Summary
Aquí, presentamos homogénea tiempo resuelve FRET (HTRF) como un método eficiente para la detección rápida de la insulina secretada desde las células.
Abstract
La detección de la secreción de insulina es crítica para desdoblamiento mecanismos de secreción regulada, así como en estudios de metabolismo. Aunque numerosos ensayos de insulina han existido por décadas, el advenimiento reciente de la tecnología de transferencia de energía de resonancia Förster (HTRF) tiempo-resuelta homogénea ha simplificado significativamente estas mediciones. Esto es un ensayo óptico rápido, rentable, reproducible y robusto reliant con anticuerpos conjugados a brillante fluoróforos con emisiones de larga duración que facilita la transferencia de tiempo resuelto Förster Resonancia energía. Por otra parte, la detección de insulina HTRF es favorable para el desarrollo de ensayos de cribado de alto rendimiento. Aquí utilizamos HTRF para detectar la secreción de insulina en las células de la INS-1E, una línea de células derivadas de insulinoma de rata. Esto nos permite estimar los niveles basales de insulina y sus cambios en respuesta a la estimulación de la glucosa. Además, utilizamos este sistema de detección de insulina para confirmar el papel de la dopamina como un regulador negativo de la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS). De manera similar, otras de la dopamina D2-como agonistas del receptor, quinpirole y bromocriptina, reducen GSIS en forma concentración dependiente. Nuestros resultados destacan la utilidad del formato de análisis de insulina HTRF en determinar el papel de numerosos fármacos en GSIS y sus perfiles farmacológicos.
Introduction
La regulación del metabolismo energético es perfeccionada por una hormona anabólica insulina. Insulina es sintetizada y liberada por las células beta pancreáticas en respuesta a niveles crecientes de glucosa extracelular. La insulina liberada provoca la captación de glucosa por los tejidos sensibles a insulina1,2. Fisiológicamente, esto está relacionado con la elevación de la concentración de glucosa después de una comida, seguida por la secreción de insulina para regular la absorción de glucosa. Disturbios en la homeostasis de la glucosa conducen a trastornos metabólicos que culminan en resistencia a la insulina y, finalmente, en el inicio del tipo 2 diabetes2,3,4.
Aunque la secreción de insulina ha sido extensamente estudiada, sus mecanismos de regulación siguen siendo mal entendidos. Un área crítica de investigación ha sido la identificación de nuevos moduladores de la secreción de insulina por las células beta5,6,7,8. Estos estudios requieren una mejor comprensión de la relación de acoplamiento entre el estímulo de la glucosa y la secreción de insulina. Por lo tanto, la capacidad para controlar y cuantificar los niveles de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) exactamente ha sido esencial. Hasta la fecha, sin embargo, sólo un número limitado de métodos estaba disponible para permitir la cuantificación de GSIS utilizando líneas de células secretoras de insulina o islotes pancreáticos. Uno es el radioinmunoanálisis (RIA), que utiliza radioisótopos marcados insulina y anticuerpos. Las principales limitaciones de este enfoque incluyen problemas de seguridad debido a la manipulación y eliminación de materiales radiactivos. Además, este método es mano de obra intensiva, que implica múltiples lavado largo y pasos de incubación. Análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) es otro enfoque costoso y mano de obra intensiva que utiliza anticuerpos para la detección de insulina. Variación en las afinidades de anticuerpo y en la eficacia del reconocimiento insulina son limitantes de este método y puede afectar la reproducibilidad de los resultados. ELISA ni RIA fue diseñado para experimentos de alto rendimiento. AlphaScreen es un ensayo homogéneo utilizado para la detección y medición de los niveles de secreción de insulina. Tecnología AlphaScreen se basa en la conversión de oxígeno ambiental en un estado de singlete de oxígeno excitado que puede reaccionar con especies quimioluminiscente, lo que resulta en la generación de QL. Porque el ensayo es homogéneo, se eliminan muchos de los pasos de lavado asociados de RIA y ELISA. Sin embargo, la inestabilidad de la señal debido a la naturaleza de la reacción es un factor limitante que afecte la lectura del ensayo. (TR-pinza, desarrollado por Heyduk y colegas9, es otro enfoque homogéneo para la medición de insulina basado en la Unión de dos anticuerpos diferentes a diferentes epítopes en la molécula de insulina. Los anticuerpos son cada químicamente ligado a doble trenzada DNA con trenzado DNA voladizos cortos complementarios solo. Unión de los anticuerpos a la insulina los reúne y lleva a un dúplex de DNA trenzado doble. Cada anticuerpo también se asocia con un fluoróforo donador o aceptor respectivo, y la Asociación de lo dúplex de ADN reúne a estos fluoróforos para generar a transferencia de energía de Förster Resonancia (FRET). Una limitación potencial de TR-pinza, sin embargo, recae en el traste sí mismo. La incapacidad para disipar rápidamente la fluorescencia del fondo durante la reacción de traste puede conducir a niveles relativamente altos de fluorescencia del fondo y una baja relación señal a ruido en el ensayo. Por lo tanto, todavía existe una necesidad para un análisis confiable, robusto y rentable para cuantificar GSIS en un modo de alto rendimiento.
Los avances recientes en biofísica han culminado en el desarrollo de un ensayo de transferencia (HTRF) basado en resonancia de fluorescencia de tiempo resuelto homogénea energía. Específicamente, mientras que la transferencia de energía en el ensayo puede ser descrito como basada en el traste, más exactamente, que HTRF se basa en la luminiscencia energía resonancia transferencia (LRET)10 que es la transferencia no radiativo de energía entre el donador y aceptor especies11,12,13. Esta distinción es importante, desde el momento de una fluorescencia o amortiguamiento basado en interacción traste es muy diferente de lo que es para la LRET, aunque los mismos tipos de compuerta pueden ser usados para el traste y LRET. Además, el uso de tierras raras lantánidos cryptate compuestos, como el europio o cryptate Terbio en HTRF produce fluorescencia larga vida media12,14. Esto ofrece la ventaja de la introducción de un intervalo de tiempo (μs) entre la excitación de la donante y la medición de emisiones desde el aceptor (es decir, ensayo de tiempo resuelto). Este retardo permite tiempo suficiente para la fluorescencia de fondo disipar antes de la medición de la fluorescencia de emisión del aceptador. En consecuencia, la lectura es libre de fluorescencia no específica y por lo tanto, se logra una alta relación señal a ruido (figura 1). Además, la naturaleza homogénea del HTRF elimina la necesidad de pasos de lavado para lavar la especie independiente, haciendo el análisis mucho más rápido que métodos basados en la RIA o ELISA.
Figura 1: esquema del mecanismo de detección de insulina HTRF. Dos anticuerpos monoclonales independientemente generados específicamente reconocen y se unen a la insulina en sitios separados. Estos anticuerpos se conjugan bien europio cryptate donante o el receptor de XL665. Excitación del donante en 337 resultados nm en emisión a 620 nm. La transferencia de energía resultante causa XL665 emitir en una longitud de onda más larga, 665 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Presentamos un protocolo detallado para que el uso de un enfoque basado en HTRF para determinar los niveles de GSIS de células INS-1E, una bien establecida secretoras de insulina derivadas de células beta rata insulinoma celular línea15. Además, este ensayo puede ser usado para identificar el perfil farmacológico de los reguladores moleculares de la secreción de insulina. Aplicamos este análisis de insulina basada en HTRF para examinar la dopamina D2-como regulación del receptor de GSIS. Cada vez más estudios han revelado que el neurotransmisor dopamina es un importante regulador de GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. la dopamina afecta GSIS en forma autocrina/paracrina negativo a través de acciones de la dopamina D2-como los receptores (D2, D3, D4 receptores) expresados en la superficie de las células pancreáticas beta8 , 16 , 19. usando este análisis, confirmar el papel de la dopamina como un regulador negativo de GSIS y demostrar que la dopamina D2-como bromocriptina agonistas de receptor y quinpirole también reducen GSIS.
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Protocol
1. INS-1E células: mantenimiento y chapado
- Mantener las células de la INS-1E en un incubador de2 ˚C/5% CO 37 humidificado y cultivadas con Medio RPMI 1640 suplementado con 5% (v/v) inactivado con calor suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, 10 mM HEPES, piruvato de sodio 1 m m, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina solución, 50 μm β-mercaptoetanol. Células en Medio RPMI 1640 completo de 10 mL (por placa), de la cultura hasta llegar a 80-90% de confluencia, cuando pueden se tripsinizaron y pasados o utilizados para el análisis de la secreción de insulina.
- Día 1: Los medios de comunicación de aspirar y lavar las células una vez con 5 mL de PBS precalentada. Agregar 0,5 mL de tripsina (0,025%) diluido 1:1 en 0.5 mL de PBS trypsinize las células e incubar durante 3-4 minutos a 37 ° c. Desactivar tripsina añadiendo 9 mL completo medios de comunicación y transferencia de células a un tubo de centrífuga de 15 mL por pipeteo.
- Pellet de células por centrifugación y Resuspenda el precipitado de células en medios frescos de aproximadamente 5 mL.
- Tomar 10 μl de las células re-suspensión y mezclar con 10 μl de colorante vital azul de tripano para verificar la viabilidad de las células. Contar las células vivas y muertas en 10 μl de esta mezcla usando un hemocitómetro. Nivel de viabilidad debe estar por encima del 90%. Diluir las células suspendidas de nuevo en medios frescos a 1 millón de células por mL.
- Semillas 0,5 mL INS-1E de células por pozo en una poly-L-lisina cubierto primero placa de 24 pozos, con una densidad de 500.000 células/pozo.
- Día 2: Eliminar medios de 18-24 h después de la galjanoplastia y agregar 500 μL/pocillo de frescos medios RPMI 1640. Incube las células por otro 24 h permitir que las células se recuperan completamente del passaging paso previo. Este tiempo adicional permite que las células se difunda en la placa de cultivo de tejidos.
2. insulina secreción ensayo (día 3)
- Preparar el tampón KRB: 132,2 mM NaCl, 3,6 mM KCl 5 mM NaHCO3, 0,5 mM NaH2PO4, 0,5 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2y 0,001 g/mL albúmina sérica bovina (BSA), pH 7,4.
- Los medios de comunicación de las células de aspirar y lavar dos veces con PBS precalentada.
- Para el paso de la inanición de la glucosa, añadir 450 μL/pocillo KRB (que contiene BSA) sin glucosa por 1 h a 37 ˚C/5% CO2.
- Durante la etapa de hambre glucosa, preparar diluciones seriadas de lo medicamento en KRB conteniendo 200 mM glucosa (concentración 10 x).
- Preparar drogas en 10 veces la concentración final de KRB suplementado con glucosa de 200 mM (también 10 veces la concentración de glucosa del ensayo final). Si el stock de drogas (más el añadido 10 x glucosa) es en DMSO, asegúrese de que porcentaje de DMSO se mantiene constante a lo largo del ensayo (porcentaje ideal final de menos de 0.1% DMSO).
- Para los tratamientos dopaminérgicos y quinpirole, usar un rango de concentración de droga ensayo final de 100 μm a 100 pM (de mayor a menor concentración), con el último punto de la respuesta a la dosis que contiene ningún fármaco. Para bromocriptina, usar un rango de concentración de ensayo final del μm 10 a 22:00, con el último punto de la respuesta de dosis, siendo el control libre de drogas.
- Después de hambre de la glucosa, añadir diluciones seriadas de drogas para el análisis para producir una respuesta a la dosis.
- Añadir 50 μL/pocillo de cada serie dilución a los pocillos correspondientes (análisis total volumen 500 μl).
- Para el paso del estímulo de la glucosa, incubar las células con las diluciones seriadas de drogas respectivo (en presencia de glucosa 20 mM) 90 min a 37 ˚C/5% CO2. Incluyen un conjunto de pozos de control: (1) estimulación con glucosa 20 mM sola en la ausencia de cualquier droga adicional (2) las células y que son estimuladas ni con drogas ni con glucosa (que ofrece una tasa basal de secreción).
- Después de la etapa de estimulación, retire cuidadosamente los sobrenadantes (uso directamente o almacenar a 4 ° c).
Nota: Un paso de centrifugación suave de 5 min adicional (600 x g, 1 min) se puede introducir en este punto para eliminar cualquier célula restante en los sobrenadantes de ensayo.
3. HTRF a medida la secreción de insulina
- Diluir preferiblemente ensayo sobrenadantes 1:10 en KRB (sin BSA), en placas de 96 pocillos claro.
- Preparar la curva estándar de insulina para el ensayo de insulina HTRF (tabla 1).
| Solución estándar 500 ng/ml | Diluciones seriadas | Trabajo [insulina] ng/ml |
| STD 7 | 30 μL stock + 140 μl KRB | 150 |
| STD 6 | 30 μL STD 7 + 45 μl KRB | 60 |
| STD 5 | 30 μL STD 6 + 45 μl KRB | 24 |
| STD 4 | 30 μL STD 5 + 45 μl KRB | 9.6 |
| ETS 3 | 30 μL STD 4 + 45 μl KRB | 3.84 |
| STD 2 | 30 μL STD 3 + 45 μl KRB | 1.54 |
| STD 1 | 30 μL STD 2 + 45 μl KRB | 0,61 |
| STD 0 | KRB 45 μl | 0 |
| Nota: Valores de STD es 500 ng/ml | ||
Tabla 1. Diluciones seriadas para hacer la curva estándar de insulina.
- Añadir las muestras de la curva estándar y los sobrenadantes de ensayo diluido a la placa HTRF. La medición de la insulina secretada por HTRF puede llevarse a cabo en un pozo de 96 o un formato de placa de 384 pozos, teniendo en cuenta que el volumen de ensayo debe volver a ajustarse. Uso 10 μL/pocillo de muestra en placas de medio área 96 pocillos blancas o 5 μL/pocillo en un plato blanco de 384 pozos de bajo volumen, fondo redondo (véase Tabla de materiales).
- Preparar mezcla de anticuerpo en solución tampón de detección (véase Tabla de materiales) en un donante de 1:2 (cryptate) / cociente del aceptador (XL-665).
Nota: Más detalles específicos sobre el ensayo HTRF están disponibles del fabricante. - Añada la mezcla de anticuerpos para el ensayo a 30 μL/pocillo (para un formato de ensayo de placa de la pozo 96) o 15 μL/pocillo (para un formato de ensayo de placa de 384 pocillos).
- Sellar la placa e incubar a temperatura ambiente.
- Leer la placa después de 2 h, 4 h o incubación durante la noche con anticuerpos usando el lector de la placa y el correspondiente módulo de óptica HTRF (337 665 620 nm) (véase Tabla de materiales y las instrucciones del fabricante). El principio de integración en 60 μs y el tiempo de integración a 400 μs. uso 200 parpadea por pozo.
Nota: Estos parámetros se basaron en el uso de nuestro lector particular. La lectura a 620 nm y 665 nm puede variar entre diferentes instrumentos. Esta es una de las razones que se sugiere utilizar el cociente 665/620. En el cálculo de esta proporción, las diferencias potenciales de lector a lector se normalizará y proporcionan los valores constantes cualquiera que sea el instrumento utilizado para medir HTRF.
4. normalización y análisis de datos
- Calcular las concentraciones de insulina de los pocillos de ensayo mediante extrapolación de radiométrica lecturas de fluorescencia (665 nm/620 nm) a una segundo orden polinómico curva cuadrática (figura 2).
Figura 2 : Curva estándar de insulina. Acción de la insulina humana de concentraciones conocidas se utilizó para generar la curva estándar de insulina. Los cocientes resultantes de HTRF (665 nm / 620 nm) se trazaron las concentraciones de insulina. Los datos han sido mejor ajuste a una curva de Polinomio cuadrático de segundo orden (R2 = 0.99996). Se trata de una curva estándar representativa. Barras de error = SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Con los datos extrapolados como ng/mL de insulina secretada, normalizar (insulina secretada en respuesta al aumento de las concentraciones de ligando) al valor medio de los pozos de ensayo de secreción de insulina máxima % (condición de solo glucosa 20 mM).
- Utilice el ajuste de la curva (R2) de un solo experimento para calcular la variación intraplaca. Dentro del experimento, deriva los valores individuales de2 R de los duplicados la experimentales, que permite el cálculo del error estándar de la media de la curva de ajuste.
- Para determinar la variación interplaca, utilice los datos de por lo menos tres experimentos individuales para calcular el error estándar de la media para el valor de R2 de la curva de colectivo.
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Representative Results
Validamos nuestro análisis HTRF de insulina generando una curva estándar de insulina con insulina humana purificada estándares de concentraciones predefinidas (figura 2). Generación de la curva estándar nos permitida extrapolar las lecturas de fluorescencia radiométrica y así determinar los niveles de insulina secretada en respuesta a los tratamientos de drogas (figura 2). Variación intraplaca para ajuste de curvas fue mínima (R2 = 0.99996 ± 5.0 x 10-5) como era la variación interplaca (R2 = 0.947 ± 5.5 x 10-5; n = 3 placas).
A continuación determinamos los niveles basales de la secreción de insulina de las células de la INS-1E. Utilizando una densidad de siembra de 5 x 105 células por pocillo en un formato de placa de 24 pozos, encontramos que las células secretan 54.53 ± 2.2 ng/mL de insulina en ausencia de glucosa durante un periodo de incubación de 90 min en un baño estático. Adición de glucosa 20 mM para estimular GSIS resultó en una mejora significativa en GSIS (insulina de 112.4 ± 5.2 ng/mL; p < 0.0001) (figura 3).
Figura 3 : Estimación de la basal y la secreción de insulina estimulada. INS-1E las células fueron tratadas en la ausencia o la presencia de la estimulación de la glucosa alta (20 mM) durante 90 minutos. Una duplicación en los niveles de secreción de insulina fue detectada en respuesta al estímulo de glucosa alta en relación a las células sin estimular (condición de secreción basal; *** p < 0.0001, dos colas t-test). N = 5; todos los ensayos se realizaron en triplicado. Barras de error = SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para investigar el papel de dopaminérgicos D2-como estimulación de receptor en GSIS dentro de nuestro sistema de célula de INS-1E, incubamos las células en presencia D2-como los fármacos agonistas del receptor (dopamina quinpirole y bromocriptina) durante los 90 minutos período de estimulación con glucosa 20 mM (figura 4).
Figura 4 : Detección de HTRF de dopamina D2 -como la inhibición de agonista del receptor de GSIS. INS-1E las células fueron tratadas con el aumento de las concentraciones de la dopamina D2-como agonistas del receptor durante 90 minutos en presencia de glucosa alta (20 m m; 37 ° c). (A) dopamina inhibe GSIS con una IC50= 1.78 ± 3.9 μm (R2 = 0.4355). (B) bromocriptina era más potente que la dopamina en la reducción de GSIS (IC50 = 13,9 ± 2,4 nM, R2 = 0.7501). (C) potencia de Quinpirole fue similar a la dopamina (IC50 = 3.3 μm ± 3, R2 = 0.3617). Todos los datos fueron mejor ajuste a una curva sigmoidal ajuste de tres parámetros. ' 0 mM glucosa ' punto indica la secreción de insulina basal por las células de la INS-1E en ausencia del estímulo de la glucosa alta (20 mM). N > 3; todos los ensayos se realizaron en triplicado en diferentes días experimentales. Barras de error = SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La eficacia y la potencia de estos fármacos agonista fue determinada Graficando las curvas de secreción de insulina. Encontramos que en la ausencia de la estimulación con glucosa alta, las células de INS-1E continuadas a secretar insulina, aunque a una notablemente menor (indicada por la condición de 0 mM), consistente con anteriores informes de15. Nuestros resultados demostraron que la dopamina, el agonista endógeno de D2-como los receptores, inhibe GSIS en una forma dependiente de la concertación (DA IC50 = 1.78 ± 3.9 μm; Figura 4A). En contraste, bromocriptina, un medicamento aprobado para tratar la diabetes tipo 223,24, fue notablemente más potente que la dopamina en la producción de inhibición GSIS (IC50 = 13,9 ± 2,4 nM; Figura 4B). Por último, aunque menos eficaz que la bromocriptina, quinpirole exhibe potencia similar a la dopamina en inhibición GSIS (IC50 = 3.3 ± 3 μm; Figura 4).
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Discussion
El ensayo de insulina HTRF aquí descrito ofrece un sistema rápido y eficiente para medir la secreción de insulina desde un sistema basado en células cultivada. Entre sus ventajas más importantes, este ensayo ofrece una señal de bajo fondo debido a la alta relación de señal a ruido. Además, hemos confirmado que la señal HTRF es estable por largos períodos de tiempo (> 24 h)7. Sin embargo, puesto que los anticuerpos monoclonales de insulina vinculante llegar rápidamente a la saturación de la Unión después de la adición para el ensayo, cinética de unión de anticuerpos puede verse afectada por la temperatura o las variaciones en los niveles de secreción de insulina. Por lo tanto, se puede leer la placa de ensayo en varios puntos del tiempo (2 h, 4 h y durante la noche) para identificar con precisión cuando los anticuerpos han alcanzado la saturación completa y HTRF señal es más robusto7. Hemos también ha demostrado que los anticuerpos de insulina no reacción significativamente cruzada con proinsulina o péptido c, lo que sugiere que el ensayo es muy específico para insulina madura7.
Un paso importante en la optimización del análisis implicó establecer una amplia gama dinámica de la secreción de insulina. Este rango dinámico se define como la diferencia en detectado insulina durante basal (sin estimular) versus la secreción de insulina estimulada. Nos encontramos con que un paso de hambre inicial breve glucosa (glucosa de 0 mM, 1 h) anterior a la estimulación de la glucosa alta amplía el rango dinámico por cebado las células INS-1E para secretar más insulina durante GSIS. En trabajo anterior, mostramos el rango dinámico del ensayo de 0,17 ng/mL (límite de detección) de tan alto como insulina de ~ 110 ng/mL con una relación señal a ruido de 10.027. Además, la cantidad de insulina secretada depende de número de células inicial plateado por pozo. Nos más optimizado el ensayo por estandarizar los pases y manejo de las células de la INS-1E. Mantiene la consistencia en el horario de pases y de la galjanoplastia en un tipo de placa específica (por ejemplo, platos de 10 cm) es esencial para obtener los niveles de insulina secretada consistente.
Entre las fuentes potenciales de análisis variabilidad está burbujeando en las soluciones de ensayo que interfiere con la lectura HTRF. Una fuente importante de estas burbujas es la presencia de albúmina de suero bovino (BSA) en las diversas soluciones de ensayo basados en KRB. Para solucionar este problema potencial, reduciendo o incluso eliminando BSA significativamente minimiza las burbujas en la solución y por lo tanto mejora la confiabilidad de señal HTRF. Esto es particularmente importante cuando se genera la curva estándar de insulina y las diluciones de la droga. La célula paso número dependiente diferencias en la secreción de insulina basal son otra fuente de variabilidad potencial de prueba (datos no mostrados). Esto es consistente con el anterior trabajo por Merglen y colegas que también sugirieron que la secreción de insulina óptima se encuentra entre un número de células paso INS-1E ~ 60-10015. Por lo tanto, para minimizar la posible variabilidad en la secreción de insulina relacionada con numero de celular paso, recomendamos limitar el análisis de la secreción a este rango de paso de celda bien definida.
La limitación principal del ensayo de secreción de insulina basado en la célula es la variabilidad de la secreción basal intrínseca a las células de la INS-1E. Esto puede estar relacionado con el crecimiento células secretoras de insulina fuera del contexto fisiológico de los islotes pancreáticos. De hecho, los otros tipos de células dentro de la isla incluyendo las células alfa y delta secretan numerosos factores que pueden modular la secreción de insulina basal y estimulada de las células beta en un local, de manera paracrina25. La ausencia de estos otros tipos de células del islote puede alterar la regulación apretada de la secreción de insulina, conduce a una mayor variabilidad de lo contrario observar fisiológicamente. Otra limitación potencial es el relativamente pequeño rango lineal del ensayo, ya que casi era saturar la insulina secretada en respuesta a 20 mM de glucosa en algunos casos. Como resultado, en los sobrenadantes de células sin diluir, efectos de secretagogos en la secreción de insulina estimulada pueden ser fuera de la porción lineal de la curva de calibración. Sin embargo, esto es, obviado diluyendo el sobrenadante que contiene la insulina lo suficiente como para permitir que la insulina a caer en el rango lineal de la curva de calibración.
Validamos nuestro análisis mostrando ese agonismo de la dopamina D2-como receptores a través de la dopamina, bromocriptina y quinpirole tratamientos inhibición GSIS en forma concentración dependiente. Estos datos nos permitieron determinar las propiedades farmacológicas de estos fármacos (es decir, IC50 y eficacia) en términos de sus efectos sobre GSIS. Nuestros resultados son coherentes con un creciente cuerpo de evidencia que sugiere un papel importante de dopamina y dopaminérgicas señalización fuera del sistema nervioso central20,21,22,26, 27. En particular, nuestros resultados muestran que la dopamina D2-receptor agonista bromocriptina inhibe potentemente GSIS, pero recientemente fue aprobado por la FDA para el tratamiento de la diabetes de tipo 224, plantea la importante cuestión: Cómo puede este convite de drogas tipo 2 ¿diabetes (T2D) si disminuye la secreción de insulina, por lo menos agudo? Una posible explicación puede estar relacionada con capacidad de bromocriptina a incurrir en "célula beta resto." Según esta hipótesis, ya que una de las características cardinales de T2D es un general secreción excesiva de insulina, en última instancia, puede contribuir a célula beta falla28. Por otra parte, sugerimos que la insulina secreción excesiva durante T2D también puede exacerbar la resistencia a la insulina disminuyendo la sensibilidad a la insulina de órganos como el músculo esquelético, hígado y tejido adiposo. Así, bloqueando o disminuyendo GSIS puede causar resensitization gradual de estos tejidos diana, haciéndolos más sensibles a la insulina y mejorando la sensibilidad a la insulina. Tener un sistema de análisis susceptible de proyección de alto rendimiento abre la puerta a futuros trabajos tanto diseccionar las vías de señalización intracelulares mediadas por la dopamina D2-como los receptores en las células beta pancreáticas que son responsables de paracrina / inhibición de GSIS autocrina, así como más dilucidar mecanismos que fármacos como la bromocriptina pueden mejorar los síntomas de la diabetes.
El desarrollo de un análisis de la secreción de insulina celulares que aprovecha la tecnología HTRF para la secreción de insulina y representa un avance significativo en la detección rápida y eficiente de la insulina en forma significativa disminución costo relativa o mayor seguridad en comparación con mayores ensayos de detección de insulina basándose en enfoques basados en ELISA y RIA. De hecho, aunque los ensayos de ELISA y RIA insulina son comparable sensible y específica para el ensayo de insulina HTRF, la naturaleza homogénea de la detección, elimina numerosos pasos de lavado adicional presentes en estos otros análisis los sistemas7. Además, la relativa estabilidad de la señal HTRF proporciona otra ventaja clave para la medición confiable de la insulina.
Tomados en conjunto, el HTRF análisis de secreción de insulina tiene la capacidad de discriminar rápidamente entre las propiedades farmacológicas de las drogas múltiples en el contexto de la secreción de insulina celular. Por otra parte, relativamente facilidad este ensayo de uso y señal robusta hacen favorable para detección de alto rendimiento.
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Disclosures
Agradecemos a Nicolas Pierre (Cisbio pruebas biológicas) para consejos y Dr. Pierre Maechler (Universidad de Ginebra) para proporcionar generosamente las células INS-1E. Este trabajo fue apoyado por fondos del Departamento de defensa (grant PR141292 a Z.F.), John F. y Nancy A. Emmerling Fund de la Pittsburgh Fundación (Z.F.).
Acknowledgments
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well white half area plate | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384-well white low-volume, round-bottom plate | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | 10,000 test HTRF-based insulin assay kit |
| PHERAstar FSX plate reader | BMG Labtech | FSX | Plate reader adapted for HTRF-based assay readings |
| Plate sealers | Fisher Scientific | DY992 | To seal plate while antibodies incubate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutamine |
| Trypsin 0.05% | Corning | 25-052-CI | 0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | Without calcium and magnesium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Penicillin/Streptomycin solution 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M1348 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptine mesylate | Tocris | 427 | |
| (-)-Quinpirole hydrochloride | Tocris | 1061 | |
| Bovine Serum Albumin | Calbiochem | 12659 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | 276855 |
References
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).
- Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes. Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).
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