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Biology

Um modelo In Vitro para estudar o efeito da terapia fotodinâmica 5 ácido aminolevulínico-mediada no biofilme de Staphylococcus aureus

Published: April 16, 2018 doi: 10.3791/57604
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 3, 1, 2
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye & ENT Hospital, Shanghai Key Clinical Disciplines of otorhinolaryngology, Fudan University, 2Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College of Fudan University, 3Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University
* These authors contributed equally

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo para estudar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica 5-aminolevulínico mediada por ácido (ALA-PDT) sobre um biofilme de Staphylococcus aureus . Este protocolo pode ser usado para desenvolver um modelo in vitro para estudar o tratamento de biofilmes bacterianos com PDT no futuro.

Abstract

Staphylococcus aureus (S. aureus) é um patógeno humano comum, que causa infecções sistêmicas e piogênica. S. aureus infecções são difíceis de erradicar, não só devido ao surgimento de cepas resistentes aos antibióticos, mas também sua capacidade de forma de biofilmes. Recentemente, a terapia fotodinâmica (PDT) tem sido indicada como um dos tratamentos possíveis para controlar infecções de biofilme. No entanto, mais estudos são necessários para melhorar o nosso conhecimento de seus efeitos sobre biofilmes bacterianos, bem como os mecanismos subjacentes. Este manuscrito descreve um modelo in vitro do PDT com ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), um precursor do fotossensibilizador real, protoporfirina IX (PpIX). Brevemente, maduras S. aureus biofilmes foram incubados com ALA e em seguida, expostos à luz. Posteriormente, o efeito antibacteriano do ALA-PDT no biofilme de S. aureus foi quantificado calculando as unidades (CFUs) formadoras e visualizado pela viabilidade fluorescente coloração através de laser confocal, microscopia (CLSM). Resultados representativos demonstraram um forte efeito antibacteriano do ALA-PDT sobre biofilmes de S. aureus . Este protocolo é simples e pode ser usado para desenvolver um modelo in vitro para estudar o tratamento de biofilmes de S. aureus com ALA-PDT. No futuro, ela também pode ser referenciada em estudos de PDT, utilizando outros fotossensibilizadores para diferentes cepas bacterianas com ajustes mínimos.

Introduction

S. aureus é um importante patógeno Gram-positiva que coloniza a pele e mucosa de hospedeiros humanos. Sua capacidade de forma de biofilmes é considerada um aspecto importante de sua patogênese1. Biofilmes bacterianos são uma comunidade de bactérias incorporado em uma matriz de produção própria, que é composta de substâncias poliméricas extracelulares, incluindo polissacarídeo, DNA e proteínas. Esta matriz desempenha um papel significativo na persistência de infecções bacterianas, contribuindo para um alto grau de resistência ao sistema imunológico humano e terapias antimicrobiana atual2. Os antibióticos são ainda o principal tratamento para infecções de biofilme, embora os efeitos dos antibióticos sobre biofilmes são limitados. Ficou demonstrado anteriormente que as células em biofilmes são 10 a 1.000 vezes mais resistentes a antibióticos em comparação com suas contrapartes planctônicos3. Assim, estratégias alternativas são necessárias para conquistar esse problema.

PDT, uma alternativa de tratamento para infecções bacterianas, usa a luz de um comprimento de onda apropriado para ativar fotossensibilizadores. Isto leva à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), que são letais para as células alvo por perturbar a parede celular, inativando as enzimas e danificar o DNA4. Esta característica multi-alvo torna difícil para que as bactérias desenvolver resistência ao tratamento de PDT.

O efeito antimicrobiano do PDT em biofilmes bacterianos e fungos, com vários fotossensibilizadores, tais como o azul de toluidina, verde de malaquita, azul de metileno, cloro e6 e porfirinas, tem sido estudado em anteriores relatórios5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, um pró-fármaco do fotossensibilizador real, PpIX, caracteriza-se por seu peso molecular pequeno e rápido desembaraço12,14. Estas vantagens dão grande potencial ALA-PDT como uma aplicação terapêutica. Embora o efeito de ALA-PDT em bactérias planctônicas tem sido estudado por muitos grupos de12, o efeito antimicrobiano do ALA-PDT em biofilmes bacterianos ainda não foi elucidado. Entretanto, é difícil comparar os resultados entre os estudos anteriores. Uma das razões é que os diferentes protocolos são usados por diversos grupos. Assim, este protocolo descreve um modelo in vitro de um sistema de ALA-PDT, com base na nossa anterior trabalho15. O efeito deste modelo foi confirmado pelo cálculo do UFC e viabilidade de coloração com CLSM.

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Protocol

1. formação de biofilmes

  1. Formação de biofilmes em microplacas de 96 poços
    1. Recuperar a cepa S. aureus USA300 e 3 formadoras de biofilme clínicas cepas (C1 - C3) armazenadas a-80 ° C.
      Nota: A capacidade das estirpes clínicas para formar biofilmes foi determinada pelo ensaio de placa de microtitulação descrito anteriormente15.
    2. Inocular a bactéria num meio de caldo (TSB) 5ml triptona soja e cultivar em uma incubadora com agitação a 37 ° C durante a noite para a fase estacionária.
    3. Centrifugar a cultura bacteriana durante a noite a 4.000 x g durante 10 minutos a 25 ° C e em seguida, descartar o sobrenadante. Resuspenda as pelotas em solução salina tamponada fosfato (PBS) a uma concentração final de 2,0 x 109 UFC/mL.
      Nota: A concentração das bactérias foi estimada através da medição de densidade óptica e mais determinada pela placa contar16, revelando que 1 OD600 de suspensão contida 1,5 x 108 UFC/mL.
    4. Diluir a suspensão bacteriana a 1: 200 (1.0 x 107 UFC/mL) em meio TSB contendo 0,5% de glicose. Inocule 200 µ l de suspensão bacteriana em cada poço de uma microplaca de 96 poços poliestireno celular-cultura-tratados.
    5. Incube a microplaca estaticamente a 37º C por 24 h sob um ambiente bem oxigenado.
      Nota: O tempo de incubação para formação de biofilme maduro pode variar para diferentes cepas bacterianas; Isto deve ser determinado antes do PDT experimentar15.
    6. Descartar os meios de comunicação em poços e lavar os poços da microplaca suavemente com PBS três vezes e em seguida, descartar o sobrenadante.
      Nota: A etapa deve proceder com muito cuidado para não comprometer o biofilme formado.
  2. Formação de biofilmes em pratos
    1. Inocular a cepa S. aureus USA300 em 5 mL de meio TSB e cultivar em uma incubadora com agitação a 37 ° C durante a noite para a fase estacionária.
    2. Centrifugar a cultura bacteriana durante a noite a 4.000 x g durante 10 minutos a 25 ° C e em seguida, descartar o sobrenadante. Resuspenda as pelotas em PBS para uma concentração final de 2,0 x 109 UFC/mL. Em seguida, diluir a 1: 200, a suspensão bacteriana (1.0 x 107 UFC/mL) em meio TSB contendo 0,5% de glicose. Inocular 2 mL da suspensão bacteriana numa placa de cultura de células de fundo vidro 35mm qualidade óptica e incubar estaticamente a 37 ° C por 24 h.
      Nota: A concentração das bactérias foi estimada através da medição da densidade óptica.
    3. Aspirar a mídia com uma pipeta e depois enxaguar os biofilmes no prato suavemente com PBS três vezes e em seguida, descartar o sobrenadante cuidadosamente.
      Nota: Evite tocar a ponta da pipeta no fundo do prato. O passo 2.2 deve ser realizado imediatamente após esta etapa para impedir a secagem do biofilme formado.

2. luz da irradiação

  1. Loja 5-ALA em um frigorífico de 4 ° C. Antes do experimento, dilua 5-ALA com PBS a 10 mM.
    Nota: solução 5-ALA deve ser preparada antes do experimento.
  2. No grupo experimental, adicione 200 µ l de 10mm ALA a cada poço da microplaca ou 2 mL para o prato de cultura. Cubra o prato/prato com papel alumínio e incubar durante 1 h. Então, irradiar o placa/prato com um diodo emissor de luz (LED) com uma intensidade de luz de 100 mW/cm2 para 1 h atingir uma dose leve de 360 J/cm2 no comprimento de onda principal de 633 ± 10 nm17.
    Nota: A fim de deixar a energia da luz seja efetivamente e igualmente entregue para o biofilme em todos os poços/pratos, corrigir a distância entre o pico da fonte de luz para o bem/prato a 6,0 cm e limitar a região experimental para a área de irradiação central (10 cm x 8 cm). para garantir que os resultados são reprodutíveis, os experimentos devem ser executados na mesma sala de temperatura.
    Na etapa de irradiação LED, para evitar a exposição direta da placa para outras fontes de luz, como luz solar, iluminação do quarto ou do lamplight, o LED foi ativado antes de mover o placa/prato para a área de irradiação, e a luz foi brilhante o suficiente para concluir a operação.
  3. Configurar os grupos de controle (grupos de controle de três foram criados em nossa experiência).
    1. Para o primeiro controle de grupo (ALA - LED-), adicionar 200 µ l de PBS a cada poço do microplate, ou 2 mL para o prato de cultura. Cubra o prato/prato com papel alumínio e incube-lo por 2 h.
    2. Para o segundo grupo de controle (ALA + LED-), adicionar 200 µ l de 10mm ALA a cada poço do microplate, ou 2 mL para o prato de cultura. Cubra o prato/prato com papel alumínio e incube-lo por 2 h.
    3. Para o terceiro grupo de controle (ALA-LED +), adicionar 200 µ l de PBS a cada poço do microplate, ou 2 mL para o prato de cultura. Cubra o prato/prato com papel alumínio e incube-lo por 1 h. Em seguida expor a placa para o LED com 360 J/cm2 luz irradiação no comprimento de onda principal de 633 ± 10 nm17.
      Nota: Na etapa de irradiação LED, evite a exposição direta da placa para outras fontes de luz, como luz solar, iluminação do quarto ou o lamplight.

3. determinação da eficácia do tratamento de PDT

Nota: Para confirmar o efeito de ALA-PDT sobre os biofilmes de S. aureus , a viabilidade das células com ou sem ALA-PDT foi avaliada pela contagem de UFC, bem como pela coloração de viabilidade.

  1. Determinação das restantes células bacterianas viáveis
    1. Após o tratamento de ALA-PDT, descartar os meios de comunicação em poços e lavar os poços com PBS três vezes para remover todas as células não-aderentes para ambos experimental e grupos de controle.
      Nota: Esta etapa deve ser efectuada muito suavemente.
    2. Raspar as células de bactérias aderentes completamente dos poços com a ponta da pipeta e coletar as células nos tubos cónicos.
    3. Centrifugar a suspensão bacteriana 4.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C e, em seguida, descartar o sobrenadante.
    4. Ressuspender as bactérias em 1 mL de enzima de pancreatina 0,25% em PBS e incubar a 37 ° C por 1,5 h.
    5. Centrifugar a 4.000 x g por 10 min; desprezar o sobrenadante e, em seguida, resuspenda o pellet em 200 µ l de PBS.
    6. Fazer 01:10 diluições em série da solução celular com PBS; em seguida, adicione 5 µ l de cada amostra de diluição serial na placa de agar (TSA) soja triptona. Incubar a placa TSA a 37 ° C durante 16 h; em seguida, conte (pelo olho nu), o número de colônias bacterianas (UFC/mL).
  2. Observação de S. aureus biofilmes por CLSM
    1. Após a irradiação de luz, lave os biofilmes no prato de cultura com PBS três vezes.
      Nota: Esta etapa deve ser efectuada muito suavemente.
    2. Adicione 1 mL de 1 µM verde-fluorescente nuclear e mancha de cromossomo que é permeável às membranas células procarióticas (por exemplo, SYTO9) e 1 mL de iodeto de propidium 1 µM (PI) por 20 min manchar o biofilme, bem como as células mortas.
    3. Observar células viáveis (verde fluorescência, Ex / Em 485 nm/530 nm) e células mortas (fluorescência vermelha, Ex / Em 485 nm/630nm) sob um CLSM com uma lente objetiva óleo-imersão de 63 X 1.4-at.
    4. Gere imagens usando o software de microscopia.

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Representative Results

A viabilidade das bactérias nos biofilmes foi diminuída após o tratamento de ALA-PDT quando comparados aos controles (ALA - diodo emissor de luz, ALA + LED - e ALA-LED +) em USA300 e das três estirpes clínicas (Figura 1).

Para confirmar os resultados do UFC ensaio e observam o antibacteriano, efeito de ALA-PDT sobre o S. aureus biofilme em situ, os biofilmes USA300 foram visualizadas por CLSM com viabilidade de coloração. As células viáveis e mortas foram coradas com fluorescência verde e vermelha, respectivamente. A imagem mostrou que a maioria das bactérias nos biofilmes foram morta pela ALA-PDT, que era consistente com os resultados do ensaio do UFC (Figura 2).

Figure 1
Figura 1: O efeito de ALA-PDT em biofilmes. UFC/mL foi mostrado como o média ± desvio-padrão em USA300 e três estirpes clínicas (C1 - C3) tratadas com ALA-PDT e log-transformadas (ALA + LED +) ou sob as condições de controle (ALA - LED-, ALA + LED, ALA-LED +). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: imagens CLSM representante de S. aureus biofilmes com coloração LIVE/mortos. Biofilmes formados por bactérias USA300 foram tratados com ou sem ALA-PDT (painel r: ALA - LED-, b: ALA + LED no painel, painel c: ALA-D: ALA + LED painel de LED +, +) e em seguida, corados com SYTO9 (verde fluorescência) e PI (fluorescência vermelha) para representar as bactérias vivas e mortas de forma independente. Utilizou-se um objectivo de imersão de óleo 63 X 1.4-at. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

PDT tem sido uma terapia estudada para o tratamento de câncer, desde que foi inventado há mais de 100 anos18. Na última década, PDT foi aplicado como uma estratégia antimicrobiana e demonstrou eficácia contra algumas bactérias patogénicas resistentes a antibióticos,12. Comparado ao estado planctônico, biofilmes bacterianos parecem ser mais resistentes ao tratamento com antibióticos3, enquanto o efeito de ALA-PDT em biofilmes não foi totalmente investigado ainda.

Neste artigo, um sistema de ALA-PDT in vitro foi descrito, e demonstrou-se o efeito antibacteriano deste modelo em biofilmes de S. aureus . Dois métodos foram utilizados para testar o efeito de ALA-PDT em biofilmes de S. aureus no presente protocolo. Enquanto o teste CFU demonstrou o efeito antimicrobiano calculando as células viáveis após o tratamento, fluorescente viabilidade manchando com CLSM não só confirmou os resultados do teste de UFC, mas também detectou o caráter morfológico dos vivos e mortos bactérias em situ. Usar ambas as técnicas analíticas juntos é uma abordagem ideal para determinar o efeito de ALA-PDT em biofilmes. Baseado nos resultados CLSM, as células bacterianas mortas foram predominantemente distribuídas na camada superior, enquanto algumas das bactérias na camada inferior permaneceram vivo15. Este último pode ser a fonte de colônias bacterianas no ensaio de UFC. Um resultado semelhante foi observado em um estudo realizado por O'Neill et al, que foi explicado pela baixa acumulação de fotossensibilizadores na camada interna ou a incapacidade da luz penetrar estas regiões19.

Neste protocolo, o biofilme maduro foi incubado com 10 mM de ALA para 1h antes da exposição ao PDT. Estes parâmetros foram escolhidos com base nos resultados de dois pre experimentos. Primeiro, o efeito antimicrobiano de ALA foi testado contra biofilmes sem irradiação de luz utilizando diferentes concentrações de ALA e diferentes quantidades de tempo para incubação com S. aureus biofilmes. Os grupos sem qualquer efeito bactericida foram escolhidos como os candidatos. Em segundo lugar, o efeito do PDT foi detectado nestes grupos de candidatos, e o grupo com o mais potente efeito bactericido foi finalmente escolhido no presente protocolo. Assim, os parâmetros usados neste protocolo garantiram que não havia nenhum efeito bactericido da ALA sozinho. Um tempo de incubação de 1-h é significativamente menor do que aqueles usados em anteriores estudos17,20, tornando-se conveniente para estudos em vitro e para potencial aplicação em futuros tratamentos clínicos.

Existem vários pontos críticos para o uso bem sucedido desse modelo. Em primeiro lugar, todo o processo que envolve que a manipulação da ALA tratados bactérias deve ser realizado na escuridão. Em segundo lugar, a manipulação do biofilme maduro deve ser suave para não comprometer o biofilme formado. Em terceiro lugar, no teste da CFU, raspar as bactérias da parte inferior das placas deve ser minucioso. Finalmente, o ALA recentemente preparado deve ser usado; Portanto, é melhor preparar direito ALA antes do experimento.

Embora este protocolo pode ser usado para testar o efeito de ALA-PDT em s. aureus biofilmes em vitro, é ainda diferente a situação clínica em vivo. Por exemplo, biofilmes no corpo humano são geralmente formados por várias estirpes bacterianas21,22, e o ambiente em vivo é mais complexo do que em vitro, que possam influenciar o efeito da PDT. Portanto, futuras na vivo experimentos são necessários para uma avaliação completa dos efeitos anti-bacterianos de ALA-PDT em biofilmes de S. aureus . No entanto, por causa de suas vantagens da conveniência e as questões éticas dos estudos- no vivo , esta plataforma em vitro será útil e prático para melhorar o estudo dos efeitos da ALA-PDT em biofilmes de S. aureus . Também deve ser notado que embora ALA, um precursor do fotossensibilizador PpIX, tem características favoráveis, incluindo a liberação rápida, menos e de mais curta duração Fotossensibilidade cutânea, limitado restringida para lesões superficiais de penetração de luz e especialmente sua toxicidade não-cumulativo,14, a dose de luz e fotossensibilizador concentração necessária para atingir as bactérias matando ainda podem ter um efeito espectador na viabilidade celular de anfitrião. Assim, estudar a modificação da ALA23 para terapia-alvo de estirpes de bactérias patogénicas selecionadas como S. aureus é valioso para a futura terapia antimicrobiana.

Este protocolo não só pode ser usado para o estudo do efeito de ALA-PDT em estirpes de S. aureus no futuro, mas também pode ser referenciado para estudar seu efeito sobre biofilmes formados por outras bactérias. Os parâmetros, tais como a concentração de ALA e a duração da incubação com ALA, as bactérias podem variar entre diferentes cepas bacterianas, mas os princípios discutidos acima são comumente compartilhados.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela natureza nacional Science Foundation da China para jovens estudiosos (n º 81300810), programa de treinamento de Shanghai jovem médico (n º 20141057) e Nacional Natural Science Foundation da China (81671982, 81271791 e 81571955). Gostaríamos de agradecer LetPub (www.letpub.com) para fornecer assistência linguística durante a preparação deste manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone Soya Broth (TSB) OXOID CM0129B
Tryptone Soya Agar (TSA) OXOID CM0131
SYTO9 Thermo Fisher Scientific L7012 The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits 
Propidium iodide (PI) Thermo Fisher Scientific L7012 The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits 
Pancreatin Sigma-Aldrich P3292
5-aminolevulinic acid (ALA) Fudan Zhangjiang Bio-Pharm 3.1
Staphylococcus aureus strain USA300 / / The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”.
Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) / / All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627].
96-well microplate Corning Inc 3599 Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile
Fluorodish NEST Biotechnology 801001 Glass bottom, Non-pyrogenic
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf 0030120086
Eppendorf microcentrifuge 5417 Eppendorf Z365998 | SIGMA
Incubator Thermo Fisher Scientific SHKE4000 MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers
Light emitting diode (LED) Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO LED-IB
Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope Leica Microsystems
Leica LAS AF software Leica Microsystems
IMARIS software Bitplane

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References

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