Summary
本手稿描述了一种研究 5-氨基乙酰丙酸介导光动力疗法 (ALA)对金黄色葡萄球菌生物膜的抗菌作用的协议。该协议可用于开发一种体外模型来研究细菌生物膜与 PDT 在未来的治疗。
Abstract
金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌) 是一种常见的人类病原体, 引起化脓性和系统性感染。金黄色葡萄球菌感染很难根除, 这不仅是由于抗药性菌株的出现, 而且是它形成生物膜的能力。近年来, 光动力疗法 (PDT) 已被指出是控制生物膜感染的潜在治疗方法之一。然而, 需要进一步的研究, 以提高我们对其对细菌生物膜的影响的认识, 以及潜在的机制。这篇手稿描述了一个体外模型的 PDT 与 5-氨基乙酰丙酸 (5-阿拉), 一个前兆的实际光敏剂, 原卟啉 IX (PpIX)。简单地, 成熟的金黄色葡萄球菌生物膜与阿拉巴马一起孵化, 然后暴露在光中。随后, 通过共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 计算菌落形成单元 (CFUs), 并通过活性荧光染色可视化方法对金黄色葡萄球菌生物膜的抗菌作用进行了量化。具有代表性的结果表明, 对金黄色葡萄球菌生物膜具有较强的抗菌作用。该协议很简单, 可用于开发一种体外模型, 用于研究用 ALA PDT 治疗金黄色葡萄球菌生物膜的方法。在未来的研究中, 也可以借鉴其他光敏对不同菌株的光动力分析, 并进行最小的调整。
Introduction
金黄色葡萄球菌是一种重要的革兰氏阳性病原体, 殖民了人类寄主的皮肤和粘膜。它形成生物膜的能力被认为是其发病机制的一个重要方面1。细菌生物膜是一种植入自产基质中的细菌群落, 由胞外高分子物质组成, 包括多糖、DNA 和蛋白质。这种基质在细菌感染的持续性中起着重要作用, 对人体免疫系统和目前的抗微生物治疗有很大的抵抗力,2。尽管抗生素对生物膜的影响有限, 但抗生素仍然是生物膜感染的主要治疗方法。先前已经表明, 生物膜中的细胞比它们的浮游相对物3更耐抗生素 10-1000 倍。因此, 需要采取替代战略来克服这一问题。
光动力疗法是一种治疗细菌感染的替代疗法, 它利用适当波长的光线激活光敏。这导致了活性氧种类 (ROS) 的生产, 这是致命的靶细胞通过扰乱细胞壁, 失活酶, 并损害 DNA4。这种多目标特性使得细菌难以对 PDT 治疗产生抗药性。
在以前的报告5、6中, 研究了 PDT 对细菌和真菌生物膜的抗菌作用, 其中包括甲苯胺蓝、孔雀石绿、亚甲基蓝、氯 e6 和卟啉等多种光敏. 7,8,9,10,11,12,13。5-阿拉, 药的实际光敏剂, PpIX, 其特点是其小分子量和快速清除12,14。这些优势给了阿拉 PDT 的主要潜力作为治疗应用。虽然对浮游细菌的影响已经研究了许多组12, 但对细菌生物膜的抗菌作用尚未阐明。同时, 比较以往研究的结果是很难的。其中一个原因是不同的协议被各种组使用。因此, 本协议描述了一种基于我们以前的工作15的一种用于 PDT 系统的体外模型。通过 CFU 计算和 CLSM 活性染色证实了该模型的有效性。
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Protocol
1. 生物膜形成
-
96井微型生物膜的形成
- 检索金黄色葡萄球菌应变 USA300 和3生物膜形成的临床菌株 (C1-C3), 存储在-80 摄氏度。
注: 临床菌株形成生物膜的能力由前述的微量滴定板检测方法确定(15)。 - 在5毫升的胰蛋白胨大豆汤中接种细菌, 并在一个孵化器中培养, 一夜之间以37摄氏度的温度抖动到固定的阶段。
- 将隔夜细菌培养在25摄氏度的 4000 x g 上离心, 然后丢弃上清。并用重悬磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中的颗粒, 最终浓度为 2.0 x10 9 CFU/毫升。
注: 通过测量光学密度并进一步确定了细菌浓度, 并通过平板计数16, 揭示了 1 OD600的悬浮液中含有 1.5 x 108 CFU/毫升。 - 将细菌悬浮液稀释到含有0.5% 葡萄糖的 1:200 (1.0 x 107 CFU/毫升) 中。接种200µL 细菌悬浮液进入细胞培养处理过的聚苯乙烯 96-井微板块。
- 在含氧良好的环境下, 将微板块静态地孵化为24小时37摄氏度。
注: 成熟生物膜形成的潜伏期可能因不同菌株而异;这应在 PDT 实验15之前确定。 - 在井中丢弃介质, 用 PBS 轻轻冲洗微板块井三次, 然后丢弃上清。
注意: 该步骤应非常温和地进行, 以避免扰乱形成的生物膜。
- 检索金黄色葡萄球菌应变 USA300 和3生物膜形成的临床菌株 (C1-C3), 存储在-80 摄氏度。
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碟形中的生物膜形成
- 将金黄色葡萄球菌菌株接种到5毫升的 USA300 中, 并在一个孵化室中培养, 在37摄氏度一夜之间摇晃到固定相。
- 将隔夜细菌培养在25摄氏度的 4000 x g 上离心, 然后丢弃上清。将 PBS 中的颗粒并用重悬到最终浓度为 2.0 x10 9 CFU/毫升。然后, 将细菌悬浮液稀释到含有0.5% 葡萄糖的 1:200 (1.0 x 107 CFU/毫升) 中。将2毫升细菌悬浮液接种到35毫米光学质量的玻璃底部细胞培养皿中, 并以37摄氏度静态孵育24小时。
注: 通过测量光学密度来估计细菌的浓度。 - 用吸管吸出培养基, 然后用 PBS 轻轻地冲洗盘子中的生物膜三次, 然后小心地丢弃上清液。
注意: 避免接触到盘子底部的吸管尖端。步骤2.2 应在这一步骤后立即执行, 以防止干燥的形成生物膜。
2. 光辐照
- 在4摄氏度冰箱里存储 5-阿拉巴马。实验前, 用 PBS 稀释 5-阿拉-10 毫米。
注: 5-阿拉氨酸溶液应在实验前进行新的准备。 - 在实验组, 添加200µL 10 毫米的微板块或2毫升到养殖皿的每一个井。用铝箔盖住盘子/盘子, 孵化1小时。然后, 用发光二极管 (LED) 照射板/盘, 亮度为100兆瓦/厘米2 , 为 1 h, 在 2 @ 633 nm10的主要波长处达到光剂量 360 J/厘米17 。
注: 为了让光能有效地和均匀地传递到所有水井/盘子中的生物膜, 将光源的峰值与6.0 厘米的井/盘的距离固定, 并将实验区限制在中心辐照区 (10 厘米 x 8cm). 为了确保结果是可重现的, 实验应在相同的室温下进行。
在 led 照射步骤中, 为了避免直接接触到其他光源 (如日光、房间照明或灯光), led 在将盘子/盘子移到辐照区前打开, 光线足够亮, 足以完成操作。 - 设置控制组 (在实验中设置了三个控制组)。
- 对于第一个控制组 (阿拉巴马 LED), 添加200µL 的 PBS, 每井微板块或2毫升的文化菜。用铝箔盖住盘子/盘子, 孵化2小时。
- 对于第二个控制组 (阿拉巴马 + LED), 添加200µL 10 毫米的微板块或2毫升到养殖皿的每一个井。用铝箔盖住盘子/盘子, 孵化2小时。
- 对于第三个控制组 (阿拉巴马 LED +), 增加200µL 的 PBS 微板块或2毫升的文化菜。用铝箔盖住盘子/盘子, 孵化1小时。然后将该板暴露在 LED 上, 其 360 J/厘米2光照射波长为 633 @ 10 nm17。
注: 在 LED 照射步骤中, 避免直接接触到其他光源, 如日光、房间照明或灯光。
3. PDT 治疗效果的测定
注: 为了确认对金黄色葡萄球菌生物膜的影响, 通过 CFU 计数和活性染色法对具有或不带 pdt 的细胞的生存能力进行了评价。
-
剩余存活菌细胞的测定
- 治疗后, 丢弃在水井中的介质和冲洗与 PBS 三倍的水井, 以消除所有非黏附细胞的实验和对照组。
注意: 这一步应该非常温和地进行。 - 用吸管尖端从水井中彻底刮去附着的细菌细胞, 并收集锥形管中的细胞。
- 离心机的细菌悬浮在 4000 x g 10 分钟4摄氏度, 然后丢弃上清。
- 并用重悬1毫升0.25% 胰酶酶在 PBS 中的细菌和孵育37°c 1.5 小时。
- 离心机在 4000 x g 10 分钟;丢弃上清, 然后在 PBS 的200µL 中并用重悬颗粒。
- 用 PBS 制作1:10 系列稀释细胞溶液;然后, 将每个系列稀释样品的5µL 添加到胰蛋白胨大豆琼脂 (TSA) 板上。孵育37°c 的 TSA 板16小时;然后, (肉眼) 计数细菌菌落数 (CFU/毫升)。
- 治疗后, 丢弃在水井中的介质和冲洗与 PBS 三倍的水井, 以消除所有非黏附细胞的实验和对照组。
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CLSM 对金黄色葡萄球菌生物膜的观察
- 光照射后, 用 PBS 将培养基中的生物膜洗净三次。
注意: 这一步应该非常温和地进行。 - 添加1毫升的1µM 绿色荧光核和染色体染色, 可渗透到原核细胞膜 (例如, SYTO9) 和1毫升1µM 碘碘 (PI), 以染色生物膜和死细胞。
- 观察可行细胞 (绿色荧光, 前/em 485 nm/530 nm) 和死细胞 (红色荧光, 前/em 485 nm/630nm) 下 CLSM 与 63X 1.4-钠油浸泡物镜。
- 使用显微软件生成图像。
- 光照射后, 用 PBS 将培养基中的生物膜洗净三次。
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Representative Results
在 USA300 和三株临床菌株中, 与对照组 (以阿拉巴马为首的、以阿拉为主导的 led 和阿拉巴马为首的 +) 相比, 生物膜中细菌的生存能力下降了 (图 1)。
为证实 CFU 测定的结果, 观察其对金黄色葡萄球菌生物膜的抗菌作用, USA300 生物膜通过 CLSM 与活性染色进行可视化. 存活和死亡细胞分别染色绿色和红色荧光。图像显示, 生物膜中的大多数细菌都是由 CFU 的实验结果所杀死的, 这与该方法的效果一致 (图 2)。
图 1: ALA PDT 对生物膜的影响.CFU/毫升是对数转换, 并显示为 USA300 和三临床菌株 (C1-C3) 治疗的平均的标准偏差, 以阿拉 PDT (亚拉巴马州 + led +) 或在控制条件下 (以阿拉巴马为首, 阿拉巴马州 + led, 阿拉巴马 led +)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 代表的 CLSM 图像S. 金黄色葡萄球菌生物膜与活/死染色.由 USA300 细菌形成的生物膜用或不采用 PDT (A 组: 以阿拉为主导-, 小组 B: 亚拉巴马州 + led-, 面板 C: 阿拉巴马 led +, 面板 D: 阿拉 + led +), 然后染色与 SYTO9 (绿色荧光) 和 PI (红色荧光) 代表活和死的细菌独立。采用 63X 1.4-钠油浸泡目标。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
PDT 一直是一个良好的研究治疗癌症治疗, 因为它是发明100年前的18。在过去的十年中, PDT 已被应用作为一种抗菌策略, 并显示了对某些耐药性致病菌的有效性12。与浮游状态相比, 细菌生物膜似乎对抗生素治疗的抗药性更有3, 而对生物膜的影响还没有得到充分的研究。
本文介绍了一种体外PDT 系统, 并对该模型对金黄色葡萄球菌生物膜的抗菌作用进行了论证。采用两种方法对本协议中的金黄色葡萄球菌生物膜进行了实验研究。CFU 试验通过对治疗后存活细胞的计算证明了抗菌效果, CLSM 荧光活性染色不仅证实了 CFU 试验结果, 而且还检测了活死人的形态学特征。细菌就地。将两种分析技术结合在一起是确定其对生物膜影响的理想方法。在 CLSM 结果的基础上, 死细菌细胞主要分布在上层, 而底层的一些细菌仍然活着15。后者可能是 CFU 化验中细菌菌落的来源。奥尼尔et 等人进行的一项研究也发现了类似的结果, 这是由于内部层中光敏的低积累或光线无法穿透这些区域的19所解释的。
在该协议中, 成熟的生物膜在10毫米的1小时内孵化, 然后再接触到 PDT。这些参数是根据两个预试验结果选择的。首先, 用不同浓度的阿拉巴马和不同的时间进行孵化, 用金黄色葡萄球菌生物膜对其抗菌效果进行了试验。没有任何杀菌效果的组被选为候选者。第二, 在这些候选组中检测到 PDT 效应, 最后选择了具有最有效杀菌效果的组。因此, 本议定书所使用的参数确保了仅在阿拉巴马州没有杀菌效果。1小时的潜伏期比以前的研究中使用的时间短得多17,20, 这使得的体外研究和未来临床治疗的潜在应用更加方便。
成功使用此模型有几个关键点。首先, 要在黑暗中进行处理的全过程, 包括对被治疗的细菌的操作。其次, 对成熟生物膜的操纵应温和避免干扰形成的生物膜。第三, 在 CFU 试验中, 从底板上刮出的细菌应该是彻底的。最后, 应使用新鲜准备的阿拉巴马;因此, 最好在实验前准备好。
尽管本协议可用于测试对金黄色葡萄球菌生物膜的影响, 但它与临床情况在体内仍有不同。例如, 人体内的生物膜通常由多个细菌菌株组成21、22, 而环境在体内比体外更复杂, 这可能会影响 PDT 的效果。因此, 需要在未来的体内实验中, 全面评估其对金黄色葡萄球菌生物膜的抗菌作用。然而, 由于其方便性和进行体内研究的伦理问题, 此体外平台将是有益和实用的, 以改善对S 金黄色葡萄球菌生物膜的影响研究。还应指出的是, 尽管 PpIX 光敏剂的前驱体具有良好的特性, 包括快速清除、较短且持久的皮肤感光性、有限的光穿透仅限于表面病变。特别是其非累积毒性14, 所需的光剂量和光敏剂浓度, 以实现细菌杀死可能仍然有旁观者的影响, 宿主细胞的生存能力。因此, 研究23对某些致病性细菌如金黄色葡萄球菌进行靶向治疗的修改, 对于今后的抗菌治疗有重要价值。
该协议不仅可以用于研究对未来的金黄色葡萄球菌菌株的影响, 还可以参考其对其他细菌形成的生物膜的影响。这些参数, 如阿拉巴马的浓度和细菌孵化的持续时间, 在不同的细菌菌株之间可能有所不同, 但上述原则通常是共享的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
这项工作由中国国家自然科学基金 (81300810 号)、上海市青年医生培训计划 (20141057 号) 和中国国家自然科学基金 (81671982、81271791和 81571955) 资助。我们感谢 LetPub (www.letpub.com) 在编写本手稿期间提供语言援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
References
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