Summary
Hier presenteren we homogene tijd opgelost FRET (HTRF) als een efficiënte methode voor snelle detectie van insuline afgescheiden uit cellen.
Abstract
De detectie van insuline secretie is essentieel voor informatief mechanismen van gereglementeerde secretie zo goed zoals in de studie van het metabolisme. Hoewel talrijke insuline tests hebben al tientallen jaren bestaan, heeft de recente komst van homogene time-resolved Förster Resonance Energy Transfer (HTRF) technologie deze metingen aanzienlijk vereenvoudigd. Dit is een snelle, rendabele, reproduceerbare en robuuste optische test afhankelijker van antilichamen geconjugeerd met heldere fluorophores met langdurige emissie die time-resolved Förster Resonance Energy Transfer vergemakkelijkt. Bovendien is HTRF insuline detectie vatbaar voor de ontwikkeling van high-throughput screening tests. Hier gebruiken we HTRF om het detecteren van insuline secretie in INS-1E cellen, een rat Insulinoom afkomstige cellijn. Dit kan we schatten van basale niveaus van insuline en hun veranderingen in reactie op de stimulatie van de glucose. Daarnaast gebruiken wij deze insuline-detectiesysteem om te bevestigen de rol van dopamine als een negatieve regulator van glucose-gestimuleerd insuline secretie (GSIS). Op een vergelijkbare manier, andere dopamine D2-like receptor agonisten, quinpirole en bromocriptine, GSIS in een concentratie-afhankelijke manier verminderen. Onze resultaten wijzen op het nut van het HTRF insuline assay formaat bij het bepalen van de rol van talrijke drugs in GSIS en hun farmacologische profielen.
Introduction
De regulering van de energie-stofwisseling is verfijnd door een grote anabole hormoon, insuline. Insuline wordt gesynthetiseerd en uitgebracht door alvleesklier beta cellen in reactie op de toegenomen extracellulaire glucoseniveaus. De vrijgegeven insuline activeert de opname van glucose door insuline-gevoelige weefsels1,2. Fysiologisch, is dit gekoppeld aan de hoogte van glucose concentratie na een maaltijd, gevolgd door de secretie van insuline te reguleren van glucose-opname. Verstoringen in glucose homeostase leiden tot metabole waardeverminderingen culminerend in insulineresistentie en uiteindelijk in het begin van type 2 diabetes2,3,4.
Hoewel insuline secretie is uitgebreid bestudeerd, blijven de regulerende mechanismen slecht begrepen. Een cruciaal gebied van onderzoek is identificatie van roman modulatoren van insuline secretie door beta cellen5,,6,,7,8. Deze studies vereisen een beter begrip van de relatie van de koppeling tussen stimulatie van glucose en insuline secretie. Daarom is de mogelijkheid om nauwkeurig controleren en kwantificeren van de niveaus van de glucose-gestimuleerd insuline secretie (GSIS) essentieel geweest. Tot op heden, waren echter slechts een beperkt aantal methoden om een kwantificering van GSIS met behulp van insuline-afscheidende cellijnen en/of de alvleesklier eilandjes. Een is de radioimmunoanalyse (RIA), die gebruik maakt van de isotoop-gelabeld insuline en antilichamen. De belangrijkste beperkingen van deze aanpak zijn veiligheidsproblemen als gevolg van de behandeling en de verwijdering van radioactieve materialen. Bovendien, is deze methode arbeidsintensief, waarbij meerdere lange wassen en incubatie stappen. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is een andere duur en arbeidsintensief benadering die gebruikmaakt van antilichamen voor insuline detectie. Variatie in antilichaam affiniteiten en de efficiëntie van de erkenning van insuline factoren van deze methode zijn beperkt, en de reproduceerbaarheid van de resultaten kan beïnvloeden. ELISA noch RIA is ontworpen voor high-throughput experimenten. AlphaScreen is een homogene test gebruikt voor het opsporen en het meten van niveaus van insuline secretie. AlphaScreen technologie is gebaseerd op de omzetting van ambient zuurstof in een opgewonden zuurstof singlet staat die met chemiluminescentie soorten reageren kan, resulterend in de generatie van Chemoluminescentie. Omdat de bepaling homogeen is, worden veel van de stappen van de Supermarket gekoppeld RIA en ELISA geëlimineerd. De instabiliteit van het signaal door de aard van de reactie is echter een beperkende factor die invloed kan hebben op de uitlezing van de bepaling. (TR-Tang, ontwikkeld door Heyduk en collega's9, is een andere homogene aanpak van insuline waarderingsmethode op basis van de binding van twee aparte antilichamen tegen verschillende epitopen op de insuline-molecuul. De antilichamen zijn elk chemisch verbonden met dubbele gestrande DNA met korte overhangen voor aanvullende gestrande enkele DNA. Binding van de antilichamen aan insuline brengt hen samen en leidt tot een dubbele duplex voor gestrande DNA. Elke antilichaam wordt ook geassocieerd met een respectieve donor of acceptor fluorophore en de vereniging van de DNA-duplex verenigt deze fluorophores te genereren Förster resonance energy transfer (FRET). Een mogelijke beperking van TR-Tang, berust echter bij de FRET zelf. Het onvermogen om snel het verdrijven van achtergrond fluorescentie tijdens de FRET reactie kan leiden tot relatief hoge achtergrond fluorescentie en een lage signaal / ruisverhouding binnen de bepaling. Daarom bestaat een noodzaak nog steeds voor een betrouwbare, robuuste en rendabele assay voor het kwantificeren GSIS zodanig hoge gegevensdoorvoer.
Recente vooruitgang in de biofysica hebben geresulteerd in de ontwikkeling van een homogene time-resolved fluorescentie energie resonantie overdracht (HTRF) gebaseerd assay. Specifiek, terwijl de energie overdracht binnen kan de bepaling worden omschreven als FRET gebaseerde, nauwkeuriger, dat HTRF afhankelijk van luminescentie energie resonantie overdracht (LRET)10 die de niet-stralingstransport van energie tussen de donor en de acceptor soorten11,12,13. Dit onderscheid is belangrijk, aangezien de timing van een fluorescentie of blussen gebaseerde FRET interactie is veel anders dan die van LRET, hoewel het dezelfde soorten gating kunnen worden gebruikt voor de FRET en LRET. Bovendien, het gebruik van zeldzame aarden lanthanide cryptate verbindingen zoals europium of terbium cryptate in HTRF produceert lange fluorescentie halfwaardetijd12,14. Dit biedt het unieke voordeel van de invoering van een vertraging (µsec) tussen excitatie van de donor en de meting van de emissie van de acceptor (dat wil zeggen, time-resolved assay). Deze vertraging zorgt voor voldoende tijd voor de achtergrond fluorescentie te verdrijven voorafgaand aan de meting van de acceptor emissie fluorescentie. Bijgevolg, de uitlezing is gratis voor niet-specifieke fluorescentie en dus een hoge signaal-/ ruisverhouding wordt bereikt (Figuur 1). Bovendien, het homogene karakter van de HTRF elimineert de noodzaak voor het wassen van de stappen aan het afwassen van de niet-afhankelijke soorten, het maken van de test veel sneller dan ELISA of RIA gebaseerde methoden.
Figuur 1: schematische van het mechanisme voor HTRF insuline detectie. Twee onafhankelijk gegenereerde monoklonale antilichamen specifiek herkennen en binden aan insuline op afzonderlijke sites. Deze antilichamen zijn geconjugeerd aan hetzij de europium cryptate donor of de XL665 acceptor. Excitatie van de donor op 337 nm resultaten in emissie bij 620 nm. De resulterende energieoverdracht veroorzaakt XL665 te stoten bij een langere golflengte, 665 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het bepalen van de niveaus van GSIS van INS-1E cellen met een HTRF gebaseerde benadering, een gevestigde insuline-afscheidende bèta cel-afgeleide rat Insulinoom cel lijn15. Bovendien, kan deze bepaling worden gebruikt voor de identificatie van het farmacologisch profiel van moleculaire regulatoren van insuline secretie. We passen deze test van de HTRF gebaseerde insuline te onderzoeken van dopamine D2-like receptor regulering van GSIS. Steeds meer studies hebben aangetoond dat de neurotransmitter dopamine een belangrijke regulator van GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. dopamine beïnvloedt GSIS op een negatieve wijze van de autocrine/paracrine via acties op de dopamine D-2-receptoren (D2, D3D4 receptoren) uitgedrukt op het oppervlak van beta cellen van de alvleesklier8 graag , 16 , 19. met behulp van deze test, wij bevestigen dopamine de rol als een negatieve regulator van GSIS en aantonen dat de dopamine D2-like receptor agonisten bromocriptine en quinpirole ook GSIS verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. INS-1E cellen: onderhoud en beplating
- Handhaven INS-1E cellen in een bevochtigde 37 ˚C/5% CO2 incubator en gekweekte met RPMI 1640 medium aangevuld met 5% (v/v) warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvaat, 100 U/mL penicilline/streptomycine oplossing, 50 µM β-mercaptoethanol. Cultuur cellen in de volledige RPMI 1640 10 mL medium (per plaat), totdat ze bij 80-90% samenvloeiing, wanneer ze kunnen worden trypsinized en gepasseerd of voor de insuline secretie assay gebruikt.
- Dag 1: Gecombineerd media en wassen van cellen een keer met 5 mL voorverwarmde PBS. Voeg 0,5 mL trypsine (0,025%) verdund 1:1 in 0,5 mL PBS trypsinize van de cellen en incubeer gedurende 3-4 minuten bij 37 ˚C. Trypsine door toevoeging van de volledige media 9 mL en overdracht cellen aan een tube van 15 mL centrifuge door pipetteren deactiveren
- Pellet cellen door centrifugeren en resuspendeer de pellet cel in ongeveer 5 mL verse media.
- Neem 10 µL van het opnieuw gesuspendeerde cellen en meng met 10 µL van de vitale kleurstof Trypan blauw te controleren voor de levensvatbaarheid van de cellen. Levende en dode cellen in 10 µL van dit mengsel met behulp van een hemocytometer tellen. Levensvatbaarheid niveau moet boven de 90%. Verdun het opnieuw gesuspendeerde cellen in verse media naar 1 miljoen cellen per mL.
- Vooraf gecoat zaad 0,5 mL INS-1E cellen per putje in een poly-L-Lysine 24-well plaat, bij een dichtheid van 500.000 cellen per putje.
- Dag 2: Verwijder media 18-24 uur na plating en 500 µL per putje van verse RPMI 1640 media toevoegen. Incubeer de cellen gedurende een andere 24 uur om de cellen volledig herstellen uit de voorafgaande passaging stap toestaan. Deze extra tijd het toelaat de cellen te verspreiden op de plaat weefselkweek.
2. de insuline secretie Assay (dag 3)
- Bereiden KRB buffer: 132.2 mM NaCl, KCl, 5 mM NaHCO3, 0.5 mM NaH2PO4, 0.5 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2en 0,001 g/mL bovien serumalbumine (BSA), pH van de 3.6 mM 7.4.
- Media uit cellen gecombineerd en spoel tweemaal met voorverwarmde PBS.
- Toevoegen voor de glucose honger stap, 450 µL per putje KRB (met BSA) zonder glucose gedurende 1 uur bij 37 ˚C/5% CO2.
- Tijdens de glucose honger stap, maak seriële verdunningen van de drugs in KRB 200 mM met Glucose (10 x concentratie).
- Drug voor te bereiden op 10 x de uiteindelijke concentratie in KRB aangevuld met 200 mM glucose (ook 10 x de laatste assay glucose concentratie). Als de voorraad van de drug (plus de toegevoegde 10 x glucose) is in DMSO, zorg ervoor dat DMSO percentage is consequent door de bepaling (idealiter definitieve percentage van minder dan 0,1% DMSO) beperkt.
- Voor dopamine en quinpirole behandelingen, gebruik een laatste assay drug concentratiebereik van 100 µM tot 100 uur (van hoogste naar laagste concentratie), met het laatste punt van de dosis-respons met geen drug. Voor bromocriptine, door een definitieve assay concentratiebereik van 10 µM tot 22.00, te gebruiken met het laatste punt van de dosis-respons de drugsvrije controle.
- Toevoegen seriële verdunningen van de drug aan de bepaling voor de productie van een dosis-respons na glucose honger.
- Breng 50 µL per putje van elke seriële verdunning in de overeenkomstige putjes (totale assay volume 500 µL).
- Voor de glucose stimulatie stap, Incubeer de cellen met de seriële verdunningen van de respectieve drug (in aanwezigheid van 20 mM glucose) gedurende 90 minuten bij 37 ˚C/5% CO2. Geleverd met een set van controleputjes: (1) stimulatie met 20 mM glucose alleen in de afwezigheid van eventuele aanvullende drug en (2) cellen die noch worden gestimuleerd met drug noch glucose (waarmee een basale tarief van secretie).
- Na de stimulatie stap, verwijder voorzichtig het supernatant (gebruik direct of bewaren bij 4 ˚C).
Opmerking: Een extra 5 min zachte centrifugeren stap (600 x g, 1 min) kan worden ingevoerd op dit punt als u wilt verwijderen van alle resterende cellen in het supernatant assay.
3. HTRF aan maatregel insuline secretie
- Verdun assay supernatant 1:10 in KRB (zonder BSA), bij voorkeur in duidelijke 96-wells-platen.
- De standaard curve van insuline voor te bereiden voor de HTRF insuline assay (tabel 1).
| Standaard stockoplossing, 500 ng/ml | Seriële verdunningen | Werken [insuline] ng/ml |
| STD 7 | 30 µl voorraad + 140 µl KRB | 150 |
| STD 6 | 30 µl STD 7 + 45 µl KRB | 60 |
| STD 5 | 30 µl STD 6 + 45 µl KRB | 24 |
| STD 4 | 30 µl STD 5 + 45 µl KRB | 9.6 |
| STD 3 | 30 µl STD 4 + 45 µl KRB | 3.84 |
| STD 2 | 30 µl STD 3 + 45 µl KRB | 1.54 |
| STD 1 | 30 µl STD 2 + 45 µl KRB | 0.61 |
| STD 0 | 45 µl KRB | 0 |
| Opmerking: STD voorraad is 500 ng/ml | ||
Tabel 1. Seriële verdunningen te maken van de standaard curve van insuline.
- De standaard curve monsters en het verdunde assay supernatant toevoegen aan de HTRF plaat. De meting van secreted insuline door HTRF kan worden uitgevoerd in een 96-Wells of een 384-well plaat-indeling, in het achterhoofd dat het volume van de test moet opnieuw worden aangepast. Gebruik 10 µL per putje monster in 96-Wells witte helft-gebied platen of 5 µL per putje in een 384-well witte laag-volume, ronde bodem plaat (Zie Tabel van materialen).
- Bereiden van antilichaam mix in detectie buffer (Zie Tabel van materialen) in een 1:2 donor (cryptate) / acceptor (XL-665) verhouding.
Opmerking: Verdere bijzonderheden over de bepaling van de HTRF zijn verkrijgbaar bij de fabrikant. - Antilichaam mix toevoegen aan de bepaling op 30 µL per putje (voor een 96 well-plate assay-indeling) of 15 µL per putje (voor een 384-well plaat assay formaat).
- Afdichting van de plaat en laat bij kamertemperatuur inwerken.
- Lees plaat na 2U, 4 h, en/of overnachting incubatie met antilichamen met behulp van de afleesapparaat en de juiste HTRF optische module (337 665 620 nm) (Zie Tabel van materialen en aanwijzingen van de fabrikant). De integratie start vastgesteldop 60 µs en de tijd van de integratie op 400 µs. gebruik 200 flitsen per putje.
Opmerking: Deze parameters waren gebaseerd op het gebruik van onze bijzondere lezer. De uitlezing op 620 nm en 665 nm kan variëren tussen verschillende instrumenten. Dit is een van de redenen raden we u aan de 665/620-verhouding. Bij de berekening van deze ratio, elke potentiaalverschillen van lezer aan lezer zal worden genormaliseerd en consistente waarden ongeacht het instrument gebruikt voor het meten van HTRF leveren.
4. data-analyse en normalisatie
- Berekenen van de concentraties van insuline van de assay putten via extrapolatie van ratiometric fluorescentie lezingen (665 nm/620 nm) naar een tweede bestelling kwadratische polynomiale curve (Figuur 2).
Figuur 2 : Insuline standaard curve. Menselijke insuline voorraad van bekende concentraties werd gebruikt voor het genereren van de standaard curve van insuline. De resulterende HTRF ratio's (665 nm / 620 nm) werden uitgezet tegen de concentraties van insuline. De gegevens was beste pasvorm voor een tweede bestelling kwadratische polynomiale curve (R2 = 0.99996). Dit is een representatieve standaard curve. Foutbalken = SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Met de geëxtrapoleerde gegevens als ng/mL van insuline afgescheiden, normaliseren (insuline afgescheiden in reactie op de toenemende ligand concentraties) aan de gemiddelde waarde van de % maximale insuline secretie assay putten (20 mM glucose alleen voorwaarde).
- De pasvorm van de kromme (R2) van een één experiment gebruiken voor de berekening van de variatie van de intraplate. Binnen het experiment, door de afzonderlijke R2 waarden te afgeleid door de intra experimentele duplicaten, waardoor berekening de standaardfout van het gemiddelde voor de curve past.
- Voor het bepalen van de interplate variatie, door de gegevens uit ten minste drie afzonderlijke experimenten te gebruiken voor het berekenen van de standaardfout van het gemiddelde voor de R2 waarde van de collectieve curve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We onze insuline HTRF assay gevalideerd door het genereren van een insuline standaard curve met behulp van gezuiverde menselijke insuline normen van vooraf gedefinieerde concentraties (Figuur 2). Generatie van de standaard curve toegestaan ons om te extrapoleren de ratiometric fluorescentie lezingen en dus om te bepalen van de secreted insulineniveaus in reactie op de behandelingen van de drug (Figuur 2). Intraplate variatie voor curve-fitting was minimaal (R2 = 0.99996 ± 5.0 x 10-5) was de interplate variatie (R2 = 0.947 ± 5,5 x 10-5; n = 3 platen).
Wij vastbesloten vervolgens het basale niveau van insuline secretie van INS-1E cellen. Met behulp van een seeding dichtheid van 5 x 105 cellen per putje in de indeling van een 24-well plaat, vonden we dat cellen 54.53 ± 2.2 ng/mL van insuline bij gebrek aan glucose via een duur 90 min incubatietijd in een statische Bad uitgescheiden. Toevoeging van 20 mM glucose te stimuleren GSIS resulteerde in een aanzienlijke verbetering in GSIS (112.4 ± 5.2 ng/mL insuline; p < 0.0001) (Figuur 3).
Figuur 3 : Schatting van basale versus gestimuleerd insuline secretie. INS-1E cellen werden behandeld in de afwezigheid of de aanwezigheid van hoge glucose (20 mM) stimulatie voor 90 min. Een verdubbeling in de insuline secretie niveaus werd ontdekt in reactie op de stimulatie van de hoge glucose ten opzichte van de ongestimuleerde cellen (basale secretie voorwaarde; *** p < 0.0001, tweezijdige ongepaarde t-test). N = 5; alle tests werden uitgevoerd in triplicates. Foutbalken = SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Om te onderzoeken van de rol van de Dopaminerge D2-zoals de stimulatie van de receptor in GSIS binnen onze INS-1E cel systeem, we geïncubeerd cellen in aanwezigheid van de D-2-receptor agonist drugs (dopamine, quinpirole en bromocriptine) als tijdens de 90-min de periode van de stimulatie met 20 mM glucose (Figuur 4).
Figuur 4 : HTRF detectie van dopamine D2 -like receptor agonist remming van GSIS. INS-1E cellen werden behandeld met toenemende concentraties van dopamine D2-like receptor agonisten voor 90 min in aanwezigheid van hoge glucose (20 mM, 37 ˚C). (A) Dopamine geremd GSIS met een IC-50= 1,78 ± 3,9 µM (R2 = 0.4355). (B) Bromocriptine was krachtiger dan dopamine bij het verminderen van GSIS (IC50 = 13.9 ± 2.4 nM, R2 = 0.7501). (C) Quinpirole de potentie was gelijkaardig aan dopamine (IC50 = 3.3 ± 3 µM, R2 = 0.3617). Alle gegevens werden beste aanpassen aan een drie-parameter fit sigmoïdale curve. De ' 0 mM Glucose' punt geeft aan basale insuline secretie door de cellen van de INS-1E in de afwezigheid van hoge glucose (20 mM) stimulatie. N > 3; alle tests werden uitgevoerd in triplicates op verschillende experimentele dagen. Foutbalken = SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De werkzaamheid en de potentie van deze drugs agonist werd bepaald door de insuline secretie curven graphing. Vonden we dat bij gebrek aan stimulatie met hoge glucose, de cellen van de INS-1E bleef afscheiden van insuline, zij het aan een aanzienlijk lagere graad (aangegeven door de voorwaarde 0 mM), conform eerder rapporteert15. Onze resultaten aangetoond dat dopamine, de endogene agonist van D2-als receptoren, GSIS in een overleg-afhankelijke manier geremd (DA IC50 = 1,78 ± 3,9 µM; Figuur 4A). In contrast, bromocriptine, een drug die zijn goedgekeurd voor de behandeling van type 2 diabetes23,24, was aanzienlijk krachtiger dan dopamine in het produceren van GSIS remming (IC50 = 13.9 ± 2.4 nM; Figuur 4B). Tot slot, hoewel minder doeltreffend dan bromocriptine, quinpirole tentoongesteld soortgelijke potentie aan dopamine in GSIS remming (IC50 = 3.3 ± 3 µM; Figuur 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De HTRF insuline assay hier beschreven biedt een snelle, efficiënte systeem voor het meten van de insuline secretie van een gekweekte cel-gebaseerd systeem. Onder zijn belangrijkste voordelen biedt deze test een signaal van de laag achtergrond als gevolg van de hoge signaal-/ ruisverhouding. Bovendien, we hebben bevestigd dat het HTRF signaal stabiel voor langere tijd (> 24 h)7. Niettemin, aangezien snel de insuline-bindende monoclonal antilichamen bindende verzadiging na toevoeging aan de bepaling bereiken, kinetiek van antilichaam binding kan worden beïnvloed door de omgevingstemperatuur of variaties in secreted niveau van insuline. Dus, we lezen de assay plaat op meerdere tijdstippen (2 h 4 h en 's nachts) om te precies bepalen wanneer de antilichamen hebben bereikt volledige verzadiging en HTRF signaal meest robuuste7 is. We hebben ook onlangs aangetoond dat de insuline-antilichamen niet aanzienlijk cross-react met proinsulin of c-peptide, suggereert dat de bepaling vrij specifiek voor volwassen insuline7 is.
Een belangrijke stap in de optimalisering van de bepaling betrokken tot oprichting van een brede dynamische waaier van insuline secretie. Dit dynamisch bereik wordt gedefinieerd als het verschil in gedetecteerde insuline tijdens basale (ongestimuleerde) versus gestimuleerd insuline secretie. Dat vinden wij een eerste korte glucose honger stap (0 mM glucose, 1 h) voorafgaand aan hoge glucose stimulatie het dynamische bereik uitgebreid door de INS-1E cellen meer insuline afscheiden tijdens GSIS priming. In eerder werk, toonden we het dynamisch bereik van de bepaling van 0,17 ng/mL (aantal detectie) tot zo hoog als ~ 110 ng/mL insuline met een signaal / ruisverhouding van 10.027. Bovendien is de hoeveelheid secreted insuline afhankelijk van eerste celaantal verguld per putje. We verder geoptimaliseerd de bepaling door de standaardisatie van de passaging en de verwerking van het INS-1E cellen. Behoud consistentie in passaging schema en plating in een specifieke plaat type (bijvoorbeeld 10 cm gerechten) is van essentieel belang voor het verkrijgen van consistente secreted insulineniveaus.
Variabiliteit is onder de potentiële bronnen van assay borrelt in de assay-oplossingen die interfereert met de HTRF uitlezing. Een belangrijke bron van deze bubbels is de aanwezigheid van bovien serumalbumine (BSA) in de verschillende assay KRB gebaseerde oplossingen. Om dit potentiële probleem op te lossen, te verminderen of zelfs het elimineren van BSA aanzienlijk minimaliseert bubbels in de oplossing en dus verbetert de HTRF signaal betrouwbaarheid. Dit is vooral belangrijk bij het genereren van de insuline standaard curve en drug verdunningen. Cel passage nummer-afhankelijke verschillen in basale insuline secretie zijn een andere bron van potentiële assay variabiliteit (gegevens niet worden weergegeven). Dit is in overeenstemming met eerder werk van Merglen en collega's die ook gesuggereerd dat de optimale insuline secretie is gevonden tussen INS-1E cel passage nummers ~ 60-10015. Daarom, om te minimaliseren mogelijk variabiliteit in de insuline secretie gerelateerde aan passage celaantal, raadzaam secretie testen naar deze welomschreven celbereik passage te beperken.
De belangrijkste beperking van de bepaling van cel-gebaseerde insuline secretie is de variabiliteit van de basale secretie inherent is aan de INS-1E cellen. Dit kan worden gerelateerd aan de groeiende insuline-afscheidende cellen buiten de fysiologische context van de alvleesklier eilandje. Inderdaad, de andere celtypes binnen het rotseilandje inclusief alpha en delta cellen afscheiden talrijke factoren die basale en gestimuleerd insuline secretie van beta cellen in een paracrine wijze van lokale,25 moduleren kunnen. Het ontbreken van deze andere islet celtypes kan verstoren de strakke reglementering van insuline secretie, wat leidt tot grotere variabiliteit dan anders waargenomen fysiologisch. Een andere mogelijke beperking is het relatief kleine lineaire bereik van de bepaling, aangezien het verzadigen van insuline afgescheiden in reactie op 20 mM glucose was bijna in sommige gevallen. Dientengevolge, in de onverdunde cel supernatant, effecten van insuline secretagogues op gestimuleerd insuline secretie mogelijk buiten het lineaire gebied van de kalibratiekromme. Dit is, echter, afgewend door verdunning van het supernatans dat insuline-bevattende voldoende zodat de insuline te vallen in het lineaire bereik van de kalibratiekromme.
We onze assay gevalideerd door aan te tonen dat agonisme van dopamine D2-als receptoren via dopamine, bromocriptine en quinpirole behandelingen in een concentratie-afhankelijke manier GSIS geremd. Deze gegevens hebben wij kunnen bepalen van de farmacologische eigenschappen van deze drugs (dat wil zeggen, IC50 en werkzaamheid) in termen van hun effecten op de GSIS. Onze resultaten stroken met een groeiend lichaam van bewijsmateriaal dat suggereert een belangrijke rol voor dopamine en Dopaminerge signalering buiten het centrale zenuwstelsel20,21,22,26, 27. Met name onze bevindingen waaruit blijkt dat de dopamine D-2-receptor agonist bromocriptine krachtig remt GSIS, nog onlangs werd goedgekeurd door de FDA voor de behandeling van type 2 diabetes24, de belangrijke vraag: hoe kan deze drug traktatie type 2 diabetes (T2D) als het verlaagt insuline secretie, op zijn minst scherp? Een mogelijke verklaring kan worden gerelateerd aan bromocriptine de capaciteit moet hebben "bèta cel rest." Volgens deze hypothese, omdat een van de kardinale kenmerken van T2D een totale oversecretion van insuline is, die uiteindelijk kan bijdragen aan bèta cel mislukking28. Bovendien, wij stellen voor dat insuline oversecretion tijdens T2D kan ook insulineresistentie verergeren door het afnemen van insulinegevoeligheid van organen, met inbegrip van de skeletspieren, lever en vetweefsel. Dus, blokkeren of afnemende GSIS kan leiden tot geleidelijke resensitization van deze onderzoeken weefsels, waardoor ze meer ontvankelijk voor insuline en dus verbetering van de insulinegevoeligheid. Een test systeem vatbaar voor high-throughput screening opent de deur naar toekomstige werkzaamheden aan beide ontleden de intracellulaire signaalroutes gemedieerd door dopamine D-2-receptoren in de alvleesklier beta-cellen die verantwoordelijk voor paracrine zijn zoals / autocrine GSIS remming alsmede over verdere verheldering mechanismen waardoor drugs zoals bromocriptine symptomen van diabetes kunnen verbeteren.
De ontwikkeling van een cel-gebaseerde insuline secretie assay die maakt gebruik van HTRF technologie voor insuline secretie en vertegenwoordigt een belangrijke stap voorwaarts in de snelle en efficiënte detectie van insuline op aanzienlijk verminderd kosten relatieve en/of meer veiligheid ten opzichte van oudere insuline detectie assays beroep op RIA en ELISA-gebaseerde benaderingen. Inderdaad, hoewel ELISA en RIA insuline testen zijn relatief gevoelig en specifiek naar de HTRF insuline assay, elimineert de homogene aard van het opsporen, talrijke extra wassen stappen in deze andere test systemen7aanwezig. Bovendien biedt de relatieve stabiliteit van het signaal van de HTRF een ander belangrijkste voordeel voor betrouwbare insuline meting.
Insuline secretie assay tezamen, de HTRF en heeft het vermogen snel onderscheid tussen de farmacologische eigenschappen van meerdere drugs in het kader van cellulaire insuline secretie. Bovendien, deze test van relatief gebruiksgemak en robuuste signaal maken vatbaar voor high-throughput screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij danken Nicolas Pierre (Cisbio Bioassays) voor nuttig advies en Dr. Pierre Maechler (Universiteit van Genève) royaal voorzien van INS-1E cellen. Dit werk werd gesteund door financiële middelen van het ministerie van defensie (grant PR141292 aan Z.F.), en de John F. en Nancy A. Emmerling Fund van de Pittsburgh Stichting (Z.F.).
Acknowledgments
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well white half area plate | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384-well white low-volume, round-bottom plate | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | 10,000 test HTRF-based insulin assay kit |
| PHERAstar FSX plate reader | BMG Labtech | FSX | Plate reader adapted for HTRF-based assay readings |
| Plate sealers | Fisher Scientific | DY992 | To seal plate while antibodies incubate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutamine |
| Trypsin 0.05% | Corning | 25-052-CI | 0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | Without calcium and magnesium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Penicillin/Streptomycin solution 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M1348 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptine mesylate | Tocris | 427 | |
| (-)-Quinpirole hydrochloride | Tocris | 1061 | |
| Bovine Serum Albumin | Calbiochem | 12659 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | 276855 |
References
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).
- Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes. Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).
- Despres, J. P., Lemieux, I. Abdominal obesity and metabolic syndrome. Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
- Barg, S. Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells. Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).
- Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. Autocrine regulation of insulin secretion. Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).
- Farino, Z. J., et al. Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence. PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).
- Simpson, N., et al. Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro. Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).
- Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets. Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).
- Heyduk, T. Measuring protein conformational changes by FRET/LRET. Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).
- Degorce, F. HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening. Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).
- Degorce, F., et al. HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications. Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).
- Mathis, G. HTRF(R) Technology. J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).
- Daijo, J. E., Sportsman, J. R. A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).
- Merglen, A., et al. Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells. Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).
- Ustione, A., Piston, D. W. Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations. Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet. Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).
- Rubi, B., et al. Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion. J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).
- Garcia-Tornadu, I., et al. Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance. Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).
- Garcia-Tornadu, I., et al. New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse. Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).
- Lopez Vicchi, F., et al. Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis. Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).
- Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).
- Mahajan, R. Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes. Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).
- Caicedo, A. Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye. Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).
- Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications. Trends Endocrinol Metab. , (2014).
- Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia. Front Neurosci. 11, 432 (2017).
- de Leeuw van Weenen, E. J., et al. The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells. Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).
