Summary
여기, 우리가 현재의 균질 시간 세포에서 분 비 하는 인슐린의 신속한 검출을 위한 효율적인 방법으로 무서 워 (HTRF) 해결.
Abstract
인슐린 분 비의 검출은 규제의 분 비 또한 연구에서 물질 대사의 elucidating 메커니즘에 대 한 중요 합니다. 비록 수많은 인슐린 분석 실험은 수십 년 동안 존재 했다, 균질 시간 해결 포스터 공명 에너지 전송 (HTRF) 기술의 최근 출현 방식이 크게이 측정을 간소화 하 게 됩니다. 이것은, 비용, 재현성, 신속 하 고 강력한 광학 분석 결과 오래 지속 방출 포스터 공명 에너지 전송 시간 해결 용이와 밝은 fluorophores에 활용 된 항 체에 의존. 또한, HTRF 인슐린 탐지 높은 처리량 검열 분석 실험의 개발에 대 한 순종입니다. 여기 우리는 기능-1E 셀, 쥐 insulinoma 파생 셀 라인에서에서 인슐린 분 비를 검색 하기 위해 HTRF를 사용 합니다. 인슐린과 포도 당 자극에 그들의 변화 기초 수준 추정 수 있습니다. 또한,이 인슐린 탐지 시스템 사용 하 여 포도 당 자극 인슐린 분 비 (GSIS)의 부정적인 레 귤 레이 터로 서 도파민의 역할을 확인 하. 비슷한 방식으로, 다른 도파민 D2-수용 체 주 작동 근, quinpirole, bromocriptine, 줄일 GSIS 농도 의존 방식에서 처럼. 우리의 결과 GSIS와 그들의 약리 프로필에 수많은 약물의 역할을 결정 HTRF 인슐린 분석 결과 형식 유틸리티를 강조 표시 합니다.
Introduction
에너지 대사의 규정 주요 단백 동화 호르몬, 인슐린에 의해 미세 하 게. 인슐린 합성 이며 췌 장 베타 세포 증가 세포 외 포도 당 수준에 대 한 응답에서에 의해 발표. 출시 된 인슐린 인슐린에 민감한 조직1,2포도 당 통풍 관을 트리거합니다. 생리학적으로,이 식사 후, 포도 당 통풍 관을 통제 하는 인슐린의 분 비에 의해 다음 포도 당 농도의 상승에 연결 됩니다. 포도 당 항상성 교란 인슐린 저항에 culminating 대사 장애가 발생할 고 궁극적으로 2 형 당뇨병2,,34의 발병에.
인슐린 분 비를 광범위 하 게 공부 했다, 하지만 그 규제 메커니즘 제대로 이해 남아 있습니다. 수 사의 중요 한 지역 베타 세포5,6,,78인슐린 분 비의 소설 변조기의 식별 되었습니다. 이러한 연구는 포도 당 자극 인슐린 분 비 사이의 결합 관계의 더 나은 이해 해야 합니다. 따라서, 정확 하 게 모니터링 하 고 포도 당 자극 인슐린 분 비 (GSIS)의 수준을 계량 능력 필수 되었습니다. 그러나 날짜 하려면,, 방법의 제한 된 수만 셀 라인 인슐린 분 비 췌 장 독도 이용 GSIS의 정량화를 허용 하도록 사용할 수 없었습니다. 하나는 방사성 태그 인슐린과 항 체를 이용 하는 방사 면역 검정 법 (RIA)입니다. 이 방법의 주요 제한 사항 처리 및 방사성 물질의 안전 문제가 포함 됩니다. 또한,이 방법은 노동 집약, 여러 긴 세척 및 인큐베이션 단계를 포함 합니다. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 인슐린 검출을 위한 항 체를 이용 하는 또 다른 비용과 노동 집약적인 접근 이다. 항 체 친 화력 및 인슐린 인식의 효율 변화 요인이이 방법의 제한 그리고 결과의 재현성에 영향을 미칠 수 있습니다. 애 란도 리아 높은 처리량 실험을 위해 설계 되었습니다. AlphaScreen 균질 분석 결과 감지 하 고 인슐린 분 비의 수준 측정에 사용 되는. AlphaScreen 기술 화학의 세대의 결과로 chemiluminescent 종으로 대응할 수 있는 흥분된 산소 내의 상태로 주변 산소의 변환 기반으로 합니다. 분석 결과 균질 성 때문에, 많은 RIA와 ELISA 세척 단계는 제거 됩니다. 그러나, 반응의 특성상 신호의 불안정은 제한 요인 분석 결과의 판독에 영향을 미칠 수 있습니다. (TR-협공,9Heyduk와 동료 의해 개발 된 인슐린 분자에 다른 epitopes 두 개의 별도 항 체의 바인딩을에 따라 인슐린 측정에 다른 동종 접근 이다. 항 체는 짧은 상호 보완적인 단일 좌초 DNA 돌출부와 화학적으로 이중 연결 된 각 좌초 DNA. 인슐린 항 체의 바인딩 함께 그들을 제공 그리고 두 배 좌초 된 DNA 이중으로 이어집니다. 각 항 체는 또한 각 기증자 또는 수락자 fluorophore와 연결 하 고 DNA 이중의 협회 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워)를 생성 하기 위해 이러한 fluorophores 함께 제공. 그러나 TR-협공의 한 가지 잠재적인 한계 자체 무서 워, 달려있다. 빠르게 무서 워 반응 동안 배경 형광을 발산 하지 못하는 배경 형광의 상대적으로 높은 수준 및 낮은 신호 대 잡음 비 분석 결과 내에서 발생할 수 있습니다. 따라서, 필요 높은 처리량 방식에서 GSIS를 측정에 대 한, 강력한, 안정적이 고 비용 효율적인 분석 결과 대 한 여전히 존재 합니다.
물리학에서 최근의 진보는 균질 시간 해결 형광 에너지 공명 전송 (HTRF) 기반으로 분석 결과의 개발에서 남 중 했다. 특히, 에너지 내에서 전송 하는 동안 분석 결과 수 있습니다 무서 워 기반으로 설명 더 정확 하 게, 발광 에너지 공명 전송 (LRET)10 은 기증자와 수락자 사이 에너지의 비 복사 전달에 의존 하는 HTRF 종11,,1213. 이 차이 이후는 형광의 타이밍 중요, 또는 냉각 하는 기반으로 무서 워 상호 작용 LRET, 보다 훨씬 다른 무서 워 및 LRET 게이팅의 동일한 종류를 사용할 수 있습니다. 또한, 유로 퓸 등 희토류 란타넘족 cryptate 사용 하 여 화합물 또는 HTRF에 븀 cryptate 생산 긴 형광 반감기12,14. 이 여기 기증자와 수락자 (즉, 시간 확인 시험)에서 방출의 측정 사이 타임 딜레이 (무색하)의 도입의 독특한 장점을 제공합니다. 이 시간 지연의 수락자 방출 형광 측정 전에 사라지고 배경 형광에 대 한 충분 한 시간을 허용 합니다. 따라서, 판독은 일반적인 형광의 자유롭고 높은 신호 대 잡음 비율 달성 하므로, (그림 1). 또한, HTRF의 동질적인 특성 분석 결과 많이 만드는 언바운드 종 ELISA 또는 RIA 기반 방법 보다 더 빠른 씻어 세척 단계에 대 한 필요가 없습니다.
그림 1: HTRF 인슐린 감지 메커니즘의 도식. 두 개의 독립적으로 생성 된 단일 클론 항 체는 특히 인식 하 고 별도 사이트에서 인슐린에 바인딩합니다. 이 항 체는 유로 퓸 cryptate 기증자 또는 수락자 XL665 활용 된. 여기 620에서 방출에 337 nm 결과에 기증자의 nm. 결과 에너지 전송 하면 더 긴 파장, 665에서 방출 하는 XL665 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
여기, 우리는 자세한 프로토콜 제공 기능-1E 셀에서 GSIS의 수준을 결정 하는 HTRF 기반 방식을 사용 하 여를 위한 insulinoma 셀 선15쥐는 확고 인슐린 은닉 베타 세포 파생. 또한,이 분석 결과 인슐린 분 비의 분자 레 귤 레이 터의 약리 프로필을 식별 하는 데 사용할 수 있습니다. 우리이 인슐린 HTRF 기반 분석 결과 도파민 D2를 검사 하는 적용-GSIS의 수용 체 규칙 처럼. 증가 연구는 신경 전달 물질 도파민 GSIS8,,1617,18,19,20, 의 중요 한 레 귤 레이 터 밝혀졌다 21 , 22. 도파민은 도파민 D2에 대 한 작업을 통해 부정적인 autocrine/paracrine 방식에서 GSIS를에 영향을 미치는-같은 수용 체 (D2, D3D4 수용 체) 베타 췌 장 세포8 의 표면에 표현 , 16 , 19. 우리 GSIS의 부정적인 레 귤 레이 터로 서 도파민의 역할을 확인 하 고 입증 하는이 분석 결과 사용 하 여, 도파민 D2-수용 체 주 작동 근 bromocriptine와 quinpirole 또한 GSIS 감소 같은.
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Protocol
1. 기능-1E 셀: 유지 보수 및 도금
- 기능-1E 셀 습도 37 ˚C/5% CO2 인큐베이터 고 RPMI 1640 매체와 교양 5% (v/v) 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 2 m m L-글루타민, 10 mM HEPES, 1mm 나트륨 pyruvate, 100 U/mL 페니실린/스와 보완 유지 솔루션, 50 µ M β-mercaptoethanol입니다. 80-90%의 합류를 도달할 때까지, 그들은 수 있는 trypsinized 및 passaged 또는 인슐린 분 비 분석 결과 대 한 사용 하는 경우 셀 (접시), 당 10 mL 전체 RPMI 1640 매체에 문화.
- 주 1: 미디어를 발음 하 고 셀 미리 따뜻하게 PBS의 5 mL로 한 번 씻어. 트립 신 (0.025%)의 0.5 mL 희석 1:1 0.5 ml PBS 셀 trypsinize 37 ˚C에서 3-4 분 동안 품 어를 추가 합니다. 추가 하 여 9 mL 전체 미디어 전송 셀 15 mL 원심 분리기 튜브를 pipetting으로 트립 신을 비활성화 합니다.
- 원심 분리에 의해 세포를 작은 고 다시 약 5 mL 신선한 매체에서 셀 펠 릿을 일시 중단.
- 다시 일시 중단 된 세포의 10 µ L 고 10 µ L 세포 생존 능력에 대 한 확인을 Trypan 블루 중요 한 염료 혼합. 10 µ L hemocytometer를 사용 하 여이 혼합의에 라이브 하 고 죽은 세포를 계산 합니다. 생존 수준 90% 이상 이어야 한다입니다. ML 당 1 백만 세포에 신선한 미디어에 다시 정지 셀을 희석.
- 폴 리-L-리 신에 잘 당 종자 0.5 mL 기능-1E 셀 전 24-잘 접시, 500, 000 셀/잘의 조밀도에 코팅.
- 주 2: 미디어 18-24 h를 제거 후 도금 및 신선한 RPMI 1640 미디어의 500 µ L/잘 추가. 이전 passaging 단계에서 완벽 하 게 복구 하 셀 수 있도록 또 다른 24 h에 대 한 셀을 품 어. 이 추가 시간 조직 문화 접시에 확산 하기 위해 셀 수 있습니다.
2. 인슐린 분 비 분석 결과 (3 일)
- 기계 버퍼 준비: 132.2 m m NaCl, 3.6 m m KCl, 5mm NaHCO3, 0.5 m m NaH2포4, 0.5 m m MgCl2, 1.5 m m CaCl2및 0.001 g/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA), pH 7.4.
- 셀에서 미디어를 발음 하 고 미리 데워 공영으로 두 번 씻어.
- 포도 당 기아 단계 37 ˚C/5% CO2450 µ L/잘 기계 (포함 BSA) 없이 1 시간에 대 한 포도 당을 추가 합니다.
- 포도 당 기아 단계 동안 준비 200 m m를 포함 하는 기계에 나타나는데의 직렬 희석 포도 당 (10 배 농도).
- 200 mM 포도 당 (또한 10 최종 분석 결과 포도 당 농도 배)으로 보충 하는 기계에 최종 농도 x 10에서 마약을 준비 합니다. 경우 약 재고 (추가 10 플러스 포도 당 x)는 DMSO, DMSO 비율 분석 결과 (이상적으로 최종 비율 0.1 %DMSO 미만)에 걸쳐 일관성이 유지 됩니다 있는지 확인.
- 치료를 위해 도파민, quinpirole, 100 100 µ M의 최종 분석 결과 약물 농도 범위를 사용 하 여 포함 하는 약 복용량 응답의 마지막 포인트 (가장 높은 것에서 낮은 농도), 오후. Bromocriptine, 마약류 통제 되는 복용량 응답의 마지막 지점으로 오후 10 시, 10 µ M의 최종 분석 결과 농도 범위를 사용 합니다.
- 포도 당 기아 후 마약 직렬 희석 생산 복용량 응답 분석 결과를 추가 합니다.
- 해당 우물 (총 분석 결과 볼륨 500 µ L)를 각 직렬 희석의 50 µ L/우물을 추가 합니다.
- 포도 당 자극 단계에 대 한 37 ˚C/5% CO에서 90 분 동안 각각 약 직렬 희석 (20 mM 포도 당)의 존재와 셀을 품 어2. 제어 우물의 세트를 포함: (1) 어떤 추가 약물 및 약물도 (이 분의 기저 속도 제공 합니다) 포도 당 자극도 (2) 세포의 부재에 혼자 20 mM 포도 당으로 자극.
- 자극 단계 후 조심 스럽게 제거 supernatants (직접 사용 또는 저장소 4 ˚C에서).
참고: 추가 5 분 부드러운 원심 분리 단계 (600 x g, 1 분) 분석 결과 supernatants에 나머지 셀을 제거 하려면이 시점에서 소개 될 수 있습니다.
3입니다. HTRF 측정 인슐린 분 비를
- 명확한 96 잘 접시에 선호 분석 결과 supernatants 1:10 (BSA) 없이 기계를 희석.
- HTRF 인슐린 분석 결과 (표 1)에 대 한 인슐린 표준 곡선을 준비 합니다.
| 표준 재고 솔루션 500 ng/ml | 직렬 희석 | [인슐린] ng/ml 일 |
| STD 7 | 30 µ l 주식 + 140 µ l 기계 | 150 |
| 표준 6 | 30 µ l 성병 7 + 45 µ l 기계 | 60 |
| 표준 5 | 30 µ l 성병 6 + 45 µ l 기계 | 24 |
| 표준 4 | 30 µ l 성병 5 + 45 µ l 기계 | 9.6 |
| 표준 3 | 30 µ l 성병 4 + 45 µ l 기계 | 3.84 |
| 표준 2 | 30 µ l 성병 3 + 45 µ l 기계 | 1.54 |
| 표준 1 | 30 µ l 성병 2 + 45 µ l 기계 | 0.61 |
| STD 0 | 45 µ l 기계 | 0 |
| 참고: 표준 재고는 500 ng/ml | ||
표 1입니다. 인슐린 표준 곡선을 만들기 위해 직렬 희석입니다.
- HTRF 플레이트를 표준 곡선 샘플 및 희석된 분석 결과 supernatants를 추가 합니다. HTRF에 의해 인슐린 분 비의 측정 96 잘 또는 분석 결과 볼륨을 다시 조정 해야 하는 것을 명심 384-잘 플레이트 형식 수행할 수 있습니다. 사용 10 µ L/잘 96 잘 화이트 반-지역 접시 또는 384-잘 화이트 낮은 볼륨, 라운드-하단 플레이트에서 5 µ L/잘 샘플 ( 재료의 표참조).
- 항 체 탐지 버퍼에 혼합 준비 ( 재료의 표참조) 1:2 기증자 (cryptate)에서 / 수락자 (XL-665) 비율.
참고: 추가 HTRF 분석 결과 대 한 특정 정보는 제조 업체에서 사용할 수 있습니다. - 30 µ L/잘 (96 잘 접시 분석 결과 형식) 또는 15 µ L/잘 (384-잘 접시 분석 결과 형식)에 대 한 분석 결과를 항 체 믹스를 추가 합니다.
- 접시를 봉인 하 고 실 온에서 품 어.
- 2h, 4h, 및 야간 보육 후 플레이트 리더와 적절 한 HTRF 광섬유 모듈을 사용 하 여 항 체 판 읽기 (337 665 620 nm) ( 테이블의 재료 및 제조 업체의 지침 참조). 60 µ s에 통합 시작을 설정 하 고 통합 시간 400 μ s. 사용 200 잘 당 깜박입니다.
참고: 이러한 매개 변수는 우리의 특정 리더의 사용에 근거 했다. 620에서 판독 및 665 nm 서로 다른 악기 사이 다를 수 있습니다. 이 665/620 비율을 사용 하는 것이 좋습니다 이유 중 하나입니다. 이 비율을 계산, 리더를 리더에서 어떤 잠재적인 차이 정규화 될 것 이다 하 고 HTRF를 측정 하는 데 사용 하는 악기에 관계 없이 일관 된 값을 제공 합니다.
4. 데이터 분석 및 정규화
- 비율의 추정을 통해 분석 결과 우물의 인슐린 농도 계산 형광 판독 (665 nm/620 nm)는 두 번째 순서 이차 다항식 곡선 (그림 2).
그림 2 : 인슐린 표준 곡선. 인간 인슐린 재고 알려진된 농도의 인슐린 표준 곡선을 생성 하기 위해 사용 되었다. 결과 HTRF 비율 (665 nm / 620 nm) 인슐린 농도 대 한 표시 했다. 데이터는 두 번째 순서 이차 다항식 곡선 적합 (R2 = 0.99996). 이것은 대표적인 표준 곡선 이다. 오차 막대 SEM. = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 인슐린 분 비의 ng/mL로 추정 데이터 % 최대 인슐린 분 비 분석 결과 우물 (20 mM 포도 당 혼자 조건)의 평균 값 (ligand 농도 증가에 대 한 응답에서 분 비 되는 인슐린)를 정상화.
- Intraplate 변화를 계산 하는 단일 실험에서 곡선 적합 (R2)를 사용 합니다. 실험에서 맞는 곡선에 대 한 의미의 표준 오차 계산을 수 있도록 내 실험 중복에서 개별 R2 값을 파생.
- Interplate 변형 결정 집단 곡선의 R2 값에 대 한 의미의 표준 오차를 계산 하기 위해 적어도 3 개의 개별 실험에서 데이터를 사용 합니다.
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Representative Results
우리는 미리 정의 된 농도 (그림 2)의 순화 된 인간의 인슐린 표준을 사용 하 여 인슐린 표준 곡선을 생성 하 여 우리의 인슐린 HTRF 분석 결과 검증. 따라서 우리 비율 형광 수치를 추정 하는 것을 허용 하는 표준 곡선의 세대 하 고 다음으로 하는 약물 치료 (그림 2)에 대 한 응답 인슐린 분 비 수준을 결정. 커브 피팅 Intraplate 변형 최소화 했다 (R2 = 0.99996 ± 5.0 x 10-5) interplate 변형 했다 (R2 0.947 ± 5.5 x 10 =-5, n = 3 판).
우리는 다음 기능-1E 세포에서 인슐린 분 비의 기초 수준 결정. 24 잘 플레이트 형식에 잘 당 5 x 105 셀의 시드 밀도 사용 하 여, 우리는 셀 정적 목욕 부 화 90 분의 기간을 통해 포도 당 결핍에 인슐린의 54.53 ± 2.2 ng/mL 분 비 발견. GSIS 자극 하 포도 당 20 m m의 추가 GSIS (112.4 ± 5.2 ng/mL 인슐린;에 상당한 향상 결과 p < 0.0001) (그림 3).
그림 3 : 자극된 인슐린 분 비와 기초의 추정. 기능-1E 셀 90 분에 대 한 높은 혈당 (20mm) 자극의 존재 또는 부재에 대우 되었다. Unstimulated 셀에 상대적으로 높은 포도 당 자극에 대 한 응답에서 검색 되었습니다 인슐린 분 비 수치에서 2 배 (기저 분 비 상태; * * * p < 0.0001, 양측 짝이 없는 t-테스트). N = 5; 모든 분석 triplicates에서 실행 되었다. 오차 막대 SEM. = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Dopaminergic D2의 역할을 조사 하기-수용 체 자극 GSIS 우리의 기능-1E 셀 시스템 내에서 같은 우리 셀 D2의 존재 인 큐베이 팅-수용 체 길 항 제 약물 (도파민, quinpirole, 및 bromocriptine) 90 분 동안 같은 20 mM 포도 당 (그림 4)와 자극 기간.
그림 4 : 도파민 D2 의 HTRF 감지 -GSIS의 수용 체 주 작동 근 억제 같은. 기능-1E 세포는 도파민 D2의 농도 증가 함께 취급 했다-높은 포도 당 (20 m m, 37 ˚C)의 면 전에 서 90 분에 대 한 수용 체 주 작동 근 처럼. (A) IC50도파민 저해 GSIS 1.78 ± 3.9 µ M = (R2 = 0.4355). (B) Bromocriptine은 도파민 GSIS 감소에 보다 더 강력한 (IC50 13.9 ± 2.4 nM, R2 = 0.7501 =). (C) Quinpirole의 효능은 도파민 비슷 했다 (IC50 = 3.3 ± 3 µ M R2 = 0.3617). 모든 데이터 3-매개 변수 적합된 자형 곡선에 적합 했다. ' 0 mM 포도 당 ' 포인트 높은 포도 당 (20mm) 자극의 부재에서 기능-1E 세포에 의해 기저 인슐린 분 비를 나타냅니다. N > 3; 모든 분석 별도 실험적인 일에 triplicates에서 실행 되었다. 오차 막대 SEM. = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
효능과 이러한 길 항 제 약물의 효능 인슐린 분 비 곡선 그래프에 의해 결정 되었다. 우리는 높은 포도 당, 기능-1E 셀 정도로 현저 하 게 낮은 (0 m m 조건으로 표시), 일치 이전 보고15이기는 하지만, 인슐린 분 비를 계속 된 자극의 부재에서 그를 발견. 우리의 결과 도파민 D2의 내 생 적인 주 작동 근 시연-수용 체, 같은 concertation 종속 방식에서 GSIS 저해 (다 IC50 = 1.78 ± 3.9 µ M; 그림 4A)입니다. 반면, bromocriptine, 마약 치료 유형 2 당뇨병23,24, 승인 되었다 도파민 생산 GSIS 억제 보다 현저 하 게 더 강력 (IC50 = 13.9 ± 2.4 nM; 그림 4B)입니다. 마지막으로, 하지만 덜 효과, bromocriptine 보다 quinpirole GSIS 억제에 도파민에 유사한 힘 전시 (IC50 = 3.3 ± 3 µ M; 그림 4C)입니다.
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Discussion
여기에 설명 된 HTRF 인슐린 분석 결과 교양된 셀 기반 시스템에서 인슐린 분 비를 측정 하는 신속 하 고 효율적인 시스템을 제공 합니다. 그것의 가장 중요 한 장점 중이 분석 결과 높은 신호 대 잡음 비율 때문에 낮은 배경 신호를 제공합니다. 또한, 우리는 시간의 연장된 기간에 대 한 HTRF 신호는 안정 확인 했습니다 (> 24 h)7. 그럼에도 불구 하 고, 인슐린 바인딩 단일 클론 항 체 신속 하 게 분석 결과를 추가 후 바인딩 채도 도달, 이후 항 체 바인딩의 활동 수 영향을 받을 주위 온도 또는 인슐린의 분 비 수준에 있는 변이. 따라서, 우리는 여러 시간 포인트 (2h, 4h와 하룻밤) 항 체 전체 채도 도달 했습니다 HTRF 신호 이며 가장 강력한7때 정확 하 게 식별 하는 분석 결과 접시를 읽었다. 우리는 또한 최근 표시 인슐린 항 체에 크게 proinsulin 또는 c-펩 티 드, cross-react 하지 않습니다 분석 결과 매우 성숙한 인슐린7에 대 한 구체적인 제안.
분석 결과의 최적화에 중요 한 단계는 인슐린 분 비의 넓은 동적 범위를 수립 참여. 이 동적 범위 검색 된 인슐린 기저 중 (unstimulated) 자극된 인슐린 분 비 대에 차이로 정의 됩니다. 우리는 초기 간단한 포도 당 기아 단계 (0 mM 포도 당, 1 시간) 찾을 GSIS 동안 더 많은 인슐린을 분 비 하는 기능-1E 셀을 못쓰게 하 여 동적 범위를 확장 하는 선행 하는 높은 포도 당 자극. 이전 작품에서는, 우리는 0.17 ng/mL (탐지 한계)에서 분석 결과 동적 범위를 보였다 ~ 110 ng/mL 인슐린 신호 대 잡음 비 10.027의로 높은. 또한, 인슐린 분 비의 양을 잘 당 도금 초기 휴대폰 번호에 따라 달라 집니다. 우리는 더는 뿌리고 표준화 및 기능-1E 셀의 처리 분석 결과 최적화. 뿌리고 일정 하 고 (예를 들어, 10 cm 요리) 특정 판형에 도금에 일관성을 유지 하는 일관 된 분 비 인슐린 수치를 얻기 위해 필수적.
분석 결과의 잠재적인 소스 중 가변성은 HTRF 판독 방해는 분석 결과 솔루션에 버블링 됩니다. 이 거품의 중요 한 원천이 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 다양 한 기계 기반 분석 결과 솔루션의 존재 이다. 이 잠재적인 문제를 해결 하려면 줄이거나 심지어 BSA 크게 솔루션에 거품을 최소화 하 고 따라서 HTRF 신호 안정성을 향상 시킵니다. 이 인슐린 표준 곡선 및 약물 희석을 생성할 때 특히 중요 하다. 기저 인슐린 분 비에 셀 통로 수 종속 차이점은 잠재적인 시험 가변성 (데이터 표시 되지 않음)의 다른 소스. 이것은 Merglen와 동료 또한 최적의 인슐린 분 비 기능-1E 셀 통로 숫자 사이15~ 60-100 발견 된다 제안 이전 작업과 일치. 따라서, 인슐린 분 비 세포 통로 수에 관련 된 가능한 변화를 최소화 하기 위해 분 비 분석 실험이 잘 정의 된 셀 통로 범위를 제한 것이 좋습니다.
셀 기반 인슐린 분 비 분석 결과의 주요 제한 기능-1E 셀에 본질적인 기저 분 비의 변화 이다. 이 췌 장 섬의 생리 적인 컨텍스트 외부 성장 인슐린 은닉 세포 관련이 있을 수 있습니다. 실제로, 알파와 델타 세포를 포함 하 여 섬 내에서 다른 세포 유형, paracrine 방법25의 베타 세포에서 기저 및 자극 인슐린 분 비를 조절 수 있습니다 수많은 요인 분 비. 이러한 다른 작은 섬 세포 유형의 부재 그렇지 않으면 순수 관찰 보다 더 큰 변화를 선도 하는 인슐린 분 비의 꽉 규제를 방해 수 있습니다. 또 다른 잠재적인 한계 때문에 응답 20 mM 포도 당으로 분 비 하는 인슐린은 거의 어떤 경우에 흠뻑 젖 게의 분석 결과, 상대적으로 작은 선형 범위입니다. 그 결과, undiluted 셀 supernatants 자극된 인슐린 분 비에 인슐린 secretagogues의 효과 보정 곡선의 선형 부분에서 있을 수 있습니다. 그러나 이것은,, 충분히 교정 곡선의 선형 범위에 빠지게 할 인슐린 수 있도록 인슐린이 포함 된 상쾌한 diluting 하 여 방지.
우리는 도파민 D2의 그 agonism 보여줌으로써 우리의 분석 결과 확인-bromocriptine 및 quinpirole 치료 통해 도파민 수용 체, 같은 농도 의존 방식에서 GSIS를 저해. 이러한 데이터를 사용 하 여 GSIS에 그들의 효과 관점에서 (즉, IC50 과 효능) 이러한 약물의 약리학 속성을 확인할 수 있었습니다. 우리의 결과 도파민과 dopaminergic 중추20,,2122,26, 외부 신호에 대 한 중요 한 역할을 제안 하는 증거의 성장 시체와 일치 27. 특히, 우리의 연구 결과 도파민 D2를 보여주는-수용 체 주 작동 근 bromocriptine potently GSIS를 억제, 아직 치료 유형 2 당뇨병24FDA에 의해 승인 했다 최근, 중요 한 질문을 제기: 어떻게이 약물 치료 2를 입력할 수 당뇨병 (T2D) 적어도 심하게 인슐린 분 비를 낮춘 다 면? 1 개의 잠재적인 설명 bromocriptine의 용량 "베타 세포 휴식." 발생에 관련이 있을 수 있습니다. 이 가설에 따르면 T2D의 기본적인 기능 중 하나 이기 때문에 인슐린의 전반적인 oversecretion는 궁극적으로 기여할 수 있습니다 베타 셀 오류28에. 또한, 인슐린이 좋습니다 T2D 동안 oversecretion 장기 골격 근육, 간, 지방 조직 등의 인슐린 감도 감소 하 여 인슐린 저항을 악화 수도 있습니다. 따라서, 차단 및 떨어지면서 GSIS 이러한 대상 조직, 그들을 더 인슐린에 반응 하 고 따라서 인슐린 감도 개량의 점진적 resensitization에서 발생할 수 있습니다. 의무가 높은 처리량 검열 열립니다 미래의 일을 모두 하 문 도파민 D2에 의해 중재 세포내 신호 통로 해 부 분석 결과 시스템-paracrine에 대 한 책임은 췌 장 베타 세포에 있는 수용 체와 같은 / 더로 또한 autocrine GSIS 저해 명료 메커니즘으로 bromocriptine 같은 약물 당뇨병의 증상을 향상 시킬 수 있습니다.
인슐린 분 비에 대 한 HTRF 기술을 활용 하 고 상당히 중요 한 사전에 인슐린의 빠르고 효율적인 검색에서을 나타냅니다 셀 기반 인슐린 분 비 분석 결과 개발 상대 또는 큰 비용 감소 RIA와 ELISA 기반 접근 이전 인슐린 탐지 분석 실험에 비해 안전. 실제로, ELISA와 RIA 인슐린 분석 실험 대 등 하 게 과민 하 고 특정 HTRF 인슐린 분석 결과에, 검출의 동질적인 특성이 다른 분석 결과 시스템7에 수많은 추가 세척 단계를 제거 합니다. 게다가, HTRF 신호의 상대적인 안정성 신뢰할 수 있는 인슐린 측정을 위한 또 다른 주요 장점은 제공 한다.
HTRF 함께, 찍은 인슐린 분 비 분석 실험은 빠르게 세포 인슐린 분 비의 맥락에서 여러 약물의 약리 속성 사이 차별의 기능이 있습니다. 또한,이 분석 결과 상대적으로 사용의 용이성과 강력한 신호를 만들 높은 처리량 검열에 대 한 의무가.
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Disclosures
우리가 아낌없이 제공 하는 기능-1E 셀에 대 한 유용한 조언을 니콜라 피에르 (Cisbio 생물 검정) 및 박사 피에르 Maechler (제네바 대학) 감사 합니다. 이 작품은 국방부 (그랜트는 Z.F. PR141292), 그리고 존 F. 낸시 A. Emmerling 기금 (Z.F.)에 피츠버그 재단에서 자금에 의해 지원 되었다.
Acknowledgments
저자는 공개 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well white half area plate | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384-well white low-volume, round-bottom plate | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | 10,000 test HTRF-based insulin assay kit |
| PHERAstar FSX plate reader | BMG Labtech | FSX | Plate reader adapted for HTRF-based assay readings |
| Plate sealers | Fisher Scientific | DY992 | To seal plate while antibodies incubate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutamine |
| Trypsin 0.05% | Corning | 25-052-CI | 0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | Without calcium and magnesium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Penicillin/Streptomycin solution 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M1348 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptine mesylate | Tocris | 427 | |
| (-)-Quinpirole hydrochloride | Tocris | 1061 | |
| Bovine Serum Albumin | Calbiochem | 12659 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | 276855 |
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