster haben. B-D. Repräsentative Analyse der Signalintensität pro Zelle. Signal-Ausdruck / Zelle aus Quantifizierung der Signalintensität des Bildes (mit Intensität Schwelle über Hintergrund) und dividiert durch die Anzahl der Zellen innerhalb des Bildes abgeleitet werden kann. Die Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Decision Tree für empfohlene statistische Analyse. Der Entscheidungsbaum enthält Richtlinien für die Bestimmung der statistischen Analyse am besten geeignet für die Fragestellung von Interesse ist. Der Entscheidungsbaum ist nicht vollständig und in einigen Fällen möglicherweise andere Analysen geeignet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir eine neuartige Technik der in Situ Hybridisierung für Tiefkühlfrische Gehirnscheiben, Drd1α-Rezeptor-Expression in dem Nucleus Accumbens (NAc) und Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Ausdruck in der Substantia Nigra (SNR) Region zu bewerten. Wir bieten auch Methoden der Datenanalyse für unterschiedliche Färbung Muster: "diskrete Dot" oder "Cluster".
Die entscheidenden Schritte für einen erfolgreichen Multiplex-Fluoreszenz RNA-Assay in Situ Hybridisierung sind im Preis inbegriffen. Sobald enthaupten die Ratte und das Gehirn zu entfernen das Gehirn einfrieren in flüssigem Stickstoff innerhalb von 5 min. halten Sie die Gehirn-Abschnitte bei-20 ° C bis 4 % Paraformaldehyd Fixierung. Nach 30 min Inkubation der Vorbehandlung 4 sollten die Folien nicht mit 1 X PBS-Puffer für länger als 15 min bleiben. Lassen Sie sich nicht von Gehirn, die Abschnitte zwischen Verstärkung Schritte austrocknen. Konfokale Bildgebung ist sehr hilfreich für die Bereitstellung von qualitativ hochwertigen Bildern zeigen deutliche Färbung Signale in Gewebeprobe. Verwendung des Ofens Hybridisierung wird schnell und effizient die Proben bis 40 ° C.
Die einzelnen Fluoreszenz-Signale der Drd1α-Rezeptor-Expression in den NAc wurden als einzelne "Dots," repräsentieren jeweils einen einzelnen RNA-Transkript innerhalb der Zelle identifiziert. Wichtig ist, spiegelt "Punktgröße" Unterschiede in der Assay-Bedingungen, Probenvorbereitung, und andere Faktoren als Drd1α-RNA Ausdruck Niveaus. Ebenso ist die Signalstärke der einzelnen "Punkte" nicht für Drd1α-RNA Ausdruck Ebenen relevant. Wir beurteilen die Dynamik dieses Ausdrucks als semi-quantitative Analyse erzielte mit "0-9" basierend auf der Anzahl der Punkte pro Zelle, die das Ausmaß und die Variabilität für Drd1α Ausdruck beurteilen können. Darüber hinaus bietet die Prüfung der Anzahl der Punkte pro Zelle eine kategoriale Variablen für weitere statistische Auswertungen.
Nach der Untersuchung der deskriptiven Statistik empfiehlt unser Protokoll drei Hauptansätze statistisch analysieren Signale, die den "diskreten Dot" Färbung Muster, wonach eine ordinale Variablen zur weiteren Analyse zu präsentieren. Insbesondere sind eine nichtparametrische Mann-Whitney U-Test, eine nichtparametrische Kruskal-Wallis-Test und ein Mantel-Haenszel-Test des Verbandes empfohlen. Ein Mann-Whitney U-Test und Kruskal-Wallis-Test sind besonders geeignet, wenn die Prüfung nur eine zwischen-Faktor (z.B. Sex) Themen. Darüber hinaus möglicherweise ein Mantel-Haenszel-Test des Vereins für die Untersuchung von Veränderungen in der Verteilung geeignet. Komplexere statistische Analysen, kann unter anderem eine allgemeine Schätzung Gleichung oder allgemeine lineare gemischte Modell angebracht, wenn zusätzliche Faktoren enthalten sind. Die Empfehlungen sind nicht erschöpfend, und der genaue statistische Ansatz werden abhängig von der Versuchsplanung und Fragestellung von Interesse.
In Fällen wo die Kopienzahl der Niederschrift sehr hoch ist, können die Signale jedoch als Cluster angezeigt. Hier zeigte TH Ausdruck im Großraum SNR Färbung Muster "Cluster". Zur Quantifizierung des hoch exprimierenden TH Markers haben wir angepasst Bildintensität basierend auf Festlegen des Schwellenwerts Mindestintensität oberhalb der durchschnittlichen Hintergrundintensität und analysiert als Signal pro Zelle th. Signale, die Färbung Muster, "Cluster" zu präsentieren, wie TH in die SNR, können statistisch ausgewertet werden, mithilfe einer unabhängiges Proben t-Tests oder ANOVA, Gruppen zu vergleichen.
Es gibt Einschränkungen des neuartigen RNA in Situ Hybridisierung Assays. Dazu gehören für die "diskrete Dot" Färbung Muster wie Sie eine einzelne Zelle genauer zu definieren. In unserer Studie durchgeführt, um die einzelne Zelle aus dem Bild identifizieren wir DAPI-Färbung als nukleare Marker. Es ist jedoch nach wie vor schwierig, bestimmte Teile des Hirngewebes zu analysieren, da es mehrere Arten von Zellen mit unregelmäßigen Formen von Kernen und/oder Zellen hat. Hier ordnen zwei erfahrene Forscher separat jede Zelle aus Bildern die Region Zelle definieren. Für die "Cluster" Färbung Muster sollten spezifische Software Schwelle oder automatische Zelle Waermetauscher Setup gewählt werden.
So konnten die innovative RNA in Situ Hybridisierung Assay Mechanismen beeinflussen DA Aufnahme und DA Freigabe gleichzeitig, Verbesserung des Verständnisses von der Komplexität des Systems der striatalen DA untersuchen. Alles in allem würde Forscher von neuartigen RNA in Situ Hybridisierung Verfahrens profitieren, bei der Untersuchung von dysfunktionaler Änderungen an dopaminergen Marker während der Entstehung und Verlauf von Erkrankungen des Gehirns.
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Disclosures
Es gibt keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Die vorliegenden Werke wurden von der National Institutes of Health (NIH) Zuschüsse, HD043680, MH106392, DA013137 und NS100624 unterstützt. Partielle Fonds sorgte ein NIH T32 Ausbildung Stipendium in Biomedical-Behavioral Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe - Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
| RNAscope Probe - Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |
References
- Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
- Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
- Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
- Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).
- Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neuroscience. 255, 246-254 (2013).
- Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
- Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
- Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
- Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).
