Summary
Vi præsenterer her, homogen tid løst ærgre sig (HTRF) som en effektiv metode til hurtig påvisning af insulin udskilles fra celler.
Abstract
Påvisning af insulinsekretion er kritisk for informative mekanismer til reguleret sekretion såvel som i undersøgelser af metabolisme. Selvom mange insulin assays har eksisteret i årtier, har den nylige fremkomsten af homogene tidsopløst Förster resonans energi Transfer (HTRF) teknologi væsentligt forenklet disse målinger. Dette er en hurtig, omkostningseffektiv, reproducerbare og robust optisk assay afhængig af antistoffer konjugeret med lyse fluorophores med langvarige emission, som letter tidsopløst Förster resonans energi Transfer. Desuden er HTRF insulin opdagelse modtagelig for udviklingen af high throughput screening-assays. Her bruger vi HTRF til at opdage insulinsekretion i INS-1E celler, en rotte insulinom-afledte cellelinie. Dette giver os mulighed at vurdere basal niveauer af insulin og deres ændringer som reaktion på glucose stimulation. Derudover bruger vi denne insulin detection system til at bekræfte betydningen af dopamin som en negativ regulator af glucose-stimuleret insulinsekretion (GSIS). I en lignende måde, andre dopamin D2-ligesom receptor agonister, quinpirole og Bromocriptin, reducere GSIS i en koncentration-afhængige måde. Vores resultater fremhæve nytten af HTRF insulin assay format i bestemmelse af mange stoffer i GSIS og deres farmakologiske profiler betydning.
Introduction
Reguleringen af energimetabolisme er finjusteret af en større anabole hormon, insulin. Insulin er syntetiseret og udgivet af pancreas beta celler som reaktion på øget ekstracellulær glucose niveauer. Den frigivne insulin udløser optagelsen af glukose af insulin-følsomme væv1,2. Fysiologisk, er dette knyttet til udvidelse af glukose koncentration efter et måltid, efterfulgt af udskillelsen af insulin til at regulere glukoseoptagelse. Forstyrrelser i glukose homøostase fører til metabolisk funktionshæmninger kulminerede i insulinresistens og i sidste ende i debut af type 2 diabetes2,3,4.
Selv om insulinsekretion er blevet grundigt undersøgt, fortsat dets reguleringsmekanismer dårligt forstået. Et kritisk område af undersøgelsen har været identifikation af roman modulatorer af insulinsekretion betaceller5,6,7,8. Disse undersøgelser kræver en bedre forståelse af kobling forholdet mellem glucose stimulation og insulinsekretion. Evne til præcist at overvåge og kvantificere niveauerne af glucose-stimuleret insulinsekretion (GSIS) har derfor været afgørende. Til dato, dog var kun et begrænset antal metoder til rådighed til at tillade kvantificering af GSIS ved hjælp af insulin-secernerende cellelinjer og/eller bugspytkirtlen Holme. En er radioimmunoassay (RIA), som udnytter radioisotop-tagged insulin og antistoffer. De vigtigste begrænsninger af denne tilgang omfatter sikkerhedsspørgsmål som følge af håndtering og bortskaffelse af radioaktivt materiale. Desuden, er denne metode arbejdskrævende, der involverer flere lange vask og inkubation trin. Enzymmaerket assay (ELISA) er en anden dyrt og arbejdskrævende tilgang, der udnytter antistoffer til registrering af insulin. Variation i antistof tilhørsforhold og effektiviteten i erkendelse af insulin er begrænsende faktorer af denne metode og kan påvirke reproducerbarhed af resultaterne. Hverken ELISA eller RIA er designet til høj overførselshastighed eksperimenter. AlphaScreen er en homogen assay til påvisning og måling af niveauer af insulinsekretion. AlphaScreen teknologi er baseret på konvertering af luftens ilt ind i en spændt ilt singlet tilstand, som kan reagere med kemiluminescens arter, resulterer i generation af chemiluminescence. Fordi analysen er homogen, er mange af de vask skridt tilknyttet RIA og ELISA elimineret. Men ustabilitet af signalet på grund af karakteren af reaktionen er en begrænsende faktor, der kan påvirke udlæsning af analysen. (TR-KNIBTANG, udviklet af Heyduk og kolleger9, er en anden homogen tilgang til insulin måling baseret på bindingen af to separate antistoffer til forskellige epitoper på insulin molekyle. Antistofferne er hver kemisk forbundet med dobbelt strandede DNA med korte supplerende enkelt strandede DNA markiser. Binding af antistoffer mod insulin samler dem og fører til en dobbelt strandede DNA duplex. Hver antistof er også forbundet med en respektive donor eller acceptor fluorophore, og sammenslutningen af DNA duplex samler disse fluorophores til at generere Förster resonans energioverførsel (FRET). En potentiel begrænsning af TR-KNIBTANG, hviler dog med ÆRGRE sig selv. Manglende evne til hurtigt sprede baggrund fluorescens under FRET reaktion kan føre til relativt høje niveauer af baggrunden fluorescens og et lavt signal til støjforhold i analysen. Derfor findes der stadig et behov for en pålidelig, robust og omkostningseffektiv analyse til kvantificering af GSIS i en høj overførselshastighed måde.
De seneste fremskridt i biofysik har kulminerede i udviklingen af en homogen tidsopløst fluorescens energi resonans overførsel (HTRF) baseret assay. Specifikt, mens energien overføres inden for kan analysen betegnes som FRET-baseret, mere præcist, HTRF bygger på luminescence energi resonans overførsel (LRET)10 , som er ikke-radiative overførsel af energi mellem donor og acceptor arter11,12,13. Denne sondring er vigtig, da timingen af et fluorescens eller dæmper baseret FRET interaktion er meget anderledes end for LRET, men de samme typer af gating kan også bruges til FRET og LRET. Desuden brug af sjældne jordarters lanthanide cryptate forbindelser såsom europium eller terbium cryptate i HTRF producerer lang fluorescens halveringstider12,14. Dette giver den unikke fordel af indførelsen af en forsinkelse (µsec) mellem donor excitation og måling af emission fra acceptoren (dvs., tidsopløst assay). Denne forsinkelse giver mulighed for tilstrækkelig tid til baggrunden fluorescens at sprede før måling af acceptoren emission fluorescens. Udlæsningen er derfor gratis ikke-specifik fluorescens og således et højt signal / støj-forhold opnås (figur 1). Desuden, den ensartede karakter af HTRF eliminerer behovet for vaske trin til at vaske den ubundne arter, hvilket gør analysen meget hurtigere end ELISA eller RIA-baserede metoder.
Figur 1: skematisk mekanisme for HTRF insulin påvisning. To uafhængigt genererede monoklonale antistoffer specifikt genkender og binder til insulin på separate websteder. Disse antistoffer er konjugeret til enten europium cryptate donor eller XL665 acceptor. Excitation af donor på 337 nm resultater i emission på 620 nm. Den resulterende energioverførsel forårsager XL665 til at udlede på en længere bølgelængde, 665 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Her, vi leverer en detaljeret protokol for at benytte en HTRF-baseret tilgang til bestemmelse af GSIS fra INS-1E celler, en veletableret insulin-secernerende beta celle-afledte rotte insulinom celle linje15. Derudover kan dette assay bruges til at identificere den farmakologiske profil af molekylære regulatorer af insulinsekretion. Vi anvender denne HTRF-baserede insulin analyse for at undersøge dopamin D2-indkvartering receptor regulering af GSIS. Stigende undersøgelser har afsløret, at neurotransmitteren dopamin er en vigtig regulator for GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. dopamin påvirker GSIS på en negativ måde, autocrine/paracrine via aktioner på dopamin D2-indkvartering receptorer (D2, D3, D4 receptorer) udtrykkes på overfladen af beta i bugspytkirtlen celler8 , 16 , 19. ved hjælp af denne analyse, vi bekræfte dopamins rolle som en negativ regulator af GSIS og vise, at dopamin D2-ligesom receptor agonister Bromocriptin og quinpirole også reducere GSIS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. INS-1E celler: vedligeholdelse og Plating
- Vedligeholde INS-1E celler i en fugtig 37 ˚C/5% CO2 inkubator og kulturperler med RPMI 1640 medium suppleret med 5% (v/v) varme-inaktiverede føtal bovint serum, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvat, 100 U/mL Penicillin/Streptomycin opløsning, 50 µM β-mercaptoethanol. Kultur celler i 10 mL komplet RPMI 1640 medium (pr. plade), indtil de når 80-90% sammenløb, når de kan trypsinized og passaged eller bruges til insulin udskillelsen assay.
- Dag 1: Opsug medier og vaske cellerne en gang med 5 mL af pre varmede PBS. Tilsæt 0,5 mL trypsin (0.025%) fortyndet 1:1 i 0,5 mL PBS til trypsinize cellerne, og der inkuberes i 3-4 min på 37 ˚C. Deaktivere trypsin ved at tilføje 9 mL komplet media og overførsel celler i en 15 mL centrifugeglas af pipettering.
- Pellet celler ved centrifugering og genopslæmmes celle pellet i ca 5 mL frisk medier.
- Tag 10 µL af de re suspenderede celler og bland med 10 µL Trypan blå vitale farvestof til at kontrollere, om cellernes levedygtighed. Tælle levende og døde celler i 10 µL af denne blanding ved hjælp af en hemocytometer. Levedygtighed niveau bør være over 90%. Fortynd de re suspenderede celler i friske medier til 1 million celler pr. mL.
- Frø 0,5 mL INS-1E celler pr. brønd i en poly-L-lysin overfladebelagt 24-godt plade, med en tæthed på 500.000 celler/brønd.
- Dag 2: Fjerne medier 18-24 timer efter plating og tilføje 500 µL/brønd af friske RPMI 1640 medier. Inkuber celler for en anden 24 h at tillade celler til at komme sig helt fra den forudgående passaging trin. Denne ekstra tid tillader cellerne til at spredes på vævskultur plade.
2. insulin udskillelsen Assay (dag 3)
- Forberede KRB buffer: 132.2 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 5 mM NaHCO3, 0,5 mM NaH2PO4, 0,5 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2og 0,001 g/mL bovint serumalbumin (BSA), pH 7,4.
- Opsug medier fra celler og vaskes to gange med pre varmede PBS.
- For glucose sult skridt, tilføje 450 µL/brønd KRB (indeholdende BSA) uden glukose for 1 h 37 ˚C/5% CO2.
- Under trinnet glukose sult forberede serielle fortyndinger af drug(s) i KRB indeholdende 200 mM glukose (10 x koncentration).
- Forberede drug 10 x den endelige koncentration i KRB suppleret med 200 mM glukose (også 10 x endelige assay glukose koncentration). Hvis stof lager (plus de ekstra 10 x glukose) er i DMSO, sikre DMSO procentdel holdes konsekvent i hele analysen (ideelt endelige procentdel af mindre end 0,1% DMSO).
- Dopamin og quinpirole behandlinger, brug en endelige analyse stof koncentration række 100 µM til 100 pM (fra højeste til laveste koncentration), med det sidste punkt af den dose respons der indeholder ingen narkotika. For Bromocriptin, skal du bruge en endelige assay koncentrationsområde på 10 µM til 10 pM, med det sidste punkt af den dose respons bliver stoffri kontrol.
- Efter glukose sult, tilføje drug serielle fortyndinger til analysen til at producere en dosis-respons.
- Tilføje 50 µL/brønd af hver seriel fortynding til de tilsvarende wells (samlede assay volume 500 µL).
- For glucose stimulation skridt, inkuberes celler med de respektive stof serielle fortyndinger (i nærværelse af 20 mM glukose) i 90 min. ved 37 ˚C/5% CO2. Omfatter en række kontrolhullerne: (1) stimulering med 20 mM glukose alene i mangel af enhver yderligere stof og (2) celler, der heller ikke stimuleres med narkotika eller glukose (som giver en basal sats af sekretion).
- Efter trinnet stimulation Fjern forsigtigt analysere (brug direkte eller opbevares ved 4 ˚C).
Bemærk: En yderligere 5 min. skånsom centrifugering trin (600 x g, 1 min) kan indføres på dette punkt for at fjerne enhver resterende celler i assay analysere.
3. HTRF til foranstaltning insulinsekretion
- Fortynd assay analysere 1:10 i KRB (uden BSA), helst i klar 96-brønd plader.
- Forberede insulin Standardkurven for HTRF insulin assay (tabel 1).
| Standard stamopløsningen 500 ng/ml | Serielle fortyndinger | Arbejder [insulin] ng/ml |
| STD 7 | 30 µl lager + 140 µl KRB | 150 |
| STD 6 | 30 µl STD 7 + 45 µl KRB | 60 |
| STD 5 | 30 µl STD 6 + 45 µl KRB | 24 |
| STD 4 | 30 µl STD 5 + 45 µl KRB | 9.6 |
| STD 3 | 30 µl STD 4 + 45 µl KRB | 3,84 |
| STD 2 | 30 µl STD 3 + 45 µl KRB | 1,54 |
| STD 1 | 30 µl STD 2 + 45 µl KRB | 0,61 |
| STD 0 | 45 µl KRB | 0 |
| Bemærk: STD bestand er 500 ng/ml | ||
Tabel 1. Serielle fortyndinger at lave insulin standardkurven.
- Tilføje standardkurven prøver og fortyndet assay analysere til HTRF plade. Måling af udskilles insulin ved HTRF kan foretages enten en 96-brønd eller en 384-godt plade format, holde sig for øje, at assay lydstyrken skal justeres igen. Brug 10 µL/brønd prøve i 96-brønd hvid halv-området plader eller 5 µL/brønd i en 384-godt hvid lav-volumen, runde-nederste plade (Se Tabel af materialer).
- Forberede antistof mix i påvisning buffer (Se Tabel af materialer) i en 1:2 donor (cryptate) / acceptor (XL-665) forholdet.
Bemærk: Yderligere specifikke detaljer om HTRF assay er tilgængelig fra fabrikanten. - Tilføje antistof mix til analysen på 30 µL/brønd (for en 96 godt-plade assay format) eller 15 µL/brønd (for en 384-godt plade assay format).
- Forsegle pladen og inkuberes ved stuetemperatur.
- Læs plade efter 2 h, 4 h, og/eller natten inkubation med antistoffer ved hjælp af i pladelæseren og den relevante HTRF fiberoptiske modul (337 665 620 nm) (Se Tabel af materialer og producentens anvisninger). Indstille integration-start på 60 µs og integration tid på 400 µs. Brug 200 blinker pr. brønd.
Bemærk: Disse parametre var baseret på brugen af vores særlige læser. Udlæsning på 620 nm og 665 nm kan variere mellem forskellige instrumenter. Dette er en af grundene til, vi foreslår at bruge 665/620 forholdet. Ved beregningen af dette forhold, eventuelle potentielle forskelle fra læser til læser vil blive normaliseret og levere ensartede værdier uanset det instrument, der anvendes til at måle HTRF.
4. dataanalyse og normalisering
- Beregne insulin koncentrationer af brøndene via ekstrapolering af ratiometric fluorescens aflæsninger (665 nm/620 nm) til en anden rækkefølge kvadratiske polynomium kurve (figur 2).
Figur 2 : Insulin standardkurven. Humant insulin lager af kendte koncentrationer blev brugt til at generere insulin standardkurven. De resulterende HTRF nøgletal (665 nm / 620 nm) var plottes insulin koncentrationer. Data, der var bedst egnet til en anden rækkefølge kvadratiske polynomium kurve (R2 = 0.99996). Dette er en repræsentativ standardkurve. Fejllinjer = SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Med de ekstrapolerede data som ng/mL af insulin udskilles, normalisere (insulin udskilles som reaktion på stigende ligand koncentrationer) til den gennemsnitlige værdi af de % maksimale insulin udskillelsen brøndene (20 mM glukose alene tilstand).
- Bruge curve fit (R2) fra et enkelt eksperiment til at beregne intraplate variationen. Inden for eksperimentet, stammer de enkelte Rasmussen2 værdier fra intra eksperimentelle dubletterne, så beregningen standardafvigelsen på middelværdien for kurven passer.
- Til bestemmelse af den interplate variation, skal du bruge data fra mindst tre individuelle eksperimenter til at beregne standardafvigelsen på middelværdien for R2 -værdien af den kollektive kurve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi validerede vores insulin HTRF analyse ved at generere en insulin standardkurve ved hjælp af oprenset humant insulin standarder af foruddefinerede koncentrationer (figur 2). Generation af standardkurven tilladt os at ekstrapolere ratiometric fluorescens aflæsninger og dermed bestemme udskilles insulin niveauer i svar til lægemiddelsbehandlinger (figur 2). Intraplate variation for kurve montering var minimal (R2 = 0.99996 ± 5,0 x 10-5) som var den interplate variation (R2 = 0.947 ± 5,5 x 10-5, n = 3 plader).
Vi besluttet næste basal niveauer af insulin udskillelsen fra INS-1E celler. Ved hjælp af en seeding tæthed af 5 x 105 celler pr godt i en 24-godt plade format, fandt vi, at celler udskilles 54.53 ± 2.2 ng/mL af insulin i mangel af glukose over en varighed på 90 min inkubation i en statisk bad. Tilsætning af 20 mM glukose til at stimulere GSIS resulterede i en væsentlig forbedring i GSIS (112.4 ± 5,2 ng/mL insulin; p < 0,0001) (figur 3).
Figur 3 : Vurdering af basal versus stimuleret insulinsekretion. INS-1E celler blev behandlet i fravær eller tilstedeværelse af høje glukose (20 mM) stimulation til 90 min. En fordobling af insulin sekretion niveauer blev registreret som reaktion på høje glukose stimulation i forhold til de unstimulated celler (basal sekretion betingelse; *** p < 0.0001, to-sidede uparret t-test). N = 5; alle assays blev gennemført i tre. Fejllinjer = SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
At undersøge rollen af dopaminerge D2-ligesom receptor stimulation i GSIS inden for vores INS-1E celle system, vi rugede celler under tilstedeværelse af D2-indkvartering receptor agonist lægemidler (dopamin, quinpirole og Bromocriptin) under 90-min stimulation periode med 20 mM glukose (figur 4).
Figur 4 : HTRF påvisning af dopamin D2 -indkvartering receptor agonist hæmning af GSIS. INS-1E celler blev behandlet med stigende koncentrationer af dopamin D2-indkvartering receptor agonister i 90 min. i overværelse af høje glukose (20 mM; 37 ˚C). (A) dopamin hæmmede GSIS med en IC50= 1,78 ± 3,9 µM (R2 = 0.4355). (B) Bromocriptin var mere potent end dopamin i at reducere GSIS (IC50 = 13,9 ± 2.4 nM, R2 = 0.7501). (C) Quinpiroles styrke var svarende til dopamin (IC50 = 3,3 ± 3 µM, R2 = 0.3617). Alle data, der var bedst egnet til en tre-parameter fit sigmoide kurve. ' 0 mM glukose ' punkt angiver basal insulinsekretion af INS-1E celler i mangel af høje glukose (20 mM) stimulation. N > 3; alle assays blev udført i tre separate eksperimentelle dage. Fejllinjer = SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Effektiviteten og styrken af disse agonist narkotika blev fastsat ved graftegning insulin udskillelsen kurver. Vi fandt, at i mangel af stimulation med høje glukose, INS-1E celler fortsatte med at udskille insulin, omend en markant lavere grad (angivet med betingelsen 0 mM), i overensstemmelse med tidligere rapporter15. Vores resultater viste at dopamin, D2endogene agonist-ligesom receptorer, hæmmede GSIS i en samordning-afhængige måde (DA IC50 = 1,78 ± 3,9 µM; Figur 4A). I kontrast, Bromocriptin, et lægemiddel godkendt til behandling af type 2 diabetes23,24, var markant mere potent end dopamin i producerer GSIS hæmning (IC50 = 13,9 ± 2.4 nM; Figur 4B). Endelig, selv om mindre virkningsfuldt end Bromocriptin, quinpirole udstillet lignende potens til dopamin i GSIS hæmning (IC50 = 3,3 ± 3 µM; Figur 4 c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HTRF insulin analysen beskrives her tilbyder en hurtig og effektivt system til at måle insulinsekretion fra en kulturperler celle-baseret system. Blandt dens vigtigste fordele tilbyder dette assay en lav baggrunden signal på grund af den højt signal / støj-forhold. Derudover har vi bekræftet, at HTRF signalet er stabile i længere tid (> 24 h)7. Ikke desto mindre, da insulin-bindende monoklonale antistoffer hurtigt nå bindende mætning efter tilsætning til analysen, kinetik af antistof bindende kan påvirkes af omgivelsernes temperatur eller variationer i udskilles niveauer af insulin. Derfor, vi læser assay pladen på flere tidspunkter (2 h, 4 h og overnatning) til præcist at identificere når antistoffer har nået fuld mætning og HTRF signal er mest robuste7. Vi har også for nylig vist insulin antistoffer ikke væsentligt krydsreagere med proinsulin eller c-peptid, tyder på, at analysen er helt konkret for modne insulin7.
Et vigtigt skridt i optimering af analysen involveret oprettelse af en bred dynamisk rækkevidde af insulinsekretion. Dette dynamiske område er defineret som forskellen i detekterede insulin under basal (unstimulated) versus stimuleret insulinsekretion. Vi finder, at en indledende korte glukose sult trin (0 mM glucose, 1 h) forud for høje glucose stimulation udvider det dynamiske område af priming INS-1E celler til at udskille mere insulin under GSIS. I tidligere arbejde, vi viste den assay dynamikområde fra 0,17 ng/mL (grænsen for opdagelse) så højt som ~ 110 ng/mL insulin med et signal til støjforhold 10.027. Derudover er mængden af udskilles insulin afhængig af oprindelige celle nummer forgyldt pr. brønd. Vi yderligere optimeret analysen af standardisering, den passaging og håndtering af INS-1E cellerne. Fastholde sammenhængen i passaging tidsplan og plating i en bestemt plade type (f.eks. 10 cm retter) er afgørende for at opnå overensstemmelse udskilles insulin niveauer.
Blandt potentielle kilder til analysen er variabilitet bobler i assay løsninger, som forstyrrer HTRF udlæsning. En vigtig kilde til disse bobler er tilstedeværelsen af bovint serumalbumin (BSA) i de forskellige KRB-baseret analyse løsninger. For at fejlfinde dette potentielle problem, at reducere eller endog fjerne BSA betydeligt minimerer bobler i opløsningen og derfor forbedrer HTRF signal pålidelighed. Dette er især vigtigt, når du genererer insulin standardkurven og narkotika fortyndinger. Celle passage nummer-afhængige forskelle i basal insulinsekretion er en anden kilde til potentielle assay variation (data ikke vist). Dette er i overensstemmelse med tidligere arbejde ved Merglen og kolleger, der også foreslog at optimal insulinsekretion er fundet mellem INS-1E celle passage tal ~ 60-10015. For at minimere mulige variabilitet i insulinsekretion relateret til celle passage nummer, anbefaler vi derfor, begrænse sekretion assays til denne veldefinerede celleområde passage.
Den primære begrænsning af celle-baseret insulin udskillelsen assay er variabiliteten af basal udskillelsen iboende til INS-1E celler. Dette kan være relateret til de voksende insulin-secernerende celler uden for den fysiologiske sammenhæng af pancreas Holmen. Ja, de andre celletyper i Holmen herunder alpha og delta celler udskiller mange faktorer, der kan modulere basal og stimuleret insulinsekretion fra beta celler i et lokale, paracrine måde25. Fraværet af disse andre islet celletyper kan forstyrre stram regulering af insulinsekretion, hvilket fører til større variation end ellers observeret fysiologisk. En anden potentiel begrænsning er den relativt lille lineære område af analysen, da insulin udskilles i respons til 20 mM glucose næsten mætte i nogle tilfælde. Som følge heraf i ufortyndet celle analysere, kan virkninger af insulin secretagogues på stimuleret insulinsekretion være ude af den lineære del af kalibreringskurven. Dette er imidlertid undgås ved fortynding af insulin-holdige supernatanten tilstrækkeligt til at tillade insulin til at falde i det lineære område af kalibreringskurven.
Vi valideret vores analyse viser at agonisme af dopamin D2-ligesom receptorer via dopamin, Bromocriptin og quinpirole behandlinger hæmmede GSIS i en koncentration-afhængige måde. Disse data er tilladt os at bestemme farmakologiske egenskaber af disse stoffer (dvs. IC50 og effekt) med hensyn til deres virkninger på GSIS. Vores resultater er i overensstemmelse med en voksende mængde af beviser tyder på en vigtig rolle for dopamin og Dopaminerg signalering uden for det centrale nervesystem20,21,22,26, 27. Især vores resultater viser, at dopamin D2-receptor agonist Bromocriptin potent hæmmer GSIS, endnu for nylig blev godkendt af FDA til behandling af type 2 diabetes24, rejser det vigtige spørgsmål: Hvordan kan denne narkotika behandle type 2 diabetes (T2D) hvis det sænker insulinsekretion, mindst akut? En potentiel forklaring kan være relateret til bromocriptins kapacitet til at afholde "beta cell resten." Ifølge denne hypotese, eftersom en af de kardinale funktioner i T2D er en samlet oversecretion af insulin, der i sidste ende kan bidrage til beta cell fiasko28. Desuden foreslår vi, at insulin oversecretion under T2D kan også forværre insulinresistens ved faldende insulinfølsomheden af organer herunder skeletmuskulatur, lever og fedtvæv. Således, blokering eller aftagende GSIS kan resultere i gradvise resensitization af disse målvæv, hvilket gør dem mere lydhøre over for insulin og dermed forbedre insulinfølsomheden. At have en assay systemet indstillet til høj overførselshastighed screening åbner døren til fremtidige arbejde både dissekere intracellulær signalering veje medieret af dopamin D2-indkvartering receptorer i pancreas beta-celler, der er ansvarlige for paracrine / autocrine GSIS hæmning samt om yderligere belyse mekanismerne, stoffer som Bromocriptin kan forbedre symptomer på diabetes.
Udviklingen af en celle-baserede insulin udskillelsen assay, der drager fordel af HTRF teknologi til insulinsekretion og repræsenterer et betydeligt fremskridt i hurtig og effektiv påvisning af insulin på betydeligt formindsket omkostninger relative og/eller større sikkerhed i forhold til ældre insulin påvisning assays afhængige af RIA og ELISA-baserede tilgange. Faktisk, selvom ELISA og RIA insulin assays er sammenligneligt følsom og specifik til HTRF insulin assay, den ensartede karakter af påvisning, eliminerer mange ekstra vask trin til stede i disse andre assay systemer7. Desuden, den relative stabilitet i HTRF signalet giver en anden afgørende fordel for pålidelig insulin måling.
Tilsammen, HTRF er insulin udskillelsen assay i stand til hurtigt at diskriminere mellem de farmakologiske egenskaber af flere stoffer i forbindelse med cellulære insulinsekretion. Endvidere, denne assay relativt brugervenlighed og robust signal gør det modtagelig for high throughput screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi takker Nicolas Pierre (Cisbio Bioassays) for nyttige råd og Dr. Pierre Maechler (universitetet i Genève) for generøst giver INS-1E celler. Dette arbejde blev støttet af midler fra Department of Defense (grant PR141292 til Z.F.), og John F. og Nancy A. Emmerling Fund of The Pittsburgh Foundation (til Z.F.).
Acknowledgments
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well white half area plate | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384-well white low-volume, round-bottom plate | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | 10,000 test HTRF-based insulin assay kit |
| PHERAstar FSX plate reader | BMG Labtech | FSX | Plate reader adapted for HTRF-based assay readings |
| Plate sealers | Fisher Scientific | DY992 | To seal plate while antibodies incubate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutamine |
| Trypsin 0.05% | Corning | 25-052-CI | 0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | Without calcium and magnesium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Penicillin/Streptomycin solution 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M1348 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptine mesylate | Tocris | 427 | |
| (-)-Quinpirole hydrochloride | Tocris | 1061 | |
| Bovine Serum Albumin | Calbiochem | 12659 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | 276855 |
References
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).
- Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes. Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).
- Despres, J. P., Lemieux, I. Abdominal obesity and metabolic syndrome. Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
- Barg, S. Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells. Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).
- Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. Autocrine regulation of insulin secretion. Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).
- Farino, Z. J., et al. Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence. PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).
- Simpson, N., et al. Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro. Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).
- Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets. Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).
- Heyduk, T. Measuring protein conformational changes by FRET/LRET. Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).
- Degorce, F. HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening. Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).
- Degorce, F., et al. HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications. Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).
- Mathis, G. HTRF(R) Technology. J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).
- Daijo, J. E., Sportsman, J. R. A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).
- Merglen, A., et al. Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells. Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).
- Ustione, A., Piston, D. W. Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations. Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet. Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).
- Rubi, B., et al. Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion. J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).
- Garcia-Tornadu, I., et al. Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance. Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).
- Garcia-Tornadu, I., et al. New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse. Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).
- Lopez Vicchi, F., et al. Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis. Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).
- Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).
- Mahajan, R. Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes. Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).
- Caicedo, A. Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye. Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).
- Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications. Trends Endocrinol Metab. , (2014).
- Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia. Front Neurosci. 11, 432 (2017).
- de Leeuw van Weenen, E. J., et al. The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells. Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).
