Summary
Nous présentons ici homogène temps résolu vous inquiétez (HTRF) comme une méthode efficace pour la détection rapide de l’insuline sécrétée par les cellules.
Abstract
La détection de la sécrétion d’insuline est cruciale pour élucider des mécanismes de sécrétion régulée ainsi comme dans les études de métabolisme. Bien que nombreux dosages d’insuline ont existé pendant des décennies, l’avènement récent de la technologie de Förster Resonance Energy Transfer (HTRF) résolue en temps homogène a considérablement simplifié de ces mesures. Il s’agit d’un dosage rapid, rentable, reproductible et robuste optique dépendant des anticorps conjugués à des fluorophores lumineux dont les émissions de longue durée qui facilite la résolution temporelle Förster Resonance Energy Transfer. En outre, HTRF insuline détection est prête pour le développement des essais de criblage à haut débit. Ici, nous utilisons HTRF pour détecter la sécrétion d’insuline dans les cellules de l’INS-1E, une lignée de cellules dérivées d’insulinome de rat. Cela nous permet d’estimation du niveau basal de l’insuline et leurs modifications en réponse à la stimulation de la glycémie. En outre, nous utilisons ce système de détection de l’insuline pour confirmer le rôle de la dopamine comme un régulateur négatif de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS). De manière similaire, les autres de la dopamine D2-agonistes des récepteurs et quinpirole bromocriptine, GSIS de réduire d’une manière dose-dépendante. Nos résultats mettent en évidence l’utilité du format de dosage d’insuline HTRF pour déterminer le rôle de nombreux médicaments GSIS et leurs profils pharmacologiques.
Introduction
La régulation du métabolisme énergétique est affinée par une hormone anabolisante majeure, l’insuline. L’insuline est synthétisée et libérée par les cellules bêta du pancréas en réponse à des niveaux accrus de glucose extracellulaire. L’insuline libérée déclenche l’absorption du glucose par les tissus sensibles à l’insuline1,2. Physiologiquement, cela est lié à l’élévation de la concentration de glucose après un repas, suivi par la sécrétion de l’insuline pour réguler l’absorption du glucose. Troubles de l’homéostasie du glucose conduisent à des déficiences métaboliques qui a abouti à la résistance à l’insuline et, finalement, dans la survenue du diabète de type 2 pour2,3,4.
Bien que la sécrétion d’insuline a été particulièrement étudiée, ses mécanismes réglementaires restent mal compris. Un secteur critique de l’enquête a été l’identification de nouveaux modulateurs de la sécrétion d’insuline par les cellules bêta5,6,7,8. Ces études nécessitent une meilleure compréhension de la relation de couplage entre la stimulation de glucose et de la sécrétion d’insuline. Par conséquent, la capacité de surveiller avec précision et de quantifier les niveaux de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) a été déterminante. A ce jour, cependant, seulement un nombre limité de méthodes était disponible pour permettre la quantification du GSIS utilisant des lignées de cellules sécrétrices d’insuline et/ou d’îlots pancréatiques. L’un est dosage radio-immunologique (RIA), qui utilise des anticorps et l’insuline radio-isotope-tag. Les principales limites de cette approche incluent des questions de sécurité en raison de la manipulation et l’élimination des matières radioactives. En outre, cette méthode est beaucoup de travail, impliquant plusieurs lavage long et les étapes d’incubation. Immuno enzymatique (ELISA) est une autre approche de coûteuse et fastidieuse qui utilise des anticorps pour la détection de l’insuline. Variation dans l’affinité de l’anticorps et l’efficacité de la reconnaissance de l’insuline sont des facteurs de cette méthode limitant et peuvent influer sur la reproductibilité des résultats. ELISA ni RIA a été conçu pour des expériences de haut débit. AlphaScreen est un dosage homogène utilisé pour détecter et mesurer les taux de sécrétion d’insuline. AlphaScreen technologie est basée sur la transformation de l’oxygène ambiant en un état singulet excité d’oxygène qui peut réagir avec des espèces de chimiluminescence, ayant pour résultat la génération de chimiluminescence. Parce que le dosage est homogène, d'entre les étapes de lavage associées à la RIA et ELISA sont éliminés. Cependant, l’instabilité du signal dû à la nature de la réaction est un facteur limitant qui peut-être affecter la lecture du test. () TR-pince, mis au point par9Heyduk et ses collègues, est une autre approche homogène à la mesure de l’insuline basée sur la liaison des deux anticorps distincts aux épitopes différents sur la molécule d’insuline. Les anticorps sont chaque ADN bicaténaire chimiquement lié à double avec court porte-à-faux complémentaires de l’ADN échoués unique. Liaison des anticorps à l’insuline les réunit et conduit à un double brin DNA bicaténaire. Chaque anticorps est également associé à un fluorophore donneur ou accepteur respectif, et l’association de la DNA bicaténaire regroupe ces fluorophores pour générer le transfert d’énergie de résonance Förster (FRET). Une des limites possibles de TR-TENAILLE, cependant, repose avec la frette lui-même. L’incapacité à dissiper rapidement la fluorescence de fond au cours de la réaction de la frette peut conduire à des niveaux relativement élevés de fluorescence de fond et un faible rapport signal sur bruit dans le dosage. Par conséquent, un besoin existe toujours pour un dosage fiable, robuste et rentable pour quantifier le GSIS d’une manière de haut débit.
Les progrès récents en biophysique ont abouti à l’élaboration d’un test de transfert (HTRF) fondé homogène de fluorescence résolue en temps énergie résonance. Plus précisément, alors que le transfert de l’énergie dans le dosage pourrait qualifier axée sur la frette, avec plus de précision, que HTRF s’appuie sur la luminescence énergétique résonance transfert (vu)10 qui est le transfert d’énergie non radiatif entre le donneur et l’accepteur espèces de12,11,13. Cette distinction est importante, depuis le moment où une fluorescence ou trempe la base frette interaction est très différent qu’il est pour vu, bien que les mêmes types de déclenchement peuvent être utilisés pour le FRET et vu. En outre, l’utilisation des terres rares lanthanide cryptate composés comme l’europium ou cryptate de terbium à HTRF produit fluorescence longue demi-vie12,14. Cela offre l’avantage unique de l’introduction d’un temps de retard (µsec) entre l’excitation du donneur et la mesure de l’émission de l’accepteur (c.-à-d., résolution temporelle assay). Ce délai permet de suffisamment de temps pour la fluorescence de fond se dissipe avant la mesure de la fluorescence d’émission accepteur. Par conséquent, l’affichage est exempt de fluorescence non spécifiques et ainsi, un rapport signal sur bruit élevé est atteint (Figure 1). En outre, le caractère homogène de HTRF élimine la nécessité d’étapes de lavage pour laver les espèces non liés, rendant le dosage bien plus rapide que ELISA ou méthodes axées sur la RIA.
Figure 1 : schéma du mécanisme de détection de l’insuline HTRF. Deux anticorps monoclonaux indépendamment générés spécifiquement reconnaître et lier à l’insuline à des sites distincts. Ces anticorps sont conjugués à l’accepteur XL665 ou le donneur de cryptate d’europium. Excitation du donneur à 337 résultats nm dans l’émission à 620 nm. Le transfert d’énergie qui en résulte provoque la XL665 émettre une longueur d’onde plus longues, 665 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé afin d’utiliser une approche axée sur les HTRF pour déterminer les niveaux de GSIS de cellules INS-1E, un bien établie insulino-sécrétrices cellules bêta dérivé rat insulinome cellule ligne15. En outre, ce test peut servir pour identifier le profil pharmacologique de régulateurs moléculaires de la sécrétion d’insuline. Nous appliquons ce dosage insuline basée sur HTRF afin d’examiner la dopamine D2-comme la régulation des récepteurs de GSI. Croissant d’études ont révélé que la dopamine, un neurotransmetteur est un régulateur important du GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. la dopamine affecte GSIS autocrine/paracrine négativement par des actions sur la dopamine D2-comme des récepteurs (D2, D3, récepteurs de4 D) exprimée à la surface de cellules pancréatiques bêta8 , 16 , 19. à l’aide de ce test, nous confirmer le rôle de la dopamine comme un régulateur négatif du GSIS et démontrer que la dopamine D2-bromocriptine agonistes du récepteur et quinpirole également réduire GSIS.
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Protocol
1. INS-1E cellules : entretien et placage
- Maintenir les INS-1E cellules dans un incubateur à2 ˚C/5% CO 37 humidifié et cultivées avec milieu RPMI 1640 additionnée de 5 % (v/v) inactivés par la chaleur sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 10 mM HEPES, pyruvate de sodium 1 mM, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine solution, 50 µM β-mercaptoéthanol. Culture de cellules en milieu RPMI 1640 complet de 10 mL (par assiette), jusqu'à ce qu’ils atteignent la confluence de 80 à 90 %, quand ils peuvent être trypsinisées et subcultures ou utilisées pour le dosage de la sécrétion de l’insuline.
- Jour 1 : Aspirer les médias et laver les cellules une fois avec 5 mL de PBS préchauffé. Ajouter 0,5 mL de trypsine (0,025 %) dilué 1:1 dans 0,5 mL de PBS pour trypsinize les cellules et incuber pendant 3-4 min à 37 ° c. Désactiver la trypsine en ajoutant 9 mL de milieu complet et cellules de transfert dans un tube à centrifuger 15 mL de pipetage.
- Cellules de granule par centrifugation et Resuspendre le culot dans environ 5 mL de milieu frais.
- Prenez 10 µL de cellules remises en suspension et mélanger avec 10 µL colorant vital bleu Trypan pour vérifier la viabilité des cellules. Compter les cellules vivantes et mortes de 10 µL de ce mélange à l’aide d’un hémocytomètre. Niveau de viabilité doit être supérieur à 90 %. Diluer les cellules remises en suspension dans les supports neufs à 1 million de cellules / mL.
- Semences 0,5 mL INS-1E cellules / puits dans une poly-L-Lysine pré-enrobé plaque 24 puits, à une densité de 500 000 cellules par puits.
- Jour 2 : Retirez les supports 18 à 24 h après inoculation et ajouter 500 µL/puits de RPMI 1640 les supports neufs. Incuber les cellules d’un autre 24 heures afin de permettre aux cellules à se remettre complètement de l’étape préalable de passaging. Ce délai supplémentaire permet les cellules à se répandre sur la plaque de culture de tissus.
2. insuline sécrétion Assay (jour 3)
- Préparer le tampon KRB : 132,2 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 5 mM NaHCO3, 0,5 mM NaH2PO4, 0,5 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2et 0,001 g/mL d’albumine sérique bovine (BSA), pH 7,4.
- Aspirer les médias des cellules et laver deux fois avec du PBS préchauffé.
- Pour l’étape de jeûne de glucose, ajouter 450 µL/puits KRB (contenant BSA) sans glucose pendant 1 h à 37 ˚C/5% CO2.
- Au cours de l’étape de jeûne de glucose, préparer des dilutions de la drogue (s) en Karbovanets contenant 200 mM Glucose (concentration x 10).
- Préparer les médicaments à 10 fois la concentration finale en Karbovanets additionné de 200 mM de glucose (également 10 x la concentration en glucose test final). Si le stock de drogue (plus l’ajouté 10 x glucose) est dans le DMSO, s’assurer que le pourcentage de DMSO est maintenue uniforme tout au long de l’essai (idéalement final pourcentage inférieur à 0,1 % DMSO).
- Pour les traitements dopaminergiques et quinpirole, utiliser une gamme de concentrations de drogue test final de 100 µM à 100 heures (du plus élevé au plus faible concentration), avec le dernier point de la relation dose-effet ne contenant aucun médicament. Pour la bromocriptine, utiliser une gamme de concentrations d’essai final de 10 µM à 22:00, avec le dernier point de la réaction étant le contrôle de la drogue.
- Après la famine de glucose, ajouter des dilutions sériées de médicament à l’essai pour produire une dose-réponse.
- Ajouter 50 µL/puits de chaque dilution sérielle dans les puits correspondants (dosage total volume 500 µL).
- Pour l’étape de la stimulation de glucose, incuber les cellules avec des dilutions successives drogue respectifs (en présence de glucose 20 mM) pendant 90 min à 37 ˚C/5% CO2. Comprendre une série de puits de contrôle : (1) la stimulation avec 20 mM de glucose seul en l’absence de toute drogue supplémentaire et (2) les cellules qui sont stimulés ni drogue ni de glucose (qui prévoit un taux basal de sécrétion).
- Après l’étape de la stimulation, retirer délicatement le surnageant (usage directement ou conserver à 4 ° c).
Remarque : Une étape de centrifugation douce supplémentaire 5 min (600 x g, 1 min) peut-être être introduite à ce stade pour enlever toutes les cellules restantes dans les surnageants de dosage.
3. HTRF pour mesurer la sécrétion d’insuline
- Diluer dosage surnageants 01:10 dans KRB (sans BSA), préférablement en plaques 96 puits clair.
- Préparer la courbe d’étalonnage d’insuline pour le dosage de l’insuline HTRF (tableau 1).
| Solution d’étalon 500 ng/ml | Dilutions successives | Travail [insuline] ng/ml |
| STD 7 | 30 µl stock + 140 µl KRB | 150 |
| STD 6 | 30 µl STD 7 + 45 µl KRB | 60 |
| STD 5 | 30 µl STD 6 + 45 µl KRB | 24 |
| STD 4 | 30 µl STD 5 + 45 µl KRB | 9.6 |
| STD 3 | 30 µl STD 4 + 45 µl KRB | 3,84 |
| STD 2 | 30 µl STD 3 + 45 µl KRB | 1,54 |
| STD 1 | 30 µl STD 2 + 45 µl KRB | 0,61 |
| STD 0 | KRB 45 µl | 0 |
| Remarque : STD Stock est 500 ng/ml | ||
Le tableau 1. Dilutions successives pour faire la courbe standard de l’insuline.
- Ajouter les échantillons de la courbe d’étalonnage et les surnageants de dosage dilué à la plaque HTRF. La mesure de l’insuline sécrétée par HTRF peut être effectuée dans un 96 puits ou un format de plaque 384 puits, gardant à l’esprit que le volume de dosage doit être réajusté. Utilisation 10 µL/puits échantillon en blancs 96 puits moitié-zone plaques ou 5 µL/puits dans une plaque 384 puits blanche de faible volume, fond rond (voir Table des matières).
- Préparer le mélange d’anticorps dans le tampon de détection (voir Table des matières) chez un donneur de 1:2 (cryptate) / ratio accepteur (XL-665).
NOTE : Encore des détails spécifiques sur le test HTRF sont disponibles chez le constructeur. - Ajouter le mélange de l’anticorps à l’essai à 30 µL/puits (pour un format 96 puits-plaque test) ou 15 µL/puits (pour un format d’essai de plaque 384 puits).
- Sceller la plaque et incuber à température ambiante.
- Lire la plaque après 2 h, 4 h ou une nuit d’incubation avec l’anticorps utilisant le lecteur de plaque et le module optique HTRF (337 665 620 nm) (voir la Table des matières et des instructions du fabricant). Définir le début de l’intégration à 60 µs et le temps d’intégration à 400 µs. utilisation 200 clignote par puits.
Remarque : Ces paramètres étaient fondées sur l’utilisation de notre lecteur particulier. La lecture à 620 nm et 665 nm peut-être varier entre les différents instruments. C’est une des raisons pour lesquelles que nous vous suggérons d’utiliser le ratio 665/620. Dans le calcul de ce ratio, n’importe quel différences potentielles de lecteur à lecteur normaliseront et fournissent des valeurs cohérentes, quelle que soit l’instrument utilisé pour mesurer la HTRF.
4. normalisation et analyse des données
- Calculer les concentrations d’insuline des puits dosage par extrapolation de ratiométrique lectures de fluorescence (665 nm/620 nm) à une seconde ordonnance quadratique polynomiale courbe (Figure 2).
Figure 2 : Courbe d’étalonnage insuline. Stock d’insuline humaine de concentrations connues a été utilisé pour générer la courbe standard de l’insuline. Les ratios HTRF qui en résulte (665 nm / 620 nm) ont comploté contre les concentrations d’insuline. Les données ont été meilleur ajustement à une courbe polynomiale quadratique de deuxième ordre (R2 = 0.99996). Il s’agit d’une courbe standard. Barres d’erreur = SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Avec les données extrapolées en ng/mL d’insuline sécrétée, normaliser (insuline sécrétée en réponse à l’augmentation des concentrations du ligand) à la valeur moyenne des puits % d’analyses sécrétion maximale d’insuline (20 mM glucose seul État).
- L’ajustement de la courbe (R2) d’une expérience simple permet de calculer la variation intra-plaque. Au sein de l’expérience, dérivé les doublons intra-expérimentales, permettant le calcul l’erreur-type de la moyenne pour l’ajustement de la courbe des valeurs individuelles de2 R.
- Pour déterminer la variation inter-plaques, utiliser les données d’au moins trois expériences différentes pour calculer l’écart-type de la moyenne pour la valeur de2 R de la courbe collective.
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Representative Results
Nous avons validé notre essai HTRF de l’insuline en générant une courbe standard de l’insuline à l’aide de l’insuline humaine purifiée normes de concentrations prédéfinies (Figure 2). Génération de la courbe standard nous ont permis d’extrapoler les lectures de fluorescence ratiométrique et donc à déterminer les niveaux d’insuline sécrétée en réponse aux traitements médicamenteux (Figure 2). La variation intra-plaque pour ajustement de courbe a été minime (R2 = 0.99996 ± 5.0 x 10-5) comme c’était la variation inter-plaques (R2 = 0.947 ± 5,5 x 10-5; n = 3 plateaux).
Nous avons ensuite déterminé les taux de base de sécrétion d’insuline des cellules de l’INS-1E. Avec une densité de semis de 5 x 105 cellules / puits dans un format de plaque 24 puits, nous avons constaté que les cellules sécrétée 54.53 ± 2,2 ng/mL d’insuline en l’absence de glucose sur une durée de 90 min d’incubation dans un bain public static. L’addition de glucose 20 mM pour stimuler le GSIS a entraîné une augmentation significative de GSIS (112,4 ± 5.2 ng/mL d’insuline ; p < 0,0001) (Figure 3).
Figure 3 : Estimation de base par rapport à la sécrétion d’insuline stimulée. INS-1E cellules ont été traitées en l’absence ou la présence d’une stimulation forte concentration de glucose (20 mM) pendant 90 min. Un doublement des taux de sécrétion d’insuline a été détecté en réponse à la stimulation de la forte concentration de glucose par rapport aux cellules non stimulées (condition de sécrétion basale ; *** p < 0.0001, bilatéral non apparié t-test). N = 5 ; tous les essais ont été effectués en géométrie. Barres d’erreur = SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
D’enquêter sur le rôle des dopaminergiques D2-comme la stimulation des récepteurs de GSI au sein de notre système de cellule INS-1E, nous avons incubé les cellules en présence de D-2-comme récepteur agoniste drogues (dopamine, quinpirole, bromocriptine) pendant le 90 min période de stimulation avec 20 mM de glucose (Figure 4).
Figure 4 : Détection de HTRF de dopamine D2 -aime inhibition agoniste des récepteurs du GSIS. INS-1E cellules ont été traitées avec des concentrations croissantes de dopamine D2-comme des agonistes du récepteur pendant 90 min en présence de forte concentration de glucose (20 mM, 37 ° c). (A) la Dopamine inhibée GSIS avec un IC50= 1,78 ± 3,9 µM (R2 = 0.4355). (B) la Bromocriptine était plus puissant que la dopamine dans la réduction GSIS (IC50 = 13,9 ± 2,4 nM, R2 = 0.7501). (C) puissance de Quinpirole était similaire à la dopamine (IC50 = 3,3 ± 3 µM, R2 = 0.3617). Toutes les données ont été meilleur ajustement à une courbe sigmoïde fit trois paramètres. Le ' 0 mM Glucose' point indique la sécrétion d’insuline basale par les cellules de l’INS-1E en l’absence de stimulation de l’hyperglycémie (20 mM). N > 3 ; tous les essais ont été effectués dans réanalysés jours expérimental séparé. Barres d’erreur = SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
L’efficacité et la puissance de ces médicaments agonistes a été déterminée en traçant la courbe les courbes de la sécrétion de l’insuline. Nous avons constaté que, en l’absence de stimulation avec forte concentration de glucose, les cellules de l’INS-1E continues à sécréter de l’insuline, quoiqu’à un degré nettement inférieur (indiqué par la condition de 0 mM), conforme aux rapports précédents15. Nos résultats ont démontré que la dopamine, l’agoniste endogène de D2-comme des récepteurs, inhibée GSIS en fonction de la concertation (DA IC50 = 1,78 ± 3,9 µM ; Figure 4 a). En revanche, bromocriptine, un médicament approuvé pour traiter le type 2 diabète23,24, a été nettement plus puissant que la dopamine en produisant une inhibition GSIS (IC50 = 13,9 ± 2,4 nM ; Figure 4 b). Enfin, bien que moins efficace que la bromocriptine, quinpirole présentait une puissance similaire à la dopamine dans l’inhibition GSIS (IC50 = 3,3 ± 3 µM ; La figure 4).
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Discussion
Le dosage de l’insuline HTRF décrit ici vous propose un système rapid et efficace permettant de mesurer la sécrétion d’insuline d’un système de base de cellules cultivée. Parmi ses avantages les plus importants, ce test offre un signal faible bruit de fond en raison du rapport signal-bruit élevé. En outre, nous avons confirmé que le signal HTRF est stable pendant de longues périodes (> 24h)7. Néanmoins, comme les anticorps monoclonaux de liaison de l’insuline d’atteindre rapidement saturation de liaison après l’addition à l’essai, cinétiques de liaison de l’anticorps peut être affectée par la température ambiante ou les variations des niveaux d’insuline sécrétées. Par conséquent, nous avons lu la plaque d’essai à plusieurs points dans le temps (2 h, 4 h et toute la nuit) d’identifier avec précision quand les anticorps ont atteint une saturation totale et signal HTRF est plus robuste7. Nous avons aussi récemment montré que l’anticorps anti-insuline ne pas significativement croisée avec la proinsuline ou c-peptide, suggérant que le dosage est assez spécifique pour l’insuline mature7.
Une étape importante dans l’optimisation du dosage en cause établissant une large plage dynamique de la sécrétion d’insuline. Cette dynamique est défini comme la différence en insuline détecté durant basale (non stimulée) par rapport à la sécrétion d’insuline stimulée. Nous trouvons qu’une étape de famine initiale brève glucose (glycémie de 0 mM, 1 h) précédant une stimulation forte concentration de glucose augmente la plage dynamique en amorçant les cellules INS-1E à sécréter plus d’insuline pendant GSIS. Dans un travail antérieur, nous avons montré une gamme dynamique de l’essai de 0,17 ng/mL (limite de détection) pour atteindre ~ 110 ng/mL d’insuline avec un rapport signal sur bruit de 10,027. En outre, la quantité d’insuline sécrétée dépend de nombre de cellule initiale plaqué par puits. Nous avons optimisé davantage le dosage en normalisant le passage et en gérant des cellules INS-1E. Maintenir la cohérence dans l’horaire de passage et d’ensemencement dans un type de plaque spécifique (par exemple, les plats de 10 cm) est indispensable à l’obtention des niveaux d’insuline sécrétée cohérente.
Parmi les sources potentielles de dosage variabilité bouillonne dans les solutions de test qui interfère avec la lecture HTRF. Une source importante de ces bulles est la présence d’albumine sérique bovine (BSA) dans les différentes solutions d’essai KRB. Pour résoudre ce problème potentiel, réduire ou même éliminer la BSA minimise considérablement les bulles dans la solution et par conséquent améliore la fiabilité du signal HTRF. Ceci est particulièrement important lors de la génération de la courbe standard de l’insuline et des dilutions de drogues. Cellule passage nombre dépendant des différences dans la sécrétion d’insuline basale sont une autre source de variabilité assay (données non présentées). Cela est compatible avec les travaux antérieurs de Merglen et ses collègues, qui a également suggèrent que la sécrétion d’insuline optimale se trouve entre le nombre de passage des cellules INS-1E ~ 60-10015. Nous recommandons donc, afin de réduire la variabilité possible dans la sécrétion d’insuline liée au nombre de passage de cellule, limitant les dosages de sécrétion à cette plage de passage de cellules bien définis.
La principale limite du test de sécrétion de l’insuline basés sur les cellules est la variabilité de la sécrétion basale intrinsèque aux cellules INS-1E. Cela peut être lié aux cellules insulino-sécrétrices croissantes en dehors du contexte physiologique de l’îlot pancréatique. En effet, les autres types de cellules au sein de l’îlot, y compris les cellules alpha et delta sécrètent des nombreux facteurs qui peuvent moduler la sécrétion d’insuline basale et stimulée de cellules bêta dans un local, de façon paracrine25. L’absence de ces autres types de cellules des îlots pancréatiques peut-être perturber la régulation serrée de la sécrétion d’insuline, menant à une plus grande variabilité que celle observée dans le cas contraire physiologiquement. Une autre limitation potentielle est la gamme linéaire relativement petite de l’essai, puisque l’insuline sécrétée en réponse au glucose 20 mM a été presque saturant dans certains cas. Ainsi, dans les surnageants de cellule non dilué, effets des sécrétagogues de l’insuline sur la sécrétion d’insuline stimulée peuvent être hors de la partie linéaire de la courbe d’étalonnage. C’est, cependant, prévenu en diluant le surnageant contenant de l’insuline suffisamment pour permettre à l’insuline de tomber dans la gamme de linéarité de la courbe d’étalonnage.
Nous avons validé notre essai en montrant cet agoniste de dopamine D2-comme des récepteurs par l’intermédiaire de la dopamine, traitements bromocriptine et quinpirole inhibent GSIS de manière dose-dépendante. Ces données nous a permis de déterminer les propriétés pharmacologiques de ces médicaments (p. ex., IC50 et efficacité) en ce qui concerne leurs effets sur le GSIS. Nos résultats sont compatibles avec un nombre croissant de preuves suggérant un rôle important pour la dopamine et dopaminergiques de signalisation à l’extérieur du système nerveux central20,21,22,26, 27. En particulier, nos résultats montrant que la dopamine D2-récepteur agoniste bromocriptine inhibe puissamment GSIS, encore a été récemment approuvé par la FDA pour traiter le diabète de type 224, soulève la question importante : Comment peut ce régal de médicament type 2 diabète (T2D) si elle diminue la sécrétion d’insuline, au moins aiguë ? Une explication possible pourrait être liée à la capacité de bromocriptine « cellule bêta reste. » Selon cette hypothèse, puisque l’une des caractéristiques du T2D cardinales est une ensemble hypersécrétion d’insuline, qui finalement peuvent contribuer à cellules bêta échec28. Par ailleurs, nous suggérons que l’insuline hypersécrétion pendant T2D peut aussi aggraver l’insulino-résistance en diminuant la sensibilité à l’insuline des organes notamment les muscles squelettiques, le foie et le tissu adipeux. Ainsi, bloquer ou diminuer GSIS risquez sensibilisaient progressive de ces tissus cibles, ce qui les rend plus sensibles à l’insuline et afin d’améliorer la sensibilité à l’insuline. Avoir un système de dosage se prêtent au criblage à haut débit ouvre la porte aux travaux futurs à la fois disséquer les voies de signalisation intracellulaires, médiées par la dopamine D2-comme des récepteurs dans les cellules bêta du pancréas qui sont responsables de paracrine / inhibition GSIS autocrine ainsi à servir élucider les mécanismes par lesquels des médicaments comme la bromocriptine peuvent améliorer les symptômes du diabète.
Le développement d’un test de sécrétion cellulaire de l’insuline qui tire parti de la technologie HTRF pour la sécrétion d’insuline et représente un progrès important dans la détection rapide et efficace de l’insuline à considérablement diminué coût relatif ou supérieur sécurité par rapport aux déterminations de détection l’insuline plus âgées s’appuyant sur les RIA et les approches par ELISA. En effet, même si les dosages d’insuline ELISA et RIA sont relativement sensibles et spécifiques pour le dosage de l’insuline HTRF, le caractère homogène de la détection, élimine les nombreuses étapes de lavage supplémentaires présents dans ces autres systèmes dosage7. En outre, la stabilité relative du signal HTRF prévoit un autre avantage clé mesure fiable de l’insuline.
Pris ensemble, le HTRF dosage de sécrétion de l’insuline a la capacité de distinguer rapidement les propriétés pharmacologiques des médicaments multiples dans le contexte de la sécrétion d’insuline cellulaire. D’ailleurs, relativement facilité de ce dosage d’utilisation et robuste signal rendent prête pour le criblage à haut débit.
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Disclosures
Nous remercions Nicolas Pierre (Cisbio Bioassays) pour obtenir des conseils utiles et Dr Pierre Maechler (Université de Genève) pour offrir généreusement cellules INS-1E. Ce travail a été financé par le Department of Defense (grant PR141292 à Z.F.) et John F. et Nancy A. Emmerling Fund de la Fondation de Pittsburgh (à Z.F.).
Acknowledgments
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well white half area plate | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384-well white low-volume, round-bottom plate | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | 10,000 test HTRF-based insulin assay kit |
| PHERAstar FSX plate reader | BMG Labtech | FSX | Plate reader adapted for HTRF-based assay readings |
| Plate sealers | Fisher Scientific | DY992 | To seal plate while antibodies incubate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutamine |
| Trypsin 0.05% | Corning | 25-052-CI | 0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | Without calcium and magnesium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Penicillin/Streptomycin solution 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M1348 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptine mesylate | Tocris | 427 | |
| (-)-Quinpirole hydrochloride | Tocris | 1061 | |
| Bovine Serum Albumin | Calbiochem | 12659 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | 276855 |
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