Summary
Ce manuscrit décrit un protocole afin d’étudier l’effet antimicrobien de la thérapie photodynamique induite par l’acide 5-aminolévulinique (ALA-PDT) sur un biofilm de Staphylococcus aureus . Ce protocole peut être utilisé pour développer un modèle in vitro afin d’étudier le traitement des biofilms bactériens par PDT à l’avenir.
Abstract
Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) est un pathogène humain commun, ce qui provoque des infections pyogènes et systémiques. Infections à S. aureus sont difficiles à éliminer non seulement en raison de l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques, mais aussi sa capacité à forme biofilms. Récemment, la thérapie photodynamique (TPD) a été indiquée comme l’un des traitements possibles pour contrôler les infections du biofilm. Cependant, plus amples études sont nécessaires pour améliorer notre ignorance de son effet sur les biofilms bactériens, ainsi que les mécanismes sous-jacents. Ce manuscrit décrit un modèle in vitro de PDT avec de l’acide 5-aminolévulinique (5-ALA), un précurseur de la réelle photosensibilisateur, protoporphyrine IX (PpIX). Brièvement, mature S. aureus biofilms ont été incubées avec ALA et ensuite exposées à la lumière. Par la suite, l’effet antibactérien de ALA-PDT sur S. aureus biofilm a été quantifié en calculant les colonies formant des unités (UFC) et visualisée par viabilité fluorescente coloration via confocal laser scanning microscopy (CLSM). Résultats représentatifs ont démontré une forte action antibactérienne de l’ALA-PDT sur les biofilms de S. aureus . Ce protocole est simple et peut être utilisé pour développer un modèle in vitro afin d’étudier le traitement des biofilms de S. aureus par ALA-PDT. À l’avenir, il pourrait également être référencée dans d’études PDT utilisant autres photosensibilisateurs pour différentes souches bactériennes avec des ajustements minimes.
Introduction
S. aureus est un pathogène Gram positif important qui colonise la peau et les muqueuses des hôtes humains. Sa capacité à forme biofilms est considéré comme un aspect important de sa pathogénie1. Biofilms bactériens sont une communauté de bactéries noyées dans une matrice autoproduite, qui est composée de substances polymériques extracellulaires, y compris les polysaccharides, ADN et des protéines. Cette matrice joue un rôle important dans la persistance des infections bactériennes, contribuant à un haut degré de résistance au système immunitaire humain et thérapies anti-microbiens actuels2. Les antibiotiques sont toujours le traitement majeur pour les infections de biofilm, bien que les effets des antibiotiques sur les biofilms sont limitées. Il a été démontré précédemment que les cellules dans les biofilms sont 10 à 1 000 fois plus résistantes aux antibiotiques par rapport à leurs homologues planctoniques3. Ainsi, les stratégies alternatives sont nécessaires à la conquête de ce sujet.
PDT, un autre traitement pour les infections bactériennes, utilise la lumière d’une longueur d’onde appropriée pour activer les substances photosensibilisantes. Cela conduit à la production d’espèces oxygénées réactives (ROS), qui sont mortelles pour cibler les cellules en perturbant la paroi cellulaire, inactivation des enzymes et endommager l’ADN4. Cette caractéristique de cible multiples, il est difficile pour les bactéries à développer une résistance au traitement PDT.
L’effet antimicrobien du PDT sur les biofilms bactériens et fongiques, avec plusieurs substances photosensibilisantes, comme le bleu de toluidine, vert de malachite, bleu de méthylène, chlore e6 et porphyrines, a été étudiée dans les précédents rapports5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, une prodrogue de la réelle photosensibilisateur, PpIX, se caractérise par son faible poids moléculaire et une clairance rapide12,14. Ces avantages donnent ALA-PDT potentiel majeur comme une application thérapeutique. Bien que l’effet de ALA-PDT sur bactéries planctoniques a été étudiée par de nombreux groupes12, l’effet antimicrobien des ALA-PDT sur les biofilms bactériens n’a pas encore été élucidé. Pendant ce temps, il est difficile de comparer les résultats entre les études antérieures. Une des raisons est que les différents protocoles sont utilisés par divers groupes. Par conséquent, ce protocole décrit un modèle in vitro d’un système de ALA-PDT basé sur notre précédent travail15. L’effet de ce modèle a été confirmée par le calcul de l’UFC et de la viabilité de coloration avec CLSM.
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Protocol
1. la Formation de Biofilm
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Formation de biofilm en Microplaque 96 puits
- Récupérer la souche USA300 de Staphylococcus aureus et 3 formation de biofilm souches cliniques (C1 - C3) conservés à-80 ° C.
Remarque : La capacité des souches cliniques pour former des biofilms a été déterminée par l’essai de plaque de microtitration décrit précédemment15. - Inoculer la bactérie dans 5 mL tryptone soja bouillon (BST) de milieu et de cultiver dans un incubateur avec agitation à 37 ° C durant la nuit à la phase stationnaire.
- Centrifuger la culture bactérienne pendant la nuit à 4 000 x g pendant 10 min à 25 ° C et ensuite jeter le surnageant. Remettre en suspension les boulettes dans la saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration finale de 2,0 x 109 UFC/mL.
Remarque : La concentration des bactéries a été évaluée en mesurant la densité optique et plus déterminée par plaque compter16, révélant celui de OD 1600 de suspension contenue 1,5 x 108 UFC/mL. - Diluer la suspension bactérienne à 1 : 200 (1,0 x 107 UFC/mL) en milieu de BST contenant 0,5 % de glucose. Inoculer 200 µL de la suspension bactérienne dans chaque puits d’une microplaque de 96 puits en polystyrène cellulaire--traitée pour la culture.
- Incuber la microplaque statiquement à 37 ° C pendant 24 h dans un milieu bien oxygéné.
Remarque : Le temps d’incubation pour la formation de biofilms à maturité peut varier pour différentes souches bactériennes ; Cela doit être déterminé avant que le PDT expérimenter15. - Ignorer les médias dans les puits et laver la microplaque doucement avec du PBS trois fois et puis jeter le surnageant.
Remarque : L’étape devrait être effectuée très doucement pour ne pas perturber le biofilm formé.
- Récupérer la souche USA300 de Staphylococcus aureus et 3 formation de biofilm souches cliniques (C1 - C3) conservés à-80 ° C.
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Formation de biofilm dans les plats
- Ensemencer la souche USA300 de Staphylococcus aureus dans 5 mL de milieu du BST et de cultiver dans un incubateur avec agitation à 37 ° C durant la nuit à la phase stationnaire.
- Centrifuger la culture bactérienne pendant la nuit à 4 000 x g pendant 10 min à 25 ° C et ensuite jeter le surnageant. Remettre les boulettes dans du PBS à une concentration finale de 2,0 x 109 UFC/mL. Ensuite, diluer la suspension bactérienne à 1 : 200 (1,0 x 107 UFC/mL) en milieu de BST contenant 0,5 % de glucose. Ensemencer des 2 mL de la suspension bactérienne dans une boîte de Petri de qualité optique 35 mm verre bas cellule et incuber statiquement à 37 ° C pendant 24 h.
Remarque : La concentration des bactéries a été estimée en mesurant la densité optique. - Aspirer les médias avec une pipette et rincer ensuite les biofilms dans le plat doucement avec du PBS trois fois et puis, éliminer le liquide surnageant avec soin.
Remarque : Ne pas toucher le bout de la pipette au fond du plat. L’étape 2.2 devrait être effectuée immédiatement après cette étape pour éviter le dessèchement du biofilm formé.
2. lumière d’Irradiation
- Stocker 5-ALA dans un réfrigérateur à 4 ° C. Avant l’expérience, diluer 5-ALA avec du PBS à 10 mM.
NOTE : 5-ALA solution doit être préparée avant l’expérience. - Dans le groupe expérimental, ajouter 200 µL de 10 mM ALA dans chaque puits de la microplaque ou 2 mL à la boîte de Pétri. Couvrir le plat/plat avec du papier aluminium et incuber pendant 1 heure. Puis, irradient le plat/plat avec une diode électroluminescente (LED) avec une intensité de 100 mW/cm2 pendant 1 h atteindre une dose légère de 360 J/cm2 à une longueur d’onde majeure de 633 ± 10 nm17.
Remarque : Afin de laisser l’énergie lumineuse efficacement et également livrés à biofilm dans tous les puits/plats, fixer la distance entre le pic de la source lumineuse et le puits/plat à 6,0 cm et limiter la région expérimentale à la zone centrale de l’irradiation (10 cm x 8 cm). pour s’assurer que les résultats sont reproductibles, les expériences doivent être effectuées à la même température ambiante.
Dans l’étape de l’irradiation de LED, afin d’éviter une exposition directe de la plaque d’autres sources de lumière, comme la lumière du soleil, éclairage de la pièce ou lumière de la lampe, le voyant était allumé avant de passer le plat/plat à la zone d’irradiation, et la lumière était assez brillante pour terminer l’opération. - Mettre en place les groupes de contrôle (contrôle trois groupes ont été mis en place dans notre expérience).
- Pour le contrôle du premier groupe (ALA - LED-), ajouter 200 µL de PBS dans chaque puits de la microplaque ou 2 mL à la boîte de Pétri. Couvrir le plat/plat avec du papier aluminium et il incuber pendant 2 h.
- Pour le deuxième groupe de contrôle (ALA + LED-), ajouter 200 µL de 10 mM ALA dans chaque puits de la microplaque ou 2 mL à la boîte de Pétri. Couvrir le plat/plat avec du papier aluminium et il incuber pendant 2 h.
- Pour le troisième groupe de contrôle (ALA-LED +), ajouter 200 µL de PBS dans chaque puits de la microplaque ou 2 mL à la boîte de Pétri. Couvrir le plat/plat avec du papier aluminium et il incuber pendant 1 heure. Puis l’exposer la plaque à la LED avec 360 J/cm2 irradiation légère à une longueur d’onde majeure de 633 ± 10 nm17.
Remarque : Dans l’étape de l’irradiation de LED, éviter l’exposition directe de la plaque d’autres sources de lumière, comme la lumière du soleil, éclairage de la pièce ou lumière artificielle.
3. détermination de l’efficacité du traitement PDT
Remarque : Pour vérifier l’effet de ALA-PDT sur les biofilms de S. aureus , la viabilité des cellules avec ou sans ALA-PDT a été évaluée en comptant les UFC, ainsi que par la coloration de la viabilité.
-
Détermination des cellules bactériennes viables restants
- Après le traitement de l’ALA-PDT, jeter les médias dans les puits et laver les puits avec du PBS trois fois pour enlever toutes les cellules non adhérentes à la fois expérimental et le groupe témoin.
NOTE : Cette étape doit se faire très doucement. - Grattez les cellules adhérentes bactéries soigneusement des puits avec l’embout de la pipette et recueillir les cellules de tubes coniques.
- Centrifuger la suspension bactérienne à 4 000 x g pendant 10 min à 4 ° C, puis jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les bactéries dans 1 mL d’enzyme pancréatine 0,25 % dans du PBS et incuber à 37 ° C pendant 1,5 h.
- Centrifuger à 4 000 x g pendant 10 min ; jeter le surnageant, puis Resuspendre le culot dans 200 µL de PBS.
- Rendre à 01:10 série de dilutions de la solution de cellules avec du PBS ; puis, ajouter 5 µL de chaque échantillon de dilutions gélose la tryptone soja (TSA). Incuber les plaques TSA à 37 ° C pendant 16 h ; Ensuite, compter (par l’oeil nu) le nombre de colonies bactériennes (UFC/mL).
- Après le traitement de l’ALA-PDT, jeter les médias dans les puits et laver les puits avec du PBS trois fois pour enlever toutes les cellules non adhérentes à la fois expérimental et le groupe témoin.
-
Observation des biofilms de S. aureus par CLSM
- Après irradiation lumineuse, laver les biofilms dans la boîte de Pétri avec du PBS trois fois.
NOTE : Cette étape doit se faire très doucement. - Ajouter 1 mL de 1 µM vert-fluorescence nucléaire et tache d’un chromosome qui est perméable aux membranes cellulaires procaryotes (p. ex., SYTO9) et 1 mL d’iodure de propidium 1 µM (PI) pendant 20 min colorer le biofilm, mais aussi les cellules mortes.
- Observer des cellules viables (green fluorescence, Ex / Em 485 nm/530 nm) et les cellules mortes (fluorescence rouge, Ex / Em 485 nm/630nm) sous un CLSM avec un objectif de 63 X 1.4-NA-immersion dans l’huile.
- Générer des images à l’aide de logiciels de microscopie.
- Après irradiation lumineuse, laver les biofilms dans la boîte de Pétri avec du PBS trois fois.
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Representative Results
Diminution de la viabilité de la bactérie dans les biofilms après traitement ALA-PDT par rapport aux contrôles (ALA - LED-, ALA + LED - et ALA-LED +) USA300 tant les trois souches cliniques (Figure 1).
Pour confirmer les résultats de l’UFC de dosage et observent l’antibactérien effet de ALA-PDT sur le S. aureus biofilm in situ, les biofilms USA300 ont été visualisées par CLSM viabilité de coloration. Les cellules mortes et viables ont été colorés avec une fluorescence verte et rouge, respectivement. L’image a montré que la plupart des bactéries dans les biofilms ont été tuée par ALA-PDT, qui concordait avec les résultats du test de l’UFC (Figure 2).
Figure 1 : l’effet de ALA-PDT sur les biofilms. UFC/mL a été indiquée comme la moyenne ± écart-type USA300 et trois souches cliniques (C1 - C3) traités par ALA-PDT et logarithme (ALA + LED +) ou dans les conditions de contrôle (ALA - LED-, ALA + LED-, ALA-LED +). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : images représentant CLSM de S. aureus biofilms avec LIVE/DEAD coloration. Biofilms formés par USA300 bactéries ont été traités avec ou sans ALA-PDT (panel A: ALA - LED-, groupe B: ALA + LED-, panneau c : ALA-panneau LED +, D: ALA + LED +) et puis colorées avec SYTO9 (green fluorescence) et PI (fluorescence rouge) pour représenter les bactéries vivantes et mortes indépendamment. Un objectif à immersion à huile 63 X 1.4-NA a été utilisé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
PDT est un traitement bien étudié pour le traitement du cancer depuis il a été inventé il y a plus de 100 ans18. Durant la dernière décennie, PDT a été appliqué comme stratégie d’antimicrobiens et a montré l’efficacité contre certaines bactéries pathogènes résistants aux antibiotiques12. Par rapport à l’État planctonique, biofilms bactériens semblent être plus résistants aux traitements antibiotiques3, tandis que l’effet de ALA-PDT sur les biofilms n'a pas entièrement étudié encore.
Dans cet article, un système de ALA-PDT in vitro a été décrite, et l’effet antibactérien de ce modèle sur les biofilms de S. aureus a été démontrée. Deux méthodes ont été utilisées pour tester l’effet des ALA-PDT sur S. aureus biofilms dans le présent protocole. Alors que le test d’UFC a démontré l’effet antimicrobien en calculant les cellules viables après traitement, viabilité fluorescente coloration avec CLSM non seulement a confirmé les résultats du test UFC mais également détecté le caractère morphologique des vivants et des morts bactéries in situ. Ensemble à l’aide de deux techniques d’analyse est une approche idéale pour déterminer l’effet de ALA-PDT sur les biofilms. Basé sur les résultats CLSM, les cellules mortes bactériennes ont été distribués principalement dans la couche supérieure, tandis que certains des bactéries dans la couche inférieure est resté vivant15. Ce dernier peut être la source de colonies bactériennes dans l’analyse de l’UFC. Un résultat similaire a été observé dans une étude menée par O'Neill et al., qui s’explique par la faible accumulation de photosensibilisateurs dans la couche interne ou de l’incapacité de la lumière de pénétrer dans ces régions19.
Dans le présent protocole, les biofilms à maturité est incubé avec 10 mM de l’ALA pendant 1 h avant l’exposition au PDT. Ces paramètres ont été choisis après les résultats de deux expériences préalables. Tout d’abord, l’effet antimicrobien d’ALA a été testée contre les biofilms sans irradiation lumineuse à l’aide de différentes concentrations d’ALA et des quantités différentes de temps d’incubation avec les biofilms de S. aureus . Les groupes sans effet bactéricide ont été choisis comme candidats. Deuxièmement, l’effet de la PDT a été détectée dans ces groupes de candidats, et le groupe avec le plus puissant effet bactéricide a été finalement choisi par le présent protocole. Ainsi, les paramètres utilisés dans le présent protocole a assuré qu’il n’a aucun effet bactéricide de l’ALA seul. Un temps de 1 h d’incubation est significativement plus court que celles utilisées dans les précédentes études17,20, rend pratique pour des études in vitro et pour leur application potentielle dans les traitements cliniques futures.
Il y a plusieurs points critiques d’une bonne utilisation de ce modèle. Tout d’abord, l’ensemble du processus impliquant que la manipulation de l’ALA traités bactéries doit être effectué dans l’obscurité. Deuxièmement, la manipulation des biofilms matures doit être douce pour ne pas perturber le biofilm formé. En troisième lieu, dans le test d’UFC, grattage de la bactérie par le bas des plaques doit être approfondie. Enfin, l’ALA fraîchement préparée doit être utilisé ; par conséquent, il est préférable d’établir le droit ALA avant l’expérience.
Bien que ce protocole peut être utilisé pour tester l’effet de ALA-PDT sur s. aureus biofilms in vitro, il est toujours différente de la situation clinique in vivo. Par exemple, biofilms dans le corps humain sont habituellement formés par plusieurs souches bactériennes21,22, et l' environnement in vivo est plus complexe que ce in vitro, susceptibles d’influencer l’effet de PDT. Par conséquent, future in vivo des expériences sont nécessaires pour une évaluation complète des effets antibactériens de ALA-PDT sur les biofilms de S. aureus . Toutefois, en raison de ses avantages, des inconvénients et des questions éthiques de mener des études in vivo , cette plate-forme in vitro sera utile et pratique pour améliorer l’étude des effets des ALA-PDT sur les biofilms de S. aureus . Il convient également de noter que bien que ALA, un précurseur de la photosensibilisateur PpIX, présente des caractéristiques favorables, y compris une clairance rapide, moins et de plus courte durée photosensibilité cutanée, limité réservée aux lésions superficielles de la pénétration de la lumière et surtout sa toxicité non cumulatif14, la dose de lumière et de la concentration de photosensibilisateur nécessaires à la réalisation de tuer les bactéries pourraient avoir un effet bystander sur la viabilité des cellules hôtes. Ainsi, étudier la modification de l’ALA23 pour une thérapie ciblée de certaines souches bactériennes pathogènes comme Staphylococcus aureus est précieux pour le futur traitement antimicrobien.
Ce protocole peut non seulement être utilisé pour l’étude de l’effet de ALA-PDT sur les souches de Staphylococcus aureus dans le futur, mais peut également être référencé pour étudier ses effets sur les biofilms formés par d’autres bactéries. Les paramètres, tels que la concentration de l’ALA et la durée de l’incubation des bactéries avec ALA, peuvent varier entre les différentes souches bactériennes, mais les principes susmentionnés sont communément partagées.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la Fondation des sciences de Nature nationale de Chine pour jeunes chercheurs (no 81300810), programme de formation de Shanghai Young médecin (n° 20141057) et Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (81671982, 81271791 et 81571955). Nous tenons à remercier LetPub (www.letpub.com) d’assistance linguistique lors de la préparation de ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
References
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