Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

सजातीय समय-हल Förster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण-इंसुलिन स्राव का पता लगाने के लिए परख आधारित

Published: May 10, 2018 doi: 10.3791/57531
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Psychiatry, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Summary

यहां, हम सजातीय समय हल झल्लाहट (HTRF) कोशिकाओं से स्रावित इंसुलिन का तेजी से पता लगाने के लिए एक कुशल विधि के रूप में उपस्थित ।

Abstract

इंसुलिन स्राव का पता लगाने के विनियमित स्राव के elucidating तंत्र के लिए महत्वपूर्ण के रूप में अच्छी तरह के रूप में चयापचय के अध्ययन में है. हालांकि कई इंसुलिन परख दशकों के लिए अस्तित्व में है, सजातीय समय का हाल ही में आगमन-हल Förster अनुनाद ऊर्जा अंतरण (HTRF) प्रौद्योगिकी काफी इन माप सरल है । यह एक तेजी से है, लागत प्रभावी, reproducible, और मजबूत ऑप्टिकल लंबे समय तक चलने के उत्सर्जन के साथ उज्ज्वल fluorophores के लिए एंटीबॉडी संयुग्मित पर निर्भर परख जो टाइम-हल Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण की सुविधा है । इसके अलावा, HTRF इंसुलिन का पता लगाने उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग परख के विकास के लिए उत्तरदायी है. यहाँ हम आईएनएस-1E कोशिकाओं में इंसुलिन स्राव का पता लगाने के लिए HTRF का उपयोग करते हैं, एक चूहा insulinoma-व्युत्पन्न सेल लाइन. यह हमें इंसुलिन के बेसल स्तर और ग्लूकोज उत्तेजना के जवाब में उनके परिवर्तन का अनुमान करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, हम ग्लूकोज-उत्तेजित इंसुलिन स्राव (GSIS) का एक नकारात्मक नियामक के रूप में डोपामाइन की भूमिका की पुष्टि करने के लिए इस इंसुलिन का पता लगाने प्रणाली का उपयोग करें. एक समान तरीके से, अन्य डोपामाइन D2-जैसे रिसेप्टर एगोनिस्ट, quinpirole, और bromocriptine, एकाग्रता-निर्भर तरीके से GSIS को कम करते हैं । हमारे परिणाम GSIS में कई दवाओं और उनके औषधीय प्रोफाइल की भूमिका का निर्धारण करने में HTRF इंसुलिन परख प्रारूप की उपयोगिता पर प्रकाश डाला ।

Introduction

ऊर्जा चयापचय के विनियमन ठीक है-एक प्रमुख anabolic हार्मोन द्वारा देखते, इंसुलिन. इंसुलिन संश्लेषित और वृद्धि हुई extracellular ग्लूकोज के स्तर के जवाब में अग्नाशय बीटा कोशिकाओं द्वारा जारी है. स्पर्म इंसुलिन इंसुलिन के प्रति संवेदनशील ऊतकों1,2द्वारा ग्लूकोज के ऊपर चलाता है । शारीरिक, यह ग्लूकोज एकाग्रता के उन्नयन के लिए एक भोजन के बाद जुड़ा हुआ है, इंसुलिन के स्राव के बाद ग्लूकोज को विनियमित करने के लिए. ग्लूकोज homeostasis में गड़बड़ी चयापचय दोष इंसुलिन प्रतिरोध में समापन के लिए नेतृत्व और प्रकार की शुरुआत में अंत में 2 मधुमेह2,3,4.

हालांकि इंसुलिन स्राव बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, इसके विनियामक तंत्र खराब समझ में रहते हैं. जांच के एक महत्वपूर्ण क्षेत्र बीटा कोशिकाओं5,6,7,8द्वारा इंसुलिन स्राव के उपंयास मॉडुलन की पहचान की गई है । इन अध्ययनों ग्लूकोज उत्तेजना और इंसुलिन स्राव के बीच युग्मन रिश्ते की एक बेहतर समझ की आवश्यकता होती है । इसलिए, की क्षमता को सही ढंग से निगरानी और ग्लूकोज-उत्तेजित इंसुलिन स्राव (GSIS) के स्तर को बढ़ाता है आवश्यक हो गया है । तिथि करने के लिए, तथापि, तरीकों की केवल एक सीमित संख्या में इंसुलिन स्रावित सेल लाइनों और/या अग्नाशय के टाप का उपयोग GSIS के ठहराव की अनुमति के लिए उपलब्ध थे । एक radioimmunoassay (रिया) है, जो रेडियो आइसोटोप-टैग इंसुलिन और एंटीबॉडी का इस्तेमाल करता है । इस दृष्टिकोण की मुख्य सीमाओं से निपटने और रेडियोधर्मी सामग्री के निपटान के कारण सुरक्षा के मुद्दों में शामिल हैं । इसके अतिरिक्त, इस विधि श्रम गहन है, कई लंबे समय धोने और गर्मी चरणों को शामिल । एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) एक और महंगा और श्रम गहन दृष्टिकोण है कि इंसुलिन का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी का इस्तेमाल करता है । एंटीबॉडी समानताएं में भिन्नता और इंसुलिन पहचानने की दक्षता में इस विधि के कारकों को सीमित कर रहे हैं और परिणामों के reproducibility को प्रभावित कर सकते हैं. न तो एलिसा और न ही रिया उच्च प्रवाह प्रयोगों के लिए डिजाइन किया गया था । AlphaScreen एक सजातीय परख का पता लगाने और इंसुलिन स्राव के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया है । AlphaScreen प्रौद्योगिकी एक उत्साहित ऑक्सीजन स्वेटर राज्य है कि chemiluminescent प्रजातियों के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं, chemiluminescence की पीढ़ी में जिसके परिणामस्वरूप में परिवेश ऑक्सीजन के रूपांतरण पर आधारित है । क्योंकि परख समरूप है, रिया और एलिसा से जुड़े कई वाशिंग स्टेप्स खत्म हो जाते हैं । हालांकि, प्रतिक्रिया की प्रकृति के कारण संकेत की अस्थिरता एक सीमित कारक है कि परख के readout को प्रभावित कर सकता है । (TR-दोमुखी, Heyduk और सहकर्मियों9द्वारा विकसित, इंसुलिन मापन के लिए एक और समरूप दृष्टिकोण है इंसुलिन अणु पर अलग epitopes के लिए दो अलग एंटीबॉडी के बंधन के आधार पर. एंटीबॉडी एक रासायनिक छोटे पूरक एकल असहाय डीएनए के साथ डबल असहाय डीएनए से जुड़े हुए हैं । इंसुलिन के लिए एंटीबॉडी के बंधन उन्हें एक साथ लाता है और एक डबल असहाय डीएनए द्वैध की ओर जाता है. प्रत्येक एंटीबॉडी भी एक संबंधित दाता या स्वीकारकर्ता fluorophore के साथ जुड़ा हुआ है, और डीएनए द्वैध के सहयोग से इन fluorophores को एक साथ लाता है Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) उत्पन्न करते हैं. एक TR-दोमुखी की संभावित सीमा है, तथापि, झल्लाहट ही साथ टिकी हुई है । तेजी से झल्लाहट प्रतिक्रिया के दौरान पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति नष्ट करने में असमर्थता पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के अपेक्षाकृत उच्च स्तर और परख के भीतर शोर अनुपात के लिए एक कम संकेत करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसलिए, एक की जरूरत अभी भी एक विश्वसनीय, मजबूत, और लागत प्रभावी परख के लिए एक उच्च प्रवाह तरीके में GSIS बढ़ाता के लिए मौजूद है ।

हाल ही में अग्रिम भौतिकी में एक सजातीय समय के विकास में समापन किया है-हल प्रतिदीप्ति ऊर्जा अनुनाद स्थानांतरण (HTRF) आधारित परख । विशेष रूप से, जबकि परख के भीतर ऊर्जा हस्तांतरण के रूप में वर्णित किया जा सकता है झल्लाहट आधारित है, और अधिक सही, HTRF luminescence ऊर्जा अनुनाद स्थानांतरण (LRET) पर निर्भर करता है10 जो दाता और स्वीकार्यता के बीच ऊर्जा का गैर radiating हस्तांतरण है प्रजाति11,12,13. यह अंतर महत्वपूर्ण है, एक प्रतिदीप्ति या शमन आधारित झल्लाहट बातचीत के समय के बाद से यह LRET के लिए है बहुत अलग है, हालांकि गेटिंग के एक ही प्रकार झल्लाहट और LRET के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, cryptate में europium या इद् HTRF के रूप में दुर्लभ पृथ्वी lanthanide cryptate यौगिकों का उपयोग लंबे प्रतिदीप्ति आधे जीवन का उत्पादन12,14. यह दाता उत्तेजना और स्वीकारकर्ता (यानी, समय-समाधान परख) से उत्सर्जन की माप के बीच एक समय में देरी (µ एसईसी) की शुरूआत का अनूठा लाभ प्रदान करता है । इस समय देरी पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए पर्याप्त समय के लिए अनुमति देता है के लिए स्वीकार्य उत्सर्जन प्रतिदीप्ति के माप से पहले नष्ट करना । नतीजतन, readout गैर विशिष्ट प्रतिदीप्ति से मुक्त है और इस प्रकार, एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात (चित्रा 1) हासिल की है. इसके अलावा, HTRF की समरूप प्रकृति को दूर करने के लिए असीम प्रजातियों धोने कदम धोने के लिए की जरूरत समाप्त, अधिक एलिसा या रिया से अधिक तेजी से परख बनाने के तरीकों आधारित है ।

Figure 1
चित्रा 1: HTRF इंसुलिन का पता लगाने के लिए तंत्र की योजनाबद्ध. दो स्वतंत्र रूप से उत्पंन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विशेष रूप से पहचान और अलग साइटों पर इंसुलिन के लिए बाध्य । ये एंटीबॉडी या तो europium cryptate दाता या XL665 स्वीकार करने के लिए संयुग्मित हैं. उत्तेजना पर दाता के उत्सर्जन में ३३७ एनएम परिणाम में ६२० एनएम । परिणामस्वरूप ऊर्जा हस्तांतरण XL665 एक लंबी तरंग दैर्ध्य, ६६५ एनएम पर उत्सर्जन करने के लिए कारण बनता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

यहाँ, हम आईएनएस-1E कोशिकाओं, एक अच्छी तरह से स्थापित इंसुलिन स्रावित बीटा सेल-व्युत्पंन चूहे insulinoma सेल लाइन से GSIS के स्तर को निर्धारित करने के लिए एक HTRF आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं15. इसके अलावा, इस परख इंसुलिन स्राव के आणविक नियामकों के औषधीय प्रोफ़ाइल की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम इस HTRF आधारित इंसुलिन परख लागू डोपामाइन D2-GSIS के रिसेप्टर विनियमन की तरह की जांच करने के लिए । अध्ययनों में वृद्धि से पता चला है कि न्यूरोट्रांसमीटर डोपामाइन GSIS8,16,17,18,19,20, का एक महत्वपूर्ण नियामक है 21 , 22. डोपामाइन डोपामाइन d2-जैसे रिसेप्टर्स (डी2, डी3, डी4 रिसेप्टर्स) पर कार्रवाई के माध्यम से एक नकारात्मक autocrine/paracrine तरीके से GSIS को प्रभावित करता है बीटा अग्नाशय कोशिकाओं8 की सतह पर व्यक्त , 16 , 19. इस परख का उपयोग, हम GSIS के एक नकारात्मक नियामक के रूप में डोपामाइन की भूमिका की पुष्टि और प्रदर्शन है कि डोपामाइन डी2-रिसेप्टर एगोनिस्ट bromocriptine और quinpirole भी GSIS कम की तरह ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. INS-1E कोशिकाओं: रखरखाव और चढ़ाना

  1. एक humidified ३७ ˚ C/5% CO2 मशीन और RPMI १६४० मध्यम के साथ प्रसंस्कृत में INS-1E कोशिकाओं को बनाए रखने के 5% (वी/वी) गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक, 2 मिमी एल-glutamine, 10 मिमी HEPES, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन/Streptomycin हल, ५० µ m β-mercaptoethanol. 10 मिलीलीटर में संस्कृति कोशिकाओं को पूरा RPMI १६४० मध्यम (प्रति प्लेट), जब तक वे ८०-९०% संगम तक पहुंचने, जब वे trypsinized और पारित किया जा सकता है या इंसुलिन स्राव परख के लिए इस्तेमाल किया ।
  2. दिन 1: पूर्व गर्म पंजाबियों के 5 मिलीलीटर के साथ एक बार महाप्राण मीडिया और धो कोशिकाओं । trypsin के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें (०.०२५%) पतला ०.५ मिलीलीटर पंजाब में 1:1 trypsinize कोशिकाओं और 3-4 मिनट के लिए ˚ सी में मशीन । pipetting द्वारा एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए 9 मिलीलीटर पूरा मीडिया और स्थानांतरण कोशिकाओं को जोड़कर trypsin निष्क्रिय ।
  3. केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं और फिर से लगभग 5 मिलीलीटर ताजा मीडिया में सेल गोली निलंबित ।
  4. सेल व्यवहार्यता के लिए जांच करने के लिए 10 µ एल Trypan नीले महत्वपूर्ण डाई के साथ पुनः निलंबित कोशिकाओं और मिश्रण के 10 µ एल ले लो । एक hemocytometer का उपयोग कर इस मिश्रण के 10 µ एल में रहते है और मृत कोशिकाओं गिनती । व्यवहार्यता स्तर ९०% से ऊपर होना चाहिए । ताजा मीडिया में पुनः निलंबित कोशिकाओं १,०००,००० प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं को पतला ।
  5. बीज ०.५ एमएल INS-1E कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से एक पाली में-L-Lysine पूर्व लेपित 24-खैर प्लेट, ५००,००० कोशिकाओं के घनत्व पर/
  6. Day 2: चढ़ाना के बाद मीडिया 18-24 ज निकालें और जोड़ें ५०० µ ताजा RPMI १६४० मीडिया के एल/ पहले passaging चरण से कक्षों को पूरी तरह से पुनर्प्राप्त करने की अनुमति देने के लिए अंय 24 h के लिए कक्षों को मशीन करें । इस अतिरिक्त समय कोशिकाओं ऊतक संस्कृति प्लेट पर फैल करने के लिए अनुमति देता है ।

2. इंसुलिन स्राव परख (Day 3)

  1. तैयार केआरबी बफर: १३२.२ मिमी NaCl, ३.६ मिमी KCl, 5 मिमी NaHCO3, ०.५ मिमी णः2पीओ4, ०.५ मिमी MgCl2, १.५ मिमी CaCl2, और ०.००१ ग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), पीएच ७.४.
  2. कोशिकाओं से मीडिया महाप्राण और पूर्व गर्म पंजाबियों के साथ दो बार धो लो ।
  3. ग्लूकोज भुखमरी कदम के लिए, जोड़ें ४५० µ एल/अच्छी तरह से केआरबी (युक्त BSA) 1 के लिए ग्लूकोज के बिना ३७ ˚ C/5% CO2।
  4. ग्लूकोज भुखमरी कदम के दौरान, २०० mM ग्लूकोज (10x एकाग्रता) युक्त केआरबी में दवा (ओं) के धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करते हैं ।
    1. केआरबी में 10x अंतिम एकाग्रता २०० mM ग्लूकोज के साथ पूरक में दवा तैयार (भी अंतिम परख ग्लूकोज एकाग्रता 10x) । यदि दवा स्टॉक (प्लस जोड़ा 10x ग्लूकोज) DMSO में है, सुनिश्चित करें कि DMSO प्रतिशत परख भर अनुरूप रखा है (आदर्श रूप में अंतिम प्रतिशत से कम ०.१% DMSO) ।
    2. डोपामाइन और quinpirole उपचार के लिए, एक अंतिम परख दवा एकाग्रता रेंज का उपयोग करें १०० µ m से १०० बजे तक (सबसे कम एकाग्रता से), खुराक प्रतिक्रिया के अंतिम बिंदु के साथ कोई दवा युक्त. bromocriptine के लिए, 10 µ एम के एक अंतिम परख एकाग्रता रेंज का उपयोग 10 बजे, खुराक प्रतिक्रिया के अंतिम बिंदु के साथ दवा मुक्त नियंत्रण जा रहा है ।
  5. ग्लूकोज भुखमरी के बाद, एक खुराक प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए परख करने के लिए दवा धारावाहिक कमजोर पड़ने जोड़ें.
  6. जोड़ें ५० µ प्रत्येक धारावाहिक कमजोर पड़ने के अनुरूप कुओं (कुल परख मात्रा ५०० µ एल) ।
  7. ग्लूकोज उत्तेजना कदम के लिए, संबंधित दवा सीरियल कमजोर पड़ने के साथ गर्मी कोशिकाओं (20 मिमी ग्लूकोज की उपस्थिति में) के लिए ९० मिनट में ३७ ˚ C/5% CO2. नियंत्रण कुओं का एक सेट शामिल करें: (1) किसी भी अतिरिक्त दवा के अभाव में अकेले 20 मिमी ग्लूकोज के साथ उत्तेजना और (2) कोशिकाओं है कि न तो दवा के साथ उत्तेजित कर रहे हैं और न ही ग्लूकोज (जो स्राव की एक बेसल दर प्रदान करता है).
  8. उत्तेजना कदम के बाद, ध्यान से supernatants (सीधे का उपयोग करें या 4 ˚ सी पर स्टोर) को हटा दें ।
    नोट: एक अतिरिक्त 5 मिनट कोमल केंद्रापसारक कदम (६०० x g, 1 मिनट) इस बिंदु पर पेश किया जा सकता है परख supernatants में किसी भी शेष कोशिकाओं को हटा दें ।

3. इंसुलिन स्राव को मापने के लिए HTRF

  1. केआरबी में परख supernatants 1:10 पतला (BSA के बिना), अधिमानतः साफ ९६ में अच्छी तरह से प्लेटें ।
  2. HTRF इंसुलिन परख (तालिका 1) के लिए इंसुलिन मानक वक्र तैयार करें ।
मानक स्टॉक समाधान ५०० एनजी/ सीरियल कमजोर पड़ने कार्य [इंसुलिन] एनजी/
STD 7 30 µ l शेयर + १४० µ l केआरबी १५०
एसटीडी 6 30 µ l STD 7 + ४५ µ l केआरबी ६०
STD 5 30 µ l STD 6 + ४५ µ l केआरबी 24
STD 4 30 µ l STD 5 + ४५ µ l केआरबी ९.६
STD 3 30 µ l STD 4 + ४५ µ l केआरबी ३.८४
एसटीडी 2 30 µ l STD 3 + ४५ µ l केआरबी १.५४
एसटीडी 1 30 µ l STD 2 + ४५ µ l केआरबी ०.६१
STD 0 ४५ µ l केआरबी 0
नोट: एसटीडी स्टॉक ५०० एनजी/

तालिका 1. सीरियल कमजोर पड़ने इंसुलिन मानक वक्र बनाने के लिए ।

  1. मानक वक्र नमूने और HTRF प्लेट को पतला परख supernatants जोड़ें । HTRF द्वारा स्रावित इंसुलिन की माप या तो एक ९६ में बाहर किया जा सकता है अच्छी तरह से या एक ३८४-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप, मन में रखते हुए कि परख मात्रा को फिर से समायोजित किया है । उपयोग 10 µ एल/९६ में अच्छी तरह से सफेद आधा क्षेत्र प्लेटें या 5 µ एल/अच्छी तरह से सफेद कम मात्रा में, गोल नीचे प्लेट ( सामग्री की तालिकादेखें).
  2. 1:2 दाता (cryptate)/acceptor (XL-६६५) अनुपात में एंटीबॉडी मिश्रण को डिटेक्शन बफ़र में तैयार करें ( सामग्री तालिकादेखें) ।
    नोट: HTRF परख के बारे में आगे विशिष्ट विवरण निर्माता से उपलब्ध हैं ।
  3. 30 µ एल पर परख करने के लिए एंटीबॉडी मिश्रण जोड़ें/अच्छी तरह से (एक ९६ अच्छी तरह प्लेट परख प्रारूप के लिए) या 15 µ एल/(एक ३८४ के लिए अच्छी तरह से प्लेट परख प्रारूप) ।
  4. प्लेट सील और कमरे के तापमान पर गर्मी ।
  5. प्लेट रीडर और उपयुक्त HTRF ऑप्टिक मॉड्यूल (३३७ ६६५ ६२० एनएम) का उपयोग कर एंटीबॉडी के साथ 2 एच, 4 एच, और/या रात के बाद की मशीन पढ़ें (सामग्री और निर्माता के निर्देशों की तालिका देखें) । ६० µs पर एकीकरण प्रारंभ करें और ४०० µs पर एकीकरण समय सेट करें । उपयोग २०० चमक प्रति अच्छी तरह से ।
    नोट: इन मापदंडों हमारे विशेष पाठक के उपयोग पर आधारित थे । ६२० एनएम और ६६५ एनएम पर readout विभिंन उपकरणों के बीच भिंन हो सकते हैं । यह एक कारण है कि हम 665/620 अनुपात का उपयोग करने का सुझाव है । इस अनुपात की गणना में, पाठक से पाठक को किसी भी संभावित मतभेदों को सामान्यीकृत किया जाएगा और अनुरूप HTRF मापने के लिए इस्तेमाल किया साधन की परवाह किए बिना मूल्यों प्रदान करते हैं ।

4. डेटा विश्लेषण और सामान्यीकरण

  1. ratiometric प्रतिदीप्ति रीडिंग (६६५ एनएम/620 एनएम) के एक्सट्रपलेशन के माध्यम से परख कुओं के इंसुलिन सांद्रता की गणना करने के लिए एक दूसरे क्रम द्विघात बहुपद वक्र (चित्रा 2) ।

Figure 2
चित्र 2 : इंसुलिन मानक वक्र. ज्ञात सांद्रता के मानव इंसुलिन स्टॉक इंसुलिन मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. परिणामस्वरूप HTRF अनुपात (६६५ एनएम/६२० एनएम) इंसुलिन सांद्रता के खिलाफ साजिश रची गई । डेटा किसी दूसरे क्रम द्विघात बहुपद वक्र (R2 = ०.९९९९६) के लिए श्रेष्ठ फ़िट था । यह एक प्रतिनिधि मानक वक्र है । त्रुटि सलाखों = SEM. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. के साथ extrapolated डेटा के एनजी के रूप में स्रावित इंसुलिन/एमएल, सामान्य (ligand सांद्रता बढ़ाने के जवाब में स्रावित इंसुलिन)% अधिकतम इंसुलिन स्राव परख कुओं के औसत मूल्य के लिए (20 मिमी ग्लूकोज अकेले हालत).
  2. intraplate भिंनता परिकलित करने के लिए किसी एकल प्रयोग से वक्र फ़िट (R2) का उपयोग करें । प्रयोग के भीतर, अंतर प्रयोगात्मक डुप्लिकेट से व्यक्तिगत आर2 मूल्यों व्युत्पंन, गणना वक्र फिट के लिए मतलब के मानक त्रुटि की अनुमति ।
  3. थाली भिन्नता का निर्धारण करने के लिए, सामूहिक वक्र के R2 मान के लिए माध्य की मानक त्रुटि की गणना करने के लिए कम से तीन व्यक्तिगत प्रयोगों से डेटा का उपयोग करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हम पूर्वनिर्धारित सांद्रता (चित्रा 2) के शुद्ध मानव इंसुलिन मानकों का उपयोग कर एक इंसुलिन मानक वक्र पैदा करके हमारे इंसुलिन HTRF परख मान्य. मानक वक्र की पीढ़ी हमें ratiometric प्रतिदीप्ति रीडिंग एक्सट्रपलेशन करने के लिए और इस प्रकार दवा उपचार के जवाब में स्रावित इंसुलिन का स्तर निर्धारित करने के लिए अनुमति दी (चित्रा 2). वक्र फिटिंग के लिए Intraplate भिंनता कम था (आर2 = ०.९९९९६ ± ५.० x 10-5) के रूप में थाली भिंनता था (आर2 = ०.९४७ ± ५.५ x 10-5; n = 3 प्लेटें) ।

हम अगले INS-1E कोशिकाओं से इंसुलिन स्राव के बेसल स्तर निर्धारित किया है । 5 x 105 कोशिकाओं के एक बीज बोने का घनत्व का उपयोग कर एक 24 अच्छी तरह प्लेट प्रारूप में, हमने पाया है कि कोशिकाओं को एक स्थिर स्नान में ९० मिनट की अवधि में ग्लूकोज के अभाव में इंसुलिन के ५४.५३ ± २.२ एनजी/ 20 मिमी ग्लूकोज के अलावा GSIS में एक महत्वपूर्ण वृद्धि (११२.४ ± ५.२ एनजी/एमएल इंसुलिन के परिणामस्वरूप GSIS को उत्तेजित करने के लिए; p < 0.0001) (चित्र 3) ।

Figure 3
चित्र 3 : बेसल का आकलन बनाम इंसुलिन स्राव उत्तेजित. आईएनएस-1E कोशिकाओं के अभाव में इलाज किया गया या उच्च ग्लूकोज की उपस्थिति (20 मिमी) उत्तेजना के लिए ९० मिनट. उच्च ग्लूकोज उत्तेजना उत्तेजित कोशिकाओं के सापेक्ष (बेसल स्राव स्थिति; * * * * p < 0 .0001, दो-पुच्छा न बिगड़ा हुआ t-test) के प्रत्युत्तर में इंसुलिन स्राव स्तर में दोहरीकरण का पता लगाया गया । N = 5; सभी परख triplicates में किए गए । त्रुटि सलाखों = SEM. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

dopaminergic डी की भूमिका की जांच करने के लिए2-GSIS में रिसेप्टर उत्तेजना की तरह हमारे भारतीय नौसेना पोत-1E सेल प्रणाली के भीतर, हम डी2की उपस्थिति में कोशिकाओं की मशीन की तरह रिसेप्टर एगोनिस्ट दवाओं (डोपामाइन, quinpirole, और bromocriptine) के दौरान ९०-ंयूनतम 20 मिमी ग्लूकोज (चित्रा 4) के साथ उत्तेजना अवधि.

Figure 4
चित्र 4 : HTRF का पता लगाने डोपामाइन D2 -GSIS की रिसेप्टर एगोनिस्ट निषेध की तरह. आईएनएस-1E कोशिकाओं डोपामाइन की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया गया D2-की तरह रिसेप्टर एगोनिस्ट उच्च ग्लूकोज की उपस्थिति में ९० मिनट के लिए (20 मिमी; ३७ ˚ सी). (क) डोपामाइन एक आईसी के साथ GSIS बाधित५०= १.७८ ± ३.९ µ एम (आर2 = ०.४३५५) । (ख) Bromocriptine GSIS (आईसी५० = १३.९ ± २.४ एनएम, आर2 = ०.७५०१) को कम करने में डोपामाइन से अधिक शक्तिशाली था । (ग) है Quinpirole शक्ति डोपामाइन के समान था (आईसी५० = ३.३ ± 3 µ एम, आर2 = ०.३६१७) । सभी डेटा एक तीन-पैरामीटर फ़िट sigmoidal वक्र करने के लिए श्रेष्ठ फ़िट थे । ' 0 मिमी ग्लूकोज ' बिंदु उच्च ग्लूकोज (20 मिमी) उत्तेजना के अभाव में आईएनएस-1E कोशिकाओं द्वारा बेसल इंसुलिन स्राव इंगित करता है । N > 3; सभी परख अलग प्रयोगात्मक दिन पर triplicates में किया गया । त्रुटि सलाखों = SEM. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इन एगोनिस्ट दवाओं की प्रभावकारिता और शक्ति इंसुलिन स्राव घटता रेखांकन द्वारा निर्धारित किया गया था. हमने पाया है कि उच्च ग्लूकोज के साथ उत्तेजना के अभाव में, आईएनएस-1E कोशिकाओं इंसुलिन स्रावित करने के लिए जारी रखा, हालांकि एक स्पष्ट रूप से कम डिग्री करने के लिए (0 मिमी शर्त द्वारा संकेत), पूर्व रिपोर्ट के अनुरूप15. हमारे परिणामों का प्रदर्शन किया है कि डोपामाइन, डी2के अंतर्जात एगोनिस्ट-रिसेप्टर्स की तरह, एक संगीत कार्यक्रम पर निर्भर तरीके से बाधित GSIS (डा आईसी५० = १.७८ ± ३.९ µ m; चित्र 4a) । इसके विपरीत, bromocriptine, एक प्रकार का इलाज करने के लिए अनुमोदित दवा 2 मधुमेह23,24, GSIS बाधा उत्पादन में डोपामाइन की तुलना में स्पष्ट रूप से अधिक शक्तिशाली था (आईसी५० = १३.९ ± २.४ एनएम; चित्रा 4B). अंत में, हालांकि bromocriptine से कम प्रभावोत्पादक, quinpirole GSIS निषेध में डोपामाइन के लिए इसी तरह की शक्ति का प्रदर्शन (आईसी५० = ३.३ ± 3 µ एम; चित्र 4c) ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HTRF इंसुलिन परख यहां वर्णित एक तेजी से, कुशल एक कल्चरल सेल आधारित प्रणाली से इंसुलिन स्राव को मापने के लिए प्रणाली प्रदान करता है । इसकी सबसे महत्वपूर्ण लाभ के अलावा, इस परख एक कम पृष्ठभूमि उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात की वजह से संकेत प्रदान करता है । इसके अतिरिक्त, हम पुष्टि की है कि HTRF संकेत समय की विस्तारित अवधि के लिए स्थिर है (> 24 एच)7। फिर भी, के बाद से इंसुलिन बाध्यकारी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जल्दी परख के अलावा बाध्यकारी संतृप्ति तक पहुंचने, एंटीबॉडी बाध्यकारी के कैनेटीक्स परिवेश के तापमान या इंसुलिन के स्रावित स्तर में बदलाव से प्रभावित हो सकता है । इसलिए, हम एकाधिक समय अंक (2 एच, 4 एच, और रात में परख थाली पढ़ें) को ठीक पहचान जब एंटीबॉडी पूर्ण संतृप्ति और HTRF संकेत पहुंच गए है सबसे मजबूत है7। हम भी हाल ही में दिखाया है इंसुलिन एंटीबॉडी काफी पार नहीं इंसुलिन या सी के साथ प्रतिक्रिया-पेप्टाइड, सुझाव है कि परख काफी परिपक्व इंसुलिन के लिए विशिष्ट है7.

परख के अनुकूलन में एक महत्वपूर्ण कदम इंसुलिन स्राव की एक व्यापक गतिशील रेंज की स्थापना शामिल है । इस गतिशील रेंज बेसल के दौरान पता लगाया इंसुलिन में अंतर के रूप में परिभाषित किया गया है (उत्तेजित) बनाम प्रेरित इंसुलिन स्राव. हम पाते है कि एक प्रारंभिक संक्षिप्त ग्लूकोज भुखमरी कदम (0 मिमी ग्लूकोज, 1 एच) उच्च ग्लूकोज उत्तेजना पूर्ववर्ती INS-1E कोशिकाओं भड़काने के लिए GSIS के दौरान अधिक इंसुलिन स्रावित द्वारा गतिशील रेंज फैलता है । पहले काम में, हम है परख गतिशील रेंज से पता चला है ०.१७ एनजी/एमएल से (पता लगाने की सीमा) के रूप में उच्च के रूप में ~ ११० एनजी/एमएल इंसुलिन १०.०२7के शोर अनुपात के लिए एक संकेत के साथ । इसके अतिरिक्त, स्रावित इंसुलिन की मात्रा अच्छी तरह से प्रति मढ़वाया प्रारंभिक कोशिका संख्या पर निर्भर है. हम आगे passaging और INS-1E कोशिकाओं की हैंडलिंग का मानकीकरण द्वारा परख अनुकूलित । passaging अनुसूची में निरंतरता बनाए रखने और एक विशिष्ट प्लेट प्रकार में चढ़ाना (उदा., 10 सेमी व्यंजन) लगातार स्रावित इंसुलिन के स्तर को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।

परख परिवर्तनशीलता के संभावित स्रोतों के अलावा परख समाधान जो HTRF readout के साथ हस्तक्षेप में bubbling है । इन बुलबुले का एक महत्वपूर्ण स्रोत गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन की उपस्थिति (BSA) विभिंन केआरबी आधारित परख समाधान में है । इस संभावित समस्या के निवारण के लिए, कम करने या भी दूर करने BSA काफी समाधान में बुलबुले को कम करता है और इसलिए HTRF संकेत विश्वसनीयता में सुधार । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब इंसुलिन मानक वक्र और नशीली दवाओं के कमजोर पड़ने पैदा । बेसल इंसुलिन स्राव में सेल मार्ग संख्या-निर्भर अंतर क्षमता परख परिवर्तनशीलता का एक और स्रोत है (नहीं दिखाया गया डेटा) । यह Merglen और सहकर्मियों जो भी सुझाव दिया है कि इष्टतम इंसुलिन स्राव INS-1E सेल मार्ग संख्या ~ ६०-१००15के बीच पाया जाता है द्वारा पहले काम के अनुरूप है । इसलिए, इंसुलिन स्राव सेल मार्ग संख्या से संबंधित में संभव परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, हम इस अच्छी तरह से परिभाषित सेल मार्ग सीमा के लिए स्राव परख सीमित सलाह देते हैं ।

सेल के प्राथमिक सीमा आधारित इंसुलिन स्राव परख है बेसल स्राव की परिवर्तनशीलता आईएनएस-1E कोशिकाओं के लिए आंतरिक है । यह अग्नाशय टाप के शारीरिक संदर्भ के बाहर बढ़ रही इंसुलिन स्रावित कोशिकाओं से संबंधित हो सकता है । दरअसल, अल्फा और डेल्टा कोशिकाओं सहित टाप के भीतर अन्य प्रकार के सेल कई कारकों है कि एक स्थानीय, paracrine तरीके से25में बीटा कोशिकाओं से बेसल और उत्तेजित इंसुलिन स्राव मिलाना कर सकते हैं स्राव. इन अंय टाप सेल प्रकार के अभाव इंसुलिन स्राव के तंग विनियमन परेशान हो सकता है, अंयथा शारीरिक रूप से मनाया से अधिक परिवर्तनशीलता के लिए अग्रणी । एक अंय संभावित सीमा परख के अपेक्षाकृत छोटे रैखिक रेंज है, के बाद से 20 मिमी ग्लूकोज के जवाब में स्रावित इंसुलिन लगभग कुछ मामलों में संतृप्त था । एक परिणाम के रूप में, unपतला सेल supernatants में, इंसुलिन secretagogues के प्रभाव उत्तेजित इंसुलिन स्राव पर अंशांकन वक्र के रैखिक भाग से बाहर हो सकता है. यह है, तथापि, इंसुलिन-युक्त supernatant पर्याप्त रूप से कमजोर द्वारा obviated अंशांकन वक्र के रैखिक श्रेणी में गिर करने के लिए इंसुलिन की अनुमति देने के लिए ।

हम दिखा रहा है कि डोपामाइन की agonism डी2-डोपामाइन, bromocriptine और quinpirole उपचार के माध्यम रिसेप्टर्स की तरह एक एकाग्रता पर निर्भर तरीके से GSIS बाधित द्वारा हमारे परख मान्य । इन आंकड़ों हमें GSIS पर उनके प्रभाव के संदर्भ में इन दवाओं (यानी, आईसी५० और प्रभावकारिता) के औषधीय गुणों का निर्धारण करने की अनुमति दी । हमारे परिणाम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र20,21,22,26के बाहर डोपामाइन और dopaminergic संकेतन के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव सबूत के एक बढ़ती शरीर के साथ संगत कर रहे हैं, 27. विशेष रूप से, हमारे निष्कर्ष दिखा रहा है कि डोपामाइन डी2-रिसेप्टर एगोनिस्ट bromocriptine शक्तिशाली GSIS रोकता है, अभी हाल ही में एफडीए द्वारा अनुमोदित किया गया था प्रकार के इलाज के लिए 2 मधुमेह24, महत्वपूर्ण सवाल उठाती: कैसे इस दवा प्रकार का इलाज कर सकते हैं 2 मधुमेह (T2D) यदि यह इंसुलिन स्राव कम करती है, तो कम तीव्रता से? एक संभावित विवरण के लिए bromocriptine की क्षमता से संबंधित हो सकता है "बीटा सेल आराम." इस परिकल्पना के अनुसार, T2D की कार्डिनल सुविधाओं में से एक के बाद से इंसुलिन का एक समग्र स्रावित है, कि अंततः बीटा सेल विफलता के लिए योगदान कर सकते हैं28. इसके अलावा, हम सुझाव है कि T2D के दौरान इंसुलिन स्राव भी कंकाल की मांसपेशी, जिगर और वसा ऊतक सहित अंगों की इंसुलिन संवेदनशीलता कम करके इंसुलिन प्रतिरोध ख़राब हो सकता है. इस प्रकार, अवरुद्ध या कम GSIS इन लक्ष्य ऊतकों के क्रमिक पुनर्संवेदनशीलता में परिणाम कर सकते हैं, उन्हें और अधिक इंसुलिन के लिए उत्तरदायी बनाने और इस प्रकार इंसुलिन संवेदनशीलता में सुधार. एक परख उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदाई प्रणाली होने दोनों काटना intracellular संकेत मार्ग डोपामाइन D2-अग्नाशय बीटा कोशिकाओं है कि paracrine के लिए जिंमेदार है में रिसेप्टर्स की तरह से मध्यस्थता के लिए भविष्य के काम करने के लिए दरवाजे खोलता है/ autocrine GSIS निषेध के रूप में अच्छी तरह के रूप में आगे स्पष्ट तंत्र जिसके द्वारा bromocriptine की तरह दवाओं मधुमेह के लक्षणों में सुधार हो सकता है ।

एक सेल के विकास आधारित इंसुलिन स्राव परख कि इंसुलिन स्राव के लिए HTRF प्रौद्योगिकी का लाभ लेता है और तेजी से में एक महत्वपूर्ण अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है, और इंसुलिन का कुशल पता लगाने में काफी कम लागत रिश्तेदार और/ पुराने इंसुलिन का पता लगाने के लिए सुरक्षा की तुलना में रिया और एलिसा पर भरोसा परख आधारित दृष्टिकोण । वास्तव में, हालांकि एलिसा और रिया इंसुलिन परख तुलना संवेदनशील और HTRF इंसुलिन परख, पता लगाने की समरूप प्रकृति के लिए विशिष्ट हैं, कई अतिरिक्त इन अंय परख सिस्टम में मौजूद कदम धुलाई7समाप्त । इसके अलावा, HTRF संकेत के सापेक्ष स्थिरता विश्वसनीय इंसुलिन माप के लिए एक और महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है ।

एक साथ लिया, HTRF इंसुलिन स्राव परख तेजी से सेलुलर इंसुलिन स्राव के संदर्भ में कई दवाओं के औषधीय गुणों के बीच भेदभाव की क्षमता है । इसके अलावा, इस परख का उपयोग करें और मजबूत संकेत के अपेक्षाकृत आसानी यह उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी बनाते हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

हम उदारता से आईएनएस-1E कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के लिए सहायक सलाह और डॉ पियरे Maechler (जिनेवा के विश्वविद्यालय) के लिए निकोलस पियरे (Cisbio परख) धंयवाद । यह काम रक्षा विभाग (अनुदान PR141292 से Z.F.), और जॉन एफ और पिट्सबर्ग फाउंडेशन के नैंसी ए Emmerling कोष से धन द्वारा समर्थित किया गया था (Z.F. के लिए) ।

Acknowledgments

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well white half area plate Greiner Bio-One 82050-042
384-well white low-volume, round-bottom plate Corning 15100157
Insulin High Range Kit Cisbio Bioassays 62IN1PEH  10,000 test HTRF-based insulin assay kit
PHERAstar FSX plate reader BMG Labtech FSX Plate reader adapted for HTRF-based assay readings
Plate sealers Fisher Scientific DY992 To seal plate while antibodies incubate
Hemocytometer Hausser Scientific 3100
RPMI Medium 1640 (1x) Gibco  11875-093 [+] L-glutamine
Trypsin 0.05%  Corning 25-052-CI 0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) Corning 21-031-CV Without calcium and magnesium
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
HEPES Gibco  156-30-080
Sodium pyruvate Gibco  11360070
Penicillin/Streptomycin solution 100x Corning 30-002 CT
2-mercaptoethanol Sigma M1348
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco  15250-061
Dopamine hydrochloride Sigma 8502
Bromocriptine mesylate Tocris 427
(-)-Quinpirole hydrochloride Tocris 1061
Bovine Serum Albumin Calbiochem 12659
Poly-L-Lysine Sigma P4832
Glucose Sigma G7021
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma 276855

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).
  2. Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes. Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).
  3. Despres, J. P., Lemieux, I. Abdominal obesity and metabolic syndrome. Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).
  4. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  5. Barg, S. Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells. Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).
  6. Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. Autocrine regulation of insulin secretion. Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).
  7. Farino, Z. J., et al. Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence. PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).
  8. Simpson, N., et al. Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro. Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).
  9. Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets. Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).
  10. Heyduk, T. Measuring protein conformational changes by FRET/LRET. Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).
  11. Degorce, F. HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening. Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).
  12. Degorce, F., et al. HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications. Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).
  13. Mathis, G. HTRF(R) Technology. J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).
  14. Daijo, J. E., Sportsman, J. R. A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).
  15. Merglen, A., et al. Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells. Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).
  16. Ustione, A., Piston, D. W. Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations. Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).
  17. Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).
  18. Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet. Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).
  19. Rubi, B., et al. Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion. J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).
  20. Garcia-Tornadu, I., et al. Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance. Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).
  21. Garcia-Tornadu, I., et al. New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse. Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).
  22. Lopez Vicchi, F., et al. Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis. Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).
  23. Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).
  24. Mahajan, R. Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes. Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).
  25. Caicedo, A. Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye. Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).
  26. Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications. Trends Endocrinol Metab. , (2014).
  27. Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia. Front Neurosci. 11, 432 (2017).
  28. de Leeuw van Weenen, E. J., et al. The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells. Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).

Tags

चिकित्सा मुद्दा १३५ अंत-स्रावी बीटा सेल सजातीय समय हल झल्लाहट (HTRF) एंटीबॉडी इंसुलिन ग्लूकोज प्रेरित इंसुलिन स्राव डोपामाइन quinpirole bromocriptine
सजातीय समय-हल Förster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण-इंसुलिन स्राव का पता लगाने के लिए परख आधारित
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aslanoglou, D., George, E. W.,… More

Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Förster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. J. Vis. Exp. (135), e57531, doi:10.3791/57531 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter