Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo per studiare l'effetto antimicrobico della terapia fotodinamica mediata da acido 5-aminolevulinico (ALA-PDT) su un biofilm di Staphylococcus aureus . Questo protocollo può essere usato per sviluppare un modello in vitro per studiare il trattamento di biofilm batterici con PDT in futuro.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) è un agente patogeno umano comune, che provoca infezioni pyogenic e sistemiche. Le infezioni da S. aureus sono difficili da sradicare non solo causa la comparsa di ceppi resistenti agli antibiotici, ma anche la capacità di forma biofilm. Recentemente, la terapia fotodinamica (PDT) è stata indicata come uno dei potenziali trattamenti per controllare le infezioni biofilm. Tuttavia, ulteriori studi sono richiesti per migliorare la nostra conoscenza del suo effetto sul biofilm batterici, come pure i meccanismi di fondo. Questo manoscritto descrive un modello in vitro di PDT con acido 5-aminolevulinico (5-ALA), un precursore del fotosensibilizzatore effettivo, la protoporfirina IX (PpIX). Maturo, brevemente, lo Staphylococcus aureus biofilm sono stati incubati con ALA e quindi esposti alla luce. Successivamente, l'effetto antibatterico di ALA-PDT il biofilm di S. aureus è stato quantificato calcolando l'unità (CFUs) di formazione di colonie e visualizzata da vitalità fluorescente colorazione tramite laser confocale microscopia (CLSM). Risultati rappresentativi hanno dimostrato un forte effetto antibatterico di ALA-PDT il biofilm di S. aureus . Questo protocollo è semplice e può essere utilizzato per sviluppare un modello in vitro per studiare il trattamento di biofilm di S. aureus con ALA-PDT. In futuro, potrebbe anche fare riferimento a studi di PDT che utilizzano altri fotosensibilizzanti per differenti ceppi batterici con minimo aggiustamento.
Introduction
S. aureus è un importante patogeno gram-positivo che colonizza la pelle e delle mucose degli umani. Sua capacità di forma biofilm è considerato un aspetto importante della sua patogenesi1. Biofilm batterici sono una comunità di batteri incorporati in una matrice autoprodotta, che è composto di sostanze polimeriche extracellulari, inclusi polisaccaride, DNA e proteine. Questa matrice gioca un ruolo significativo nella persistenza di infezioni batteriche, che contribuiscono ad un alto grado di resistenza per il sistema immunitario umano e attuale terapie anti-microbica2. Gli antibiotici sono ancora il principale trattamento per biofilm infezioni, anche se gli effetti degli antibiotici il biofilm sono limitati. Ha dimostrato in precedenza che le cellule nei biofilm sono 10 - 1.000 volte più resistente agli antibiotici rispetto ai loro omologhi planctonici3. Così, sono necessarie strategie alternative per conquistare questo problema.
PDT, un trattamento alternativo per le infezioni batteriche, usa la luce di una lunghezza d'onda appropriata per attivare fotosensibilizzanti. Questo porta alla produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che sono letali per le cellule bersaglio di perturbare la parete cellulare, enzimi inattivanti e danneggiare il DNA4. Questa caratteristica multi-target rende difficile per i batteri di sviluppare resistenza al trattamento PDT.
L'effetto antimicrobico di PDT il biofilm batterici e fungini, con più fotosensibilizzanti, come il blu di toluidina, verde malachite, blu di metilene, cloro e6 e porfirine, è stato studiato in precedenti relazioni5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, un profarmaco del fotosensibilizzatore effettivo, PpIX, è caratterizzato dal suo peso molecolare e uno sdoganamento rapido12,14. Questi vantaggi danno potenziale principali ALA-PDT come un'applicazione terapeutica. Anche se l'effetto di ALA-PDT sui batteri planctonici è stato studiato da molti gruppi12, l'effetto antimicrobico di ALA-PDT il biofilm batterici non è stata ancora chiarita. Nel frattempo, è difficile confrontare i risultati tra gli studi precedenti. Uno dei motivi è che i diversi protocolli vengono utilizzati da gruppi diversi. Così, questo protocollo descrive un modello in vitro di un sistema di ALA-PDT basato sul nostro lavoro precedente15. L'effetto di questo modello è stata confermata da calcolo CFU e vitalità colorazione con CLSM.
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Protocol
1. di biofilm
-
Formazione di biofilm a 96 pozzetti
- Recuperare il ceppo di Staphylococcus aureus USA300 e 3 che formano biofilm ceppi clinici (C1 - C3) conservati a-80 ° C.
Nota: La capacità dei ceppi clinici per formare biofilm è stato determinato mediante l'analisi del piatto di microtitolo descritta precedentemente15. - Inoculare il batterio nel mezzo di 5ml tryptone soya brodo (TSB) e coltivare in un incubatore con agitazione a 37 ° C durante la notte per la fase stazionaria.
- Centrifugare la coltura batterica durante la notte a 4.000 x g per 10 min a 25 ° C e quindi scartare il surnatante. Risospendere il pellet in tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione finale di 2.0 x 109 CFU/mL.
Nota: La concentrazione dei batteri è stata stimata misurando la densità ottica e ulteriormente determinata da piastra contare16, rivelando quello OD 1600 di sospensione contenuta 1.5 x 108 UFC/mL. - Diluire la sospensione batterica a 1: 200 (1.0 x 107 CFU/mL) in mezzo TSB contenente 0.5% di glucosio. Inoculare 200 µ l di sospensione batterica in ciascun pozzetto di una micropiastra a 96 pozzetti polistirolo cellulare-cultura-trattati.
- Incubare la micropiastra staticamente a 37 ° C per 24 h in un ambiente ben ossigenato.
Nota: Il tempo di incubazione per la formazione di biofilm maturi può variare per diversi ceppi batterici; Questo dovrebbe essere determinato prima di sperimentare la PDT15. - Scartare i media nei pozzetti e lavare i pozzetti di micropiastra delicatamente con PBS tre volte e poi scartare il surnatante.
Nota: Il passo dovrebbe essere effettuato molto delicatamente per evitare di disturbare i biofilm formati.
- Recuperare il ceppo di Staphylococcus aureus USA300 e 3 che formano biofilm ceppi clinici (C1 - C3) conservati a-80 ° C.
-
Formazione di biofilm in piatti
- Inoculare il ceppo di Staphylococcus aureus USA300 in 5 mL di terreno TSB e coltivare in un incubatore con agitazione a 37 ° C durante la notte per la fase stazionaria.
- Centrifugare la coltura batterica durante la notte a 4.000 x g per 10 min a 25 ° C e quindi scartare il surnatante. Risospendere il pellet in PBS a una concentrazione finale di 2.0 x 109 CFU/mL. Quindi, diluire la sospensione batterica a 1: 200 (1.0 x 107 CFU/mL) in mezzo TSB contenente 0.5% di glucosio. Inoculare 2 mL di sospensione batterica in una piastra di coltura delle cellule di qualità ottica 35 mm vetro inferiore e incubare staticamente a 37 ° C per 24 h.
Nota: La concentrazione dei batteri è stata stimata misurando la densità ottica. - Aspirare i media con una pipetta e poi sciacquare il biofilm nel piatto delicatamente con PBS tre volte e quindi, scartare il surnatante con attenzione.
Nota: Evitare di toccare la punta della pipetta sul fondo del piatto. Il passo 2.2 deve essere eseguito immediatamente dopo questo passo per evitare l'essiccazione del biofilm formati.
2. luce irradiazione
- Negozio 5-ALA in un frigorifero a 4 ° C. Prima dell'esperimento, diluire 5-ALA con PBS a 10 mM.
Nota: 5-ALA soluzione deve essere preparata prima dell'esperimento. - Nel gruppo sperimentale, aggiungere 200 µ l di 10 mM ALA in ciascun pozzetto della micropiastra o 2 mL per piastra di coltura. Coprire il piatto/piatto con carta stagnola e incubare per 1 h. Quindi, irradiare il piatto/piatto con un diodo luminoso (LED) con un'intensità di luce di 100 mW/cm2 per 1 h per raggiungere una dose leggera di 360 J/cm2 a una maggiore lunghezza d'onda di 633 ± 10 nm17.
Nota: Al fine di lasciare che l'energia della luce in modo efficace e altrettanto consegnati per il biofilm in tutti i pozzetti/piatti, fissare la distanza tra il picco della sorgente luminosa e il pozzetto a 6,0 cm e limitare l'area sperimentale alla zona centrale di irradiazione (10 cm x 8 cm). per garantire che i risultati sono riproducibili, gli esperimenti devono essere eseguiti a temperatura ambiente stessa.
Nel passaggio di irradiazione di LED, per evitare l'esposizione diretta della piastra per altre sorgenti luminose, quali luce solare, illuminazione della stanza o lamplight, il LED è stato acceso prima di spostare il piatto/piatto alla zona di irradiazione e la luce era abbastanza luminosa per completare l'operazione. - Impostare i gruppi di controllo (controllo a tre gruppi sono stati istituiti nel nostro esperimento).
- Per il primo controllo gruppo (ALA - LED-), aggiungere 200 µ l di PBS in ciascun pozzetto della micropiastra o 2 mL per piastra di coltura. Coprire il piatto/piatto con carta stagnola e incubare per 2 h.
- Per il secondo gruppo di controllo (ALA + LED-), aggiungere 200 µ l di 10 mM ALA in ciascun pozzetto della micropiastra o 2 mL per piastra di coltura. Coprire il piatto/piatto con carta stagnola e incubare per 2 h.
- Per il terzo gruppo di controllo (ALA-LED +), aggiungere 200 µ l di PBS in ciascun pozzetto della micropiastra o 2 mL per piastra di coltura. Coprire il piatto/piatto con carta stagnola e incubare per 1 h. Quindi esporre la piastra al LED con 360 J/cm2 irradiazione di luce ad una maggiore lunghezza d'onda di 633 ± 10 nm17.
Nota: Nel passaggio irradiazione LED, evitare l'esposizione diretta della piastra per altre sorgenti luminose, quali luce solare, illuminazione della stanza o lamplight.
3. determinazione dell'efficacia del trattamento PDT
Nota: Per confermare l'effetto di ALA-PDT sul biofilm di S. aureus , la vitalità delle cellule con o senza ALA-PDT è stata valutata contando CFU, così come dalla macchiatura di attuabilità.
-
Determinazione delle cellule batteriche vitali restanti
- Dopo il trattamento ALA-PDT, scartare i media nei pozzetti e lavare i pozzetti con PBS tre volte per rimuovere tutte le cellule non aderenti per entrambi sperimentali e gruppi di controllo.
Nota: Questo passaggio deve essere effettuato molto delicatamente. - Raschiare le cellule aderenti batteri accuratamente dai pozzi con la punta della pipetta e raccogliere le cellule in provette coniche.
- Centrifugare la sospensione batterica a 4.000 x g per 10 min a 4 ° C, quindi eliminare il supernatante.
- Risospendere i batteri in 1 mL di enzima di pancreatina 0,25% in PBS e incubare a 37 ° C per 1,5 ore.
- Centrifugare a 4.000 x g per 10 min; scartare il surnatante e risospendere il pellet in 200 µ l di PBS.
- Effettuare 01:10 diluizioni seriali della soluzione cella con PBS; quindi, aggiungere 5 µ l di ciascun campione diluizione seriale sulla piastra tryptone soya agar (TSA). Incubare la piastra TSA a 37 ° C per 16 h; quindi, contare (ad occhio nudo) il numero di colonie batteriche (CFU/mL).
- Dopo il trattamento ALA-PDT, scartare i media nei pozzetti e lavare i pozzetti con PBS tre volte per rimuovere tutte le cellule non aderenti per entrambi sperimentali e gruppi di controllo.
-
Osservazione di biofilm di S. aureus da CLSM
- Dopo irradiazione di luce, lavare il biofilm nella piastra di coltura con PBS tre volte.
Nota: Questo passaggio deve essere effettuato molto delicatamente. - Aggiungere 1 mL di 1 µM verde-fluorescente nucleare e macchia di cromosoma che è permeabile per le membrane delle cellule procariote (ad esempio, SYTO9) e 1 mL di ioduro di propidio 1 µM (PI) per 20 min a macchiare il biofilm così come le cellule morte.
- Osservare le cellule vitali (verde fluorescenza, Ex / Em 485 nm/530 nm) e le cellule morte (fluorescenza rossa, Ex / Em 485 nm/630nm) sotto un CLSM con una lente dell'obiettivo d'immersione in olio 63 X 1.4-NA.
- Generare immagini usando il software di microscopia.
- Dopo irradiazione di luce, lavare il biofilm nella piastra di coltura con PBS tre volte.
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Representative Results
La vitalità dei batteri nel biofilm è stata diminuita dopo il trattamento ALA-PDT rispetto ai controlli (ALA - ALA + LED, LED-- e ALA-LED +) sia in USA300 che i tre ceppi clinici (Figura 1).
Per confermare i risultati dal CFU di analisi e osservano l'antibatterico effetto del ALA-PDT lo S. aureus biofilm in situ, il biofilm di USA300 sono state visualizzate da CLSM con vitalità colorazione. Le cellule vitali e morte erano macchiate con fluorescenza verde e rosso, rispettivamente. L'immagine ha mostrato che la maggior parte dei batteri nel biofilm sono stati uccisi da ALA-PDT, che era costante con i risultati del dosaggio CFU (Figura 2).
Figura 1: l'effetto di ALA-PDT il biofilm. CFU/mL era registro-trasformate e mostrato come media ± deviazione standard in USA300 e tre ceppi clinici (C1 - C3) trattati con ALA-PDT (ALA + LED +) o sotto le condizioni di controllo (ALA - LED-, ALA + LED-, ALA-LED +). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: immagini di CLSM rappresentante dei biofilm di S. aureus con LIVE/DEAD macchiatura. I biofilm formati da USA300 batteri sono stati trattati con o senza ALA-PDT (pannello a: ALA - LED-, pannello b: ALA + LED-, pannello c: ALA-pannello LED +, D: ALA + LED +) e quindi colorato con SYTO9 (verde fluorescenza) e PI (fluorescenza rossa) per rappresentare i batteri vivi e morti in modo indipendente. È stato usato un obiettivo a immersione in olio 63 X 1.4-NA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
PDT è stata una terapia ben studiata per il trattamento del cancro, quando è stato inventato più di 100 anni fa18. Nell'ultimo decennio, è stata applicata come una strategia antimicrobica e ha indicato l'efficacia contro alcuni batteri patogeni resistenti agli antibiotici12PDT. Rispetto allo stato planctonico, biofilm batterici sembrano essere più resistenti al trattamento antibiotico3, mentre l'effetto di ALA-PDT il biofilm non è stato completamente studiato ancora.
In questo articolo, è stato descritto un sistema di ALA-PDT in vitro , e l'effetto antibatterico di questo modello il biofilm di S. aureus è stata dimostrata. Due metodi sono stati utilizzati per testare l'effetto di ALA-PDT il biofilm di S. aureus in questo protocollo. Mentre il test CFU ha dimostrato l'effetto antimicrobico calcolando le cellule vitali dopo il trattamento, fluorescente vitalità colorazione con CLSM non solo hanno confermato i risultati del test CFU ma anche rilevato il carattere morfologico di vivi e morti batteri in situ. Utilizzando entrambe le tecniche analitiche insieme è un approccio ideale per determinare l'effetto di ALA-PDT il biofilm. In base ai risultati CLSM, le cellule batteriche morti erano distribuite principalmente nello strato superiore, mentre alcuni dei batteri nello strato inferiore è rimasto vivo15. Quest'ultimo può essere la fonte di colonie batteriche nell'analisi della CFU. Un risultato simile è stato osservato in uno studio condotto da O'Neill et al., che è stato spiegato il basso accumulo di fotosensibilizzatori nello strato interno o l'incapacità della luce di penetrare queste regioni19.
In questo protocollo, il biofilm maturo è stato incubato con 10mm di ALA per 1 h prima dell'esposizione al PDT. Questi parametri sono stati scelti sulla base dei risultati dei due pre esperimenti. In primo luogo, l'effetto antimicrobico dell'ALA è stato testato contro il biofilm senza irradiazione di luce utilizzando diverse concentrazioni di ALA e diverse quantità di tempo per l'incubazione con S. aureus biofilm. I gruppi senza alcun effetto battericida sono stati scelti come candidati. In secondo luogo, l'effetto di PDT è stata rilevata in questi gruppi di candidati, e il gruppo con il più potente effetto battericida è stato adottato in seguito a questo protocollo. Così, i parametri utilizzati in questo protocollo accertato che non c'era effetto battericida di ALA da solo. Un tempo di incubazione di 1-h è significativamente più breve rispetto a quelli utilizzati in precedenti studi17,20, che lo rende comodo per studi in vitro e per potenziale applicazione in trattamenti clinici futuri.
Ci sono diversi punti critici per il riuscito uso di questo modello. In primo luogo, l'intero processo che coinvolge che la manipolazione dell'ALA trattati batteri deve essere eseguita nelle tenebre. In secondo luogo, la manipolazione del biofilm maturo dovrebbe essere gentile per non disturbare i biofilm formati. In terzo luogo, nel test di CFU, raschiando i batteri dalla parte inferiore delle piastre deve essere approfondito. Infine, deve essere utilizzato l'ALA preparato al momento; Pertanto, è preferibile preparare diritto ALA prima dell'esperimento.
Anche se questo protocollo può essere utilizzato per verificare l'effetto di ALA-PDT su s. aureus biofilm in vitro, è ancora diverso dalla situazione clinica in vivo. Ad esempio, biofilm nel corpo umano sono costituite solitamente da più ceppi batterici21,22, e l' ambiente in vivo è più complesso di quello in vitro, che potrebbe influenzare l'effetto di PDT. Pertanto, futuro in vivo esperimenti sono necessari per una valutazione completa degli effetti antibatterici di ALA-PDT il biofilm di S. aureus . Tuttavia, a causa di suoi vantaggi di comodità e le questioni etiche di condurre studi in vivo , questa piattaforma in vitro sarà utile e pratico per migliorare lo studio degli effetti di ALA-PDT il biofilm di S. aureus . Si deve inoltre osservare che anche se ALA, un precursore del fotosensibilizzatore PpIX, ha caratteristiche favorevoli, tra cui uno sdoganamento rapido, meno e di più breve durata fotosensibilità cutanea, limitata penetrazione limitata a lesioni superficiali della luce e soprattutto sua tossicità non cumulativo14, la dose di luce e la concentrazione di fotosensibilizzatore necessario ottenere uccidendo i batteri può ancora avere un effetto bystander su attuabilità delle cellule ospite. Così, studiando la modifica di ALA23 per la terapia mirata dei ceppi batterici patogeni selezionati come S. aureus è prezioso per la futura terapia antimicrobica.
Questo protocollo può non solo essere utilizzato per lo studio dell'effetto di ALA-PDT su ceppi di Staphylococcus aureus in futuro, ma è anche possibile fare riferimento per studiare il suo effetto sul biofilm formato da altri batteri. I parametri, come la concentrazione di ALA e la durata dell'incubazione con l'ALA, i batteri possono variare tra diversi ceppi batterici, ma i principi discussi sopra sono comunemente condivise.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione nazionale di scienza natura della Cina per giovani studiosi (No. 81300810), programma di formazione di Shanghai il giovane dottore (No. 20141057) e National Natural Science Foundation of China (81671982, 81271791 e 81571955). Vorremmo ringraziare LetPub (www.letpub.com) per fornire assistenza linguistica durante la preparazione di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
References
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