Summary
يتم تشريح العمال القصر من أنواع النمل اكسبلودينس كولوبوبسيس لعزل المحتوى مثل الشمع المخزنة في الخزانات الغدة الفك السفلي لامداده بهم لاستخراج المذيبات اللاحقة والتحليل بواسطة الفصل اللوني للغاز-قياس الطيف الكتلي. ويرد أيضا الشرح وتحديد المكونات المتطايرة باستخدام برمجيات المصدر المفتوح ميتابوليتيديتيكتور.
Abstract
والهدف من هذه المخطوطة تقديم بروتوكول وصف تحليل metabolomic Bornean 'تنفجر النمل' تنتمي إلى مجموعة كولوبوبسيس أسطواني (كوسي). ولهذا الغرض، هو الأنواع النموذجية اكسبلودينس C. المستخدمة. تمتلك النمل الذين ينتمون إلى الطبقة العمالية البسيطة الغدد الفك السفلي لامداده المميزة (MGs). في المعارك الإقليمية، أنها تستخدم محتويات لزج بهم الخزانات تضخم الغدة الفك السفلي (الموارد الوراثية الجرثومية) لقتل المفصليات متنافسة في الخاصية 'التفجيرات الانتحارية' التي تمزق الطوعية من أهاب جاسترال (أوتوثيسيس). نعرض تشريح النمل العامل من هذه الأنواع لعزل الجزء جاسترال من محتويات MGR الشبيهة بالشمع، فضلا عن قائمة بالخطوات اللازمة لاستخراج المذيبات المتطايرة الواردة فيه مع الغاز اللاحقة التحليل اللوني-الطيف الكتلي (GC-MS) وتحديد المفترضة الواردة في النص المقتبس من الأيض. يتم تنفيذ الإجراء التشريح تحت ظروف تبريد ودون استخدام أي تشريح المخزن المؤقت الحل لتقليل التغيرات في التركيب الكيميائي لمحتويات MGR. بعد استخراج المذيبات المستندة لنواتج الأيض متقلبة الواردة فيه، يتم عرض الخطوات اللازمة لتحليل العينات عن طريق سائل-حقن-GC-MS. وأخيراً، يرد ميتابوليتيديتيكتور تجهيز البيانات، وتحديد المستقلب المفترضة بالاستخدام برمجيات المصدر المفتوح. مع هذا النهج، والتنميط وتحديد نواتج الأيض متقلبة في الموارد الوراثية الجرثومية النمل المنتمين إلى كوسي المجموعة عن طريق GC-MS والبرمجيات ميتابوليتيديتيكتور أصبح من الممكن.
Introduction
والهدف العام لسير العمل المعروض هنا هو التحقيق العامة في التراكيب الكيميائية في إفرازات الحشرات. ويتم ذلك مع الهدف الأساسي لتوضيح الأدوار التي إيكولوجية لإفراز ككل، أو مركبات واحدة منها. وعلاوة على ذلك، نحن مهتمون بالتحقيق الأيضية الأساسية للمركبات الموجودة في إفرازات كل منهما. وقد اكتسبت خاصة الغدة محتويات من النمل (غشائيات الأجنحة، Formicidae) تزايد الاهتمام في السنوات الماضية، لأنها توفر مصادر للمركبات النشطة بيولوجيا يحتمل أن لم تستكشف حتى الآن (الغراء، ومضادات الميكروبات، إلخ)1، 2-النمل العامل طفيفة لبعض الأنواع المنتمية إلى3،مجموعة كوسي4 قد توفر هذه المركبات الواردة في تلك الموارد الوراثية الجرثومية لامداده التي تمتد من فمها إلى5،غستر6. طفيفة عندما هدد الأعداء المفترضين، العمال من اكسبلودينس جيم-7 ويتصل بعض الأنواع يمكن أن تجعل استخدام بهم MGR المحتويات بطريقة غير معتادة: هي التضحية بأنفسهم بتمزيق الجدار جاسترال لإخراج محتوى زجه الموارد الوراثية الجرثومية الفلزي على الخصم، عندها العدو المفترضة وهو محتجز، وربما يموت5،6،،من89. وكان غرض تطوير واستخدام أساليب عرض هذه الوثيقة للمساعدة في تحسين فهم التركيب الكيميائي وطبيعة المكونات السمية مبدئياً لإفراز النمل هذا.
وتحقيقا لهذه الغاية، نحن نقدم بروتوكول لتشريح النمل العامل اكسبلودينس C. للحصول على الجزء جاسترال من محتوياتها MGR الشبيهة بالشمع مع استخراج المذيبات اللاحقة وتحليل GC-MS.
تحليل GC-MS إحدى الطرق الراسخة للتنميط وتحديد من التقلب من الأيض (فولاتيلومي) من الحشرات. تشمل المواد الهيدروكربونية كوتيكولار10،11من سيميوتشيميكالس، تحليلها نموذجية للفائدة في النمل والمركبات بشكل عام، مع النشاط البيولوجي12. يمكن الحصول على عينات من الحيوانات كله أو أجزاء الجسم والسوائل معزولة عن طريق تشريح الحشرات13،14. وتشمل تقنيات إعداد نموذج استخراج والايضات الواردة فيه مع استخدام المذيبات14 أو headspace--الصلبة-المرحلة-ميكروكستراكشن (HS-سبمي)15.
الدراسات metabolomic، ومن الحيوي أن العينات مجمدة سرعة مباشرة بعد أخذ العينات، بغية التقليل من التغيرات في التركيب الكيميائي وكمية من المركبات. قتل النمل المستخدمة لهذه الدراسة بالتجميد السريع في الموقع في كيس بارد محشوة بحزم الباردة ديبفروزين. ثم تم تخزين العينات في ثلاجة-20 درجة مئوية استخدام يحركها مولد الكهرباء، قبل أنهم نقلوا إلى المختبر في الثلج الجاف. إجراء تشريح المقدمة هنا يوفر إمكانية لعزل محتويات MGR دون تحليل النمل كله أو غستر ككل، مثلما فعلت قبل كوسي مختلفة الأنواع16،،من1718. وعلاوة على ذلك، البروتوكول قدم كما يتيح الوصول المباشر وتحليل الغدد والأنسجة، مثل السم الغدة (VG)5،8أو دوفور الغدة (DG)8الأمعاء في الدراسات البيولوجية الأخرى، أو المحيطة بها تحقق من وجود الممكن التلوث عبر عرض أثناء المناولة أو تشريح للنمل. الأمثل لتقليل التغيرات في التركيب الكيميائي لمحتويات MGR خلال التشريح، أما بعينات ذوبان أو باستخدام المواد الكيميائية، عملية تشريح الاضطلاع على حزمة الباردة (-20 درجة مئوية)، دون استخدام أي المخازن المؤقتة إضافية، حلول الغسيل، أو المذيبات. العينات التي تم الحصول عليها عن طريق هذا الأسلوب مناسبة للإجابة على الأسئلة النوعية والكمية.
ويتم تحليل البيانات غرض الشرح المستقلب المفترضة وتحديد الهوية عبر برمجيات المصدر المفتوح ميتابوليتيديتيكتور19، الذي تم تطويره للتحليل التلقائي لبيانات GC-MS-تعتمد جميع. يكشف قمم أيون واحدة موجودة في تشروماتوجرامس، يقوم بخطوة deconvolution، وتستخرج الأطياف الشامل ديكونفولوتيد من المركبات الكيميائية الواردة في العينات التي تم تحليلها. هو تحديد الهوية المفترضة للمركبات مع ميتابوليتيديتيكتور استناداً إلى مؤشر الاحتفاظ بالعزم (ري؛ "كوفاتس ري" يمكن أن يحسب تلقائياً عن طريق البرنامج) فضلا عن التشابه بين أطياف الشامل ديكونفولوتيد. ري وعامل مباراة الطيفية يمكن مقارنتها ضد أما المكتبات المرجعية القائمة (التي يمكن استيرادها، إذا كانت موجودة في النموذج الموحد نيست)، أو في مكتبة داخل المنشأة. وهذا وفقا للمبادئ التوجيهية (المفترضة) مجمع التعريف المقترح، مثلاً، الكيميائية التحليل تعمل المجموعة (كوج) لجميع معايير المبادرة (MSI)، حيث الحد الأدنى من اثنين من البيانات المستقلة ومتعامد بالنسبة لمجمع أصيلة (هنا الاحتفاظ الوقت/RI (RT) والطيف الشامل) حلل تحت ظروف تجريبية مماثلة يقترح ما يلزم لتأكيد الرواية غير المستقلب تعريفات20.
تجري التجربة الكاملة على محتوى MGR الأنواع النموذجية كوسي اكسبلودينس جيم، ولكن الخطوات التشريح التي يمكن تكييفها لعزل في الغدد الأخرى الموجودة في غستر النمل أيضا. وعلاوة على ذلك، بينما نقدم بروتوكول للتحليل الشامل فولاتيلومي MGR المحتوى، أجزاء أكثر عمومية لسير العمل وصف الاستخراج، قياس GC-MS، وتقييم البيانات يمكن أيضا استخدام لتحليل و (المفترضة) تعريف والايضات متقلبة بشكل عام.
حيث تجري التجارب الموصوفة في هذه المخطوطة على الحشرات، لا الموافقة الأخلاقية مطلوب. العمل الميداني، وأخذ العينات من النمل، فضلا عن استخدامها للنشر وفقا للمبادئ التوجيهية المنظمة لهذا المشروع من خلال جامعة بروني دار السلام، والبحث في بروناي ومركز الابتكار وبروناي في إدارة الغابات، بروناي دار السلام.
Protocol
1-مجموعة من النمل
- جمع النمل العامل بسيطة باستخدام الشافطة (الشكل 1).
- فورا بعد أخذ العينات، إصلاح النمل بالتجميد السريع في-20 درجة مئوية وتخزينها في هذا أو انخفاض درجة حرارة حتى التحليل.
2-عزل محتويات MGR والمديرية العامة من النمل
- قبل التشريح للنمل، إعداد الوثائق التالية:
- تنظيف زجاج صحن بيتري والصكوك المتعلقة بتشريح استخدام خليط ميثانول بمياه (ميوه/ح2س؛ 1 + 1 v/v) والأنسجة.
تنبيه: ميوه سامة للبشر. دائماً ارتداء القفازات المناسبة ومعطف مختبر، ونظارات واقية، والقيام بعملية التنظيف تحت غطاء دخان. - تجميد حزمة الباردة والزجاج طبق بيتري إلى-20 درجة مئوية.
- تحديد جماهير قنينات الخيط القصير 1.5 مل بما في ذلك الأغطية اللولبية مع سيتا سيليكون/تترافلوروايثيلين (PTFE) والاحتفاظ بها على الجليد مباشرة بجوار المجهر.
ملاحظة: اختيار عينة القنينة اختياري. هنا، يتم وضع محتويات MGR مباشرة في تبريد 1.5 مل قنينات مصنوعة من الزجاج. يمكن أن تحتوي على المواد البلاستيكية مركبات (مثلاً، والفثالات) التي قد تسبب النتائج الملموسة، التي تتداخل مع الإشارات من نواتج الأيض الهدف. - وضع حزمة الباردة المجمدة في مربع مصنوعة من رغوة البوليسترين بالبثق. ضع طبق بيتري على رأس حزمة الباردة ووضع نملة مجمدة في الطبق. جبل مربع تحت مجهر ستيريو. ضبط التكبير (20 – 40 س) والتركيز حتى يمكن رؤية النمل كله بوضوح.
- تنظيف زجاج صحن بيتري والصكوك المتعلقة بتشريح استخدام خليط ميثانول بمياه (ميوه/ح2س؛ 1 + 1 v/v) والأنسجة.
- تحقق من النمل المجمدة للسلامة في المقصورات جاسترال. للتشريح، تأخذ فقط من النمل مع منطقة غستر سليمة (الشكل 2 أ، ب). استبعاد النمل مع جاستيرس مسطحة أو آثار تصلب MGR المحتوى على أسطح الجسم من مزيد من التحليل (الشكل 2، د).
- الاستيلاء على النملة المحدد مع زوج واحد من الملقط مقلوب الجميلة في بروبوديوم (الجزء الأول البطن) ومع زوج آخر من الملقط في سويقات (الجزء الثاني من البطن). فصل منطقة غستر بسحبه بلطف بعيداً عن بقية الجسم النمل (الشكل 3A).
- إصلاح غستر النمل الآن المنفصلين عن ذويهم خلال عقد مع الملقط الجميلة ذات الرؤوس في تيرجيتي 4. مع زوج آخر من الملقط مقلوب غرامة انتزاع تيرجيتي 1 (الموجود بجوار سويقات) وإزالته بلطف بأنه يسقط (الشكل 3B). كرر هذه العملية أيضا تيرجيتيس 2 و 3 (الشكل 3، د) حتى الجزء جاسترال من الموارد الوراثية الجرثومية (الصفراء الملونة في النمل العامل اكسبلودينس جيم ، ولكن لون المحتوى ملغ يمكن أن تتراوح بين الأبيض على الأصفر إلى اللون الأحمر في الأنواع الأخرى) مرئياً للأكثر جزء.
ملاحظة: عن طريق إزالة الهيكل الخارجي، الغشاء المونسنيور جزئيا ستزال أيضا. - باستخدام إبرة تشريح، بلطف إزالة محتويات الشبيهة بالشمع الموارد الوراثية الجرثومية المزدوجة بخدش لهم خارج المقصورة جاسترال (رقم 3E). فقط قم بإزالة تلك الأجزاء من المونسنيور المحتوى التي يمكن أن تكون معزولة دون تمزيق الغدد الأخرى الموجودة في غستر النمل. إذا كان المزيد من القوة أو الجهود يجب أن يطبق للحصول على محتوى المونسنيور ككل، تقبل به الإزالة كاملة (الشكل 4).
- التقاط محتويات MGR بلمسها بلطف بطرف إبرة تشريح حتى أنها عصا على ذلك. ثم نقل محتويات MGR في قنينة خيط قصير 1.5 تبريد مع المعروفة باسم الكتلة الفارغة.
- لإزالة محتويات MGR لزجة من طرف إبرة تشريح، نقل طرف الإبرة للجدار القنينة عينة ومسحه منها على الجدار. أغلق القنينة ووضعه على الجليد حتى محتويات MGR القادمة معزولة.
- للبحث عن التلوث المحتمل عبر عينة المحتوى MGR لاحقاً بالمركبات الصادرة من المدير العام (القسم 6) المتاخمة، كما جمع DGs من النمل، الذي لا يزال سليما (الشكل 4) ووضعها في قنينة [هبلك] منفصلة.
- دائماً تنظيف صحن بيتري وأدوات تشريح مع ميوه/ح2س (1 + 1 v/v)، عند تغيير من الغدة للغدة أو من النملة للنمل.
- لنموذج تحليلي واحد، تجمع بين محتويات الخزان أو الغدد النمل متعددة.
ملاحظة: قد تختلف عدد الغدد أو محتوياتها المستخدمة لنموذج تحليلي واحد استناداً إلى تصميم التجربة. هنا، تم تجميع محتويات MGR أو DGs النمل خمسة للحصول على نموذج تحليلي واحد.
3-المذيبات-استخراج محتويات الغدة معزولة
- تحديد جماهير العينات التحليلية (هنا، المونسنيور محتويات أو الغدد المجاورة المجمعة من النمل خمسة).
- إضافة خلات الإيثيل عالية النقاء المثلج (أتاك) بنسبة ثابتة قدرها 01:14 w/v ودوامه العينات لمدة 5 دقائق في ظروف تبريد؛ هنا، يقوم عند 7 درجة مئوية في مختبر ثيرموستاتيد.
- الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في 3,820 س ز عند 7 درجة مئوية ونقل سوبيرناتانتس (حوالي 55 – 75 ميليلتر لاستخراج MGR المحتوى التي تم الحصول عليها من النمل خمسة) إلى يبرد قبل 1.5 مل زجاجة مؤشر ترابط قصيرة تحتوي على مل 0.1 مايكرو-إدراج. أحكام ختم قارورة مع الأغطية اللولبية التي تحتوي على ثقوب والمطاط الأحمر/PTFE سيتا.
ملاحظة: إذا كان لا يمكن إجراء تحليل فورا، الاحتفاظ الاستخراج في-80 درجة مئوية حتى التحليل، ولكن من المستحسن أن تحليل العينات مباشرة بعد التحضير التقليل من مخاطر التغيرات الكيميائية خلال دورة التجميد/ذوبان الجليد.
4-GC-MS
- لتسلسل قياس GC-MS كاملة، وإعداد الحلول التالية، كل منها في قنينة خيط قصير 1.5 مل:
- إعداد أن خليط كاليبرانت ري بإضعاف ألكان المتاحة تجارياً والحلول القياسية لتركيز نهائي 8 مغ/لتر كل مركب باستخدام الهكسين.
- إعداد مذيب فراغ تتكون من أتاك نقية.
- مكان استخراج قارورة تحتوي على 1) المذيبات فارغة، 2) ري كاليبرانت الخليط، 3) MGR المحتوى، والمحتوى 4) المديرية العامة استخراج في علبة تبريد (10 درجة مئوية) في أوتوسامبلير بالإضافة إلى كروماتوجرافيا الغاز (GC).
ملاحظة: من المستحسن لتقليل فترة الزمنية كل قنينة يتم الاحتفاظ بها في أوتوسامبلير قبل القياس. لعينات الحرجة، مثل عينة MGR المحتوى، قد توضع القنينة في أوتوسامبلير مباشرة قبل التحليل. - لكل عينة، حقن 1 ميليلتر الكوة في GC-MS للفصل الكروماتوغرافي على عمود مناسب للمركبات المستهدفة (هنا: العمود UI إتش 5 مللي ثانية).
- تعيين معلمات GC المناسبة، التي قد تبدو كما يلي:
- استخدام الهيليوم كالغاز الناقل ومجموعة تدفقا عمود ثابت لمجموعة منحدر درجة حرارة فرن بدءاً من 40 درجة مئوية بعقد لمدة دقيقة 2، تليها منحدر من 10 درجة مئوية/دقيقة يصل إلى 330 درجة مئوية، مع وقت الانتظار الحد الأدنى 7 ضبط درجة حرارة مدخل إلى 270 ° 1 مل/دقيقة جيم
- اختيار، وإذا لزم الأمر، ضبط نسب تقسيم لحقن GC-MS تؤدي إلى ذروة ملائمة الأشكال والاستخدامات الكثيفة للمركبات ذات الأهمية (الشكل 5).
ملاحظة: في المثال المقدم من الضروري قياس استخراج المديرية العامة في تقسيم نسبة 2:1 وخليط كاليبرانت ري في وضع سبليتلس. وقد تم تحليل استخراج المحتوى MGR في تقسيم نسبة 2:1، ومرة ثانية في 50: 1. - تعيين درجة الحرارة الإضافية إلى 350 درجة مئوية.
- تعيين المعلمات مطياف الكتلة (MS) على النحو التالي: مرض التصلب العصبي المتعدد المصدر درجة حرارة 230 درجة مئوية، وتأخير رباعية MS درجة حرارة 150 درجة مئوية، نطاق المسح من 30 أسلحة منخفضة إلى كتلة عالية 500، المذيبات 4.1 دقيقة (لعينات فارغة المذيبات والتجريبية) أو 6.1 دقيقة (لخليط كاليبرانت ري) ، على التوالي. تعيين معدل المسح الضوئي إلى مسح ما يقارب 3/s.
ملاحظة: المعلمات مرض التصلب العصبي المتعدد، خاصة مرض التصلب العصبي المتعدد المسح الضوئي--، معدل، أخذ العينات ودورة الوقت قد يؤثر على الانتقاء الذروة والطيف deconvolution ويجب مراعاتها عند اختيار إعدادات المعلمة لتقييم البيانات المناسبة مع برنامج ميتابوليتيديتيكتور.
- تعيين معلمات GC المناسبة، التي قد تبدو كما يلي:
- عند الانتهاء من القياس، تصدير البيانات ك. المشروع AIA (يقوم هنا باستخدام برنامج تحليل البيانات تسليمها مع GC) ملف على جهاز تخزين بيانات محمولة.
- حدد ملف | تصدير البيانات إلى تنسيق AIA..، ثم تحقق من إنشاء الدليل الجديد وانقر فوق موافق. قم بتحديد موقع التخزين المطلوبة (مثلاً، محرك أقراص USB محمول) وانقر فوق فتح. حدد الملفات التي يتم تصديرها وضرب الرمز ---> . بالنقر فوق عمليةالتأكد.
5-المستقلب الكشف وتحديد الهوية باستخدام البرمجيات ميتابوليتيديتيكتور
- قبل البدء في تحليل ملفات البيانات، افتح ميتابوليتيديتيكتور، اختر أدوات | إعدادات، وتعيين المعلمات المطلوبة كما يلي (ترد الأوراق بشكل فردي من ميتابوليتيديتيكتور بخط غامق):
- في صفحة المظهر، تعيين مقياس الوقت إلى دقيقة وتمكين الخيار "تسميات المحاور".
- في ورقة Deconvolution، تعيين المعلمات لتصبح "الإعدادات الذروة": عتبة الذروة: 10، والحد الأدنى ذروة الارتفاع (وحدات الضوضاء): 10. قم بإلغاء تحديد تمكين تعديل خط الأساس. تعيين المعلمات من أجل كشف المستقلب إلى: سلال/المسح الضوئي: 10، Deconvolution العرض (مسح): 5، كثافة المطلوبة (% من قاعدة الذروة): 0، والعدد المطلوب من قمم: 10.
- في الورقة تحديد، تعيين الخيار "بحث في المكتبة" إلى: Lib مجمع: 'CalibrationLibrary_Alkanes' ونيست (مكتبة sqlite نيست يمكن تضمينها في تنسيق.lbr). تعيين المعلمات على النحو التالي: ماكس. الفرق ري: 10، قطع نقاط: 0.9، الصرفة/إيمبوري التكوين: 0.5، عدد الأجزاء: 2، رقم الحد الأدنى من فرج متطابقة.: 1. تحجيم استخدام lib: قليلاً؛ نقاط تشابه: تشابه المواصفات؛ التصفية الجماعية: m/z 207 221، 281، 355 و 1147 (للملوثات المعروفة الناجمة عن مرحلة ثابتة للعمود GC).
- في صفحة تعيين القياس الكمي المعلمات إلى: عدد من أيونات الكمي: 3، الحد الأدنى من المسافة بين الأيونات اللاحقة: 5، ومؤشر الجودة المطلوبة الحد الأدنى: 1. استبعاد الأيونات الكمي 207، 221، 281، 355، و 1147.
ملاحظة: في حالة مرض التصلب العصبي المتعدد البيانات عالية الدقة، بالإضافة إلى ذلك تعيين المعلمات التالية في الورقة Centroid إلى: تبدأ عتبة الذروة: 10، نهاية عتبة الذروة:-5، والمسافة القصوى الأساس: فوم 30،: 0.5.
- استيراد الملفات في. تنسيق الدفاع المدني الواردة في الذي تم إنشاؤه. ملف المشروع AIA ك. نيتكدف في البرنامج ميتابوليتيديتيكتور بتحديد ملف | الاستيراد | استيراد نيتكدف. اختر رمز على شكل مجلد ثم قم بتحديد الملفات لفئات العينة استيراده ومعالجتها: 1) المذيبات فارغة، كاليبرانتس 2) ري، 3) MGR استخراج المحتوى واستخراج المحتوى 4) المديرية العامة. تأكيد مع موافق لبدء معالجة البيانات. بعد المعالجة، حدد الوثيق في إطار الظهور.
- لمعايرة ري وتحديد القيم ري للمركبات الواردة في النص المقتبس MGR، حدد الملف | فتح واختر الملف الذي يحتوي على بيانات كاليبرانتس ري.
- بعد فتح الملف كاليبرانت ري، حدد رمز العدسة المكبرة . تأكيد الإطار الظهور مع موافق.
- لمعايرة ري السليم، تحقق من نطاق الألكانات يمكن اكتشافها في ملف كاليبرانت ري.
- وتحقيقا لهذه الغاية، حدد المثلث التي تظهر أسفل الحد أقصى الذروة الأولى، منشؤها ألكان الأولى (مع RT أدنى، الشكل 6) يمكن كشفها بالنقر مرة واحدة على ذلك.
- تحقق من الضرب مع تشابه الطيف أعلى ('المواصفات سيم.', ماكس نقاط = 1) بالمقارنة مع الإدخالات مكتبة ألكان (الشكل 6).
- للتحقق من هوية ألكان اقترح مجمع، مقارنة الطيف الشامل إلى الطيف الشامل في الأدب، مثلاً، NIST الكيمياء ويبوك22.
- تحديد ألكان آخر يمكن اكتشافها في خليط كاليبرانت ري عد إلى آخر ألكان الذروة التي تظهر في chromatogram.
- لمعايرة ري، حدد أدوات | معالج معايرة ري. حدد التالي.
- انقر على أيقونة على شكل مجلد وقم بتحديد الملف الذي يحتوي على تشروماتوجرام في خليط كاليبرانت ري. حدد التالي.
- حدد المكتبة التي تحتوي على إدخالات كاليبرانتس ألكان في الإطار ظهرت.
- تحديد إدخالات مكتبة لجميع ألكانات قابلة للكشف في الملف كاليبرانت ري، وانقر فوق >> رمز. بعد تحديد >>، اختر التالي.
- تحقق من المحطة المذكورة المدرجة لكل ألكان يمكن اكتشافها في الجدول يظهر. وتحقيقا لهذه الغاية، تحقق RTs صورت في الإطار الرئيسي لكل ألكان بالنقر على المثلث الموجود بكل منهما (الشكل 7). إذا اللازمة (الشكل 8)، تصحيح RT في جدول المعايرة يدوياً بواسطة النقر المزدوج في مجال كل منها، تحديد من القائمة المنسدلة، واختيار الصحيح واقترح "الرايت بدلاً من ذلك"، اكتب في الرايت مع مساعدة (لوحة المفاتيح الشكل 9).
- عندما RT لكل ألكان الصحيح، حدد التالي. انقر فوق التالي في النافذة يظهر عرض الجدول المعايرة ري.
- حدد الرمز الأخضر + في إطار التحديد Chromatogram الظهور واختر ملف البيانات من المذيبات-الفارغة وملفات الغدة مقتطفات وحدد التالي. تعيين إعدادات المعلمة في إطار الظهور كما يلي: تعطيل تعديل خط الأساس، ذروة عتبة: 5، الحد الأدنى من ذروة الارتفاع: 5، سلال/المسح الضوئي: 10، وعرض Deconvolution: 5. ضرب المقبل ومن ثم البدء في القيام بحساب ري أن المركبات الموجودة في ملفات العينة المختارة.
- للشرح وتحديد نواتج الأيض المختار في استخراج MGR، فتح ملف البيانات لاستخراج المحتوى MGR المقاسة، التي حسبت RIs النحو المبين أعلاه (الخطوة 5.3.9)، عن طريق تحديد الملف | فتح واختيار ملف البيانات المطلوبين.
- حدد أدوات | إعدادات | Deconvolution وتغيير عتبة الذروة، فضلا عن الحد الأدنى ذروة الارتفاع (وحدات الضوضاء) على حد سواء إلى 5. حدد رمز العدسة المكبرة وتأكيد الإطار تحذير الظهور مرة أخرى مع موافق.
- انقر على مثلث التي تظهر أسفل الحد الأقصى من ذروة الاهتمام ومقارنة الطيف الشامل مع تلك المخزنة في نيست-المكتبة عن طريق تحديد رمز نيست .
- حدد ضرب الناتج الأول نيست-البحث (الشكل 10).
- إذا كان التشابه الطيف الناتجة من مجمع الفائدة أعلى من نقاط التشابه الطيف المختار (≥ هنا 0.9) مقارنة بإدخال نيست (الشكل 10)، بالبحث عن منظمة الروتاري الدولية (المرحلة ثابتة مماثلة العمود GC، وسمك الفيلم، والعمود قطر) ونظرا لهذا المركب في الأدب (مثلاً، NIST الكيمياء ويبوك22).
- حساب الفرق النسبي بين الإشارة نيست ري (أو RIs متوسط عندما يتم إعطاء قيم ري متعددة) وري المشتقة تجريبيا. إذا كان الفرق يساوي أو أقل من المحددة من قبل المستخدم التحمل القيمة القصوى (هنا، ≤ ± 1%)، يعين المجمع ك 'المشروح'.
- كرر الخطوات 5.4.2–5.4.5 لجميع المركبات من الفائدة الواردة في الملف عينة MGR.
- لتحديد هوية المركبة، مقارنة ري وأطياف الجماعي للحلول القياسية (مثلاً، 2 – 100 مغ/لتر) تقاس بالشروط نفسها كما هو موضح في القسم 4 لتلك المركبات المشروح.
- تحليل المعيار كما هو موضح في القسم 4 ومعالجة البيانات الناتجة كما هو موضح ألكان و MGR الغدة محتوى البيانات في الخطوات 4، 4 و 5-2.
- معايرة البيانات المستقاة من المعيار بتحديد أدوات | معالج معايرة ري | القادم واختيار نفس الملف كاليبرانت ري كاستخدامها من قبل. حدد التالي، مرة أخرى ثم التالي وقم بتحديد الملف الذي يحتوي على البيانات المكتسبة من الحل القياسية بواسطة النقر فوق الرمز الأخضر + . ضرب المقبل ومن ثم بدء تشغيل لحساب منظمة الروتاري الدولية للمجمع قياسية.
ملاحظة: إذا لا يمكن إجراء تحليل المعيار على الفور بعد تحليل العينات، من المستحسن لتحليل كاليبرانتس ري مرة أخرى وأداء جديد ري المعايرة وحساب للمعيار. - فتح ملف كل منهما للمعيار وتأكيد هويتها بالمقارنة الطيف مع نيست-المكتبة كما هو موضح في الخطوة 5.4.2.
- بعد التأكد هوية القياسية، إضافة الطيف الشامل وري بمعيار مركب إلى مكتبة داخلية. وتحقيقا لهذه الغاية، انقر على الرمز الأخضر + وأدخل الاسم المفضل لدخول مكتبة. تأكيد مع موافق لإضافة الطيف الشامل وري بمعيار مركب للمكتبة. إذا كان لا يمكن إدخال جديد في المكتبة، قم بتنشيط الزر تحديث .
ملاحظة: إذا كان إجراء المعايرة ري بنجاح، ري يحدده ميتابوليتيديتيكتور سوف تظهر في المكتبة-دخول كل منهما. بعد إنشاء إدخال المكتبة القياسية، تحديد هذا المستقلب في استخراج مغ يستند إلى مزيج من ري وتشابه الأطياف الممكن. - افتح ملف بيانات المحتوى MGR مرة أخرى. حدد أدوات | إعدادات | تحديد. الآن، كما يحسب ري مجمع القياسية وإضافتها إلى دخول مكتبة، تغيير نقاط التشابه من الطيف تشابه إلى درجة جنبا إلى جنب.
- انقر على أيقونة عدسة مكبرة وحدد المثلث الموجود أسفل المجمع الذي قد تم المشروح في خطوة 5.4.5.
- انقر فوق على الضرب والتحقق من القيمة نظراً ل 'نقاط التشابه العام' (مرصد الصحراء والساحل، يختصر "كاشف المستقلب" ك 'عموما سيميل.')، نظراً لتركيبة من الطيف التشابه والتشابه ري نقاط (الشكل 11).
ملاحظة: إذا تم العثور على إصابة في مكتبة داخلية، فإنه سيتم عرض على الجانب الأيمن من الإطار الرئيسي. - إذا كانت برمجيات المصدر المفتوح فوق العتبة المعرفة من قبل المستخدم (≥ هنا 0.9، وأشارت أيضا إلى باللون الأخضر للمثلث)، تعيين المجمع ك 'تحديد' (الشكل 11).
6-فحص لاستخراج محتوى MGR للتلوث بمحتوى المديرية العامة
- فتح ملف معايرة العينة المديرية العامة التي سبق تم حساب RIs المركبات مع ميتابوليتيديتيكتور (الخطوة 5.3.9).
- لتراكب chromatogram تم الحصول عليها بعد قياس عينة المحتوى ملغ والعينة المديرية العامة، حدد أدوات | تراكب chromatogram واختر الملفين كل منها عن طريق الرمز الأخضر + . تأكيد مع موافق.
- لعرض التراكب، حدد ورقة تراكب Chromatogram يظهر في الجزء السفلي من الإطار.
- استخراج التحقق من التداخل للمركبات بين محتوى MGR (الشكل 12) واستخراج محتوى المديرية العامة واستبعاد مجمعات متداخلة من تحليل محتوى MGR كذلك.
Representative Results
ويرد سرد الخطوات التجريبية لتحديد المستقلب المفترضة في إفرازات الغدة من اكسبلودينس جيم- سير عمل تخطيطي في الشكل 13. وعلاوة على ذلك، تقدم لمحة تخطيطية من أهم أجزاء الجسم من النمل العامل كوسي المستخدمة لعرض التجربة التكميلية الرقم S1 أ وب. يوضح الخطوات الرئيسية من تشريح للنمل حتى تحديد المستقلب المفترضة في محتوى MGR التكميلية الرقم S2.
وأبقى دولة تبريد لعزل محتويات MGR مناسبة لتحليل فولاتيلومي، خلال النقل والتخزين، وأيضا أثناء عملية التشريح. وتحقيقا لهذه الغاية، تم تجميد النمل فورا بعد جمعها بالاستخدام المضخة الحشرات (القسم 1 و الشكل 1) في الموقع. بعد التخزين لمدة يومين في ثلاجة-20 درجة مئوية، تم نقل العينات النمل على الثلج الجاف إلى النمسا، حيث أنها وضعت فورا في-80 درجة مئوية إلى مزيد من التحليل. يحمل النمل مناسبة يتم اختياره لعزله مضمونها MGR منطقة غستر وجولة وسليمة (الشكل 2A)، وفي أفضل الأحوال مجهز تجهيزا جيدا مع المونسنيور المحتوى، كما أشار المونسنيور مرئية بين تيرجيتيس (الشكل 2). جاستيرس النمل التي ليست مناسبة لإجراء مزيد من التحليل مبينة في الشكل 2، د. الخطوات الأساسية (الخطوات 2، 3-2.6) تشارك في عملية عزل محتويات MGR من النمل كوسي موضحة في الشكل 3. يتم عرض محتويات MGR معزولة (يمكن أن تتراوح الأصفر في حالة اكسبلودينس جيم، ولكن الألوان من الأبيض إلى اللون الأحمر في الأنواع الأخرى المنتمية إلى مجموعة كوسي) في الشكل 14.
عند تشريح النمل لمضمونها MGR، ينبغي الحرص على عدم ثقب أو تمزق أي الغدد الأخرى أو الأمعاء (الخطوة 2، 5). ويبين الشكل 4 غستر تشريح النمل الذي لا يزال يحتوي على اثنين آخرين، سليمة الغدد (DG و VG) بعد عزل المحتوى MGR. ويرد مثال على التلوث المرئي بمحتويات من أمعاء النمل في الشكل 15. حيث لا يمكن تجنب التلوث المتبادل مع محتويات المديرية العامة، يقع تحت MGR، تماما، يتم تصوير جزء من البروتوكول لتحليل هذه الغدد للمقارنة بين الإشارات الناتجة مع الإشارات من استخراج المحتوى MGR (القسم 6). عند إجراء التشريح تتم بشكل صحيح، فإنه من الممكن الحصول على حوالي 0.75-1.2 ملغ محتوى MGR كل النمل. للبروتوكول هو موضح هنا، تم تجميع محتويات MGR النمل خمسة تلقي عينات متكررة من 3.9-5.9 ملغ كل.
استخرجت مع أتاك (الفرع 3) محتويات الخزان الغدة معزولة وتحليلها بواسطة GC-MS (القسم 4). نتائج قياس استخراج المحتوى مغ من النمل اكسبلودينس جيم- عامل في chromatogram تضم الذري والأطياف الجماعي لعشرات من المفترضة MGR محتوى مركبات (الشكل 5). وهما والايضات المهيمن 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-ايثانون (معرف 4) و 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (معرف 5) في مغ المحتوى مقتطف بسبب التحميل الزائد للعمود، ولهذا السبب تم تحليل نفس العينة مرة أخرى في أعلى تقسيم نسبة 50: 1 ( الشكل 5، محفور). على سبيل المثال، إمكانية التلوث عبر محتوى MGR بالعناصر المكونة للمدير العام سيكون مرئياً كقمم إضافية في chromatogram GC-MS العارضة RTs الراحل، بدءاً من حول دقيقة 29 (الشكل 12). استثناء قمم الكروماتوغرافي وأطياف الشامل للمركبات الموجود أيضا في معالجة المذيبات فارغة والاصلي من مرحلة ثابتة للعمود GC، أو من محتويات المدير العام الحالي في غستر النمل واللاحقة مع ميتابوليتيديتيكتور وأسفرت البرامج حوالي 110 مركبات المحتوى MGR مع إشارة الضوضاء ≥ نسبة 10. للشرح المستقلب في وقت لاحق وتحديد الهوية مع البرمجيات ميتابوليتيديتيكتور، كانت محسوبة تشروماتوجرامس وتم تحديد قيم ري لملفات العينة المقاسة (الخطوة 5.3 والخطوات الفرعية، الشكل 6، الشكل 7 , الشكل 8 , الشكل 9). كانت المشروح والايضات المحتوى MGR المفترضة تم الكشف عنها على أساس مزيج من التشابه الطيف نيست-المكتبة، التي تشكل جزءا لا يتجزأ من برنامج ميتابوليتيديتيكتور في المثال المقدم (الخطوة 5.4 والخطوات الفرعية، الرقم 10 ). وعلاوة على ذلك، العثور على القيم ري في الأدب للمرحلة ثابتة نفس أو قابلة للمقارنة، سمك الفيلم، وقطر العمود GC اعتبرت الشرح بمجمع (الخطوات 5.4.4 و 5.4.5). بعد تحديد معايير المطابقة الصارمة وتأكيد RIs والأطياف الشامل باستخدام المعايير، كما هو موضح في المقطع بروتوكول لمعيار واحد مركب (5.4.7-5.4.15 الخطوات و الرقم 11)، كان من الممكن تأكيد هوية حوالي 10 في المائة من نواتج الأيض تم الكشف عنها. منذ سوف ينشر تقريرا مفصلاً عن فولاتيلومي لمضمون المونسنيور اكسبلودينس جيم في أماكن أخرى، هذه الدراسة تركز على نواتج الأيض تلك التي سبق وصفها في منشور سابق بجونز et al. 17 (الأنواع هنا سمي KB02-108؛ انظر أيضا كوك et al. 23). ويقدم الجدول 1 لمحة عامة عن هذه المركبات التي تم تحديدها.
رقم 1: التخطيطي رسم المضخة الحشرات. إلى غطاء الأختام على القنينة أو الحاوية، مصنوعة اثنين من الثقوب، حيث يتم وضع اثنان أنابيب مرنة من خلال. افتتاح أنبوب واحد (T1) أن يواجه الداخلية القنينة مختومة مع شبكة غرامة ما يكفي لمنع الحشرات. بالإضافة إلى ذلك، جعلت الثقوب داخل الأنبوب تيسيرا لتبادل الهواء. إلى نهاية الأنبوب T2 عن كثب نحو الحشرات التي هي الانزلاق إلى القنينة أخذ العينات من يسفط عن طريق T1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: سليمة مقابل كسر غستر. (أ) غستر سليمة مناسبة للتشريح. تماما تقريبا مليئة غستر سليمة (ب) MGR المحتوى، مناسبة أيضا للتشريح. (ج) و (د) كسر gasters النمل مع طرد وتصلب MGR المحتوى (أصفر)، ربما كسر أثناء تمزق أهاب غستر أثناء أخذ العينات. هذه النمل مستبعدة من التشريح، والاستخراج، ومزيد من التحليل. T: تيرجيتي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الرئيسية الخطوات المتضمنة في عملية تشريح. (أ) فصل غستر المنطقة عن باقي الجسم النمل. (ب) يسقط الهيكل الخارجي: تيرجيتي 1 تيرجيتي 2 (ج) وتيرجيتي 3، بعدها محتويات مقترن بالموارد الوراثية الجرثومية الملونة الصفراء هي مرئية بالكامل تقريبا (د). (ﻫ) إزالة المحتوى MGR لزجة بمساعدة إبرة تشريح. T: تيرجيتي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: غستر النمل بعد عزل محتويات MGR. الغدد الأخرى الموجودة في غستر (VG: غدة السم، والمديرية العامة: الغدة في دوفور) يمكن أن ينظر إليه. بعد إزالة المحتوى MGR (اليسار-المبالغ بعد عزلة يتبين باللون الأصفر)، ينبغي أن تكون كل المقصورات لا تزال سليمة. يمكن تحليل هذه الغدد بنفس الطريقة كمحتويات MGR. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: أيون مجموع الممثل الحالي (عرة) chromatogram من استخراج المحتوى MGR. أدت إلى قمم GC-MS هما الأكثر وفرة في أكثر شكل متناظر على شكل قمم الكروماتوغرافي، عند انقسام أعلى نسبة (50: 1) اختير بدلاً من نسبة 2:1 العادية (انظر الإطار الداخلي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: تحديد ألكان الاكتشاف الأول في ري كاليبرانت تشروماتوجرام. المثلث الموجود أسفل أقصى ذروة الذروة ألكان الأولى محدداً. ألكان التيس في دقيقة 6.31 ويظهر التشابه الطيف أعلى (هنا، 'المواصفات سيم.') لدخول مكتبة 'Alkane_C09'. للتأكد من هوية ألكان، تتم مقارنة الطيف الشامل إلى مكتبة (مثلاً، NIST الكيمياء ويبوك22). في المثال المقدم، نونان هو حددها أيون الجزيئية بقيمة 128 m/z. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7: معايرة ري بالاستخدام خليط القياسية مادة ألكانات- كاليبرانت ري تم فتح ملف البيانات والداله 'ري-المعايرة-معالج' المختار. يجب التحقق من مطابقة الصحيحة من الوقت الاحتفاظ لمنظمة الروتاري الدولية المبينة في الجدول المعايرة. RT مين 6.31 ل alkane_C09 (نونان) يتم عرضها بشكل صحيح في الجدول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: خطأ يتم عرض المحطة المذكورة في الجدول المعايرة. المحطة المذكورة لا يتم عرضها بشكل صحيح (أما هو موضح بقيمة RT خاطئ أو بواسطة قيمة RT مفقودة عرض ك-1). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 9: التصحيح اليدوي للمحطة المذكورة خاطئة في الجدول المعايرة. يمكن تصحيح قيم خاطئة يدوياً عن طريق إدراج RT الصحيح ألكان كل منهما، كما هو موضح هنا ل Alkane_C39. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 10: مقارنة الطيف الشامل من المجمع الذي تم اختياره لإدخالات مكتبة نيست. بعد تحديد التينج الذروة القصوى في 6.16 دقيقة (ري 891) وتنشيط وظيفة 'نيست-بحث' (دائرة حمراء)، يتم عرض تشابه طيف 0.99 ل 2-هيبتانوني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 11: تحديد المستقلب في استخراج المحتوى MGR. مقارنة الطيف الشامل ومنظمة الروتاري الدولية الناشئة من التينج مجمع في 891 ري في chromatogram العينة بالإدخالات مكتبة داخلية تتضمن RIs وأطياف المركبات القياسية المقاسة. إذا كان '"نقاط التشابه العام"' (مرصد الصحراء والساحل، باختصار في "كشف المستقلب" ك 'عموما سيميل.' تنفيذ الطيف الشامل ومنظمة الروتاري الدولية) بين مركب في مكتبة داخلية ومجمع في العينة هو ملف ≥ 0.9، يعين المجمع 'تحديد'. هنا، هو مرصد الصحراء والساحل بين دخول مكتبة داخلية 2-هيبتانوني والتينج مجمع في 891 ري 0.96، مما يؤدي إلى تحديد 2-هيبتانوني في محتوى MGR استخراج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 12: تراكب عرة chromatogram الأقسام (دقيقة 29 إلى 35 دقيقة) محتوى المديرية العامة استخراج (أحمر) واستخراج محتوى MGR (أزرق). ذروة المناطق المقابلة لتداخل المركبات (المفترضة) أعلى في محتوى استخراج مستخرج من مضمون MGR؛ المدير العام يحتمل أن تكون هذه المركبات تنبع من المدير العام وتعتبر ذلك استخلاص الملوثات (الصغرى) في محتوى MGR. في حالة استخراج المحتوى المونسنيور اكسبلودينس جيم ، يمكن العثور على قمم الكروماتوغرافي منشؤها تلوث المديرية العامة المفترضة في حوالي دقيقة 29، ويمكن استبعاد هذا الجزء chromatogram من إجراء مزيد من التحليل لمحتوى MGR. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 13: مقتطفات من سير العمل التخطيطي من عينات النمل إلى المستقلب الشرح/الهوية في محتوى الخزان الغدة بعد تحليل GC-MS. البروتوكول المعروضة هنا يشرح الخطوات التجريبية كل شيء بدءاً من العزلة لمحتويات MGR عبر تشريح النمل وتحليل GC-MS فضلا عن تقييم البيانات (المشار إليها باللون الأسود). وكبديل لذلك، قد يكون إفراز الحشرات التي تم إنشاؤها والتي تم جمعها في الموقع (المشار إليها باللون الرمادي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 14: عزل محتويات MGR شمعي قبل استخراج. (أ) محتويات الموارد الوراثية الجرثومية اثنين العصا معا، ولكن (ب) يمكن أيضا أن تكون مفصولة بعد عزلة. في اكسبلودينس جيم، لون المحتوى MGR برتقالي مصفر، ولكن يمكن أن تتراوح من الأبيض إلى اللون الأحمر في الأنواع الأخرى من مجموعة كوسي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 15: الرسم التوضيحي إفراز MGR معزولة عبر الملوثة بالعناصر المكونة للامعاء الحشرات (براون)- هذه الأنواع من يعزل MGR مستبعدة من استخراج وإجراء مزيد من التحليل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| معرف | المستقلب | اسم تافهة | سلسلة إينتشي | الصيغة sum | ||||||
| 1 | هيبتان-2-واحد | InChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/h3-6 ح 2، 1-2 ح 3 | س ج7ح14 | |||||||
| 2 | ن-أونديكان | InChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3 | ج11ح24 | |||||||
| 3 | ن-هيبتاديكان | InChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3 | ج17ح36 | |||||||
| 4 | -(2,4,6-Trihydroxyphenyl) 1-ايثانون | مونواسيتيلفلوروجلوسينول | InChI = 1S/C8H8O4/c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) ح 12/h2--3,10--12 3-8, 1 ح 3 | ج8ح8س4 | ||||||
| 5 | 5,7-Dihydroxy-2-methylchromen-4-one | نوريوجينين | InChI = 1S/C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5/h2-4,11، ح 13، ح 1 3 | ج10ح8س4 | ||||||
الجدول 1: والايضات المحددة في EtOAc استخراج محتويات MGR المعزولة من النمل العامل طفيفة اكسبلودينس جيم- - وترد والايضات المحدد.
الشكل التكميلية S1. نظرة عامة على أهم أجزاء الجسم المنتمين للنمل كوسي (العمال القصر) قدم في هذه المخطوطة. "الموارد الوراثية الجرثومية" (A) تظهر باللون الأصفر. ويستخدم الجزء الخاص بهم جاسترال لتحليل فولاتيلومي. (ب) الجزء جاسترال من الموارد الوراثية الجرثومية يقع تحت تيرجيتيس 1 إلى 3. T: تيرجيتي. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلية S2. نظرة عامة التخطيطي قدمت التجربة. يتم توضيح الخطوات الرئيسية من تشريح للنمل حتى تحديد المفترضة من نواتج الأيض موجودة في محتوى MGR. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
في هذه المخطوطة، نقدم بروتوكول كامل لتحليل فولاتيلومي للمحتوى العثور في الموارد الوراثية الجرثومية لامداده النمل اكسبلودينس جيم- العمال القصر. منذ النمل المستخدمة هنا قد 'تنفجر' وإخراج محتوياتها MGR بطريقة غير المنضبط عند لمسها بالملقط، يوصي باستخدام تقنية 'لينة' جمع توفرها المضخة الحشرات (الشكل 1). لبعض أنواع النمل بما في ذلك النمل كوسي، قد يكون من الضروري تحديد العدد الأقصى من النمل إلى خمسة أفراد كل قنينة 50 مل، وبخلاف ذلك التسمم الذاتي من النمل (مثلاً، بتراكم حمض الفورميك في headspace) قد تحدث. لتجميد النمل في الميدان، ويمكن استخدام كيس بارد محشوة بحزم الباردة ديبفروزين. ينبغي سرعة تجميد العينات وتخزينها تحت ظروف تبريد (مثلاً، -20 درجة مئوية، أفضل في-80 درجة مئوية)، ولكن لا ينصح لقتل وتخزين النمل في النتروجين السائل، حيث لوحظت زيادة الضرر بهم الغدد مع هذا الأسلوب.
قدم المخزن المؤقت والمذيبات خالية من تشريح المنهجية التي مناسبة للحصول على محتويات الخزان الغدة الشبيهة بالشمع الفك السفلي وكذلك الغدد الأخرى الموجودة في النمل عامل مجمد. تحليل فولاتيلومي لمحتوى المونسنيور اكسبلودينس جيم، هي الجوانب الرئيسية التي سينظر فيها خلال التشريح التبريد المستمر للنمل (الخطوة 2.1.4) والتقليل من التلوث عبر العينات مغ مع الغدة محتويات/سوائل أخرى موجودة في غستر النمل (الخطوة 2.5، رقم 4و الشكل 15). قد يكون معطوباً جزء كبير من النمل المجمدة، أما لأن النمل 'انفجرت' أثناء أخذ العينات أو أصيبت بأضرار أثناء النقل على الجليد الجاف من موقع أخذ العينات إلى المختبر. إذا كانت المنطقة غستر مكسورة، النمل هذه ليست مناسبة لإجراء مزيد من التحليل (الشكل 2، د). إلا إذا كان هوائيات والساقين تكون مفقودة أو مكسورة، لا يزال يمكن استخدام هذه النمل لاستخراج محتويات MGR وإجراء مزيد من التحليل. منذ تبريد محتويات MGR النمل اكسبلودينس C. قد اتساق الشبيهة بالشمع ومستقيم إلى الأمام عزلها باستخدام الإبر تشريح (الخطوة 2.5، 3E الشكل، و الشكل 14). الرعاية الإضافية الواجب اتخاذها أثناء التعامل مع المونسنيور لزجة المحتوى. فإنه يجوز التمسك بأي شيء يأتي إلى الاتصال المادي مع ذلك وستلتزم أيضا في كثير من الأحيان بالملقط التشريح، مما يزيد من خطر تلوث العينات الأخرى. من الضروري أن لمس فقط المحتوى MGR مع إبرة تشريح ونقل على الفور إلى قارورة زجاجية تستخدم لاستخراج (خطوات 2.5 و 2.6). وعلاوة على ذلك، يوصي بتنظيف معدات تشريح مع مزيج ميوه/ح2س عند التبديل بين النمل أو الغدة-أنواع (الخطوة 2.8).
محتويات الغدة من أنواع النمل الأخرى قد تكون موجودة في حالة سائلة حتى أثناء التبريد مع حزم الباردة. في هذه الحالة، تكون الغدة كاملة بما في ذلك الغشاء أول مايو معزولة وثقب بعد ذلك للحصول على المحتوى. كما يمكن الحصول على إفرازات السائل مع مساعدة الماصات الشعرية الجميلة. مع متوسط جسم بطول حوالي 4-5 ملم (دون هوائي)، العمال من اكسبلودينس جيم- تنتمي إلى الأنواع أصغر مجموعة كوسي. على غستر منتفخة كثيرا ما تضم حوالي 2-2.5 ملم في الطول و 1-1.5 مم في العرض. عمال الأنواع المعروفة حتى الآن أكبر مجموعة كوسي يمكن أن تصل إلى حجم حوالي 8 مم في طول الجسم مع حجم غستر حوالي 3 مم في الطول و 2.5 ملم في العرض. نظراً للبروتوكول هو ملائمة تماما لتشريح والتحقيق النمل الفردية وجاستيرس بهذا الحجم من مختلف الأنواع كوسي، هنا تستخدم أدوات تشريح والمجهر قد يتعين تكييفها لتكون قابلة للتطبيق للنمل أصغر أو أجهزة أصغر. وعلاوة على ذلك، عدد النمل كل عينة تحليلية قد تكون زيادة كذلك.
بينما تشريح النملة لمحتوى MGR، المهم ليس الأضرار بأي الغدد الأخرى أو الأمعاء-محتويات التي قد عبر-تلوث العينة (الخطوة 2، 5، الرقم 4 و الشكل 15). وفي الحالة المثلى، بعد استخراج محتويات MGR، المدير العام، فضلا عن جيد جداً واضح وتحفظ سليمة (الشكل 4). التلوث مع المحتويات من المدير العام، الذي يقع تحت الموارد الوراثية الجرثومية، يصعب تجنب تماما. قد تتضمن أسباب هذا أيضا تعطل جزئي لسلامة الغدة أثناء النقل على الجليد الجاف من الموقع--أخذ العينات إلى المختبر. من الممكن أيضا أن أسهم تلف أثناء أخذ العينات أو عملية تفجير، كما لاحظنا ل MGR في عدد من النمل التحقيق. حيث يمكن تحليل محتويات المديرية العامة بنفس الطريقة كما المونسنيور محتويات (المادتين 3 و 4)، يمكن مقارنة النتائج للبيانات الناتجة بعد تحليل العينات MGR المحتوى (المادة 6). في حالة المونسنيور مقتطفات المحتوى التي تم الحصول عليها من النمل اكسبلودينس جيم ، تبدأ المركبات الواردة أيضا في المدير العام الوت متأخراً في chromatogram (الشكل 12). المركبات لمنع ظنوا المديرية العامة لمكونات MGR، والايضات كل منها يمكن أن تستبعد من مزيد من التحليل. ومن المعروف من دراسات بشأن الأنواع الأخرى من النمل أن DGs يمكن أن تحتوي على المركبات المتطايرة (عالية)1،24، التي عادة ما الوت مبكرا في GC-تشروماتوجرام.
في الدراسات السابقة التي تتعامل مع التركيب الكيميائي لمحتويات MGR كوسي النمل، والنمل كله أو ما جاستيرس كله تم تحليل16،17،،من1823، بينما محتويات هنا المونسنيور وتم الحصول على أنفسهم عن طريق تشريح النمل.
تحليل محتويات MGR تشريح يسمح للمحققين بإجراء مجموعة واسعة من الدراسات الكيميائية الحيوية، بما في ذلك تحديد نواتج الأيض الواردة فيه. حيث ركزت الدراسة المنجزة هنا على تحديد مكونات متفجرة الواردة في المونسنيور اكسبلودينس جيم، اختير GC-MS لتحليله (القسم 4). لهذا، ينبغي من الناحية المثالية يقاس مباشرة بعد إعداد المقتطفات أو المخزنة في-80 درجة مئوية حتى التحليل. تجدر الإشارة إلى أن التخزين (الموسع) قد تتسبب التغييرات الكيميائية من المقتطفات (انظر الملاحظات بعد الخطوات 3.3 و 4.2). نظراً لتركيز محتويات MGR قد تغطي طائفة من عدة أوامر من حجم، قد يكون الضرورية لتحليل مقتطفات MGR في GC مختلفة تقسيم النسب. منذ المركبين الرئيسية في محتوى MGR استخراج النمل المتخذة لتجسيد البروتوكول تسبب في إثقال العمود عندما استخدمت تقسيم نسبة 2:1، وقد تم تحليل هذه العينة لمرة ثانية بتقسيم أعلى نسبة 50: 1 (4.3.1.2and الخطوة رقم 5). إعدادات المعلمة GC-MS قدم في القسم 4 مناسبة للبيانات التي تم إنشاؤها مع الأجهزة GC-MS المحددة في الجدول للمواد. بجوار كاليبرانتس ري (الخطوة 4.1.1)، ينبغي أيضا تحليل المذيبات-فارغة (الخطوة 4.1.2) للاعتراف بالنتائج الملموسة غير البيولوجية والملوثات أثناء تحليل البيانات اللاحقة. لتحديد المستقلب، من المهم أيضا لقياس المعايير الأصيلة لمركبات مشروحة تحت نفس الظروف GC-MS كالمستخدمة لتحليل عينة مقتطفات (5.4.7and الخطوات التالية). لتحسين دقة وموثوقية البيانات النهائية، من المستحسن لتحليل جميع فئات العينة (المذيبات فارغة ري كاليبرانتس، مقتطفات عينة والمعايير) داخل نفس تسلسل القياس. وعلاوة على ذلك، يجب أن يتم تحليل المعايير الأصيلة في تركيز مماثلة للتي لوحظت بالنسبة تستخرج العينة. وهذا يساعد على تعزيز دقة قيم ري والتشابه بين العينة وأطياف الجماعية الموحدة، التي ستؤدي في نهاية المطاف إلى المستقلب متزايدة وأكثر جدوى التعليق التوضيحي/تحديد. وتحقيقا لهذه الغاية، المعايير يمكن مرارا وتكرارا قياس استخدام عوامل انقسام مختلفة.
لتحديد المستقلب، البرمجيات المتطورة، ويستخدم ميتابوليتيديتيكتور للمقارنة deconvolution ومنظمة الروتاري الدولية وأطياف أطياف إلى تنفيذها نيست-مكتبة، وكذلك فيما يتعلق بإنشاء مكتبة داخل المنشأة (القسم 5). من المستحسن لتشغيل ميتابوليتيديتيكتور على 64 بت لينكس على أساس نظام تشغيل (مثل كوبونتو) ونسخ الذي تم إنشاؤه *. قوات الدفاع المدني ملفات البيانات (الخطوة 4، 4) من جهاز تخزين البيانات المحمولة على محرك الأقراص الثابت المحلي. ميتابوليتيديتيكتور غير قادرة على استيراد البيانات الخام GC-MS في تنسيق netCDF centroid أو الشخصية. البرنامج معظم GC-MS الصكوك ينبغي أن يكون قادراً على تحويل البيانات الخام المسجلة في هذا الشكل19. قبل البدء في تحليل البيانات، فإنه ينصح بشدة لقراءة الأدبيات المتوفرة للإصدارات السابقة من برامج ميتابوليتيديتيكتور تصبح على دراية الميزات والمستخدم الرسومية واجهة19،25، 26.
لمعايرة ري وحساب قيمة ري اللاحقة على قمم المجمع الحالي في تستخرج العينة، يتم استخدام مكتبة تحتوي على RIs وأطياف كاليبرانتس ري (هنا، ن-ألكانات). مكتبة من هذا القبيل يمكن أن يكون أما المنشأة ذاتيا، أو واحدة موجودة مسبقاً ('CalibrationLibrary_Alkanes') يمكن تحميلها27. المكتبة الافتراضية المتوفرة كاليبرانت يحتوي على RIs والأطياف لتتراوح بين C09 C39 ألكانات ن الذي قد تم تحليلها كما هو موضح في القسم 4. قدمت المكتبة يتيح للمستخدمين العمل مع "المستقلب كاشف" للبدء مباشرة في عملية معايرة البيانات الخاصة بهم. إذا لزم الأمر، كما يمكن توسيع هذه المكتبة مع إدخالات إضافية لمزيد من الألكانات. استناداً إلى تشابه إشارة والمشتقة تجريبيا RIs وأطياف الشامل (راجع الخطوة 5.3 والخطوات الفرعية، الرقم 7، رقم 8، رقم 9)، تعليق توضيحي أو تحديد هوية المركبات يمكن أن يؤديها (الخطوة 5.4 والخطوات الفرعية، الشكل 11). من المهم أيضا أن بعد التجهيز الآلي للبيانات مع ميتابوليتيديتيكتور، المستخدم سوف التحقق يدوياً لذروة الصحيح الانتقاء والطيف deconvolution بالتفتيش الشامل الأطياف الكامنة وراء 'مثلث' لكل مجمع المفترضة للفائدة. وعلاوة على ذلك، اعتماداً على أجهزة GC-MS وإعدادات المعلمة المستخدمة لتوليد البيانات، أدابتيونس ميتابوليتيديتيكتور الإعدادات المعروضة قد تكون ضرورية. قادرة على أداء العديد من عمليات أكثر فائدة مما فسر في هذه المخطوطة، مثلاً، عرض لايون المستخرجة الحالية (يؤثرون) تشروماتوجرامس، تصدير تشروماتوجرامس.csv، دفعة التلقائي-التحديد الكمي للبرمجيات ميتابوليتيديتيكتور المركبات، وغيرها الكثير.
يمكن البروتوكول المعروضة في هذه المخطوطة بمثابة اقتراح للتجارب التي يقوم بها باحثون آخرون التركيز على عزل الغدد أو محتويات الغدة من الحشرات، وتحليل فولاتيلومي، فضلا عن تحديد المستقلب.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم الحصول على تمويل لهذه الدراسة عن طريق فيينا العلوم والتكنولوجيا الصندوق (WWTF) LS13-048 إلى ISD. شكرنا الخاص لديان دبليو ديفيدسون (جامعة يوتا؛ متقاعد الآن) لتقاسم معرفتها حول النمل Bornean كوسي معنا. أننا نقدر الإدارات في كوالا بيلالونج مركز الدراسات الميدانية (كبفسك) وجامعة بروناي دار السلام (UBD) للموافقة على المشروع، فضلا عن بروناي في إدارة الغابات وبروناي في مركز البحوث والابتكار للإذن بجمع النمل و الموافقة وإصدار تراخيص التصدير. نتوجه بالشكر الخاص إلى UBD وكبفسك الموظفين وخاصة الخفافيش محمد صالح بن عبد الله، ولي وي تشوا تيدي، ميراسان ماسنة، كاهار رافهية، روسلي روشانيزة، الوهاب رودزاي، تشان تشين مي، وتيناكون كوشان لتسهيل البحث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP | Sarstedt | 62,559,001 | see Figure 1 in manuscript |
| PVC Tubings | Rehau | 290 4489 | see Figure 1 in manuscript |
| Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size | Antstore | 1000378 | see Figure 1 in manuscript |
| Freezer | Severin | KS 9890 | -20 °C or lower |
| polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm | Thorsten Koch | 4260308590481 | |
| Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm | Aldrich | BR455742 | |
| Cold pack 150 mm x 100 mm | Elite Bags | 1998 | freeze to -20 °C |
| Bucket with crushed ice | |||
| 1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening | La-Pha-Pack | 11090500 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151799 | |
| Stereomicroscope | Bresser | 5806100 | |
| Forceps, Superfine Tip curved | Medizinische Instrumente May, Norman May | PI-0005B | |
| Forceps, Superfine Tip straight | blueINOX | BL-3408 | |
| Dissection needle 140 mm, pointed, straight | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110301 | |
| Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën | fisher scientific | 15654740 | |
| Distilled water | |||
| Rotizell-Tissue-Tücher | Carl Roth GmbH + Co.KG | 0087.2 | |
| Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % | Carl Roth GmbH + Co.KG | 4442.1 | freeze to -20 °C |
| Vortex Genie 2 | neoLab | 7-0092 | |
| 0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip | La-Pha-Pack | 06090357 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum, 45° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151819 | |
| Alkane standard solution C8-C20 | Sigma-Aldrich | 04070 | |
| Alkane standard solution C21-C40 | Sigma-Aldrich | 04071 | |
| n-Hexane SupraSolv | Merck | 104371 | |
| GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister | Gerstel | ||
| Agilent Gas chromatograph 6890 N | Agilent | ||
| Gooseneck splitless Liner | Restek | 22406 | |
| Helium (5.0 - F50) | Messer | 102532501 | |
| GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent Mass Selective Detector 5975B | Agilent | ||
| MSD ChemStation Data Analysis Application software | Agilent | ||
| MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| Calibration Library for MetaboliteDetector | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| MD Conversion Tool for NIST-library | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 |
References
- Morgan, E. D. Chemical sorcery for sociality: exocrine secretions of ants (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecol News. 11, 79-90 (2008).
- Betz, O. Biological adhesive systems. , Springer. 111-152 (2010).
- Laciny, A., Zettel, H., Druzhinina, I. Workers, soldiers, and gynes-morphometric characterization and description of the female castes of Camponotus singularis (Smith, 1858)(Hymenoptera, Formicidae). Deutsche Entomologische Zeitschrift. 63, 183 (2016).
- Ward, P. S., Blaimer, B. B., Fisher, B. L. A revised phylogenetic classification of the ant subfamily Formicinae (Hymenoptera: Formicidae), with resurrection of the genera Colobopsis and Dinomyrmex. Zootaxa. 4072 (3), 343-357 (2016).
- Davidson, D. W., Salim, K. A., Billen, J. Histology of structures used in territorial combat by Borneo's 'exploding ants'. Acta Zoologica. 93 (4), 487-491 (2012).
- Davidson, D., et al. An experimental study of microbial nest associates of Borneo's exploding ants (Camponotus [Colobopsis] species). Journal of Hymenoptera Research. 18 (2), 341-360 (2009).
- Laciny, A., et al. Colobopsis explodens sp.n., model species for studies on "exploding ants" (Hymenoptera, Formicidae), with biological notes and first illustrations of males of the Colobopsis cylindrica group. ZooKeys. , (2018).
- Maschwitz, U., Maschwitz, E. Platzende Arbeiterinnen: eine neue Art der Feindabwehr bei sozialen Hautflüglern. Oecologia. 14 (3), 289-294 (1974).
- Davidson, D. W., Lessard, J. P., Bernau, C. R., Cook, S. C. The tropical ant mosaic in a primary Bornean rain forest. Biotropica. 39 (4), 468-475 (2007).
- Martin, S., Drijfhout, F. A review of ant cuticular hydrocarbons. Journal of chemical ecology. 35 (10), 1151 (2009).
- Pickett, J. Chromatography and isolation of insect hormones and pheromones. , Springer. 299-309 (1990).
- Tragust, S., et al. Ants disinfect fungus-exposed brood by oral uptake and spread of their poison. Current Biology. 23 (1), 76-82 (2013).
- Menzel, F., Blüthgen, N., Schmitt, T. Tropical parabiotic ants: highly unusual cuticular substances and low interspecific discrimination. Frontiers in Zoology. 5 (1), 16 (2008).
- Hogan, C. T., Jones, T. H., Zhukova, M., Sosa-Calvo, J., Adams, R. M. Novel mandibular gland volatiles from Apterostigma ants. Biochemical Systematics and Ecology. 72, 56-62 (2017).
- Augusto, F., Valente, A. L. P. Applications of solid-phase microextraction to chemical analysis of live biological samples. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 21 (6), 428-438 (2002).
- Davidson, D. W., et al. Nutrition of Borneo's 'exploding' ants (Hymenoptera: Formicidae: Colobopsis): a preliminary assessment. Biotropica. 48 (4), 518-527 (2016).
- Jones, T., et al. The chemistry of exploding ants, Camponotus spp.(cylindricus complex). Journal of chemical ecology. 30 (8), 1479-1492 (2004).
- Voegtle, H. L., Jones, T. H., Davidson, D. W., Snelling, R. R. E-2-ethylhexenal, E-2-ethyl-2-hexenol, mellein, and 4-hydroxymellein in Camponotus species from Brunei. Journal of chemical ecology. 34 (2), 215-219 (2008).
- Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
- Stein, S. Retention indices by NIST mass Spec data Center. NIST Chemistry Webbook, NIST Standard Reference Base. (69), (2010).
- NIST Chemistry WebBook. NIST Standard Reference Database Number 69. , Available from: http://webbook.nist.gov/chemistry/ (2018).
- Cook, S. C., Davidson, D. W. Nutritional and functional biology of exudate-feeding ants. Entomologia Experimentalis et Applicata. 118 (1), 1-10 (2006).
- Abdalla, F. C., Cruz-Landim, C. d Dufour glands in the hymenopterans (Apidae, Formicidae, Vespidae): a review. Revista Brasileira de Biologia. 61 (1), 95-106 (2001).
- Hiller, K. MetaboliteDetector. Documentation. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/wiki/index.php/Documentation (2010).
- Nieke, C. MetaboliteDetector - Development Version. , Available from: http://md.tu-bs.de/system/files/Downloads/MD-Development-Version-Documentation.pdf (2012).
- Hiller, K., Koschnitzki, N. MetaboliteDetector. Download. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 (2017).
