Summary
Les travailleurs mineurs de l’espèce de fourmi Colobopsis explodens sont disséqués afin d’isoler la cireuse de contenu stocké dans les réservoirs de leurs glandes mandibulaires hypertrophiés pour ultérieures d’extraction par solvant et l’analyse par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse. L’annotation et l’identification des constituants volatils en utilisant le logiciel open source MetaboliteDetector est également décrite.
Abstract
Le but de ce manuscrit est de présenter un protocole décrivant l’analyse métabolomique de Bornéo « explosions fourmis » appartenant au groupe Colobopsis cylindrica (COCY). À cet effet, l’espèce de modèle c. explodens est utilisé. Fourmis appartenant à la caste des travailleurs mineurs possèdent des glandes mandibulaires hypertrophiés distinctifs (MGs). Au combat territorial, ils utilisent le contenu visqueux de leurs réservoirs d’hypertrophie de la glande mandibulaire (MGRs) pour tuer les rivaux arthropodes caractéristique suicidaire « explosions » de rupture volontaire du tégument gastrale (autothysis). Nous montrons la dissection des fourmis ouvrières de cette espèce pour l’isolement de la partie gastrale le contenu MGR cireuse comme énumérant les étapes nécessaires requises pour solvant d’extraction des composés volatils qui y sont contenues avec gaz ultérieur chromatographie spectrométrie de masse (GC-MS) analyse et identification putative des métabolites contenus dans l’extrait. La procédure de dissection est réalisée dans des conditions refroidies et sans l’utilisation d’une solution tampon de dissection pour minimiser les changements dans la composition chimique du contenu MGR. Après le solvant d’extraction de métabolites volatils qu’il contient, sont présentés les mesures nécessaires pour analyser les échantillons par liquide-injection-GC-MS. Enfin, traitement des données et l’identification de métabolite putatif avec l’utilisation du logiciel open source MetaboliteDetector est montré. Avec cette approche, le profilage et l’identification des métabolites volatils dans MGRs de fourmis appartenant à la COCY groupe par GC-MS et le logiciel de MetaboliteDetector deviennent possibles.
Introduction
L’objectif global du flux de travail présentée ici est l’enquête générale des compositions chimiques dans les sécrétions d’insectes. Cela se fait avec le but primaire d’élucider les rôles écologiques de la sécrétion dans son ensemble, ou de simples composés. En outre, nous nous intéressons à enquêter sur les voies métaboliques qui sous-tendent les composés présents dans les sécrétions respectives. Surtout la glande contenu de fourmis (Hymenoptera, Formicidae) ont gagné en hausse des intérêts dans les dernières années, parce qu’ils fournissent des sources jusqu’alors inexplorées composés potentiellement bioactifs (colles, antimicrobiens, etc.)1, 2. les ouvrières mineures de certaines espèces appartenant au groupe COCY3,4 peuvent fournir ces composés contenus dans leurs MGRs hypertrophiés qui s’étendent depuis les pièces buccales au gaster5,6. Lorsqu’il est menacé par des ennemis putatifs, des mineurs travailleurs de explodens c.7 , et certains liés espèces peuvent faire usage de leur MGR le contenu d’une manière inhabituelle : ils se sacrifient par une rupture de leur paroi gastrale pour éjecter le contenu collant de la MGRs explosivement sur l’adversaire, auquel cas l’ennemi putatif est détenu et peut même mourir5,6,8,9. Le but de la mise au point et l’utilisation des méthodes présentées ci-après a été pour aider à améliorer la compréhension de la composition chimique et la nature des constituants toxiques provisoirement de cette sécrétion de fourmi.
À cette fin, nous présentons un protocole pour la dissection des fourmis ouvrières c. explodens d’obtenir la portion gastrale de leur contenu MGR cireuse avec ultérieures d’extraction par solvant et l’analyse par GC-MS.
Analyse par CPG-SM est une des méthodes bien établies pour le profilage et l’identification des métabolites volatils (volatilome) contre les insectes. Analytes typiques d’intérêt à fourmis incluent hydrocarbures cuticulaires10, écomones11et en général, les composés avec activité biologique12. Échantillons peuvent être obtenus des animaux entiers ou des parties du corps et liquides isolés par dissection des insectes13,14. Techniques de préparation d’échantillon comprennent l’extraction des métabolites qui y sont contenues avec l’utilisation de solvants14 ou feuillure-solide-microextraction en phase (HS-SPME)15.
Pour les études métabolomiques, il est vital que les échantillons sont congelés rapidement directement après le prélèvement, afin de minimiser les changements dans la composition chimique et la quantité des composés. Les fourmis utilisées pour cette étude ont été tués par la congélation rapide sur place dans un sac isotherme farcie surgelées compresses froides. Les échantillons sont ensuite conservés dans un congélateur à-20 ° C à l’aide axée sur le générateur d’électricité, avant ils ont été transportés au laboratoire sur la glace sèche. La procédure de la dissection présentée ici offre la possibilité d’isoler le contenu MGR sans analyser la fourmi entier ou le gaster dans son ensemble, comme cela a été fait avant pour différents COCY espèces16,17,18. En outre, le protocole présenté permet également un accès direct et l’analyse des glandes et des tissus, comme le venin glande (VG)5,8, glande (DG)8 du Dufourou les intestins dans d’autres études biologiques, ou à environnants Recherchez les contaminations croisées Croix possibles a présenté au cours de la manipulation ou la dissection des fourmis. Pour minimiser les changements dans la composition chimique du contenu MGR au cours de la dissection, dégel des échantillons soit par l’utilisation de produits chimiques, le processus de dissection a été optimisé pour être effectué sur une compresse froide (-20 ° C), sans l’utilisation de n’importe quel tampons supplémentaires, solutions de lavage, ou solvants. Les échantillons obtenus par cette méthode sont adaptés pour répondre aux questions qualitatives et quantitatives.
Analyse des données aux fins d’identification et annotation de métabolite putatif se fait via le logiciel open-source MetaboliteDetector19, qui a été développé pour l’analyse automatique des données de métabolomique basée sur GC-MS. Il détecte seul ion pics présents dans les chromatogrammes, effectue une étape de déconvolution et extraits déconvoluées spectres de masse des composés chimiques contenus dans les échantillons analysés. Putative identification de composés organiques MetaboliteDetector repose sur l’indice de rétention déterminée (RI ; le peut de Kovats RI calculés automatiquement par le logiciel) ainsi que de la similitude des spectres de masse déconvoluées. RI et facteur spectral match peuvent être une vérification croisée contre deux bibliothèques de référence existants (qui peut être importés, si elles sont dans le format commun de NIST) ou une bibliothèque interne établie. C’est conformément aux lignes directrices pour les (présumée) composé d’identification a suggéré, par exemple, par la de la métabolomique Standards Initiative (MSI), chimique analyse Working Group (CAWG) où un minimum de deux données indépendantes et orthogonales par rapport à un authentique composé (ici la rétention temps /RI (RT) et spectre de masse) analysé sous des conditions expérimentales identiques sont proposées au besoin pour confirmer pas nouveau métabolite identifications20.
L’expérience complète est réalisée sur le contenu MGR de l’espèce de modèle COCY c. explodens, mais les étapes de la dissection peuvent aussi être adaptées pour isoler les autres glandes présentes dans le gaster de fourmi. En outre, tandis que nous présentons un protocole pour l’analyse globale de la volatilome du contenu MGR, les pièces plus génériques du flux de travail décrivant l’extraction, GC-MS mesurage et évaluation des données permet également l’analyse et la (présumée) identification des métabolites volatils en général.
Puisque les expériences décrites dans ce manuscrit sont effectuées sur les insectes, aucune approbation éthique n’est nécessaire. Travail sur le terrain, l’échantillonnage des fourmis, ainsi que leur utilisation pour la publication sont conformément aux directives régissant ce projet par le biais de l’Universiti Brunéi Darussalam, la recherche du Brunei et Centre d’Innovation et de Brunei Forestry Department, Brunei Darussalam.
Protocol
1. collection de fourmis
- Recueillir les ouvrières mineures à l’aide d’un aspirateur (Figure 1).
- Immédiatement après le prélèvement, fixer les fourmis par congélation rapide à-20 ° C et stockez-les à ceci ou à une température plus basse jusqu'à l’analyse.
2. isolement de la DG de fourmis et de MGR contenu
- Avant la dissection des fourmis, préparer ce qui suit :
- Nettoyer le verre de Pétri et les instruments de dissection à l’aide d’un mélange méthanol / eau (MeOH/H2O ; 1 + 1 v/v) et les tissus.
ATTENTION : MeOH est toxique pour les humains. Toujours porter des gants appropriés, une blouse et des lunettes et effectuer le nettoyage sous une hotte aspirante. - Geler la compresse froide et le verre plat de Pétri à-20 ° C.
- Déterminer les masses des flacons de filet court de 1,5 mL y compris les couvercles à visser avec septa silicone/polytétrafluoroéthylène (PTFE) et les garder sur la glace juste à côté de la loupe.
Remarque : Le choix de l’échantillon est facultatif. Ici, le contenu MGR est placé directement dans refroidi 1,5 mL flacons en verre. Matières plastiques peuvent contenir des composés (par exemple, les phtalates) qui peuvent causer des artefacts, qui interfèrent avec les signaux des métabolites cible. - Placer la compresse froide congelée dans un coffrage en mousse de polystyrène extrudé. Placer le plat de Pétri sur le dessus de la compresse froide et mettre une fourmi congelée dans le plat. Montez la boîte sous un microscope stéréo. Ajustez le grossissement (20 – 40 X) et la mise au point jusqu'à ce que la fourmi entier peut être vu clairement.
- Nettoyer le verre de Pétri et les instruments de dissection à l’aide d’un mélange méthanol / eau (MeOH/H2O ; 1 + 1 v/v) et les tissus.
- Vérifier la fourmi congelée pour l’intégrité de ses compartiments gastrale. Pour la dissection, prenez seulement les fourmis avec une zone intacte gaster (Figure 2 a, B). Exclure les fourmis avec gasters plats ou des traces de contenu MGR durci sur leurs surfaces corporelles de l’analyse (Figure 2, D).
- Prenez la fourmi sélectionnée avec une paire de pinces à pointe fine à le propodeum (premier segment abdominal) et avec l’autre paire de pinces à pétiole (segment deuxième abdominal). Détacher la région gaster en tirant doucement le reste du corps de fourmi (Figure 3 a).
- Difficulté le gaster fourmi maintenant séparés en le tenant avec une pince à pointe fine au tergite 4. Une autre paire de pinces à pointe fine saisir tergite 1 (situé à côté du pétiole) et le retirer doucement par il décolle (Figure 3 b). Répétez cette opération également pour les tergites 2 et 3 (Figure 3, D) jusqu'à ce que le passage à niveau des MGRs (de couleur jaune dans explodens c. ouvrières, mais la couleur de la teneur en MG peut varier du blanc au jaune au rouge chez d’autres espèces) est visible pour la plupart partie.
Remarque : En supprimant l’exosquelette, la membrane de la MGR sera également en partie supprimée. - Par l’utilisation d’une aiguille de dissection, retirez délicatement le contenu de la cireuse des MGRs appariés en les grattant hors du compartiment gastrale (Figure 3E). Seulement enlever les parties du contenu qui peut être isolé sans rupture autres glandes présentes dans le gaster fourmi MGR. Si plus de force ou d’efforts doivent être appliquées pour obtenir le contenu MGR dans son ensemble, accepter sa suppression incomplète (Figure 4).
- Aspirer le contenu MGR en les touchant délicatement avec la pointe de l’aiguille dissection jusqu'à ce qu’elles collent dessus. Puis verser le contenu MGR dans un flacon de 1,5 filet court refroidi avec connue tarez masse.
- Pour supprimer le contenu MGR collant de la pointe de l’aiguille de la dissection, déplacer l’extrémité de l’aiguille à la paroi de la cuvette de l’échantillon et les frottis sur le mur. Fermer le flacon et le placer sur la glace jusqu'à ce que le prochain contenu MGR est isolé.
- Pour vérifier plus tard possible contamination croisée de l’échantillon contenu de MGR de composés provenant de la DG adjacente (Section 6), lui aussi recueillir DGs de fourmis, dans lequel ils sont restés intacts (Figure 4) et les mettent dans un flacon HPLC distinct.
- Nettoyez toujours la boîte de Pétri et instruments de dissection avec MeOH/H2O (1 + 1 v/v), lors du changement de la glande de la glande ou de fourmi à fourmi.
- Pour un échantillon analytique, combiner le contenu de réservoir ou les glandes de fourmis multiples.
Remarque : Le nombre de glandes ou de leur contenu utilisé pour un seul échantillon analytique peut varier selon la conception de l’expérience. Ici, contenu MGR ou DG de cinq fourmis ont été regroupées afin d’obtenir un échantillon à analyser.
3. d’extraction par solvant de contenu isolé de la glande
- Déterminer les masses des échantillons pour l’analyse (ici, le contenu MGR ou glandes voisines regroupées à partir de cinq fourmis).
- Ajouter l’acétate d’éthyle glacé haute pureté (EtOAc) dans un rapport constant de 01:14 w/v et vortex les échantillons pendant 5 min dans des conditions refroidies ; ici, jouée à 7 ° C dans un laboratoire thermostaté.
- Centrifuger les échantillons pendant 10 min à 3 820 x g à 7 ° C et transférer les surnageants (environ 55 – 75 µL pour contenu extrait de MGR provenant de cinq fourmis) dans un refroidissement préalable 1,5 mL filet court fioles contenant 0,1 mL micro-inserts. Sceller hermétiquement les flacons avec bouchons à vis contenant des trous et des septa caoutchouc/PTFE rouge.
Remarque : Si l’analyse ne peut être effectué immédiatement, conservez l’extrait à-80 ° C jusqu'à ce que l’analyse, mais il est recommandé d’analyser les échantillons immédiatement après la préparation afin de minimiser le risque d’altérations chimiques pendant le cycle de gel/dégel.
4. GC-MS
- Pour une séquence complète de mesure des GC-MS, préparer les solutions suivantes, chacune dans un flacon de 1,5 mL filet court :
- Préparer un mélange de calibrant RI en diluant les solutions standard disponibles dans le commerce d’alcane à une concentration finale de 8 mg/L par composé à l’aide d’hexane.
- Préparer un solvant-blanc composé de pure EtOAc.
- Place les flacons contenant 1) solvant-blank, mélange de degré 2) RI, contenu MGR 3) extrait et le contenu de la DG 4) extraire dans la barre d’État refroidi (10 ° C) de l’échantillonneur automatique couplée à la chromatographie en phase gazeuse (GC).
Remarque : Il est recommandé de réduire au minimum la durée que chaque flacon est conservé dans l’échantillonneur automatique avant la mesure. Pour les échantillons critiques, comme l’exemple de contenu de MGR, le flacon peut être placé dans l’échantillonneur automatique immédiatement avant l’analyse. - Pour chaque échantillon, injecter une aliquote de 1 µL dans le GC-MS pour une séparation chromatographique sur colonne appropriée pour les composés cibles (ici : colonne HP - 5MS UI).
- Définissez les paramètres appropriés de la GC, qui peuvent sembler comme suit :
- Utiliser l’hélium comme gaz vecteur et définir un flux constant de colonne de 1 mL/min. ensemble une rampe de température du four à partir de 40 ° C avec une cale pendant 2 min, suivie d’une rampe de 10 ° C/min jusqu'à 330 ° C, avec un temps de 7 min. régler la température à l’entrée à 270 ° C.
- Choisir et si nécessaire, ajustez les ratios de split pour GC-MS injection qui donnent lieu à des formes de pic adéquat et les intensités des composés d’intérêt (Figure 5).
Note : Dans l’exemple présenté, il est nécessaire de mesurer l’extrait DG à un rapport de 2:1 split et le mélange de calibrant RI en mode splitless. L’extrait MGR contenu a été analysé à un rapport de 2:1 split et une deuxième fois à 50 : 1. - Régler la température auxiliaire à 350 ° C.
- Réglez les paramètres de la spectrométrie de masse (SM) comme suit : MS d’origine température 230 ° C, température MS Quad 150 ° C, plage de balayage de faible masse 30 à haute masse 500, solvant retarder 4,1 (pour les échantillons de solvant-blank et expérimentales) ou 6,1 min (pour le mélange de RI de degré) , respectivement. Régler la vitesse de balayage à environ 3 scans/s.
Remarque : Les paramètres de MS, en particulier le MS scan-, fréquence, d’échantillonnage et temps de cycle peuvent influer sur la cueillette de pic et déconvolution de spectre et doivent être considérés lors de la sélection des paramètres pour l’évaluation des données appropriées avec le logiciel MetaboliteDetector.
- Définissez les paramètres appropriés de la GC, qui peuvent sembler comme suit :
- Lorsque la mesure est terminée, exporter les données. AIA project (interprété ici avec l’utilisation du logiciel d’analyse de données envoyée par le GC) le fichier sur un périphérique de stockage de données portable.
- Sélectionnez le fichier | Exporter des données au format AIA..., puis cochez créer le nouveau répertoire et cliquez sur OK. Sélectionnez l’emplacement de stockage voulu (par exemple, un lecteur flash USB), puis cliquez sur ouvrir. Sélectionnez les fichiers à exporter et cliquez sur l’icône ---> . Confirmer avec en cliquant sur les processus.
5. métabolite détection et l’Identification avec l’utilisation du logiciel MetaboliteDetector
- Avant de commencer l’analyse des fichiers de données, ouvrez MetaboliteDetector, choisir les outils de | Paramètres deet définissez les paramètres requis comme suit (des feuilles individuelles de MetaboliteDetector sont indiquées en caractères gras) :
- Dans la feuille, apparence, l’échelle de temps la valeur Min et activer l’option d’étiquettes des Axes.
- Dans la feuille de déconvolution, définissez les paramètres pour que les paramètres Peak : seuil max. : 10 et la hauteur Minimum du PIC (unités de bruit) : 10. Décochez la case activation du réglage de base. Définir les paramètres de détection de métabolite à : bacs/Scan : 10, largeur de déconvolution (scans) : 5, intensité requise (% du pic de base) : 0 et nombre de pointes : 10.
- Dans la feuille Identification, affectez à l’option de recherche de bibliothèque : Compound Lib : « CalibrationLibrary_Alkanes » et au NIST (une bibliothèque de sqlite NIST peut être incluse dans le format .lbr). Réglez les paramètres comme suit : Max. Différence de RI : 10, score de coupure : 0,9, pur/impur composition : 0,5, nombre de fragments : 2, nombre de Minimum de frag identiques. : 1. utilisation échelle lib : coché ; Score de similarité : Similitude de la norme ; Filtre de masse : m/z 207, 221, 281, 355 et 1147 (pour les contaminants connus résultant de la phase stationnaire de la colonne GC).
- Dans la feuille de Quantification définir les paramètres : nombre d’ions de quantification : 3, distance minimale entre les ions suivantes : 5 et l’indice de la qualité requise minimale : 1. exclure les ions de quantification, 207, 221, 281, 355 et 1147.
Remarque : En cas de haute résolution de données de MS, en outre définir les paramètres suivants dans la feuille de centroïde à : seuil de pointe commencent : fin de seuil max. 10, : -5 et la distance maximale de la base : 30, FWHM : 0,5.
- Importer les fichiers dans le. Format CDF contenue dans le produit. Fichier projet d’AIA comme. NetCDF dans le logiciel MetaboliteDetector en sélectionnant fichier | Importation | NetCDF importation. Cliquez sur l’icône en forme de dossier et sélectionnez les fichiers pour les catégories de l’échantillon d’être importé et traités : 1) solvant-blanc, 2) RI calibrants, MGR 3) contenu extrait et extrait contenu 4) DG. Confirmez avec OK pour commencer le traitement des données. Après transformation, sélectionnez Fermer dans la fenêtre qui apparaît.
- Pour l’étalonnage de RI et la détermination des valeurs pour les composés contenus dans l’extrait MGR RI, sélectionnez fichier | Ouvrir et choisissez le fichier contenant les données de la calibrants RI.
- Le degré de RI fichier s’ouvre, sélectionnez l’icône de loupe . Confirmez la fenêtre apparaissant avec OK.
- Pour un étalonnage approprié RI, contrôlez la portée des alcanes détectables dans le fichier de degré de RI.
- Pour ce faire, sélectionnez le triangle apparaissant sous le maximum de la première crête, provenant de l’alcane premier (avec le RT le plus bas, Figure 6) détectable en cliquant une fois dessus.
- Vérifier le coup avec la similitude de fréquences plus élevée (« Spec. sim. », note max = 1) par rapport aux entrées de la bibliothèque alcane (Figure 6).
- Pour vérifier l’identité de l’alcane suggéré composé, comparer son spectre de masse pour le spectre de masse donné dans la littérature, par exemple, NIST WebBook de chimie22.
- Déterminer l’alcane dernier détectable dans le mélange de calibrant RI en comptant le dernier pic alcane qui apparaissent sur le chromatogramme.
- Pour l’étalonnage de RI, sélectionnez outils | RI-Calibration Wizard. Sélectionnez suivant.
- Cliquer sur l’icône en forme de dossier et sélectionnez le fichier contenant le chromatogramme du mélange calibrant RI. Sélectionnez suivant.
- Sélectionnez la bibliothèque contenant les entrées pour les calibrants alcane dans la fenêtre apparue.
- Sélectionnez les entrées de la bibliothèque de tous les alcanes détectables dans le fichier de calibrant RI et cliquez sur le >> icône. Après avoir sélectionné >>, choisissez suivant.
- Vérifier les RTs répertoriés pour chaque alcane détectable dans le tableau qui apparaît. Pour ce faire, vérifiez les RTs représentés dans la fenêtre principale pour chaque alcane en cliquant sur le triangle respectif (Figure 7). Si nécessaire (Figure 8), corriger la RT dans le tableau de réglage manuellement en double-cliquant dans leurs domaines respectifs, en sélectionnant le menu déroulant et en choisissant suggéré le correct RT. sinon, tapez dans la RT à l’aide de la (clavier La figure 9).
- Lorsque la RT pour chaque alcane est correct, sélectionnez suivant. Cliquez sur suivant dans la fenêtre qui apparaît montrant le tableau de réglage de RI.
- Sélectionnez le symbole vert + dans la fenêtre de Sélection de chromatogramme comparante, choisissez le fichier de données du solvant-blanc et les fichiers de la glande extraits et sélectionnez suivant. Définir les paramètres de paramètre dans la fenêtre qui apparaît comme suit : désactivation du réglage de base, seuil de pointe : 5, hauteur minimale : 5, bacs/Scan : 10 et déconvolution largeur : 5. frapper la prochaine , puis commencer à effectuer le calcul de la RI de les composés contenus dans les dossiers de l’échantillon sélectionné.
- Pour l’annotation et l’identification des métabolites choisies dans l’extrait MGR, ouvrez le fichier de données de l’extrait contenu mesuré MGR, pour lequel le RIs ont été calculé comme décrit ci-dessus (étape 5.3.9), en sélectionnant fichier | Ouvrir et choisir le fichier de données voulu.
- Sélectionnez outils | Paramètres | Déconvolution et modifiez le seuil de pointe ainsi que la Minimum hauteur de pic (unités de bruit) les deux à 5. Sélectionnez l’icône de loupe et confirmez la fenêtre d’avertissement qui apparaît avec OK.
- Cliquez sur un triangle qui apparaît sous le maximum d’un pic d’intérêt et de comparer son spectre de masse avec ceux stockés dans la bibliothèque de NIST en sélectionnant l’icône NIST .
- Sélectionnez le premier coup qui en résulte de la NIST-recherche (Figure 10).
- Si la similitude du spectre résultant du composé d’intérêt dépasse le score de similarité de spectre choisie (ici ≥ 0,9) par rapport à une entrée de NIST (Figure 10), rechercher la RI (pour semblable phase stationnaire de la colonne GC, l’épaisseur de film et colonne diamètre) compte tenu de ce composé dans la littérature (p. ex., NIST WebBook de chimie22).
- Calculer l’écart relatif entre la référence NIST RI (ou la moyenne RIs lorsque plusieurs valeurs du RI sont donnés) et le FRO expérimentalement dérivé. Si la différence est égale ou inférieure à la spécifié par l’utilisateur maximale tolérée valeur (ici, ≤ ± 1 %), désigner le composé comme « annoté ».
- Répétez les étapes 5.4.2–5.4.5 pour tous les composés d’intérêt contenues dans le fichier d’exemple MGR.
- Pour l’identification des composés, comparer les RI et les spectres de masse des solutions étalons (p. ex., 2 – 100 mg/L) mesurée dans les mêmes conditions, tel que décrit à la Section 4 à celles des composés annotés.
- Analyser la norme comme expliqué dans la Section 4 et traiter les données qui en résulte comme décrit pour l’alcane - et MGR glande contenu données aux étapes 4.4 et 5.2.
- Étalonner les données acquises de la norme en sélectionnant outils | RI-calibration Wizard | Prochain et choisir le même fichier de calibrant RI comme ceux utilisés avant. Sélectionnez le prochain, et puis suivant et sélectionnez le fichier contenant les données acquises de la solution étalon en cliquant sur le symbole vert + . Frapper la prochaine , puis commencer à calculer le RI pour le composé standard.
Remarque : Si l’analyse de la norme ne peut être effectuée rapidement après l’analyse de l’échantillon, il est recommandé d’analyser calibrants RI encore une fois et d’effectuer nouvel étalonnage RI et calcul de la norme. - Ouvrez le fichier respectif pour la norme et confirmer son identité par comparaison du spectre avec la NIST-bibliothèque, comme l’a expliqué à l’étape 5.4.2.
- Après confirmation de l’identité de la norme, ajouter le spectre de masse et RI de la norme composée à la bibliothèque interne. Pour ce faire, cliquez sur le symbole vert + et entrez le nom préféré de l’entrée de la bibliothèque. Confirmez avec OK pour ajouter le spectre de masse et la RI de la norme composée à la bibliothèque. Si la nouvelle entrée ne peut pas être vu dans la bibliothèque, cliquez sur le bouton Actualiser .
Remarque : Si l’étalonnage de RI a été effectuée avec succès, le RI déterminé par MetaboliteDetector sera affiché à l’entrée de bibliothèque respectif. Après avoir créé l’entrée de la bibliothèque pour le standard, l’identification de ce métabolite dans l’extrait MG fondée sur une combinaison de RI et similitude des spectres est possible. - Ouvrez à nouveau le fichier de données de contenu de MGR. Sélectionnez outils | Paramètres | Identification. Maintenant, comme le RI du composé standard est calculé et ajouté à l’entrée de la bibliothèque, changer le Score de similarité de Similitude de spectre au Score combiné.
- Cliquer sur l’icône de loupe et sélectionnez le triangle sous le composé qui a été annoté à l’étape 5.4.5.
- Cliquez sur la frappe et vérifier la valeur fournie pour le « score de similarité globale » (OSS, abrégés en métabolite détecteur comme « Globalement simil. »), compte tenu d’une combinaison de similitude de spectre et similitude RI marquer (Figure 11).
Remarque : Si un coup a été trouvé dans la bibliothèque interne, il apparaît sur le côté droit de la fenêtre principale. - Si l’OSS est supérieur au seuil défini par l’utilisateur (ici ≥ 0,9, également indiqué par la couleur verte du triangle), désigner le composé comme « identifiés » (Figure 11).
6. cocher de MGR contenu extrait de Contaminations par le contenu de la DG
- Ouvrez le fichier calibré de l’échantillon DG pour lesquels le RIs des composés ont déjà été calculé avec MetaboliteDetector (étape 5.3.9).
- Pour une superposition du chromatogramme obtenu après la mesure de l’échantillon contenu de MG et le DG, sélectionnez outils | Superposition de chromatogramme et choisissez les deux fichiers respectifs via l’icône vert + . Validez avec OK.
- Pour afficher la superposition, sélectionnez la feuille de Superposition de chromatogramme apparaissant au bas de la fenêtre.
- Contrôle de chevauchement des composés entre le contenu MGR extrait (Figure 12) et le contenu DG extraire et exclure outre MGR analyse du contenu des composés qui se chevauchent.
Representative Results
Un workflow schématique énumérant les étapes expérimentales pour l’identification de métabolite putatif dans les sécrétions de la glande de explodens c. est illustré à la Figure 13. En outre, un aperçu schématique des principales parties du corps de fourmis ouvrières COCY utilisés pour l’expérience présentée est fourni comme complémentaire Figure S1 A, B. Les principales étapes de la dissection des fourmis jusqu'à identification métabolite putatif dans le contenu MGR sont illustrés dans la Complémentaire Figure S2.
Pour isoler le contenu MGR d’analyse volatilome, un État refroidi a été maintenu tout au long du transport, de stockage et également pendant le processus de dissection. À cette fin, les fourmis ont été gelés immédiatement après leur collection à l’aide d’un aspirateur insectes (article 1 et Figure 1) in situ. Après l’entreposage pendant 2 jours dans un congélateur à-20 ° C, les échantillons de fourmis ont été transportés sur glace en Autriche, où ils ont été immédiatement mis à-80 ° C jusqu'à l’analyse plus loin. Fourmis apte à être choisi pour l’isolement de leur contenu MGR présentent une région de gaster, qui est ronde et intact (Figure 2 a) et dans le meilleur des cas bien garnie avec contenu MGR, comme en témoigne le MGR visible entre les tergites (Figure 2 b). Gasters des fourmis qui ne conviennent pas pour une analyse ultérieure sont indiquées dans la Figure 2, D. Les étapes principales (étapes 2,3-2,6) impliqués dans le processus d’isolation du contenu MGR de fourmis COCY sont illustrées à la Figure 3. Le contenu MGR isolé (jaune dans le cas de c. explodens, mais les couleurs varient du blanc au rouge chez d’autres espèces appartenant au groupe COCY) est affiché à la Figure 14.
Quand les fourmis pour leur contenu MGR de dissection, veillez à ne pas percer ou se rompre à n’importe quel autres glandes ou les intestins (étape 2.5). La figure 4 montre un gaster disséqués fourmi qui contient encore les deux autres, glandes intactes (DG et VG) après l’isolement du contenu MGR. Un exemple de contamination visible par le contenu de l’intestin de fourmi est illustré à la Figure 15. Étant donné que la contamination croisée avec le contenu DG, situé sous le MGR, impossible d’éviter complètement, une partie du protocole est représentée pour analyser ces glandes pour la comparaison des signaux qui en résulte avec les signaux de l’extrait de contenu de MGR (Section 6). Lorsque la procédure de la dissection est faite de façon appropriée, il est possible d’obtenir environ 0,75 à 1,2 mg de contenu MGR par ant. Pour le protocole décrit ici, contenu MGR de cinq fourmis ont été regroupées pour recevoir des échantillons répétitives de 3,9 à 5,9 mg chacune.
Le contenu du réservoir isolé de la glande ont été extraites avec EtOAc (Section 3) et analysé par GC-MS (Section 4). La mesure de l’extrait de contenu MG de fourmis ouvrières c. explodens se traduit par un chromatogramme comprenant des pics et des spectres de masse pour des dizaines de composés de contenu du MGR putatifs (Figure 5). Les deux métabolites dominante 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-éthanone (ID 4) et 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (5 ID) dans l’extrait de contenu MG due colonne une surcharge, ce qui explique pourquoi le même échantillon a été analysé à nouveau à un niveau plus élevé split ratio de 50 : 1 ( Figure 5, encart). La contamination croisée possible du contenu par les constituants de la DG MGR par exemple, serait visible comme des pics supplémentaires dans le chromatogramme de GC-MS présentant RTs tardive, à partir d’environ minute 29 (Figure 12). À l’exclusion des pics chromatographiques et les spectres de masse des composés se trouvent également dans le traitement solvant-blanc, originaire de la phase stationnaire de la colonne GC, ou du contenu de la DG présente dans le gaster fourmi et ultérieur avec le MetaboliteDetector logiciel a entraîné environ 110 composés de contenu de MGR avec un signal/bruit ratio ≥ 10. Ultérieure d’annotation de métabolite et d’identification avec le logiciel MetaboliteDetector, les chromatogrammes ont été étalonnés et les valeurs de RI ont été déterminées pour les fichiers d’exemple mesurée (étape 5.3 et sous-étapes, Figure 6, Figure 7 , Figure 8 , La figure 9). Les métabolites de contenu MGR putatifs détectés ont été annotées, basé sur une combinaison de similitude de spectre pour la NIST-library, qui fait partie intégrante du logiciel MetaboliteDetector dans l’exemple présenté (étape 5.4 et sous-étapes, Figure 10 ). En outre, RI valeurs trouvées dans la littérature pour la phase stationnaire identiques ou comparable, épaisseur du film et le diamètre de la colonne GC étaient considérés comme pour l’annotation composée (étapes 5.4.4 et 5.4.5). Après avoir défini des critères de filtrage stricts et la confirmation des RIs et des spectres de masse par l’utilisation des normes, comme cela est expliqué dans la section protocole pour un standard composé (étapes 5.4.7-5.4.15 et Figure 11), il était possible de confirmer l’identité d’environ 10 % des métabolites détectés. Puisqu’un rapport détaillé sur la volatilome du contenu de explodens c. MGR sera publié ailleurs, la présente étude axée sur ces métabolites qui ont déjà été décrite dans une publication précédente par Jones et al. 17 (espèces ci-après dénommée KB02-108 ; Voir également Cook et al. 23). le tableau 1 donne un aperçu de ces composés identifiés.
Figure 1 : schéma du dispositif d’aspiration insecte. Dans un couvercle qui scelle un flacon ou un conteneur, deux trous sont faits, où les deux tuyaux flexibles est mis à travers. L’ouverture d’un tube (T1) qui fait face à l’intérieur de la cuvette est scellé avec un maillage assez fin bloquer les insectes. En outre, les trous sont faits dans le tube pour faciliter l’échange d’air. L’extrémité du tube T2 est étroitement désignait les insectes qui sont aspirés dans le flacon d’échantillonnage en aspirant par le biais de T1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : intacte contre cassé gaster. (A) Intact gaster approprié pour la dissection. Gaster Intact (B) est presque entièrement rempli avec du contenu MGR, convient également pour la dissection. (C) et (D) cassé gasters ant les contenus de MGR éjecté et durci (jaune), éventuellement rompus au cours de la rupture du tégument gaster lors de l’échantillonnage. Ces fourmis sont exclus de la dissection, d’extraction et une analyse plus approfondie. T: tergite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : principales étapes impliquées dans le processus de dissection. (A) séparation de la région de gaster du reste du corps de la fourmi. (B) décolle de l’exosquelette : tergite 1 tergite 2 (C) et tergite 3, après quoi le contenu des appariés MGRs de couleurs jaunes est presque complètement visible (D). (E) retirer le contenu MGR collant à l’aide d’une aiguille de dissection. T: tergite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : gaster Ant après l’isolement des matières MGR. Les deux autres glandes présentes dans le gaster (VG : glande de venin et DG : glande de Dufour) peut être vu. Après le retrait du contenu MGR (restes après que isolement peut être vu en jaune), les deux compartiments doivent rester intactes. Ces glandes peuvent être analysées de la même façon que le contenu MGR. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : chromatogramme de (TIC) courant ionique total représentant de l’extrait de contenu de MGR. Les deux sommets plus abondants de la GC-MS a entraîné plus symétrique en forme de pics chromatographiques, quand un ratio plus élevé de split (50 : 1) a été choisi plutôt que le ratio de 2:1 régulière (voir encart). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : détermination du premier alcane détectable dans le chromatogramme calibrant RI. Le triangle sous le maximum du pic de la première apogée de l’alcane est sélectionné. L’alcane élue à 6,31 min et montre la similitude du spectre plus élevée (ici, « spec. sim ») à l’entrée de la bibliothèque « Alkane_C09 ». Pour confirmer l’identité de l’alcane, le spectre de masse est comparé à une bibliothèque (par exemple, NIST WebBook de chimie22). Dans l’exemple présenté, nonane est identifié par son ion moléculaire avec une valeur m/z de 128. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : étalonnage RI avec l’utilisation d’un mélange standard de n-alcane. Le degré de RI, fichier de données a été ouverte et la fonction de « RI-étalonnage-Wizard » choisi. La correspondance correcte le temps de rétention à la RI représenté dans le tableau d’étalonnage doit être vérifiée. La RT de 6,31 min pour alkane_C09 (nonane) est correctement affichée dans le tableau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : RTs sont affichées dans le tableau de calibrage erroné. Les RTs ne s’affichent pas correctement (soit reproduit par une mauvaise valeur RT ou une valeur manquante de RT affiché sous la forme -1). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : correction manuelle des RTs incorrect dans le tableau d’étalonnage. Les valeurs erronées peuvent être corrigées manuellement en insérant la RT correcte pour l’alcane respectif, comme ici pour Alkane_C39. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : comparaison du spectre de masse du composé choisi aux entrées de NIST-bibliothèque. Après avoir sélectionné l’éluant maximale de crête à 6,16 min (891 RI) et l’activation de la fonction « NIST-recherche » (cercle rouge), une similitude de spectre de 0,99 pour la 2-heptanone est affichée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 11 : identification des métabolites dans l’extrait de contenu de MGR. Le spectre de masse et le FRO provenant de l’éluant composé à 891 RI dans le chromatogramme de l’échantillon sont comparés aux entrées de la bibliothèque interne contenant les RIs et les spectres des composés mesurés de standards. Si le « Score de similarité globale » (OSS, abrévié en métabolite détecteur « Globalement simil. » application de spectre de masse et RI) entre un composé dans la bibliothèque interne et d’un composé dans l’exemple de fichier est ≥ 0,9, le composé est désigné comme « identifié ». Ici, les systèmes d’exploitation entre l’entrée de la bibliothèque interne de la 2-heptanone et l’éluant composé à 891 RI est 0,96, qui se traduit par l’identification de la 2-heptanone dans le contenu MGR extrait. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 12 : superposition des sections de chromatogramme TIC (min 29 min 35) du contenu DG extrait (rouge) et le contenu MGR extrait (bleu). Des pics correspondant au chevauchement des composés (présumés) sont plus élevés dans la DG contenue extrait que dans le contenu MGR extrait ; ces composés potentiellement proviennent de la DG et sont donc considérés comme des contaminants (mineurs) dans le contenu MGR extrait. Dans le cas de l’extrait de contenu MGR c. explodens , les pics chromatographiques provenant d’une contamination de DG putative se trouvent à environ min 29, et cette partie du chromatogramme peut être exclue de l’analyse de la teneur MGR. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 13 : workflow schématique d’échantillons de fourmi à métabolite annotation/identification dans le contenu du réservoir glande extraits après analyse par CPG-SM. Le protocole présenté ici explique les étapes expérimentales tout à partir de l’isolement du contenu par l’intermédiaire de dissection de la fourmi et l’analyse par CPG-SM MGR ainsi que de l’évaluation des données (indiquée en noir). Comme alternative, la sécrétion d’insectes peut-être également être générées et collectées in situ (indiqués en grisé). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 14 : isolé cireux contenus MGR avant l’extraction. (A) le contenu de le deux EMRC colle, mais (B) ils peuvent aussi être séparés après l’isolement. Dans c. explodens, la couleur du contenu MGR est orange-jaune, mais peut varier du blanc au rouge chez d’autres espèces du groupe COCY. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 15 : Illustration d’une sécrétion de MGR isolée contaminé croisée par les constituants de l’intestin de l’insecte (brun). Ces types de MGR isolats sont exclus de l’extraction et analyse approfondie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| ID | Métabolite | Nom trivial | Chaîne d’Inca InCHI | Formule de la somme | ||||||
| 1 | Heptan-2-one | InChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/ h3 6H 2, 1-2H 3 | C7H14O | |||||||
| 2 | n-undécane | InChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3 | C11H24 | |||||||
| 3 | n-heptadécane | InChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3 | C17H36 | |||||||
| 4 | 1-(2,4,6-Trihydroxyphenyl)-éthanone | Monoacetylphloroglucinol | InChI = 1 s/C8H8O4/c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 3-8 12/h2 / 3,10-12 H, 1 H 3 | C8H8S4 | ||||||
| 5 | 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one | Noreugenin | InChI = 1 s/C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5/h2-4, 11, 13H, 1H 3 | C10H8S4 | ||||||
Tableau 1 : les métabolites identifiés dans le EtOAc extraire du contenu MGR isolé des ouvrières mineures c. explodens . Certains métabolites sont présentent.
Figure supplémentaire S1. Vue d’ensemble des parties du corps plus importants appartenant à fourmis COCY (travailleurs mineurs) présentées dans ce manuscrit. (A) The MGRs sont indiqués en jaune. Leur partie gastrale est utilisée pour l’analyse de volatilome. (B) la partie gastrale des RGM est situé sous les tergites 1 à 3. T: tergite. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2. Aperçu schématique de l’expérience présentée. Les principales étapes de la dissection de la fourmi jusqu'à putative identification des métabolites présents dans le contenu MGR sont illustrées. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole complet pour l’analyse de la volatilome du contenu trouvé dans les RGM hypertrophiés des ouvrières mineures c. explodens . Puisque les fourmis utilisées ici pourraient « exploser » et éjecter de leur contenu MGR de manière incontrôlée quand ils sont touchés avec une pince, il est recommandé d’utiliser une technique de collection « douces » comme prévu par un aspirateur d’insectes (Figure 1). Pour certaines espèces de fourmis dont les fourmis COCY, il peut être nécessaire de limiter le nombre maximal de fourmis à cinq individus par flacon de 50 mL, car sinon intoxication des fourmis (p. ex., par accumulation de l’acide formique dans l’espace de tête) peut-être survenir. Pour congeler les fourmis dans le champ, un sac isotherme farci avec des compresses froides surgelés peut-être être utilisé. Les échantillons devraient être rapidement congelés et stockés dans des conditions de refroidissement (par exemple, -20 ° C, les meilleures à-80 ° C), mais il n’est pas recommandé de tuer et de stocker les fourmis dans l’azote liquide, car on a observé une augmentation des dommages de leurs glandes avec cette méthode.
La méthodologie de la dissection présentée tampon - et sans solvant convient pour obtenir le contenu du réservoir cireuse glande mandibulaire, mais aussi des autres glandes présentes dans les fourmis ouvrières congelés. Volatilome analyse de la teneur MGR de explodens c., principaux aspects à considérer lors de la dissection sont un refroidissement continu de la fourmi (étape 2.1.4) et minimiser les contaminations croisées entre des échantillons MG avec d’autres matières de glande/liquides présents dans le gaster de fourmi (étape 2.5, Figure 4et Figure 15). Une fraction considérable des fourmis congelés peut-être être endommagée, soit parce que les fourmis « explosé » lors de l’échantillonnage ou ont été endommagés pendant le transport sur la neige carbonique sur le site de prélèvement d’échantillons au laboratoire. Si la région de gaster est cassée, ces fourmis ne conviennent pas pour une analyse ultérieure (Figure 2, D). Si seulement les antennes et les pattes sont manquantes ou brisées, ces fourmis pourront encore être utilisés pour l’extraction du contenu MGR et une analyse plus approfondie. Étant donné que le contenu MGR de refroidi par explodens c. fourmis ont une consistance cireuse, il est simple de les isoler avec l’utilisation d’aiguilles de dissection (étape 2.5, Figure 3Eet Figure 14). Soins supplémentaires doivent être prises lorsque vous maniez le collant MGR contenu. Il peut s’en tenir à tout ce qui vient en contact physique avec elle et respectera également souvent à la pince de dissection, ce qui augmente le risque de contamination des autres échantillons. Il faut seulement toucher au contenu MGR avec l’aiguille de la dissection et de transférer immédiatement dans les flacons de verre utilisés pour l’extraction (étapes 2.5 et 2.6). En outre, il est recommandé de nettoyer le matériel de dissection avec un mélange de2O MeOH/H lors du basculement entre les fourmis ou glande-types (étape 2.8).
Contenu de la glande d’autres espèces de fourmis peut-être être présents à l’état liquide même pendant le refroidissement avec compresses froides. Dans ce cas, la glande entière, y compris la membrane peut d’abord être isolée et perforée par la suite pour obtenir le contenu. Sécrétions de liquides peuvent également être obtenues à l’aide de pipettes capillaires fines. Avec une longueur moyenne d’environ 4-5 mm (sans antenne), travailleurs de explodens c. appartiennent à des espèces plus petites du groupe COCY. Leur gaster souvent gonflée comprend environ 2 à 2,5 mm de longueur et 1 à 1,5 mm de largeur. Travailleurs des espèces connues pour autant plus grandes du groupe COCY peuvent atteindre une taille d’environ 8 mm de longueur de corps avec une taille d’environ 3 mm de long et 2,5 mm de largeur de gaster. Étant donné que le protocole est bien adapté pour disséquer et étudier les fourmis et gasters de cette taille de différentes espèces de COCY, ici utilisaient des instruments de dissection et microscope peut-être devoir être adapté pour s’appliquer aux petites fourmis ou petits organes. En outre, le nombre de fourmis par échantillon d’analyse peut-être d’augmenter aussi bien.
En disséquant la fourmi pour le contenu MGR, il est critique ne pas d’endommager les autres glandes ou les intestins - dont le contenu peut croisée l’échantillon (étape 2.5, Figure 4 et Figure 15). Dans le cas optimal, après l’extraction du contenu MGR, le DG, ainsi que le VG sont visiblement gardé intact (Figure 4). Des contaminations par le contenu de la DG, qui se trouve sous les RGM, sont difficiles à éviter complètement. Raisons pour cela peuvent également inclure l’interruption partielle de l’intégrité de la glande au cours du transport sur la neige carbonique sur le site d’échantillonnage au laboratoire. Il est également possible que les DG sont endommagés lors de l’échantillonnage ou en train d’exploser, comme nous avons remarqué pour le MGR dans un certain nombre de fourmis étudiés. Étant donné que le contenu de la DG peut être analysé de la même manière comme le MGR Sommaire (Sections 3 et 4), les résultats peuvent être comparés aux données résultantes après analyse des échantillons contenus MGR (Section 6). Dans le cas de MGR contenus extraits de c. explodens fourmis, les composés figurant également dans la DG commencent à éluer tard dans le chromatogramme (Figure 12). Pour éviter de confondre DG composés pour les constituants MGR, les métabolites respectifs peuvent être exclus de l’analyse. D’études sur les autres espèces de fourmis, il est connu que DGs peuvent également contenir des composés volatils (très)1,24, qui généralement éluer au début de la GC-chromatogramme.
Dans des études antérieures portant sur la composition chimique du contenu MGR de COCY fourmis, fourmis entières ou leurs gasters entiers étaient analysées16,17,18,23, tandis que contenu ici le MGR eux-mêmes ont été obtenues par l’intermédiaire de dissection des fourmis.
Analysant disséqués MGR contenu permet aux enquêteurs effectuer un large éventail d’études biochimiques, y compris l’identification des métabolites qui y figurent. Étant donné que l’étude réalisée ici axée sur l’identification des constituants volatils contenus dans le MGR de c. explodens, GC-MS a été choisi pour son analyse (Section 4). Pour ce faire, les extraits doivent idéalement être mesurés immédiatement après la préparation ou conservés à-80 ° C jusqu'à l’analyse. Il est à noter que le stockage (étendu) peuvent entraîner des altérations chimiques des extraits (voir les Notes après les étapes 3.3 et 4.2). Étant donné que la concentration du contenu MGR peut couvrir une gamme de plusieurs ordres de grandeur, il peut être nécessaire d’analyser les extraits MGR à différent GC fractionner les ratios. Étant donné que les deux principaux composés dans le contenu MGR extrait des fourmis pris pour illustrer le protocole due colonne surcharge lorsqu’un rapport de 2:1 split a été utilisé, cet échantillon a été analysé une deuxième fois à un ratio plus élevé de la scission de 50 : 1 (étape 4.3.1.2and Figure 5). Les GC-MS des paramètres présentés à la Section 4 conviennent aux données obtenues avec les appareils de la GC-MS spécifiés dans la Table des matières. À côté de la RI calibrants (étape 4.1.1), un solvant-blanc (étape 4.1.2) devrait également être analysé afin de reconnaître les artefacts non biologiques et contaminants pendant l’analyse ultérieure des données. Pour l’identification des métabolites, il est aussi important de mesurer les normes authentiques de composés annotés dans les mêmes conditions de GC-MS que celui utilisé pour analyser les extraits d’échantillons (suivant étapes à 5.4.7and). Afin d’améliorer l’exactitude et la fiabilité des données finales, il est recommandé d’analyser au sein de la même séquence de mesure sur toutes les catégories de l’échantillon (solvant-blank, RI calibrants, extraits d’échantillons et les normes). En outre, les normes authentiques doivent être analysées à une concentration comparable à celle observée pour les extraits d’échantillons. Cela permet d’améliorer l’exactitude des valeurs de RI et la similitude entre l’échantillon et les spectres de masse standards, qui mènent finalement au métabolite accrue et plus significative annotation/identification. À cette fin, les normes peuvent être à plusieurs reprises mesurés à l’aide de facteurs différents split.
Pour l’identification des métabolites, le logiciel sophistiqué, MetaboliteDetector est utilisé pour la comparaison de déconvolution et RI et spectres de spectres à une mise en œuvre NIST-bibliothèque ainsi qu’une bibliothèque interne établie (article 5). Il est recommandé d’exécuter le MetaboliteDetector sur un 64 bits basé sur LINUX système d’exploitation (p. ex., KUBUNTU) et de copier le produit *. Fichiers de données CDF (étape 4.4) depuis le périphérique de stockage de données portable sur le disque dur local. MetaboliteDetector est capable d’importer des fichiers RAW au format netCDF centroïde ou profil GC-MS. Le logiciel de la plupart des instruments de GC-MS devrait être en mesure de convertir les données brutes enregistrées dans ce format19. Avant de commencer l’analyse des données, il est fortement recommandé de lire la documentation disponible pour les versions précédentes du logiciel MetaboliteDetector pour vous familiariser avec les fonctionnalités et l’interface utilisateur graphique19,25, 26.
Pour l’étalonnage de RI et calcul de la valeur RI subséquente des pics composés présents dans les extraits d’échantillons, une bibliothèque contenant les RIs et les spectres des calibrants RI (ici, n-alcanes) est utilisée. Cette bibliothèque peut être autonome établie, ou un préexistant (« CalibrationLibrary_Alkanes ») peut être téléchargé27. La bibliothèque de degré par défaut fourni contient RIs et spectres pour les n-alcanes allant de C09 à C39 qui ont été analysées comme décrit à la Section 4. La bibliothèque fournie permet aux utilisateurs qui travaillent avec détecteur de métabolite de commencer directement par le processus d’étalonnage de leurs données. Si nécessaire, cette bibliothèque peut être étendue avec des entrées supplémentaires pour les autres alcanes. Annotation ou l’identification des composés basés sur la similitude de référence et les RIs expérimentalement dérivées et les spectres de masse (voir étape 5.3 et les étapes intermédiaires, Figure 7, Figure 8, Figure 9), peut être réalisée (étape 5.4 et sous-étapes, La figure 11). Il est également crucial qu’après traitement automatisé des données avec MetaboliteDetector, l’utilisateur vérifiera manuellement pour pic bonne cueillette et spectre déconvolution en inspectant les spectres de masse qui sous-tend le « triangle » pour chaque composé putatif d’intérêt. En outre, selon l’instrumentation GC-MS et les paramètres utilisés pour la génération de données, les adaptations des paramètres MetaboliteDetector présentés peuvent être nécessaires. Le logiciel MetaboliteDetector est capable d’effectuer de nombreuses opérations plus utiles que l’expliquer dans ce manuscrit, par exemple, l’affichage des chromatogrammes (EIC) actuels d’ion extrait, exportation des chromatogrammes comme .csv, lot-quantification automatique des composés et bien d’autres.
Le protocole présenté dans ce manuscrit peut servir de suggestion pour les expériences réalisées par d’autres chercheurs, en se concentrant sur l’isolement des glandes ou contenu de la glande d’insectes, volatilome analyse, ainsi que d’identification métabolite.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Financement de cette étude a été obtenue par le biais de la Vienne Science et Technology Fund (WWTF) LS13-048 pour la DSI. Remerciements spéciaux à Diane W. Davidson (Université de l’Utah ; maintenant la retraite) pour nous faire partager ses connaissances sur les fourmis Bornean COCY. Nous apprécions les administrations de le Kuala Belalong Field Studies Center (KBFSC) et Universiti Brunei Darussalam (UBD) d’approbation du projet ainsi que du Brunei Département des forêts et du Brunei recherche et Centre d’Innovation pour obtenir la permission de recueillir des fourmis et approbation et délivrance de permis d’exportation. Remerciements spéciaux à DLUO et KBFSC personnel, notamment Mohammed Salleh bin Abdoullah Bat, Teddy Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, Chan Chin Mei et Kushan Tennakoon pour faciliter nos recherches.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP | Sarstedt | 62,559,001 | see Figure 1 in manuscript |
| PVC Tubings | Rehau | 290 4489 | see Figure 1 in manuscript |
| Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size | Antstore | 1000378 | see Figure 1 in manuscript |
| Freezer | Severin | KS 9890 | -20 °C or lower |
| polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm | Thorsten Koch | 4260308590481 | |
| Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm | Aldrich | BR455742 | |
| Cold pack 150 mm x 100 mm | Elite Bags | 1998 | freeze to -20 °C |
| Bucket with crushed ice | |||
| 1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening | La-Pha-Pack | 11090500 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151799 | |
| Stereomicroscope | Bresser | 5806100 | |
| Forceps, Superfine Tip curved | Medizinische Instrumente May, Norman May | PI-0005B | |
| Forceps, Superfine Tip straight | blueINOX | BL-3408 | |
| Dissection needle 140 mm, pointed, straight | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110301 | |
| Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën | fisher scientific | 15654740 | |
| Distilled water | |||
| Rotizell-Tissue-Tücher | Carl Roth GmbH + Co.KG | 0087.2 | |
| Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % | Carl Roth GmbH + Co.KG | 4442.1 | freeze to -20 °C |
| Vortex Genie 2 | neoLab | 7-0092 | |
| 0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip | La-Pha-Pack | 06090357 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum, 45° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151819 | |
| Alkane standard solution C8-C20 | Sigma-Aldrich | 04070 | |
| Alkane standard solution C21-C40 | Sigma-Aldrich | 04071 | |
| n-Hexane SupraSolv | Merck | 104371 | |
| GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister | Gerstel | ||
| Agilent Gas chromatograph 6890 N | Agilent | ||
| Gooseneck splitless Liner | Restek | 22406 | |
| Helium (5.0 - F50) | Messer | 102532501 | |
| GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent Mass Selective Detector 5975B | Agilent | ||
| MSD ChemStation Data Analysis Application software | Agilent | ||
| MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| Calibration Library for MetaboliteDetector | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| MD Conversion Tool for NIST-library | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 |
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