Summary
Qui, presentiamo omogeneo tempo risolto FRET (HTRF) come un metodo efficace per la rilevazione rapida di insulina secernuta dalle cellule.
Abstract
La rilevazione della secrezione dell'insulina è fondamentale per illuminante meccanismi di secrezione regolata anche negli studi di metabolismo. Anche se numerosi saggi di insulina sono esistite per decenni, il recente avvento di tecnologia tempo-risolta omogenea del Förster Resonance Energy Transfer (HTRF) ha notevolmente semplificato queste misurazioni. Questo è un saggio di ottico rapido, conveniente, riproducibile e robusto affidamento anticorpi coniugati a fluorofori luminose con emissione di lunga durata che facilita risolta in tempo Förster Resonance Energy Transfer. Inoltre, rilevamento di insulina HTRF è favorevole per lo sviluppo di saggi di screening ad alta resa. Qui usiamo HTRF per rilevare la secrezione dell'insulina in cellule INS-1E, una linea cellulare derivata da insulinoma del ratto. Questo ci permette di stimare i livelli basali di loro cambiamenti in risposta a stimolazione del glucosio e dell'insulina. Inoltre, utilizziamo questo sistema di rilevazione di insulina per confermare il ruolo della dopamina come un regolatore negativo della secrezione insulinica glucosio-mediata (GSIS). In modo simile, altri di dopamina D2-come agonisti del recettore, quinpirole e Bromocriptina, ridurre GSIS in un modo dipendente dalla concentrazione. I nostri risultati evidenziano l'utilità del formato di dosaggio di insulina HTRF nel determinare il ruolo dei numerosi farmaci in GSIS e loro profili farmacologici.
Introduction
La regolazione del metabolismo energetico è messo a punto da un importante ormone anabolizzante, insulina. L'insulina viene sintetizzata e rilasciato da cellule beta pancreatiche in risposta ai livelli aumentati del glucosio extracellulare. L'insulina rilasciata innesca l'assorbimento di glucosio da tessuti insulino sensibili1,2. Fisiologicamente, questo è legato all'elevazione della concentrazione di glucosio dopo un pasto, seguita dalla secrezione di insulina per regolare l'assorbimento del glucosio. Perturbazioni nell'omeostasi del glucosio conducono ai danni metabolici che culmina nell'insulino-resistenza e, infine, nell'insorgenza del diabete di tipo 22,3,4.
Anche se la secrezione dell'insulina è stata studiata estesamente, suoi meccanismi regolatori rimangono poco compresi. Un'area critica di indagine è stata l'identificazione di nuovi modulatori della secrezione di insulina dalle cellule beta5,6,7,8. Questi studi richiedono una migliore comprensione del rapporto accoppiamento tra stimolazione del glucosio e la secrezione di insulina. Di conseguenza, la possibilità di monitorare accuratamente e quantificare i livelli di secrezione insulinica glucosio-mediata (GSIS) è stato essenziale. Fin qui, tuttavia, solo un numero limitato di metodi era disponibile per consentire la quantificazione di GSIS utilizzando linee di cellule secernenti insulina e/o isole pancreatiche. Uno è la radioimmunoanalisi (RIA), che utilizza il radioisotopo-etichetta dell'insulina e gli anticorpi. Le principali limitazioni di questo approccio includono problemi di sicurezza dovuto la manipolazione e lo smaltimento di materiali radioattivi. Inoltre, questo metodo è laborioso, che coinvolgono più lunga lavaggio e le fasi di incubazione. Analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) è un altro approccio costoso e laborioso che utilizza anticorpi per il rilevamento di insulina. Variazione di affinità dell'anticorpo e dell'efficienza di riconoscere insulina stanno limitando i fattori di questo metodo e può influenzare la riproducibilità dei risultati. ELISA, né RIA è stato progettato per esperimenti di alto-rendimento. AlphaScreen è un dosaggio omogeneo utilizzato per il rilevamento e la misurazione dei livelli di secrezione dell'insulina. AlphaScreen tecnologia si basa sulla conversione dell'ossigeno ambientale in uno stato di singoletto eccitato ossigeno che possa reagire con specie a chemiluminescenza, conseguente generazione di chemiluminescenza. Perché il test sia omogeneo, molti i passaggi di lavaggio associato a RIA ed ELISA sono eliminati. Tuttavia, l'instabilità del segnale a causa della natura della reazione è un fattore limitante che può influenzare la lettura del test. (TR-tenaglia, sviluppato da Heyduk e colleghi9, è un altro approccio omogeneo alla misura dell'insulina basata sul legame degli anticorpi separati due epitopi diversi della molecola di insulina. Gli anticorpi sono ogni chimicamente legata al doppio DNA incagliato con strapiombi di DNA incagliati singoli complementari breve. Associazione degli anticorpi all'insulina li riunisce e porta ad un duplex di DNA incagliato doppio. Ogni anticorpo inoltre è associato con un fluoroforo donatore o accettore rispettivo, e l'associazione del duplex DNA riunisce questi fluorofori per generare il trasferimento di energia per risonanza (FRET). Uno dei potenziale limiti di TR-tenaglia, spetta tuttavia con il tasto stesso. L'incapacità di dissipare rapidamente fluorescenza di fondo durante la reazione di FRET può portare a livelli relativamente alti di fluorescenza di fondo e un basso rapporto segnale-rumore all'interno del dosaggio. Pertanto, sia ancora necessario per un'analisi affidabile, robusta e conveniente per quantificare GSIS in un modo ad alta velocità.
Gli avanzamenti recenti nella biofisica sono culminati nello sviluppo di un test di trasferimento (HTRF) basata risonanza energia omogenea fluorescenza risolta in tempo. In particolare, mentre l'energia di trasferimento all'interno l'analisi può essere descritto come basato su FRET, più precisamente, che HTRF si basa sulla luminescenza energia risonanza trasferimento (LRET)10 che è il non-radiative trasferimento di energia tra il donatore e accettore specie11,12,13. Questa distinzione è importante, poiché i tempi di una fluorescenza o tempra base FRET interazione è molto diversa da quella per LRET, anche se gli stessi tipi di gating possono essere utilizzati per FRET e LRET. Inoltre, l'uso di terre rare lantanidi cryptate composti quali europio o terbio cryptate in HTRF produce fluorescenza lunga emivita12,14. Questo offre un vantaggio unico dell'introduzione di un tempo di ritardo (µ sec) tra eccitazione del donatore e la misurazione del livello di emissione l'accettore (cioè, risolta in tempo saggio). Questo ritardo consente per un tempo sufficiente per la fluorescenza di fondo dissipare prima misurazione della fluorescenza emissione accettore. Di conseguenza, la lettura è libera di fluorescenza aspecifica e così, si ottiene un elevato rapporto segnale-rumore (Figura 1). Inoltre, la natura omogenea di HTRF Elimina la necessità per i passaggi di lavaggio per lavare via le specie non associate, che rende l'analisi molto più rapido rispetto ELISA o metodi basati su RIA.
Figura 1: schematica del meccanismo per il rilevamento di insulina HTRF. Due anticorpi monoclonali indipendentemente generati specificamente riconoscono e si legano all'insulina presso siti separati. Questi anticorpi sono coniugati per il donatore cryptate europio o l'accettore XL665. Eccitazione del donatore a 337 risultati nm in emissione a 620 nm. Il trasferimento di energia provoca XL665 a emettere ad una lunghezza d'onda, 665 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'utilizzo di un approccio basato su HTRF per determinare i livelli di GSIS dalle cellule INS-1E, una consolidata insulina-secrezione beta cellula-derivato ratto insulinoma cella linea15. Inoltre, questo dosaggio può essere usato per identificare il profilo farmacologico di molecolari regolatori della secrezione dell'insulina. Applichiamo questo dosaggio di insulina basata su HTRF per esaminare la dopamina D2-come regolazione del recettore di GSIS. Sempre più studi hanno rivelato che la dopamina del neurotrasmettitore è un regolatore importante di GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. dopamina colpisce GSIS in modo autocrino/paracrino negativo tramite azioni sulla dopamina D2-come i ricevitori (D2, D3, ricevitori4 D) espressi sulla superficie delle cellule pancreatiche beta8 , 16 , 19. usando questa analisi, abbiamo conferma del ruolo di dopamina come un regolatore negativo di GSIS e dimostrare che la dopamina D2-come bromocriptina agonisti del recettore e quinpirole ridurre anche GSIS.
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Protocol
1. INS-1E cellule: manutenzione e placcatura
- Mantenere cellule INS-1E in un incubatore 37 ˚C/5% CO2 e coltivate con medium RPMI 1640 completati con 5% (v/v) inattivati siero bovino fetale, 2 mM L-Glutammina, 10 mM HEPES, piruvato di sodio di 1 mM, 100 U/mL di penicillina/streptomicina soluzione, 50 µM β-mercaptoetanolo. Della coltura di cellule in 10 mL di terreno completo RPMI 1640 (per piastra), finché non raggiungono la confluenza di 80-90%, quando possono essere tripsinizzate e attraversate o utilizzati per il dosaggio di secrezione di insulina.
- 1 ° giorno: Media di aspirare e lavare le cellule una volta con 5 mL di PBS preriscaldata. Aggiungere 0,5 mL di tripsina (0.025%) diluito 1:1 in 0,5 mL di PBS tripsinizzano le cellule e incubare per 3-4 min a 37 ° c. Disattivare tripsina aggiungendo 9 mL completo media e cellule di trasferimento di una provetta da centrifuga da 15 mL pipettando.
- Pellet di cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet cellulare nei mezzi di comunicazione fresco di circa 5 mL.
- Prendere 10 µ l di cellule ri-sospensione e mescolare con 10 µ l di colorante vitale tripan blu per verificare la vitalità cellulare. Contare le celle vivi e morte in 10 µ l di questa miscela utilizzando un emocitometro. Livello di redditività dovrebbe essere superiore al 90%. Diluire le cellule risospese in media fresco per 1 milione di cellule per mL.
- Le cellule di INS-1E 0,5 mL di seme per pozzetto in una poli-L-lisina prerivestiti piastra a 24 pozzetti, ad una densità di 500.000 cellule per pozzetto.
- 2 ° giorno: Rimuovere media 18-24 h dopo la placcatura e aggiungere 500 µ l/pozzetto di fresco RPMI 1640 media. Incubare le cellule per altre 24 ore consentire alle cellule di recuperare completamente dal passaggio precedente e passaging. Questo tempo aggiuntivo permette alle cellule di diffondere sulla piastra di coltura del tessuto.
2. insulina secrezione Assay (giorno 3)
- Preparare il tampone di KRB: 132,2 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 5mm NaHCO3, 0,5 mM NaH2PO4, 0,5 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2e 0,001 g/mL di sieroalbumina bovina (BSA), pH 7,4.
- Media da cellule di aspirare e lavare due volte con PBS preriscaldata.
- Per il passaggio di fame di glucosio, aggiungere 450 µ l/pozzetto KRB (contenente BSA) senza glucosio per 1 h a 37 ˚C/5% CO2.
- Durante la fase di inedia di glucosio, preparare diluizioni seriali delle droghe in KRB contenente 200 mM glucosio (10x concentrazione).
- Preparare droga a 10x la concentrazione finale in KRB completati con 200 millimetri di glucosio (anche 10 volte la concentrazione di glucosio finale del dosaggio). Se lo stock di droga (plus aggiunto 10 x glucosio) è in DMSO, assicurarsi che la percentuale di DMSO è mantenuto costante durante tutto il test (percentuale idealmente finale inferiore a 0.1% DMSO).
- Per i trattamenti di dopamina e quinpirole, utilizzare una gamma di concentrazione di farmaco dosaggio finale di 100 µM a 100 pM (dalla più alta alla più bassa concentrazione), con l'ultimo punto della dose risposta non contenente nessuna droga. Per la bromocriptina, utilizzare una gamma di concentrazione finale del dosaggio di 10 µM a 22, con l'ultimo punto della dose risposta essendo il controllo droga-libero.
- Dopo aver fame di glucosio, aggiungere diluizioni seriali di droga per il dosaggio di produrre una reazione al dosaggio.
- Aggiungere 50 µ l/pozzetto di ciascuna diluizione seriale nei pozzetti corrispondenti (dosaggio totale volume 500 µ l).
- Per la fase di stimolazione del glucosio, incubare le cellule con le diluizioni seriali di rispettivi droga (in presenza di glucosio 20 mM) 90 min a 37 ˚C/5% CO2. Comprendono una serie di pozzetti di controllo: (1) stimolazione con 20 millimetri di glucosio da solo in assenza di qualsiasi farmaco aggiuntivo e (2) le cellule che vengono stimolate né droga né glucosio (che fornisce un tasso basale di secrezione).
- Dopo la fase di stimolazione, rimuovere con cautela i surnatanti (uso direttamente o conservare a 4 ° c).
Nota: Un passo di centrifugazione delicata di ulteriori 5 minuti (600 x g, 1 min) può essere introdotti a questo punto per rimuovere tutte le cellule rimanenti nei surnatanti dosaggio.
3. HTRF per misura la secrezione dell'insulina
- Diluire il dosaggio surnatanti 01:10 in KRB (senza BSA), preferibilmente in piastre da 96 pozzetti chiaro.
- Preparare la curva standard di insulina per il dosaggio di insulina HTRF (tabella 1).
| Soluzione standard stock 500 ng/ml | Diluizioni seriali | Lavoro [insulina] ng/ml |
| STD 7 | 30 µ l stock + 140 µ l KRB | 150 |
| STD 6 | 30 µ l STD 7 + 45 µ l KRB | 60 |
| STD 5 | 30 µ l STD 6 + 45 µ l KRB | 24 |
| STD 4 | 30 µ l STD 5 + 45 µ l KRB | 9.6 |
| STD 3 | 30 µ l STD 4 + 45 µ l KRB | 3.84 |
| STD 2 | 30 µ l STD 3 + 45 µ l KRB | 1.54 |
| STD 1 | 30 µ l STD 2 + 45 µ l KRB | 0.61 |
| STD 0 | KRB 45 µ l | 0 |
| Nota: STD Stock è 500 ng/ml | ||
Tabella 1. Diluizioni seriali per rendere la curva standard di insulina.
- Aggiungere i campioni di curva standard ed i surnatanti di dosaggio diluito alla piastra HTRF. La misurazione di insulina secreta da HTRF può avvenire in un formato di piastra 384 pozzetti, tenendo presente che il volume di dosaggio deve essere ri-regolato o un 96 pozzetti. Uso 10 µ l/pozzetto campione in bianchi 96 pozzetti metà-zona lastre o 5 µ l/pozzetto in un piatto bianco 384 pozzetti di basso volume, turno-fondo (Vedi Tabella materiali).
- Preparare la miscela di anticorpi nel buffer di rilevamento (Vedi Tabella materiali) in un donatore di 1:2 (criptato) / rapporto accettore (XL-665).
Nota: Ulteriori dettagli specifici circa l'analisi HTRF sono disponibili presso il produttore. - Aggiungi mix di anticorpo per test a 30 µ l/pozzetto (per un formato di 96 pozzetti saggio) o 15 µ l/pozzetto (per un formato di test piastra 384 pozzetti).
- La piastra ed incubare a temperatura ambiente.
- Leggere la piastra dopo 2h, 4h, e/o pernottamento incubazione con anticorpi usando il lettore di piastre e il modulo di ottica HTRF appropriato (337 665 620 nm) (Vedi Tabella dei materiali e le istruzioni del produttore). Impostare l'inizio di integrazione alle 60 µs e il tempo d'integrazione alle 400 µs. uso 200 lampeggia per pozzetto.
Nota: Questi parametri sono stati basati sull'uso del nostro lettore particolare. La lettura a 620 nm e 665 nm possono variare tra i diversi strumenti. Questo è uno dei motivi che si consiglia di utilizzare il rapporto di 665/620. Nel calcolo di questo rapporto, eventuali differenze di potenziale dal lettore al lettore saranno normalizzati e forniscono valori coerenti indipendentemente lo strumento utilizzato per misurare HTRF.
4. normalizzazione e analisi dei dati
- Calcolare le concentrazioni di insulina nei pozzetti di saggio tramite estrapolazione di raziometrici letture di fluorescenza (665 nm/620 nm) a una secondo ordine polinomiale curva quadratica (Figura 2).
Figura 2 : Curva standard insulina. Stock di insulina umana di concentrazioni note è stato utilizzato per generare la curva standard di insulina. I rapporti HTRF risultanti (665 nm / 620 nm) sono state tracciate contro le concentrazioni di insulina. I dati erano più adatta a una curva polinomiale quadratica di secondo ordine (R2 = 0.99996). Si tratta di una curva standard rappresentativa. Barre di errore = SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Con i dati estrapolati come ng/mL di insulina secernuta, normalizzare (insulina secernuta in risposta all'aumento delle concentrazioni di ligando) al valore medio dei pozzi % insulina massima secrezione assay (stato solo del glucosio di 20 mM).
- Utilizzare la curva adatta (R2) da un singolo esperimento per calcolare la variazione di intraplacca. All'interno dell'esperimento, derivato i singoli valori di R2 dai duplicati intra-sperimentali, che consentano di calcolare l'errore standard della media per la curva.
- Per la determinazione della variazione interplacca, utilizzare i dati da almeno tre singoli esperimenti per calcolare l'errore standard della media per il valore di2 R della curva del collettivo.
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Representative Results
Abbiamo validato la nostra analisi HTRF insulina generando una curva standard di insulina utilizzando standard di insulina umana purificata delle concentrazioni predefiniti (Figura 2). Generazione della curva standard ha permesso di estrapolare le letture di fluorescenza raziometrici e quindi a determinare i livelli di insulina secreta in risposta ai trattamenti farmaco (Figura 2). Variazione di intraplacca per adattamento della curva era minimo (R2 = 0.99996 ± 5,0 x 10-5) come era la variazione interplacca (R2 = 0,947 ± 5.5 x 10-5; n = 3 piastre).
Successivamente abbiamo determinato i livelli basali di secrezione dell'insulina dalle cellule INS-1E. Utilizzando una densità di semina di 5 x 105 cellule per pozzetto in un formato di piastra a 24 pozzetti, abbiamo trovato che le cellule secreto 54.53 ± 2,2 ng/mL di insulina in assenza di glucosio durante un periodo di incubazione di 90 min in un bagno statico. Aggiunta di glucosio di 20 mM per stimolare GSIS ha provocato un miglioramento significativo in GSIS (insulina di 112,4 ± 5.2 ng/mL; p < 0,0001) (Figura 3).
Figura 3 : Stima del basale versus secrezione insulinica stimolata. INS-1E cellule sono state trattate in assenza o presenza di stimolazione di alto glucosio (20 mM) per 90 min. Un raddoppio nei livelli di secrezione dell'insulina è stato rilevato in risposta a stimolazione del glucosio elevato rispetto le cellule non stimolate (condizione di secrezione basale; * * * p < 0.0001, due code spaiato t-test). N = 5; tutte le analisi sono state effettuate in triplici copie. Barre di errore = SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per studiare il ruolo di dopaminergici D2-come la stimolazione del recettore in GSIS all'interno del nostro sistema di cellule INS-1E, abbiamo incubato le cellule in presenza di D2-come farmaci agonisti del recettore (dopamina, quinpirole e bromocriptina) durante i 90 min periodo di stimolazione con glucosio 20 mM (Figura 4).
Figura 4 : Rilevazione HTRF di dopamina D2 -come inibizione dell'agonista del ricevitore di GSIS. INS-1E cellule sono state trattate con aumento delle concentrazioni di dopamina D2-come agonisti del recettore per 90 min in presenza di elevati del glucosio (20mm; 37 ˚ c). (A) della dopamina ha inibito GSIS con un IC50= 1,78 ± 3,9 µM (R2 = 0.4355). (B) il Bromocriptine è stato più potente della dopamina nella riduzione GSIS (IC50 = 13,9 ± 2,4 nM, R2 = 0.7501). (C) la potenza di Quinpirole era simile alla dopamina (IC50 = 3,3 ± 3 µM, R2 = 0,3617). Tutti i dati sono stati più adatta a una curva sigmoidale tre parametri. Il ' 0 mM glucosio ' punto indica la secrezione basale di insulina dalle cellule INS-1E in assenza di stimolazione di alto glucosio (20 mM). N > 3; tutte le analisi sono state effettuate in triplici copie in giorni separati sperimentale. Barre di errore = SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Rappresentare graficamente le curve di secrezione di insulina è stata determinata l'efficacia e la potenza di questi farmaci agonisti. Abbiamo scoperto che in assenza di stimolazione con alto glucosio, le cellule INS-1E ha continuate a secernere insulina, anche se in misura nettamente inferiore (indicato dalla condizione 0 mM), coerente con precedenti rapporti15. I nostri risultati hanno dimostrato che la dopamina, l'agonista endogeno di D2-come i ricevitori, inibito GSIS in un modo dipendente dalla concertazione (DA IC50 = 1,78 ± 3,9 µM; Figura 4A). In contrasto, Bromocriptina, un farmaco approvato per trattare il diabete di tipo 223,24, era sensibilmente più potente della dopamina nel produrre l'inibizione GSIS (IC50 = 13,9 ± 2,4 nM; Figura 4B). Infine, anche se meno efficace di bromocriptine, quinpirole esposto potenza simile alla dopamina nell'inibizione di GSIS (IC50 = 3,3 ± 3 µM; Figura 4).
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Discussion
Il dosaggio di insulina HTRF descritto qui offre un sistema rapido, efficiente per misurare la secrezione di insulina da un sistema basato su cellule coltivata. Tra i suoi più importanti vantaggi, questo saggio offre un segnale basso fondo dovuto l'alto rapporto segnale-rumore. Inoltre, abbiamo confermato che il segnale HTRF è stabile per lunghi periodi di tempo (> 24 h)7. Tuttavia, poiché gli anticorpi monoclonali di insulina-associazione raggiungere velocemente la saturazione di associazione dopo aggiunta per il dosaggio, la cinetica del legame anticorpo può dipendere dalla temperatura ambiente o variazioni nei livelli di secreti di insulina. Dunque, leggiamo la piastra di dosaggio a più punti di tempo (2h, 4h e pernottamento) per identificare con precisione quando gli anticorpi hanno raggiunto la piena saturazione e HTRF segnale è più robusto7. Abbiamo anche recentemente dimostrato che gli anticorpi dell'insulina non significativamente cross-reagiscono con proinsulina o c-peptide, suggerendo che il dosaggio è abbastanza specifico per insulina matura7.
Un passo importante nell'ottimizzazione del dosaggio coinvolto stabilire un'ampia gamma dinamica della secrezione dell'insulina. Questa gamma dinamica è definita come la differenza in insulina rilevato durante basale (non stimolata) versus secrezione stimolata dell'insulina. Troviamo che un passo di fame iniziale breve glucosio (glucosio 0mm, 1h) precede la stimolazione del glucosio alto estende la gamma dinamica di innesco le cellule INS-1E a secernere più insulina durante GSIS. In un precedente lavoro, abbiamo mostrato il range dinamico del dosaggio da 0,17 ng/mL (limite di rilevazione) ad un massimo di 110 ~ insulina di ng/mL con un rapporto segnale-rumore di 10.027. Inoltre, la quantità di insulina secreta dipende dal numero di cellula iniziale placcato per pozzetto. Abbiamo ottimizzato ulteriormente il dosaggio standardizzando il passaggio e la manipolazione delle cellule INS-1E. Mantenimento della coerenza nel passaggio pianificazione e placcatura in un tipo di piastra specifica (ad es., piatti di 10cm) è essenziale per ottenere i livelli di insulina secreta coerente.
Tra le potenziali fonti di analisi variabilità ribolle nelle soluzioni di saggio che interferisce con la lettura HTRF. Una fonte importante di queste bolle è la presenza di albumina di siero bovino (BSA) nelle varie soluzioni di analisi KRB-basata. Per risolvere questo potenziale problema, riducendo o eliminando anche BSA minimizza significativamente bolle nella soluzione e quindi migliora l'affidabilità del segnale di HTRF. Ciò è particolarmente importante quando si genera la curva standard di insulina e diluizioni di droga. Cella passaggio numero-dipendente differenze nella secrezione di insulina basale sono un'altra fonte di potenziale variabilità di analisi (dati non mostrati). Ciò è coerente con il precedente lavoro di Merglen e colleghi che ha anche suggerito che la secrezione dell'insulina ottimale si trova tra numeri di passaggio delle cellule INS-1E ~ 60-10015. Pertanto, per ridurre al minimo possibile variabilità nella secrezione dell'insulina, relazionata al numero di cellulare passaggio, si consiglia di limitare dosaggi di secrezione di questa gamma di passaggio ben definiti.
Il limite principale del dosaggio di secrezione di insulina basati su celle è la variabilità della secrezione basale intrinseca alle cellule INS-1E. Ciò può essere collegata alle cellule secernenti insulina crescente all'esterno del contesto fisiologico dell'isolotto pancreatico. Infatti, gli altri tipi di cella all'interno l'isolotto compreso le cellule alfa e delta secernono numerosi fattori che possono modulare la secrezione dell'insulina basale e stimolata dalle beta cellule in modo paracrino locale,25. L'assenza di questi altri tipi delle cellule dell'isolotto può disturbare la regolazione stretta della secrezione dell'insulina, che porta a una maggiore variabilità rispetto a quanto osservato in caso contrario fisiologicamente. Un'altra limitazione potenziale è la gamma lineare relativamente piccola del test, poiché l'insulina secernuta in risposta al glucosio di 20 mM è stata quasi saturare in alcuni casi. Di conseguenza, nei surnatanti delle cellule non diluito, effetti di secretagoghi dell'insulina sulla secrezione stimolata dell'insulina possono essere fuori la porzione lineare della curva di calibrazione. Questo è, tuttavia, ha prevenuto diluendo il supernatante contenente insulina sufficiente per consentire l'insulina a cadere nella gamma lineare della curva di calibrazione.
Abbiamo validato il nostro saggio mostrando che agonismo di dopamina D2-come i ricevitori via dopamina, bromocriptina e quinpirole trattamenti inibito GSIS in modo concentrazione-dipendente. Questi dati ci ha permesso di determinare le proprietà farmacologiche di queste droghe (cioè, IC50 ed efficacia) in termini di loro effetti GSIS. I nostri risultati sono coerenti con un crescente corpo di evidenze che suggeriscono un ruolo importante per la dopamina e la segnalazione di fuori del sistema nervoso centrale20,21,22,26, dopaminergica 27. In particolare, i nostri risultati dimostrano che la dopamina D2-recettore agonista Bromocriptina inibisce potentemente GSIS, ancora è stato recentemente approvato dalla FDA per il trattamento di diabete di tipo 224, solleva la questione importante: come può questo trattare droga tipo 2 diabete (T2D) se si abbassa la secrezione dell'insulina, almeno acutamente? Una spiegazione potenziale potrebbe essere correlato a capacità di bromocriptine incorrere "delle cellule beta resto." Secondo questa ipotesi, dal momento che uno dei segni cardinali di T2D è un generale ipersecrezione di insulina, che in ultima analisi, può contribuire alla beta cellulare guasto28. Inoltre, suggeriamo che l'insulina ipersecrezione durante T2D può anche aggravare l'insulino-resistenza, diminuendo la sensibilità dell'insulina di organi compreso il muscolo scheletrico, fegato e tessuto adiposo. Così, il blocco o diminuendo GSIS potrebbero resensitization graduale di questi tessuti di destinazione, che li rende più sensibili all'insulina e migliorando così la sensibilità dell'insulina. Avere un sistema di dosaggio suscettibile di high throughput screening apre la porta al lavoro futuro per entrambi sezionare le vie di segnalazione intracellulare mediate dalla dopamina D2-come i ricevitori in cellule beta pancreatiche che sono responsabili di paracrine / inibizione GSIS autocrino pure ulteriormente delucidare i meccanismi da cui le droghe come bromocriptine possono migliorare i sintomi del diabete.
Lo sviluppo di un saggio di secrezione di insulina basati su cellule che si avvale della tecnologia HTRF per la secrezione di insulina e rappresenta un progresso significativo in rilevamento rapido ed efficiente di insulina a significativamente diminuito costo relativo e/o maggiore sicurezza rispetto ai vecchi saggi di rilevazione insulina basandosi su approcci basati su ELISA e RIA. Infatti, anche se ELISA e RIA dosaggi di insulina sono relativamente sensibili e specifici per il dosaggio di insulina HTRF, la natura omogenea del rilevamento, Elimina numerosi lavaggi aggiuntivi presenti in queste altre analisi sistemi7. Inoltre, la relativa stabilità del segnale HTRF offre un altro vantaggio chiave per misura affidabile dell'insulina.
Presi insieme, i HTRF analisi di secrezione di insulina ha la capacità di discriminare rapidamente tra le proprietà farmacologiche delle droghe multiple nel contesto della secrezione cellulare dell'insulina. Inoltre, relativamente facilità di questo dosaggio d'uso e robusto segnale rendono suscettibili per high throughput screening.
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Disclosures
Ringraziamo Nicolas Pierre (Cisbio analisi biologiche) per consigli utili e Dr. Pierre Maechler (Università di Ginevra) per fornire generosamente alle cellule INS-1E. Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento dal dipartimento della difesa (grant PR141292 a Z.F.), John F. e Nancy A. Emmerling Fund della Fondazione Pittsburgh (a Z.F.).
Acknowledgments
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well white half area plate | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384-well white low-volume, round-bottom plate | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | 10,000 test HTRF-based insulin assay kit |
| PHERAstar FSX plate reader | BMG Labtech | FSX | Plate reader adapted for HTRF-based assay readings |
| Plate sealers | Fisher Scientific | DY992 | To seal plate while antibodies incubate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutamine |
| Trypsin 0.05% | Corning | 25-052-CI | 0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | Without calcium and magnesium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Penicillin/Streptomycin solution 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M1348 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptine mesylate | Tocris | 427 | |
| (-)-Quinpirole hydrochloride | Tocris | 1061 | |
| Bovine Serum Albumin | Calbiochem | 12659 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | 276855 |
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