Summary
Dit manuscript beschrijft een protocol om te bestuderen van de antimicrobiële werking van 5-aminolevulinic zuur-gemedieerde Fotodynamische therapie (PDT-ALA) op een biofilm Staphylococcus aureus . Dit protocol kan worden gebruikt om een in vitro model om te bestuderen van de behandeling van bacteriële biofilms met PDT in de toekomst te ontwikkelen.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) is een gemeenschappelijke menselijke pathogenen, waardoor pyogenic en systemische infecties. S. aureus -infecties zijn moeilijk uit te roeien niet alleen te wijten aan de opkomst van antibiotica-resistente stammen, maar ook zijn vermogen om vorm biofilms. Fotodynamische therapie (PDT) heeft onlangs, is aangegeven als een van de mogelijke behandelingen voor het beheersen van biofilm infecties. Echter zijn verdere studies nodig om onze kennis van de invloed ervan op bacteriële biofilms, evenals de onderliggende mechanismen te verbeteren. Dit manuscript beschrijft een in vitro model van PDT met 5-aminolevulinic acid (5-ALA), een voorloper van de werkelijke fotosensitizer, protoporfyrine IX (PpIX). Kort, oudere S. aureus biofilms werden geïncubeerd met ALA en vervolgens blootgesteld aan het licht. Vervolgens was het antibacteriële effect van ALA-PDT op S. aureus biofilm gekwantificeerd door het berekenen van de kolonievormende eenheden (CFUs) en gevisualiseerd door levensvatbaarheid fluorescerende vlekken via confocale laser scanning microscopie (CLSM). Representatieve resultaten toonde een sterke antibacteriële werking van ALA-PDT op S. aureus biofilms. Dit protocol is eenvoudig en kan worden gebruikt voor het ontwikkelen van een in vitro model voor het bestuderen van de behandeling van S. aureus biofilms met ALA-PDT. Het kan in de toekomst ook in PDT studies met behulp van andere photosensitizers voor verschillende bacteriestammen met minimale aanpassingen worden verwezen.
Introduction
S. aureus is een belangrijke Gram-positive pathogenen die de huid en mucosa van menselijke gastheren koloniseert. Haar vermogen om vorm biofilms wordt beschouwd als een belangrijk aspect van de pathogenese1. Bacteriële biofilms zijn een Gemeenschap van bacteriën die zijn ingesloten in een zelf geproduceerde matrix, die is samengesteld uit de extracellulaire polymere stoffen, zoals polysacharide, DNA en proteïne. Deze matrix speelt een belangrijke rol in de persistentie van bacteriële infecties, bijgedragen tot een hoge mate van weerstand tegen het menselijke immuunsysteem en de huidige anti-microbiële therapieën2. Antibiotica zijn nog steeds de belangrijke behandeling tegen biofilms infecties, hoewel de effecten van antibiotica op biofilms beperkt zijn. Eerder is aangetoond dat cellen in biofilms 10 - 1000 keer meer resistent zijn tegen antibiotica vergeleken met hun tegenhangers van de planktonische3. Dus, alternatieve strategieën nodig zijn om het veroveren van deze kwestie.
PDT, een alternatieve behandeling van bacteriële infecties, wordt het licht van een passende golflengte om te activeren photosensitizers. Dit leidt tot de productie van reactieve zuurstof soorten (ROS), die dodelijk voor de doelcellen zijn door beschadiging van DNA4, verstoren de celwand en enzymen te inactiveren. Dit kenmerk voor meerdere doelen maakt het moeilijk voor bacteriën ontwikkelen resistentie tegen de behandeling met PDT.
De antimicrobiële effect van PDT op bacteriële en schimmelinfecties biofilms, met meerdere photosensitizers, zoals toluïdine blauw, groen Malachiet, methyleenblauw, chloor e6 en porphyrins, is bestudeerd in vorige verslagen5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, een voorstadium van de werkelijke fotosensitizer, PpIX, wordt gekenmerkt door zijn kleine moleculaire gewicht en de snelle goedkeuring12,14. Deze voordelen geven ALA-PDT groot potentieel als een therapeutische toepassing. Hoewel het effect van ALA-PDT op planktonische bacteriën is bestudeerd door vele groepen12, heeft het antimicrobiële effect van ALA-PDT op bacteriële biofilms niet toch geweest opgehelderd. Ondertussen is het moeilijk te vergelijken van de resultaten van eerdere studies. Een van de redenen is dat de verschillende protocollen worden gebruikt door diverse groepen. Dus, dit protocol beschrijft een in vitro model van een ALA-PDT-systeem is gebaseerd op onze eerdere werk15. Het effect van dit model werd bevestigd door CFU berekening en levensvatbaarheid kleuring met CLSM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de Biofilm vorming
-
Biofilm vorming in 96-Wells-microplates
- Ophalen van de S. aureus -stam USA300 en 3 biofilm-vormende klinische stammen (C1 - C3) opgeslagen bij-80 ° C.
Opmerking: Het vermogen van de klinische stammen aan formulier biofilms werd bepaald door de microtiterplaat plaat assay eerder beschreven15. - Enten van de bacterie in 5 mL trypton soja Bouillon (TSB) medium, en cultiveer in een broedmachine met schudden bij 37 ° C's nachts aan de stationaire fase.
- Centrifugeer het nachtelijke bacteriecultuur bij 4000 x g gedurende 10 minuten bij 25 ° C en vervolgens Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellets in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om een eindconcentratie van 2.0 x 109 CFU/mL.
Opmerking: De concentratie van de bacteriën werd geschat door het meten van de extinctie en verder bepaald door plaat rekenen16, onthullen dat 1 OD600 van schorsing opgenomen 1.5 x 108 CFU/mL. - Verdun de bacteriële suspensie te 1:200 (1.0 x 107 CFU/mL) in TSB opslagmedium met 0,5% glucose. Inoculeer 200 µL van bacteriële suspensie in ieder putje van een cel-cultuur-testgroep polystyreen 96-Wells-microplate.
- Incubeer de microplate statisch bij 37 ° C gedurende 24 uur onder een goed zuurstofrijk milieu.
Opmerking: De incubatietijd voor volwassen biofilm vorming kan variëren voor verschillende bacteriestammen; Dit moet worden bepaald voordat de PDT experimenteren15. - Was de putjes goed microplate zachtjes met PBS driemaal, negeren van de media in de putjes en vervolgens Verwijder het supernatant.
Opmerking: De stap moet worden uitgevoerd heel voorzichtig om te voorkomen dat de gevormde biofilm verstoren.
- Ophalen van de S. aureus -stam USA300 en 3 biofilm-vormende klinische stammen (C1 - C3) opgeslagen bij-80 ° C.
-
Biofilm vorming in gerechten
- Enten van de S. aureus -stam USA300 in 5 mL van TSB medium, en cultiveer in een broedmachine met schudden bij 37 ° C's nachts aan de stationaire fase.
- Centrifugeer het nachtelijke bacteriecultuur bij 4000 x g gedurende 10 minuten bij 25 ° C en vervolgens Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellets in PBS om een eindconcentratie van 2.0 x 109 CFU/mL. Dan Verdun de bacteriële suspensie te 1:200 (1.0 x 107 CFU/mL) in TSB opslagmedium met 0,5% glucose. Enten van 2 mL van bacteriële suspensie in een 35-mm optische kwaliteit glazen bodem cel cultuur schotel en incubeer statisch bij 37 ° C gedurende 24 uur.
Opmerking: De concentratie van de bacteriën werd geschat door het meten van de optische dichtheid. - De media met een pipet, gecombineerd en spoel de biofilms in de schotel voorzichtig met PBS driemaal en vervolgens Verwijder het supernatant zorgvuldig.
Opmerking: Raak het uiteinde van de pipet naar de onderkant van de schotel. De stap 2.2 moet worden uitgevoerd onmiddellijk na deze stap om te voorkomen dat het drogen van de gevormde biofilm.
2. lichte bestraling
- 5-ALA in een koelkast 4 ° C worden opgeslagen. Voordat het experiment, Verdun 5-ALA met PBS tot 10 mM.
Opmerking: 5-ALA oplossing moet vers worden bereid voor het experiment. - In de experimentele groep, voeg toe 200 µL van 10 mM ALA aan elk putje van de microplate of 2 mL tot de cultuur schotel. Dekking van de plaat/schotel met aluminiumfolie en incubeer gedurende 1 uur. Vervolgens het bestralen van de plaat/schotel met een licht afgevende diodes (LED) met een lage intensiteit van 100 mW/cm2 voor 1 h om een lichte dosis van 360 J/cm2 bij een grote golflengte van 633 ± 10 nm17.
Opmerking: Om te laten de lichtenergie worden effectief en even afgeleverd bij de biofilm in alle putten/gerechten, de afstand van de piek van de lichtbron tot de goed/schotel 6.0 cm vast, en beperken van de experimentele regio op het gebied van de centrale bestraling (10 cm x 8 cm). om ervoor te zorgen dat de resultaten reproduceerbaar zijn, de experimenten moeten worden uitgevoerd bij dezelfde kamer temperatuur.
In de LED bestraling stap, om te voorkomen dat de rechtstreekse blootstelling van de plaat aan andere lichtbronnen, zoals zonlicht, ruimtelicht of lamplicht, de LED is ingeschakeld voordat u de plaat/schotel naar de bestraling gebied, en het licht was helder genoeg om de bewerking te voltooien. - Instellen van de controlegroepen (drie controlegroepen werden opgezet in ons experiment).
- Voor het eerste besturingselement wordt in groep (ALA - LED-), 200 µL van PBS toevoegen aan elk putje van de microplate of 2 mL tot de cultuur schotel. Dekking van de plaat/schotel met aluminiumfolie en het Incubeer gedurende 2 uur.
- Voor de tweede controlegroep (ALA + LED-), 200 µL van 10 mM ALA toevoegen aan elk putje van de microplate of 2 mL tot de cultuur schotel. Dekking van de plaat/schotel met aluminiumfolie en het Incubeer gedurende 2 uur.
- Voor de derde controlegroep (ALA-LED +), 200 µL van PBS toevoegen aan elk putje van de microplate of 2 mL tot de cultuur schotel. Dekking van de plaat/schotel met aluminiumfolie en het Incubeer gedurende 1 uur. Dan bloot de plaat op de LED met 360 J/cm2 lichte bestraling bij een grote golflengte van 633 ± 10 nm17.
Opmerking: In de LED bestraling stap, vermijd directe blootstelling van de plaat aan andere lichtbronnen, zoals zonlicht, ruimtelicht of lamplicht.
3. bepaling van de effectiviteit van PDT behandeling
Opmerking: Om te bevestigen het effect van ALA-PDT op de S. aureus biofilms, de levensvatbaarheid van de cellen met of zonder ALA-PDT werd geëvalueerd door het tellen van de CFU alsmede door levensvatbaarheid kleuring.
-
Bepaling van de resterende levensvatbare bacteriële cellen
- Na de ALA-PDT behandeling, negeren van de media in de putjes en was de putjes met PBS driemaal te verwijderen van alle niet-aanhanger cellen voor beide experimentele en controlegroepen.
Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd heel zachtjes. - Schraap de aanhangend bacteriën cellen grondig de putjes met de pipet-tip en het verzamelen van de cellen in de conische buisjes.
- Centrifugeer de bacteriële schorsing bij 4000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, en vervolgens de vloeistof wordt weggeworpen.
- Resuspendeer de bacteriën in 1 mL van 0,25% Pancreatine enzym in PBS en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1,5 uur.
- Centrifugeer bij 4000 x g gedurende 10 minuten; Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 µL van PBS.
- Maken van 1:10 seriële verdunningen van de cel-oplossing met PBS; Voeg vervolgens toe 5 µL van elk monster seriële verdunning op het bord trypton soja agar (TSA). Incubeer de TSA-plaat bij 37 ° C gedurende 16 uur; vervolgens (met blote oog) het aantal bacteriële kolonies (CFU/mL).
- Na de ALA-PDT behandeling, negeren van de media in de putjes en was de putjes met PBS driemaal te verwijderen van alle niet-aanhanger cellen voor beide experimentele en controlegroepen.
-
Waarneming van S. aureus biofilms door CLSM
- Na de bestraling van het licht, spoel de biofilms in de cultuur-schotel met PBS driemaal.
Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd heel zachtjes. - Voeg 1 mL 1 µM groen-fluorescerende nucleaire en chromosoom vlek thats permeabele aan de prokaryote cel membranen (bijvoorbeeldSYTO9) en 1 mL 1 µM propidium jodide (PI) voor 20 min om de biofilm, evenals dode cellen vlek.
- Observeren van levensvatbare cellen (groene fluorescentie, Ex / Em 485 nm/530 nm) en dode cellen (rode fluorescentie, Ex / Em 485 nm/630nm) onder een CLSM met een 63 X 1.4-NA olie-immersie objectief.
- Afbeeldingen met behulp van microscopie software genereren.
- Na de bestraling van het licht, spoel de biofilms in de cultuur-schotel met PBS driemaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De levensvatbaarheid van de bacteriën in de biofilms werd verlaagd na de ALA-PDT behandeling in vergelijking met de besturingselementen (ALA - LED-, ALA + LED- en ALA-LED +) in zowel USA300 als de drie klinische stammen (Figuur 1).
Om te bevestigen de resultaten van de CFU assay en observeren het antibacteriële effect van ALA-PDT op de S. aureus biofilm in situ, de USA300 biofilms waren gevisualiseerd door CLSM met levensvatbaarheid kleuring. De levensvatbare en dode cellen werden gekleurd met groene en rode fluorescentie, respectievelijk. De afbeelding is gebleken dat de meeste van de bacteriën in de biofilms werden gedood door de ALA-PDT, die in overeenstemming was met de resultaten van de CFU assay (Figuur 2).
Figuur 1: het effect van ALA-PDT op biofilms. CFU/mL was log-omgezet en weergegeven als de gemiddelde ± standaardafwijking in USA300 en drie klinische stammen (C1 - C3) behandeld met ALA-PDT (ALA + LED +) of onder de controlevoorwaarden (ALA - LED-ALA + LED, ALA-LED +). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger CLSM beelden van S. aureus biofilms met LIVE/DEAD kleuring. Biofilms gevormd door USA300 bacteriën werden behandeld met of zonder ALA-PDT (A: ALA - LED-paneel B: ALA + LED paneel, paneel C: ALA-LED +, deelvenster D: ALA + LED +), en vervolgens gekleurd met SYTO9 (groene fluorescentie) en PI (rode fluorescentie) vertegenwoordigen de levende en dode bacteriën onafhankelijk van elkaar. Een 63 X 1.4-NA olie onderdompeling doelstelling werd gebruikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PDT is een goed bestudeerde therapie voor de behandeling van kanker sinds het werd meer dan 100 jaar geleden uitgevonden18. Het laatste decennium, PDT is toegepast als een antimicrobiële strategie en effectiviteit tegen sommige antibiotica-resistente ziekteverwekkende bacteriën12heeft aangetoond. Ten opzichte van de planktonische staat, bacteriële biofilms lijken te zijn meer resistent tegen antibiotica behandeling3, terwijl het effect van ALA-PDT op biofilms niet volledig nog onderzocht heeft.
In dit artikel, een in vitro ALA-PDT systeem werd beschreven, en de antibacteriële werking van dit model op S. aureus biofilms werd aangetoond. Twee methoden werden gebruikt voor het testen van het effect van ALA-PDT op S. aureus biofilms in dit protocol. Terwijl de CFU test aangetoond de antimicrobiële werking door het berekenen van de levensvatbare cellen na de behandeling, fluorescerende levensvatbaarheid kleuring met CLSM niet alleen de resultaten van de test van de CFU bevestigd, maar ontdekt ook de morfologische karakter van de levende en dode bacteriën in situ. Via beide analytische technieken samen is een ideale aanpak voor het bepalen van het effect van ALA-PDT op biofilms. Op basis van de resultaten van de CLSM, werden de dood bacteriële cellen voornamelijk verspreid in de bovenste laag, terwijl enkele van de bacteriën in de onderste laag bleef levend15. De laatste kan er de oorzaak van bacteriële kolonies in de CFU assay. Een soortgelijk resultaat geconstateerd in een studie uitgevoerd door O'Neill et al., die werd verklaard door de lage accumulatie van photosensitizers in de binnenste laag of de onmogelijkheid van het licht doordringen van deze regio's19.
In dit protocol was de volwassen biofilm geïncubeerd met 10 mM van ALA gedurende 1 uur vóór de blootstelling aan PDT. Deze parameters werden gekozen op basis van de resultaten van twee pre experimenten. Ten eerste, de antimicrobiële werking van ALA werd getest tegen biofilms zonder licht bestraling met behulp van verschillende concentraties van ALA en verschillende hoeveelheden tijd voor incubatie met S. aureus biofilms. De groepen zonder enig bactericide effect werden gekozen als de kandidaten. Ten tweede, het PDT effect werd ontdekt in deze kandidaat-groepen, en de groep met de meest potente bactericide effect werd uiteindelijk gekozen in dit protocol. Dus, de parameters die worden gebruikt in dit protocol is gezorgd dat er geen bactericide effect van ALA alleen. Een 1-h incubatietijd is aanzienlijk korter dan die welke worden gebruikt in eerdere studies17,20, waardoor het handig voor in vitro studies en potentiële toepassing in toekomstige klinische behandelingen.
Er zijn een aantal kritische punten voor succesvol gebruik van dit model. Ten eerste moet het hele proces waarbij dat de manipulatie van ALA behandeld bacteriën worden uitgevoerd in duisternis. Ten tweede moet de manipulatie van de volwassen biofilms zacht om te voorkomen dat de gevormde biofilm verstoren. Ten derde, de CFU, schrapen van de bacteriën uit de onderkant van de platen moet test grondig. Ten slotte, de vers bereide ALA moet worden gebruikt; Daarom is het beter om te bereiden ALA vlak voor het experiment.
Hoewel dit protocol kan worden gebruikt voor het testen van het effect van ALA-PDT op biofilms S. aureus in vitro, is het nog steeds verschillend van de klinische situatie in vivo. Bijvoorbeeld, biofilms in het menselijk lichaam worden meestal gevormd door meerdere bacteriestammen21,22, en het milieu in vivo is complexer dan die in vitro, die het effect van PDT kunnen beïnvloeden. Toekomstige in vivo experimenten zijn dus nodig voor een volledige evaluatie van de antibacteriële effecten van ALA-PDT op S. aureus biofilms. Echter, vanwege de voordelen van het gemak en de ethische aspecten van het uitvoeren van in vivo studies, dit platform in vitro zullen nuttig en praktisch om de studie van de effecten van ALA-PDT op S. aureus biofilms. Het moet ook worden opgemerkt dat hoewel ALA, een voorloper van de fotosensitizer PpIX, heeft gunstige kenmerken, inclusief snelle afhandeling, minder en korter durende cutane photosensitivity, beperkt licht penetratie beperkt tot oppervlakkige laesies en vooral de niet-cumulatieve toxiciteit14, de lichte dosis en fotosensitizer concentratie vereist om bacteriën doden kunnen nog steeds een omstander effect hebben op de levensvatbaarheid van de cellen van de gastheer. Dus, het bestuderen van de wijziging van de ALA23 voor gerichte therapie van geselecteerde pathogene bacteriestammen als S. aureus is waardevol voor toekomstige antimicrobiële therapie.
Dit protocol kan niet alleen worden gebruikt voor de studie van het effect van ALA-PDT op S. aureus stammen in de toekomst, maar ook om te bestuderen van het effect daarvan op biofilms gevormd door andere bacteriën kan worden verwezen. De parameters, zoals de concentratie van ALA en de duur van de bacteriën incubatie met ALA, kunnen variëren tussen verschillende bacteriestammen, maar de principes die hierboven besproken worden vaak gedeeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door nationale aard Science Foundation van China voor jonge geleerden (nr. 81300810), Shanghai jonge arts trainingsprogramma (nr. 20141057), en nationale Natural Science Foundation van China (81671982, 81271791 en 81571955). We zouden graag bedanken LetPub (www.letpub.com) voor het verstrekken van taalkundige bijstand tijdens de voorbereiding van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
References
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
- Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
- Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
- Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
- Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
- Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202 (2015).
- Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D'Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
- De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039 (2015).
- Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
- Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M.
- Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
- Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627 (2017).
- Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863 (2013).
- Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
- St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
- O'Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
- Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
- Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).
