Summary
ここでは、提案する均質な時分割フレット (HTRF) 細胞から分泌されるインスリンの急速な検出のための効率的な方法として。
Abstract
インスリン分泌の検出だけでなく代謝の研究のように規制の分泌機構の解明にとって重要です。多数のインスリン アッセイは、何十年も存在している、けれども均一時間分解蛍光共鳴エネルギー伝達 (HTRF) 技術の最近の出現が大幅これらの測定に簡略化します。これは、急速なコスト効果の高い、再現、および堅牢な光学測定時間分解蛍光共鳴エネルギー移動を容易にする長期的な排出量と明るい蛍光物質を抗体に依存です。また、HTRF インスリン検出は高スループット スクリーニングの試金の開発の影響を受けやすいです。ここ HTRF を使用して INS 1E 細胞、ラット インスリノーマ細胞ラインでインスリン分泌を検出します。これはインスリンとグルコース刺激による変化の基底のレベルを推定することができます。さらに、このインスリン検出システムを [グルコース刺激によるインスリン分泌 (GSIS) の負の調節因子としてのドーパミンの役割を確認します。同様に、他のドーパミン D2-受容体アゴニスト、クインピ、ブロモクリプチン、濃度依存的に GSIS を減らすような。我々 の結果は、GSIS、その薬理学的プロファイルで多数の薬の役割を決定する際に HTRF インスリン測定形式の有用性を強調表示します。
Introduction
主要な蛋白同化ホルモン、インスリンによるエネルギー代謝の調節を微調整します。インスリンが合成・増加細胞外グルコース レベルに応じて膵 β 細胞が発表しました。リリースされたインシュリンはインシュリン敏感なティッシュ1,2によりブドウ糖の取り込みをトリガーします。生理学的に、これはグルコースの取り込みを調節するインスリンの分泌が続く、食後後のグルコース濃度の上昇にリンクされます。グルコース恒常性の障害がインスリン抵抗性で最高潮に達する代謝障害につながる、最終的に、2 型糖尿病2,3、4を発症。
インスリン分泌が広く研究されていますがその分子機構、ままかり。調査の重要な分野は、インスリン分泌 β 細胞5,6,7,8で新規変調器の識別されています。これらの研究では、グルコース刺激とインスリン分泌の結合関係の理解を深める必要があります。したがって、正確に監視し、グルコース刺激によるインスリン分泌 (GSIS) のレベルを定量化することが不可欠でした。までに、ただし、メソッド数が限られていたインスリン分泌細胞や膵島を用いた GSIS の定量化できます。インスリンのタグ付きの放射性同位元素と抗体を利用したラジオイムノアッセイ (RIA) であります。このアプローチの主な制限には、取り扱いや放射性物質の処分のための安全性の問題が含まれます。また、このメソッドは労働集約的な複数の長い洗濯とインキュベーションの手順を含みます。酵素結合抗体法 (ELISA) は、インスリン検出のための抗体を利用して別のコストがかかり、労働集約的なアプローチです。抗体の親和性のインスリンの認識効率の変化はこのメソッドの要因を制限しているし、結果の再現性に影響を与えることができます。ELISA も RIA は、高スループット実験のために設計されました。AlphaScreen、均質なアッセイ検出とインスリン分泌のレベルを測定するために使用します。AlphaScreen 技術は、周囲の酸素の化学発光の生成に終って化学発光の種と反応することができます酸素の励起一重項状態への変換に基づいています。試金は同種、RIA、ELISA に関連付けられている洗濯の手順の多くは除去されます。しかし、反応の性質により信号が不安定は、アッセイの読み出しに影響を与える可能性があります制限要因です。(TR 挟撃、Heyduk および同僚の9によって開発された、インスリン分子上の異なるエピトープを 2 つの独立した抗体の結合に基づくインスリン測定に同種別のアプローチ。抗体が短い相補単鎖 DNA オーバーと各二重に化学的にリンクの鎖 DNA です。インスリン抗体の結合は、一緒にそれらをもたらす、二重鎖 DNA 二重につながります。各抗体はそれぞれのドナーやアクセプタ fluorophore に関連付けられても、DNA 密生相のアソシエーションをもたらします一緒にこれらの同時蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) を生成します。TR-挟撃の潜在的な制限の 1 つは、ただし、フレット自体にかかっています。フレット反応中にバック グラウンド蛍光を急速に消費することができないことは、背景の蛍光性の比較的高いレベルと信号対雑音比アッセイ内につながる可能性があります。したがって、高スループット方法で GSIS を定量化するため、堅牢で信頼性の高い、費用対効果分析のため、まだ必要があります。
生物物理学の最近の進歩は、均質な時間分解蛍光エネルギー共鳴の転送 (HTRF) を用いたアッセイの開発に結実しています。具体的には、内のエネルギー移動のアッセイがありますフレット ベースとして記述されていたより正確に、HTRF に依存は、ドナーとアクセプター間エネルギーの非放射伝達発光エネルギー共鳴転送 (LRET)10種11,12,13。蛍光のタイミング重要であるこの区別またはフレットと LRET ゲートの同じ種類を利用できますより多くの LRET、それは異なるフレット インタラクションを焼入れです。また、ユウロピウムなど化合物の希土類元素ランタノイド cryptate の使用または HTRF でテルビウム cryptate が長い蛍光半減12,14を生成します。これはドナー励起と受容体 (すなわち、時間分解法) からの放出の測定間の遅延時間 (μ 秒) の導入のユニークな利点を提供しています。この遅延は、アクセプター発光蛍光の測定前に放散する背景の蛍光性のための十分な時間をことができます。その結果、読み出しが非特異蛍光を解放し、したがって、高い信号対雑音比を達成 (図 1)。さらに、HTRF の同種の性質は、elisa 法や RIA ベースの方法より迅速アッセイを重視、非連結の種を洗浄する洗浄手順の必要性を排除します。
図 1: HTRF インスリン検出のメカニズムの概略図。2 つ独立して生成されたモノクローナル抗体は具体的に認識し、別々 のサイトでインスリン バインドします。これらの抗体はユウロピウム cryptate ドナーまたは XL665 アクセプター共役系します。620 で排出で 337 nm 結果をドナー励起 nm。結果として得られるエネルギー移動の原因で波長が長く、665 を出力する XL665 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ここで、詳細なプロトコルを提供 HTRF ベースのアプローチを使用して、INS 1E 細胞から情報科学研究科のレベルを判断する、インスリノーマ細胞ライン15をラット、確立されたインスリン分泌 β 細胞由来します。さらに、この試金はインスリン分泌の分子の調節物質の薬理学的プロファイルを識別するため使用する場合があります。ドーパミン D2を調べるこの HTRF ベース インスリン アッセイを適用-国際学研究科受容体規制のような。増加研究は、神経伝達物質ドーパミンが GSIS8,16,17,18,19,20,の重要な制御因子であることを明らかにしました。21,22ドーパミンがドーパミン D2アクションを介して負オートクリン/パラクリン的 GSIS を影響-膵細胞のベータ8の表面に表現の受容体 (D2、3D、D4受容体) のように。,16,19. この試金を使用して、我々 は情報科学研究科の負の調節因子としてドーパミンの役割を確認し、ことを示すドーパミン D2-受容体作動薬のブロモクリプチンとクインピまた、GSIS を減らすような。
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Protocol
1. INS 1E 細胞: メンテナンスとめっき
- 5% (v/v) 熱不活化牛胎児血清 L-グルタミン, 2 mM 10 mM HEPES、1 mM ピルビン酸ナトリウム、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した INS 1E 細胞加湿 37 ˚C/5% CO2インキュベーターと RPMI 1640 培地で培養を維持します。50 μ M β-メルカプトエタノールのソリューションです。80-90% の合流点に到達するまで、トリプシンし継代またはインスリン分泌の試金のために使用することができます (プレート) あたり 10 mL 完全 RPMI 1640 培地での細胞を培養します。
- 1 日目:メディアを吸引し、予め温めておいた PBS の 5 mL と一度セルを洗ってください。トリプシン (0.025%) の 0.5 mL 希釈 0.5 mL の PBS のセルを trypsinize し、37 ° C で 3-4 分間インキュベートに 1:1 を追加します。15 mL 遠心管にピペットによって 9 mL 完全なメディアおよび転送細胞を加えることによってトリプシンを非アクティブ化します。
- 遠心分離によって細胞をペレットし、約 5 mL の新鮮なメディアで再細胞ペレットを中断します。
- 再浮遊細胞の 10 μ L を取るし、10 μ L でトリパン ブルー セル実行可能性を確認するための重要な染料を混ぜます。診断この混合物の 10 μ L のライブとデッドのセルをカウントします。生存率レベルは 90% 以上にする必要があります。1 mL あたり 100 万の細胞に新鮮なメディアの再浮遊細胞を希釈します。
- 多 L リジンの井戸あたり種子 0.5 mL INS 1E 細胞事前 500,000 細胞/ウェルの密度で、24 ウェル プレートをコーティングしました。
- 2 日目:18-24 h のメディアを削除後めっきと新鮮な RPMI 1640 メディアの 500 μ L/ウェルを追加。セル前の passaging ステップから完全に回復するように別の 24 時間のセルを孵化させなさい。この余分な時間は、細胞の培養皿に広がりを許可します。
2. インスリン分泌の試金 (3 日目)
- KRB バッファーを準備: 132.2 mM NaCl、3.6 mM KCl、5 mM NaHCO3、0.5 mM NaH2PO40.5 mM MgCl2、1.5 mM CaCl2、0.001 g/mL ウシ血清アルブミン (BSA)、pH 7.4。
- 細胞からメディアを吸引し、予め温めておいた PBS で 2 回洗ってください。
- グルコース飢餓ステップ 37 ˚C/5% CO2で 1 時間血糖なし 450 μ L/ウェル KRB (含まれている BSA) を追加します。
- グルコース飢餓の段階、準備 200 ミリメートルを含む KRB で薬のシリアル希薄グルコース (10 倍濃度)。
- 200 mM グルコース (また最終的なアッセイのグルコース濃度 x 10) を添加した KRB の最終濃度 x 10 で薬物を準備します。場合薬株式 (プラス追加の 10 グルコース x) は、DMSO に DMSO 割合の試金 (DMSO 0.1% 未満の理想的に最終的な割合) を通して一貫性が保たを確認します。
- 100 に 100 μ M の最終的なアッセイ薬物濃度範囲を使用してドーパミンやクインピの治療のため薬物を含まない用量反応の最後のポイントで (高いもの低い濃度から)、午後。ブロモクリプチン、薬物のない制御をされている用量反応の最後の点と、22 に 10 μ M の最終的な分析濃度範囲を使用します。
- グルコース飢餓後線量応答を生成するアッセイに薬物のシリアル希薄を追加します。
- シリアル希薄を各 50 μ L/ウェルを対応する井戸 (合計アッセイ ボリューム 500 μ L) に追加します。
- グルコース刺激ステップ (20 mM グルコース) の存在下でそれぞれ薬シリアル希釈でセルを 37 ˚C/5% CO で 90 分間インキュベートします2. 。コントロール井戸のセットが含まれます: (1) 任意の新たな薬物と (2) どちらも薬物も (分泌の基礎率を提供する) グルコース刺激される細胞の不在で一人で 20 mM グルコース刺激。
- 刺激のステップの後 (直接使用またはストア 4 ° C で) 培養上清を慎重に取り外します。
注: (600 × g、1 分) のさらに 5 分穏やかなの遠心分離ステップをこの時点で導入してアッセイ培養上清中に残っているセルを削除することがあります。
3. HTRF 測定インスリン分泌に
- できればクリア 96 ウェル プレートでアッセイ培養上清 1:10 KRB (BSA) なしでを希釈します。
- HTRF インスリン測定 (表 1) インスリン標準曲線を準備します。
| 標準原液 500 ng/ml | シリアルの希薄 | [インスリン] ng/ml の作業 |
| STD 7 | 30 μ l 在庫 + 140 μ l KRB | 150 |
| スタンダード 6 | 30 μ l STD 7 + 45 μ l KRB | 60 |
| STD 5 | 30 μ l STD 6 + 45 μ l KRB | 24 |
| STD 4 | 30 μ l STD 5 + 45 μ l KRB | 9.6 |
| STD 3 | 30 μ l STD 4 + 45 μ l KRB | 3.84 |
| STD 2 | 30 μ l STD 3 + 45 μ l KRB | 1.54 |
| STD 1 | 30 μ l STD 2 + 45 μ l KRB | 0.61 |
| STD 0 | 45 μ l KRB | 0 |
| 注: STD 入荷 500 ng/ml | ||
表 1。インスリン標準曲線にシリアルの希薄。
- 標準曲線のサンプルや希釈アッセイ培養上清を HTRF プレートに追加します。96 ウェルまたは試金ボリュームに再調整することは念頭に置きつつ、384 ウェル プレート形式の HTRF によって分泌されたインスリンの測定が行えます。使用 10 μ L/ウェルの 384 ウェル白い低ボリューム、丸底プレートに 5 μ L/ウェルまたは 96 ウェル ハーフ エリア プレート サンプル (材料の表を参照してください)。
- 抗体検出バッファーにミックスを準備 (材料の表を参照) で 1:2 ドナー (cryptate)/アクセプター (XL-665) 比。
注: さらに HTRF 測定についての詳細は、製造元から入手できます。 - (96 ウェル プレート アッセイ フォーマット) の 30 μ L/ウェルまたは 15 μ L/ウェル (384 ウェル プレート アッセイ フォーマット) のために試金する抗体のミックスを追加します。
- プレートを密封し、室温で孵化させなさい。
- 2 h、4 h、または一晩インキュベート後プレートをプレート リーダーと適切な HTRF 光モジュールを使用する抗体と読む (337 665 620 nm) (材料表と製造元の指示を参照してください)。60 μ s で統合開始を設定し、ウェルあたり 400 μ s で積分時間使用 200 点滅します。
注: これらのパラメーターは、特定のリーダーの使用に基づいていた。620 で読み出し nm と 665 nm がさまざまな楽器と異なる場合があります。これは 665/620 比を使用をお勧めする理由の一つです。この比の計算、リーダーにリーダーから任意の潜在的な違いは正規化され、HTRF 測定に使われる道具に関係なく、一貫した値を提供します。
4. データの解析と標準化
- レシオ メトリックの外挿によって試金井戸のインスリン濃度を計算する第 2 順序 2 次多項式曲線 (図 2) の蛍光測定 (665 nm/620 nm)。
図 2: インスリン標準曲線。既知濃度のヒトインスリン株式は、インスリン標準曲線の生成に使用されました。結果として得られる HTRF 比 (665 nm/620 nm) インスリン濃度に対してプロットしました。データが第 2 順序の 2 次多項式曲線にベスト フィット (R2 = 0.99996)。これは、代表的な標準曲線です。誤差 = SEM.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- Ng/ml 分泌されるインスリンの推定データ、(リガンド濃度の増加への応答で分泌されるインスリン) を % 最大のインスリン分泌の試金井 (20 mM グルコースだけで条件) の平均値に正規化します。
- 内陸変動を計算するのに単一の実験からカーブ フィット (R2) を使用します。実験中、個々 の R2値を近似曲線の平均の標準誤差の計算をできるように実験内の重複に由来します。
- プレート境界のバリエーションを確認するには、集合的な曲線の R2値の平均値の標準誤差を計算するのに少なくとも 3 つの個々 の実験からのデータを使用します。
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Representative Results
定義済みの濃度 (図 2) の浄化されたヒトインスリン標準を使用してインスリン標準曲線を生成することによって、インスリン HTRF 測定を検証しました。レシオ メトリック蛍光測定値を推定することができること標準的な曲線の世代薬物治療 (図 2) への応答で分泌されたインスリン レベルを決定します。カーブ フィットの内陸のバリエーションが少なかった (R2 = 0.99996 ± 5.0 x 10-5) されたプレート境界の変化 (R2 0.947 ± 5.5 x 10 =-5; n = 3 プレート)。
我々 は次に、INS 1E 細胞からのインスリン分泌の基底のレベルを決定しました。24 ウェル プレート形式の井戸あたり 5 x 10 の5セルの播種密度を使用して、セルには静的バスで 90 分インキュベーションの期間にわたって 54.53 ± 2.2 ng/mL のブドウ糖の不在でインスリンが分泌されるとわかりました。GSIS を刺激するために 20 mM グルコース添加により GSIS (112.4 ± 5.2 ng/mL インスリン; の大きな機能強化p < 0.0001) (図 3)。
図 3: 刺激インスリン分泌と基底の推定します。INS 1E セルは、90 分 (20 mM) 高グルコース刺激の有無で扱われました。些細のセルと相対的高グルコース刺激への応答で検出されたインスリンの分泌量が 2 倍 (基底の分泌状態; * * * p < 0.0001、2 尾対になっていないt-テスト)。N = 5;すべてのアッセイは、トリプリケートで行われました。誤差 = SEM.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ドーパミン D2の役割を調査するため-受容体刺激 GSIS INS 1E セル体制内のような我々 は D2の存在下で細胞を培養した-(ドーパミン、クインピ、ブロモクリプチン) 受容体アゴニスト薬のような 90 分間刺激周期 20 mM グルコース (図 4)。
図 4: ドーパミン D2 HTRF 検出-国際学研究科受容体アゴニスト阻害が好き。INS 1E 細胞がドーパミン D2の濃度の増加と扱われた-受容体アゴニスト (20 mM; 37 ° C) 高グルコースの存在下で 90 分間が好き。(A)ドーパミン抑制 GSIS IC50= 1.78 ± 3.9 μ M (R2 = 0.4355)。(B)ブロモクリプチンはドーパミン GSIS を減らすことでより強い (IC50 13.9 ± 2.4 nM、R2 = = 0.7501)。(C)クインピの効力ドーパミンに類似していた (IC50 = 3.3 ± 3 μ M、R2 = 0.3617)。すべてのデータは、三つのパラメーター適合シグモイド カーブにベスト フィットでした。'0 mM グルコース' ポイント高グルコース (20 mM) 刺激の不在で INS 1E 細胞による基礎インスリン分泌を示します。N > 3;すべてのアッセイは、別の実験日にトリプリケートで行われました。誤差 = SEM.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
有効性とこれらのアゴニスト薬の効力は、インスリン分泌曲線をグラフによって決定されました。(0 mM の状態で示されます)、著しく低い程度と以前報告15とはいえ、インスリンを分泌する続けた INS 1E 細胞高グルコース刺激の不在で分かった。実験の結果, そのドーパミンは、D2の内因性アゴニスト-受容器のような concertation 依存的に GSIS を抑制 (DA IC50 = 1.78 ± 3.9 μ M;図 4 a)。対照的に、ブロモクリプチン、2 型糖尿病23,24の治療に承認された薬剤は GSIS 抑制の生産におけるドパミンよりも著しくより強力な (IC50 = 13.9 ± 2.4 nM;図 4 b)。最後に、しかし効果が小さいブロモクリプチンよりクインピ展示 GSIS 抑制でドーパミンに似た効力 (IC50 = 3.3 ± 3 μ M図 4)。
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Discussion
ここで説明した HTRF インスリン アッセイ培養細胞系からのインスリン分泌を測定するための迅速で効率的なシステムを提供しています。その最も重要な利点は、この試金は高い信号対雑音比のための低バック グラウンド信号を提供しています。また、HTRF 信号は、長期間安定したことを確認した (> 24 h)7。それにもかかわらず、のでインスリン結合モノクローナル抗体迅速分析への付加の後でバインド飽和に到達、抗体の結合の動力学は周囲温度やインスリンの分泌レベルの変動による影響は。したがって、我々 は (2 h、4 h、一晩) 抗体は完全飽和に達しているし、HTRF 信号は最も堅牢な7を正確に識別するために複数の時点でアッセイ プレートを読みます。私たちも最近示されているインスリン抗体は大幅プロインスリン c-ペプチドと交差反応を行う成熟インスリン7の非常に特定であることを示唆します。
アッセイの最適化の重要なステップは、インスリン分泌の広いダイナミック範囲を確立する関与しています。このダイナミック レンジは、検出されたインスリン中に基底無刺激刺激インスリン分泌との差として定義されます。我々 は、初期の簡単なグルコース飢餓ステップ (0 mM グルコース、1 h) を見つける情報科学研究科の中により多くのインスリンを分泌する INS 1E 細胞のプライミングによってダイナミック レンジを拡大高グルコース刺激の前します。以前の仕事で示した 0.17 ng/mL (検出限界) からするアッセイのダイナミック レンジ信号対雑音比 10.027の 110 〜 ng/mL インスリンの高。また、分泌されるインスリンの量はウェルあたりメッキ初期細胞数に依存しています。我々 は、通過を標準化し、INS 1E 細胞の処理によってさらにアッセイを最適化しました。スケジュールを継・特定プレート タイプ (例えば、 10 cm 皿) のメッキに整合性を維持する一貫性のある分泌されたインスリン レベルを取得に不可欠です。
アッセイの潜在的な源の間で変動が HTRF 読み出しと干渉する分析ソリューションでぐつぐつ煮えています。これらの泡の重要な源は、KRB を用いた測定溶液中のウシ血清アルブミン (BSA) の存在です。この潜在的な問題をトラブルシューティングするには、を軽減またはも BSA を排除ソリューションで気泡を最小限に抑えられます、したがって HTRF 信号の信頼性を向上させます。インスリン標準曲線と薬剤希釈液を生成するとき、これは特に重要です。基礎インスリン分泌細胞通過数依存性の違いは、潜在的な試金変動 (データは示されていない) の別のソースです。これは最適なインスリン分泌は 〜 60 10015INS 1E セル通路番号の間発見はまた提案した Merglen らによる以前の論文と一貫性が。したがって、インスリン分泌細胞の継代数に関連する可能な変動を最小限に抑えるために、通路にあるこの明確に定義されたセルの範囲に分泌の試金を制限することをお勧めします。
セルベースのインスリン分泌の試金の主な制限は、INS 1E セルに組み込み基礎分泌の変動です。これは、膵島の生理学的なコンテキストの外部成長インスリン分泌細胞に関連する可能性があります。確かに、アルファおよびデルタの細胞を含む膵島内の他の細胞型は、ローカル、パラクリン方法25のベータ細胞からの基底部および刺激インスリン分泌を調節することがあります多くの要因を分泌します。これら他の膵島細胞の型がない場合は、インスリンの分泌は、生理学的に観測されたそれ以外の場合よりも大きく変動につながるの厳格な規制を妨げる可能性があります。20 mM グルコースに対して分泌されるインスリンはいくつかのケースでほぼ飽和状態から、もう一つの潜在的な制限はアッセイの比較的小さい線形範囲です。その結果、原液細胞上清では刺激インスリン分泌に及ぼすインスリン分泌促進薬は較正曲線の直線部分の外にあります。これは、ただし、検量線の直線範囲に分類するためにインスリンを許可するのに十分なインスリンを含む上清を希釈することによって除外されます。
ドーパミン D2の作動を示すことによって我々 の分析を検証しました-ブロモクリプチンとクインピの治療が濃度依存的に GSIS を抑制を介してドーパミン受容体のような。これらのデータは、情報科学研究科への影響の観点からこれらの薬剤 (すなわち、 IC50性) の薬理学的特性を決定することができました。我々 の結果は、ドーパミンやドーパミンは中枢神経系20,21,22,26、外シグナル伝達に重要な役割を示唆する証拠の成長するボディと一致しています。 27。特に、我々 の調査結果は示すドーパミン D2-受容体作動薬のブロモクリプチン GSIS を強力に阻害する、まだ最近 2 型糖尿病24を治療するために FDA によって承認された、重要な質問を上げる: この薬物治療 2 を入力できます糖尿病 (T2D) 場合、それは少なくとも急性インスリン分泌を低下させるか。「Β 細胞休息」が発生するブロモクリプチン能力に関連する 1 つの潜在的な説明この仮説によれば T2D の枢機卿の特徴の一つはインスリンの全体的な oversecretion なので最終的に貢献するかもしれない β 細胞障害28に。さらに、提案するインスリン T2D 中 oversecretion も臓器は骨格筋、肝臓、脂肪組織などのインスリン感受性を減少しインスリン抵抗性を悪化させるかもしれない。したがって、ブロックまたは GSIS を減少はインスリンに敏感に反応し、インスリン感受性を向上させるこれらのターゲット組織の段階的な resensitization にあります。高スループット スクリーニング開き両方に将来の仕事への扉を解剖ドーパミン D2を介した細胞内シグナル伝達経路に従うアッセイ システムを持つこと-パラクリンは、膵臓の β 細胞の受容器のように/ブロモクリプチンのような薬が糖尿病の症状を向上すると共にオートクリン GSIS 阻害だけでなく今後の解明します。
インスリン分泌の HTRF 技術活用、大幅にインシュリンの迅速かつ効率的な検出が大幅に進歩を表すセルベースのインスリン分泌の試金の開発は相対および/または大きいコストを減少RIA、elisa 法を用いたアプローチに頼る古いインスリン検出アッセイに比べて安全です。確かに、elisa 法と RIA のインスリン アッセイは、HTRF インスリン測定に比較的特異的かつ高感度が、検出の同種の性質はこれら他のアッセイ システムで7本多数追加洗浄のステップを排除します。さらに、HTRF 信号の相対的な安定性は、信頼性の高いインスリン測定のもう一つ重要な利点を提供します。
インスリン分泌の試金は急速に細胞のインスリン分泌のコンテキストで複数の薬物の薬理学的特性を区別能力を持って、HTRF を一緒に撮影します。また、このアッセイの比較的使いやすさと堅牢な信号作って高スループットス クリーニングの影響を受けやすい。
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Disclosures
INS 1E 細胞を気前よく提供、ニコラ ・ ピエール (生物検定 Cisbio) 有益な助言と博士ピエール Maechler (ジュネーブの大学) に感謝します。この作品は、国防総省 (Z.F. にグラント PR141292) とジョン ・ f ・財団 (Z.F.) にピッツバーグのナンシー A. Emmerling 基金からの資金によって支えられました。
Acknowledgments
著者が明らかに何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well white half area plate | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384-well white low-volume, round-bottom plate | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | 10,000 test HTRF-based insulin assay kit |
| PHERAstar FSX plate reader | BMG Labtech | FSX | Plate reader adapted for HTRF-based assay readings |
| Plate sealers | Fisher Scientific | DY992 | To seal plate while antibodies incubate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutamine |
| Trypsin 0.05% | Corning | 25-052-CI | 0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | Without calcium and magnesium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Penicillin/Streptomycin solution 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M1348 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptine mesylate | Tocris | 427 | |
| (-)-Quinpirole hydrochloride | Tocris | 1061 | |
| Bovine Serum Albumin | Calbiochem | 12659 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | 276855 |
References
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