Summary
Hier präsentieren wir homogene Zeitaufgelöste FRET (HTRF) als effiziente Methode zum Schnellnachweis von Insulin aus den Zellen abgesondert.
Abstract
Die Erkennung der Insulin-Sekretion ist entscheidend für erhellendes Mechanismen der regulierten Sekretion sowie wie in Studien des Stoffwechsels. Obwohl zahlreiche Insulin-Assays für Dekaden bestanden haben, hat die jüngsten Aufkommen der homogenen Zeitaufgelösten Förster Resonance Energy Transfer (HTRF) Technologie diese Messungen deutlich vereinfacht. Dies ist eine schnelle, kostengünstige, reproduzierbare und robuste optische Assay abhängig, Antikörper konjugiert, helle Fluorophore mit lang anhaltende Emission, die Zeitaufgelöste Förster Resonance Energy Transfer erleichtert. Darüber hinaus ist HTRF Insulin Erkennung für die Entwicklung von Hochdurchsatz-Screening-Assays. Hier verwenden wir HTRF, um Insulin-Sekretion in INS-1E Zellen, eine Ratte Insulinom abgeleitet Zell-Linie zu erkennen. Dies ermöglicht es uns, basalen Ebenen von Insulin und deren Veränderungen in Reaktion auf die Stimulation der Glukose zu schätzen. Darüber hinaus verwenden wir diese Insulin-Detection-System, um die Rolle von Dopamin als negativer Regulator der Glukose-stimulierten Insulinsekretion (GSIS) zu bestätigen. In ähnlicher Weise, anderen Dopamin D2-wie-Rezeptor-Agonisten, Quinpirole und Bromocriptin, GSIS Konzentration abhängig zu senken. Unsere Ergebnisse zeigen das Dienstprogramm des Formates HTRF Insulin-Test bei der Bestimmung der Rolle von zahlreichen Medikamenten im GSIS und ihre pharmakologische Profile.
Introduction
Die Verordnung des Energiestoffwechsels ist durch ein großen anabole Hormon Insulin verfeinert. Insulin ist synthetisiert und von pankreatischen Betazellen in Reaktion auf erhöhte extrazelluläre Blutzuckerwerte veröffentlicht. Das freigesetzte Insulin löst die Aufnahme von Glukose durch Insulin-empfindlichen Gewebe1,2. Physiologisch ist dies auf die Höhe der Glukosekonzentration nach einer Mahlzeit, gefolgt von Sekretion von Insulin, Glukoseaufnahme Regeln verbunden. Störungen in Glukose Homöostase zu metabolische Beeinträchtigungen bis hin zu Insulinresistenz führen und letztlich bei der Entstehung von Typ-2 Diabetes2,3,4.
Obwohl die Insulinsekretion ausgiebig untersucht wurde, bleiben seine Regulationsmechanismen schlecht verstanden. Ein kritischer Bereich Untersuchung wurde Identifikation von neuartigen Modulatoren der Insulin-Sekretion von Beta-Zellen5,6,7,8. Diese Studien erfordern ein besseres Verständnis der Kupplung Beziehung zwischen Stimulation von Glukose und Insulin-Sekretion. Daher ist die Fähigkeit, genau zu überwachen und zu quantifizieren, das Niveau der Glukose-stimulierten Insulinsekretion (GSIS) unerlässlich gewesen. Bisher wurden jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Methoden zur Quantifizierung der GSIS mit Insulin-sezernierenden Zelllinien und/oder pankreatischen kleinen Inseln. Einer ist Radioimmunoassay (RIA), das Radioisotop-Tags Insulin und Antikörper verwendet. Die wichtigsten Einschränkungen dieses Ansatzes umfassen Fragen der Sicherheit durch die Handhabung und Entsorgung von radioaktiven Stoffen. Darüber hinaus ist diese Methode arbeitsintensiv, mit mehreren langen waschen und inkubationsschritte. Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) ist ein weiterer Kosten- und arbeitsintensive Ansatz, der Antikörper gegen Insulin-Erkennung nutzt. Veränderung des Antikörpers Affinitäten und der Effizienz von Insulin zu erkennen sind limitierende Faktoren dieser Methode und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beeinflussen können. ELISA weder RIA wurde für Hochdurchsatz-Experimente entwickelt. AlphaScreen ist ein homogenes Assay verwendet für die Erkennung und Messung der Insulin-Sekretion. AlphaScreen Technologie basiert auf der Umwandlung von ambient Sauerstoff in einem aufgeregt Sauerstoff Singulett-Zustand, die mit Chemilumineszenz Arten, was die Generation der Chemilumineszenz reagieren kann. Da die Probe homogen ist, entfallen viele der Waschschritte RIA und ELISA zugeordnet. Die Instabilität des Signals aufgrund der Art der Reaktion ist jedoch ein limitierender Faktor, der die Ablesung des Tests beeinflussen kann. () TR-Zange, entwickelt von Heyduk und Kollegen9, ist ein weiterer homogenen Ansatz zur Insulin-Messung basiert auf der Bindung von zwei separaten Antikörper gegen unterschiedliche Epitope auf die Insulin-Molekül. Die Antikörper sind jedes chemisch mit Doppel stranded DNA mit kurze ergänzende einzelne stranded DNA Überhänge. Bindung von Antikörpern an Insulin bringt sie zusammen und führt zu ein Doppel stranded DNA Duplex. Jeder Antikörper ist auch verbunden mit einer jeweiligen Spender oder Akzeptor Fluorophor, und der Verband der DNA Duplex vereint diese Fluorophore, Förster Resonanz Energietransfer (FRET) zu generieren. Eine mögliche Einschränkung der TR-Zange, liegt jedoch bei den Bund selbst. Die Unfähigkeit, schnell zerstreuen Hintergrundfluoreszenz während der Bund Reaktion führen zu relativ hohen Hintergrundfluoreszenz und ein low-Signal Rauschabstand innerhalb der Assay. Daher besteht ein Bedürfnis nach wie vor für eine zuverlässige, robuste und kostengünstige Assay zur Quantifizierung der GSIS in gewissem Sinne Hochdurchsatz.
Jüngste Fortschritte in der Biophysik gipfelten in der Entwicklung eines homogenen Zeitaufgelöste Fluoreszenz Energie Resonanz Transfer (HTRF) basierte Assays. Insbesondere während der Energietransfer innerhalb kann der Assay als FRET-basierte, genauer gesagt, bezeichnen HTRF Lumineszenz Energie Resonanz Transfer (LRET)10 abhängig von der nichtstrahlenden Übertragung von Energie zwischen Donor und Akzeptor Art11,12,13. Diese Unterscheidung ist wichtig, da der Zeitpunkt für eine Fluoreszenz oder Abschreckung basiert Bund Interaktion ist viel anders als bei LRET, obwohl die gleichen Arten von gating für Bund und LRET verwendet werden können. Darüber hinaus die Verwendung von seltenen Erden lanthanid Cryptate Verbindungen wie Europium oder Terbium Cryptate in HTRF produziert lange Fluoreszenz Halbwertszeiten12,14. Dies bietet den einzigartigen Vorteil der Einführung einer zeitlichen Verzögerung (µsec) zwischen Spender Erregung und die Messung der Emission von den Akzeptor (d. h. Zeitaufgelösten Assay). Diese zeitliche Verzögerung ermöglicht ausreichend Zeit für die Hintergrundfluoreszenz, vor der Messung der Akzeptor Emission Fluoreszenz zu zerstreuen. Infolgedessen das Auslesen ist frei von unspezifischen Fluoreszenz und damit ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht ist (Abbildung 1). Darüber hinaus entfallen homogene Artder HTRF Waschschritten ungebundenen Arten, so dass des Tests viel schneller als ELISA oder RIA-basierten Methoden abwaschen.
Abbildung 1: Schematische des Mechanismus der Insulin-Erkennung HTRF. Zwei unabhängig generierten monoklonale Antikörper spezifisch erkennen und Binden an Insulin an verschiedenen Standorten. Diese Antikörper sind entweder dem Europium Cryptate Spender oder den XL665 Akzeptor konjugiert. Anregung des Spenders auf 337 nm Ergebnisse in Emission bei 620 nm. Die daraus resultierende Energieübertragung bewirkt XL665 emittieren bei einer längeren Wellenlänge, 665 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines HTRF ausgerichteten Ansatzes an der GSIS aus INS-1E Zellen bestimmen, eine gut etablierte Insulin-sezernierenden Beta-Zellen abgeleitet Ratte Insulinom Zelle Zeile15. Darüber hinaus kann dieser Assay verwendet werden, für die Ermittlung der pharmakologischen Profils der molekularen Regulatoren der Insulin-Sekretion. Wir wenden dieses HTRF-basierte Insulin-Assay untersuchen Dopamin D2-Rezeptor Regulierung der GSIS mag. Immer mehr Studien haben gezeigt, dass der Neurotransmitter Dopamin ein wichtiger Regulator der GSIS8,16,17,18,19,20, ist 21 , 22. Dopamin wirkt GSIS in gewissem negativen Autokrine/Parakrine über Aktionen auf dem Dopamin D-2-Rezeptoren (D2, D3, D-4 -Rezeptoren) an der Oberfläche der Beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse8 zum Ausdruck gebracht, wie , 16 , 19. mit dieser Assay, wir bestätigen Dopamin die Rolle als negativer Regulator der GSIS und nachweisen, dass die Dopamin D2-wie Rezeptor-Agonisten Bromocriptin und Quinpirole auch GSIS reduzieren.
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Protocol
(1) INS-1E Zellen: Wartung und Beschichtung
- Pflegen Sie, INS-1E Zellen in einem befeuchteten 37 ˚C/5% CO2 Inkubator und kultivierten mit RPMI 1640 Medium mit 5 % (V/V) Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM Natrium Pyruvat, 100 U/mL Penicillin/Streptomycin ergänzt Lösung, 50 µM β-Mercaptoethanol. Kulturzellen Sie in 10 mL komplette RPMI 1640 Medium (pro Platte), bis zum Zusammenfluss von 80-90 % erreichen, wenn sie trypsiniert und passagiert oder verwendet werden können für die Insulin-Sekretion-Assay.
- Tag 1: Aspirieren Sie Medien und waschen Sie Zellen einmal mit 5 mL vorgewärmten PBS. Fügen Sie 0,5 mL Trypsin (0,025 %) verdünnt 1:1 in 0,5 mL PBS trypsinize Zellen und 3-4 min bei 37 ° c inkubieren. Deaktivieren Sie Trypsin, indem eine 15 mL Zentrifugenröhrchen durch pipettieren 9 mL komplette Medien und Transfer Zellen hinzufügen.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation und erneut aussetzen der Zelle Pellet in etwa 5 mL frische Medien.
- Nehmen Sie 10 µL der neu suspendierten Zellen und mischen mit 10 µL Trypan blau vital Farbstoff für Zellviabilität zu überprüfen. Lebende und tote Zellen in 10 µL dieser Mischung mit einer Hemocytometer zu zählen. Lebensfähigkeit sollte über 90 % liegen. Verdünnen Sie die neu suspendierten Zellen in frische Medien auf 1 Million Zellen pro mL.
- 0,5 mL INS-1E Samenzellen pro Bohrloch in einer Poly-L-Lysin vorbeschichtet 24-Well-Platte bei einer Dichte von 500.000 Zellen/gut.
- Tag 2: Entfernen Sie die Medien 18-24 h nach der Beschichtung und 500 µL/Well frische RPMI 1640 Medien hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen für eine weitere 24 h damit Zellen vollständig von der vorherigen passaging Schritt zu erholen. Diese zusätzliche Zeit erlaubt die Zellen auf der Gewebekultur Platte verteilen.
2. Insulin-Sekretion Assay (Tag 3)
- KRB Puffer vorzubereiten: 132,2 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 5 mM Nahco33, 0,5 mM NaH2PO4, 0,5 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2und 0,001 g/mL Rinderserumalbumin (BSA), pH 7.4.
- Aspirieren Sie Medien aus Zellen und zweimal mit vorgewärmten PBS waschen.
- Fügen Sie für den Glukose-Hunger-Schritt 450 µL/Well KRB (mit BSA) ohne Glukose für 1 h bei 37 ˚C/5% CO2.
- Während der Glukose-Hunger-Schritt vorzubereiten Verdünnungsreihen Gefäßsystem im KRB mit 200 mM Glukose (10 X-Konzentration).
- Bereiten Sie Medikament bei 10 x die Endkonzentration im KRB ergänzt mit 200 mM Glukose (auch 10 x die endgültige Assay-Glukosekonzentration vor). Wenn die Droge-Lager (plus die zusätzlichen 10 x Glukose) ist in DMSO, stellen Sie sicher, DMSO Prozentsatz Assay (idealerweise endgültige Prozentsatz von weniger als 0,1 % DMSO) konstant gehalten wird.
- Für Dopamin und Quinpirole Behandlungen, verwenden Sie einen abschließenden Test Medikament Konzentrationsbereich von 100 µM bis 100 pM (vom höchsten zum niedrigsten Konzentration), mit dem letzten Punkt der Dosis-Antwort enthält kein Medikament. Verwenden Sie für Bromocriptin einen abschließenden Test Konzentrationsbereich von 10 µM bis 22:00, mit dem letzten Punkt der Dosis-Antwort wird die wirkstofffreie Kontrolle.
- Fügen Sie nach Glukose Hunger Medikament Verdünnungsreihen Assay, eine Dosis-Antwort zu produzieren hinzu.
- Fügen Sie 50 µL/Well jedes serielle Verdünnung in die entsprechenden Vertiefungen (total Assay Volume 500 µL).
- Zellen mit der jeweiligen Droge Verdünnungsreihen (in Anwesenheit von 20 mM Glukose) inkubieren Glukose Stimulation Schritt 90 min bei 37 ˚C/5% CO2. Eine Reihe von Kontroll-Vertiefungen enthalten: (1) Stimulation mit 20 mM Glukose allein in Ermangelung jeder zusätzliche medikamentöse und (2) Zellen, die weder mit Medikamenten noch Glukose (bietet eine basale Rate der Sekretion) stimuliert werden.
- Entfernen Sie nach der Stimulation Schritt vorsichtig die Überstände (Verwendung direkt oder bei 4 ° c).
Hinweis: Eine zusätzliche 5 min. sanfte Zentrifugationsschritt (600 X g, 1 min) kann an dieser Stelle eingeführt werden, um alle verbleibenden Zellen in der Assay-Überstände entfernen.
3. HTRF, Maßnahme Insulin-Sekretion
- Verdünnen Sie Assay Überstände 01:10 in KRB (ohne BSA), vorzugsweise in klaren 96-Well Platten.
- Bereiten Sie der Insulin-Standardkurve für HTRF Insulin Assay (Tabelle 1).
| Standard-Stammlösung 500 ng/ml | Verdünnungsreihen | Arbeiten [Insulin] ng/ml |
| STD 7 | 30 µl Lager + 140 µl KRB | 150 |
| STD 6 | 30 µl STD 7 + 45 µl KRB | 60 |
| 5 STD | 30 µl STD 6 + 45 µl KRB | 24 |
| 4 STD | 30 µl STD 5 + 45 µl KRB | 9.6 |
| 3 STD | 30 µl STD 4 + 45 µl KRB | 3.84 |
| 2 STD | 30 µl STD 3 + 45 µl KRB | 1,54 |
| 1 STD | 30 µl STD 2 + 45 µl KRB | 0,61 |
| STD 0 | 45 µl KRB | 0 |
| Hinweis: STD Lager ist 500 ng/ml | ||
Tabelle 1. Verdünnungsreihen die Standardkurve Insulin zu machen.
- Die HTRF-Platte die Standardkurve Proben und der verdünnten Probe Überstände hinzufügen. Die Messung des ausgeschiedenen Insulin durch HTRF kann erfolgen, in eine 96-Well oder einem 384-Well-Plattenformat, unter Berücksichtigung, die das Assay-Volumen muss neu eingestellt werden. Einsatz 10 µL/Well Probe in 96-Well weiße Hälfte-Bereich Platten oder 5 µL/Well in einem weißen 384-Well geringem Volumen, Rundboden Teller (siehe Tabelle der Materialien).
- Antikörper-Mix in detektionspuffer vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien) in einem 1:2 Spender (Cryptate) / Akzeptor (XL-665) Verhältnis.
Hinweis: Weitere spezifische Details über die HTRF Probe sind beim Hersteller erhältlich. - Der Test auf 30 µL/Well (für eine 96-Well-Platte-Assay-Format) oder 15 µL/Well (für ein 384-Well-Platte-Assay-Format) Antikörper-Mischung hinzufügen.
- Die Dichtplatte und bei Raumtemperatur inkubieren.
- Platte nach 2 h, 4 h und/oder Übernachtung Inkubation mit Antikörpern, die mit der Platte-Leser und die entsprechenden HTRF optische Modul zu lesen (337 665 620 nm) (siehe Tabelle der Werkstoffe und Anweisungen des Herstellers). Die Integration Start-bei 60 µs und die Integrationszeit bei 400 µs. Einsatz 200 blinkt pro Bohrloch.
Hinweis: Diese Parameter beruhten auf den Einsatz unserer speziellen Leser. Das Auslesen bei 620 nm und 665 nm variieren zwischen verschiedenen Instrumenten. Dies ist einer der Gründe, warum wir empfehlen die Verwendung der 665/620-Verhältnis. Bei der Berechnung dieses Verhältnis, Potentialdifferenzen von Leser zu Leser werden normalisiert und konsistente Werte unabhängig von dem Instrument zur Messung der HTRF bieten.
(4) Datenanalyse und Normalisierung
- Berechnen Sie die Insulin-Konzentrationen der Assay-Brunnen durch Extrapolation der ratiometrischen Fluoreszenz Lesungen (665 nm/620 nm), eine zweite Bestellung quadratische polynomische Kurve (Abbildung 2).
Abbildung 2 : Insulin Standardkurve. Humaninsulin Lager der bekannten Konzentrationen wurde verwendet, um die Standardkurve Insulin zu generieren. Die daraus resultierende HTRF Verhältnisse (665 nm / 620 nm) wurden gegen die Insulin-Konzentrationen aufgetragen. Die Daten am besten passte, eine zweite Bestellung quadratische polynomische Kurve (R2 = 0.99996). Dies ist eine repräsentative Standardkurve. Fehlerbalken = SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
- Normalisieren Sie mit den hochgerechneten Daten wie ng/mL Insulin sezerniert (Insulin abgesondert in Reaktion auf die steigende Konzentrationen Liganden) auf den Mittelwert der % maximale Insulin-Sekretion Assay Brunnen (20 mM Glukose allein Zustand).
- Verwenden Sie die Kurve Passform (R2) aus einem einzigen Experiment um Intraplate Variation zu berechnen. Im Rahmen des Experiments R2 Einzelwerte von Intra experimentelle Duplikate, so dass die Berechnung der Standardfehler des Mittelwerts für die Kurvenanpassung abgeleitet.
- Verwenden Sie für die Bestimmung der interplate Variation die Daten aus mindestens drei einzelnen Experimente um den Standardfehler des Mittelwerts für die R-2 -Wert der kollektiven Kurve berechnen.
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Representative Results
Wir validiert unsere Insulin HTRF Assay durch die Erzeugung eines Insulin-Standardkurve mit gereinigtem Humaninsulin Standards der vordefinierten Konzentrationen (Abbildung 2). Generation der Standardkurve erlaubt uns, die ratiometrischen Fluoreszenz Lesungen zu extrapolieren und somit bestimmen die sekretierten Insulinspiegel in Reaktion auf die medikamentöse Behandlungen (Abbildung 2). Intraplate Variante für Kurvenanpassung war minimal (R2 = 0.99996 ± 5,0 x 10-5) wie die interplate Variation (R2 = 0.947 ± 5,5 x 10-5; n = 3 Platten).
Wir bestimmt als nächstes die basalen Ebenen der Insulin-Sekretion von INS-1E Zellen. Mit einem Aussaatdichte von 5 x 105 Zellen pro Bohrloch in einer 24-Well-Plattenformat, fanden wir, dass Zellen über eine Dauer von 90 min Inkubation in einem statischen Bad 54.53 ± 2,2 ng/mL von Insulin in der Abwesenheit von Glukose abgesondert. Zugabe von 20 mM Glukose GSIS stimulieren ergab eine deutliche Verbesserung im GSIS (112.4 ± 5,2 ng/mL Insulin; p < 0,0001) (Abbildung 3).
Abbildung 3 : Schätzung der basalen versus stimulierten Insulinsekretion. INS-1E Zellen wurden in Abwesenheit oder das Vorhandensein der hohen Glukose (20 mM) Stimulation für 90 min. behandelt. Eine Verdoppelung der Insulinspiegel Sekretion in Reaktion auf die hohen Glukose Stimulation im Verhältnis zu den unstimulierte Zellen erkannt wurde (basale Sekretion Zustand; *** p < 0.0001, zweiseitige ungepaarten t-test). N = 5; alle Tests wurden in Triplicates durchgeführt. Fehlerbalken = SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Zu untersuchen, die Rolle der dopaminergen D2-wie die Stimulation der Rezeptoren im GSIS innerhalb unserer INS-1E-Zellsystem, inkubiert wir Zellen in Anwesenheit von D-2-Rezeptor-Agonisten Medikamente (Dopamin, Quinpirole und Bromocriptin) während der 90-min wie stimulationsdauer mit 20 mM Glukose (Abbildung 4).
Abbildung 4 : HTRF Erkennung von Dopamin D2 -Rezeptor Agonist Hemmung der GSIS mag. INS-1E-Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen von Dopamin D2behandelt-wie 90 min in Anwesenheit von hohen Glukose (20 mM; 37 ˚C)-Rezeptor-Agonisten. (A) Dopamin gehemmt GSIS mit einem IC-50= 1,78 ± 3,9 µM (R2 = 0.4355). (B) Bromocriptin war stärker als Dopamin bei der Verringerung der GSIS (IC50 = 13,9 ± 2,4 nM, R2 = 0.7501). (C) Quinpirole Potenz war ähnlich wie Dopamin (IC50 = 3,3 ± 3 µM, R2 = 0.3617). Alle Daten wurden optimal auf eine drei-Parameter Fit sigmoidale Kurve. Die "0 mM Glukose" Punkt zeigt basale Insulinsekretion durch die INS-1E-Zellen in der Abwesenheit der hohen Glukose (20 mM) Stimulation. N > 3; alle Tests wurden an verschiedenen experimentellen Tagen in Triplicates durchgeführt. Fehlerbalken = SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Die Wirksamkeit und die Potenz dieser Agonist Drogen wurde durch grafische Darstellung der Insulin-Sekretion Kurven bestimmt. Wir fanden, dass bei fehlender Stimulation mit hohen Glukose, die INS-1E-Zellen weiterhin Insulin absondern, wenn auch zu einem deutlich niedrigeren Grad (angegeben durch den Zustand 0 mM), mit früher15Berichte. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Dopamin, die endogenen Agonisten D2-wie Rezeptoren gehemmt GSIS in einer Abstimmung-abhängigen Weise (DA IC50 = 1,78 ± 3,9 µM; Abbildung 4A). Im Gegensatz dazu, Bromocriptin, ein Medikament zur Behandlung von Typ-2 Diabetes23,24, war deutlich stärker als Dopamin produzieren GSIS Hemmung (IC50 = 13,9 ± 2,4 nM; Abbildung 4 b). Zu guter Letzt aber weniger wirksam als Bromocriptin, ausgestellt Quinpirole ähnliche Potenz zu Dopamin im GSIS Hemmung (IC50 = 3,3 ± 3 µM; Abbildung 4).
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Discussion
Die hier beschriebenen HTRF Insulin Assay bietet eine schnelle, effiziente System zur Messung der Insulin-Sekretion aus einem kultivierten Zell-basierte System. Einer der wichtigsten Vorteile bietet dieser Test eine geringe Hintergrundsignal aufgrund der hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass das HTRF-Signal über einen längeren Zeitraum hinweg stabil ist (> 24 h)7. Dennoch, da die Insulin-Bindung monoklonaler Antikörper schnell bindende Sättigung nach Zugabe der Probe erreichen, Kinetik der Antikörperbindung Umgebungstemperatur oder Variationen in sekretierten Niveaus des Insulins betroffen sein kann. Daher lesen wir die Assay-Platte zu mehreren Zeitpunkten (2 h, 4 h und Übernachtung) genau zu bestimmen, wenn die Antikörper volle Sättigung erreicht haben und HTRF Signal robusteste7. Wir haben auch vor kurzem gezeigt, dass die Insulin-Antikörper nicht deutlich Kreuzreaktion Proinsulin und c-Peptid, darauf hindeutet, dass der Test ganz spezifisch für Reife Insulin7.
Ein wichtiger Schritt bei der Optimierung des Assays beteiligten Einrichtung einen breiten dynamischen Bereich der Insulin-Sekretion. Diese Dynamik ist definiert als der Unterschied in der erkannten Insulin während der basalen (unstimulierte) versus stimulierten Insulinsekretion. Wir finden, dass einen erste kurze Glukose Hunger Schritt (0 mM Glukose, 1 h) vor hohen Glukose Stimulation erweitert den Dynamikbereich grundieren der INS-1E-Zellen, um während der GSIS mehr Insulin absondern. In früheren Arbeiten, zeigten wir den Assay Dynamikbereich von 0,17 ng/mL (Begrenzung auf Erkennung) so hoch wie ~ 110 ng/mL Insulin mit einer Signal-Rausch-Verhältnis von 10,027. Darüber hinaus richtet sich die Menge an freigesetzten Insulin nach anfänglichen Zellzahl pro Bohrloch vergoldet. Wir weiter optimiert die Probe durch die Standardisierung der passagierung und Handhabung der Zellen INS-1E. Wahrung der Konsistenz in passagierung Zeitplan und Beschichtung in einem bestimmten Plattentyp (z. B. 10 cm Gerichte) ist wichtig für den Erhalt der konsequente sekretierten Insulinspiegel.
Unter den potentiellen Quellen der Assay sprudelt Variabilität in der Assay-Lösungen, die stört das HTRF auslesen. Eine wichtige Quelle für diese Bläschen ist das Vorhandensein von Rinderserumalbumin (BSA) in den verschiedenen KRB-basierte Test-Lösungen. Um dieses potentielle Problem zu beheben, reduziert oder sogar eliminiert BSA deutlich minimiert Luftblasen in die Lösung und verbessert damit HTRF Signal Zuverlässigkeit. Dies ist besonders wichtig, Erstellung der Standardkurve Insulin und Droge Verdünnungen. Zelle Durchgang Nummer-abhängige Unterschiede in der basalen Insulinsekretion sind eine weitere Quelle von potentiellen Assay Variabilität (Daten nicht gezeigt). Dies steht im Einklang mit früheren Arbeiten von Merglen und Kollegen, die auch vorgeschlagen, dass optimale Insulinsekretion zwischen Zellzahlen Durchgang INS-1E ~ 60-10015gefunden wird. Daher wird empfohlen zur Minimierung von möglichen Variabilität in der Insulin-Sekretion, die im Zusammenhang mit Zelle Passagenanzahl Sekretion Assays auf diese klar definierte Zellbereich Durchgang zu begrenzen.
Die größte Einschränkung des Assays zellbasierte Insulin-Sekretion ist die Variabilität der basalen Sekretion untrennbar mit dem INS-1E-Zellen. Dies kann zu den wachsenden Insulin-sezernierenden Zellen außerhalb des physiologischen Kontextes der pankreatischen Insel bezogen werden. In der Tat sezernieren Andere Zelltypen innerhalb der Insel einschließlich Alpha und Delta-Zellen zahlreiche Faktoren, die basale und stimulierte Insulin-Sekretion aus den Betazellen in einer lokalen, Parakrine Weise25modulieren können. Das Fehlen dieser anderen Zelltypen der Insel kann die strenge Regulierung der Insulinausschüttung führt zu größere Variabilität als sonst physiologisch beobachtet stören. Eine weitere mögliche Einschränkung ist relativ kleinen linearen Bereich des Assays, da Insulin als Reaktion auf 20 mM Glukose abgesondert wurde fast in einigen Fällen zu sättigen. In der unverdünnten Zelle Überstände möglicherweise Beeinflussung stimuliert Insulin-Sekretion von Insulin Secretagogues infolgedessen aus dem linearen Teil der Kalibrierkurve. Dies ist jedoch beseitigt durch Verdünnung des Insulin-haltige Überstands ausreichend, um das Insulin in den linearen Bereich der Eichkurve fallen zu lassen.
Wir validiert unsere Tests zeigen, dass Agonismus von Dopamin D2-wie über Dopamin-Rezeptoren gehemmt Bromocriptin und Quinpirole Behandlungen GSIS in gewissem Sinne Konzentration abhängig. Diese Daten konnten wir pharmakologische Eigenschaften dieser Medikamente (z. B. IC50 und Wirksamkeit) hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf GSIS zu bestimmen. Unsere Ergebnisse sind konsistent mit einem wachsenden Körper der Anhaltspunkte, die eine wichtige Rolle für Dopamin und dopaminergen Signal außerhalb des zentralen Nervensystems20,21,22,26, 27. Vor allem unsere Ergebnisse zeigen, dass die Dopamin D-2-Rezeptor-Agonisten Bromocriptin potent GSIS hemmt, doch wurde vor kurzem zugelassen von der FDA zur Behandlung von Typ-2 Diabetes24, wirft die wichtige Frage: Wie kann diese Medikament zu behandeln, Typ 2 Diabetes (T2D) wenn es Insulin-Sekretion, mindestens akut senkt? Eine mögliche Erklärung kann Bromocriptin die Fähigkeit, "Beta-Zellen Rest." entstehen im Zusammenhang mit Nach dieser Hypothese da eines der kardinalen Merkmale der T2D eine allgemeine Oversecretion von Insulin ist, kann das letztlich zu Beta-Zellen Fehler28beitragen. Darüber hinaus empfehlen wir, dass Insulin Oversecretion während T2D kann auch Insulin-Resistenz durch Verringerung der Insulin-Empfindlichkeit der Organe einschließlich Skelettmuskel, Leber und Fettgewebe verschärfen. So kann blockieren oder verringern GSIS schrittweise Resensitization dieser Ziel-Gewebe, so dass sie besser auf Insulin reagieren und somit Verbesserung der Insulinsensitivität führen. Mit einem Assay-System offen für Hochdurchsatz-Screening öffnet die Tür für zukünftige Arbeit für beide sezieren die Intrazelluläre Signalwege vermittelt durch Dopamin D-2-Rezeptoren im pankreatischen Betazellen, die verantwortlich für Parakrine mag / Autokrine GSIS Hemmung sowie über weitere aufzuklären Mechanismen mit denen Drogen wie Bromocriptin Symptome des Diabetes verbessern können.
Die Entwicklung eines zellbasierten Insulin-Sekretion-Assays, die nutzt HTRF Technologie für Insulin-Sekretion und stellt einen bedeutenden Fortschritt in der schnelle und effiziente Erkennung von Insulin bei deutlich verminderte Kosten relative und/oder größer Sicherheit im Vergleich zu älteren Insulin-Erkennung-Assays unter Berufung auf RIA und ELISA-basierten Ansätzen. In der Tat, obwohl ELISA und RIA Insulin-Assays sind vergleichsweise empfindlich und spezifisch zu HTRF Insulin Assay, die homogene Art der Erkennung, beseitigt zahlreiche zusätzliche Waschschritte in diesen anderen Test Systeme7vorhanden. Darüber hinaus bietet die relative Stabilität des Signals HTRF ein weiterer entscheidender Vorteil für zuverlässige Insulin Messung.
Insulin-Sekretion Assay hat zusammengenommen, die HTRF die Fähigkeit schnell zu diskriminieren zwischen der pharmakologischen Eigenschaften von mehreren Medikamenten im Zusammenhang mit der zellulären Insulin-Sekretion. Darüber hinaus dieser Assay relativ einfache Bedienung und robuste Signal machen es für Hochdurchsatz-Screening.
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Disclosures
Wir danken Nicolas Pierre (Cisbio Bioassays) für hilfreiche Ratschläge und Dr. Pierre Maechler (Universität Genf) für die großzügige Bereitstellung von INS-1E Zellen. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung aus dem Department of Defense (Grant PR141292, Z.F.), John F. und Nancy A. Emmerling Fund of The Pittsburgh Foundation (Z.F.).
Acknowledgments
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well white half area plate | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384-well white low-volume, round-bottom plate | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | 10,000 test HTRF-based insulin assay kit |
| PHERAstar FSX plate reader | BMG Labtech | FSX | Plate reader adapted for HTRF-based assay readings |
| Plate sealers | Fisher Scientific | DY992 | To seal plate while antibodies incubate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutamine |
| Trypsin 0.05% | Corning | 25-052-CI | 0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | Without calcium and magnesium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Penicillin/Streptomycin solution 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M1348 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptine mesylate | Tocris | 427 | |
| (-)-Quinpirole hydrochloride | Tocris | 1061 | |
| Bovine Serum Albumin | Calbiochem | 12659 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | 276855 |
References
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