Summary
개미 종 Colobopsis explodens 의 작은 노동자는 가스 크로마토그래피-질량 분석에 의해 이후 용 매 추출 및 분석에 대 한 그들의 hypertrophied 악의 선 저수지에 저장 된 왁 스와 같은 콘텐츠를 분리 해 부. 주석 및 오픈 소스 소프트웨어 MetaboliteDetector를 사용 하 여 휘발성 성분의 식별도 설명 되어 있습니다.
Abstract
이 원고의 목적은 개미의 보' 폭발' Colobopsis cylindrica (COCY) 그룹에 속하는 metabolomic 분석을 설명 하는 프로토콜을 제시 하는 것입니다. 이 위해 모델 종 C. explodens 는 사용된. 작은 노동자 계급에 속하는 개미 독특한 hypertrophied 악의 샘을 (MGs)를 소유한 다. 영토 전투, 그들은 사용 하 여 그들의 확대 악의 선 저수지 (MGRs)의 점성 내용 특성 자살 '폭발' 자발적인 파열에 의해 gastral 외피 (autothysis)의 라이벌 절지동물을 죽 일. 우리가 보여 작업자 개미 왁 스 같은 MGR 내용으로 후속 가스와 거기에 포함 된 휘발성 화합물의 용 매 추출에 필요한 필요한 단계를 나열의 gastral 부분의 절연에 대 한이의 해 부 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS) 분석 및 추출 물에 포함 된 metabolites의 putative 식별. 해 부 절차와 MGR 내용의 화학 성분의 변화를 최소화 하기 위해 해 부 버퍼 솔루션의 사용 없이 냉각된 조건 하에서 수행 됩니다. 포함 된 휘발성 metabolites의 추출 용 매 기반, 후 사출, 액체, MS, GC를 통해 샘플을 분석 하는 데 필요한 단계는 제공 됩니다. 마지막으로, 데이터 처리 및 오픈 소스 소프트웨어의 사용과 상 상속 대사 산물 식별 MetaboliteDetector 표시 됩니다. 이 방법을 프로 파일링 및 식별에는 COCY에 속하는 개미의 MGRs 휘발성 대사 산물의 GC-MS와 가능 하 게 하는 MetaboliteDetector 소프트웨어를 통해 그룹.
Introduction
여기에 제시 된 워크플로의 전반적인 목표는 곤충의 분 비에 화학 성분의 일반적인 조사입니다. 이것은 전체적으로 분 비 또는 단일 화합물 그의 생태 역할 elucidating의 기본 목표와 함께 이루어집니다. 또한, 우리는 각각 분 비에서 발견 화합물을 기본 대사 경로 조사 하 고 관심이 있습니다. 개미 (Hymenoptera, Formicidae)에서 특히 동맥 내용을 지금 까지는 미개척된 잠재적으로 bioactive 화합물 (접착제, 항균, 등)1, 의 소스를 제공 하기 때문에 지난 몇 년 동안에서 관심 상승 얻고 있다 2. COCY 그룹3,4 에 속하는 일부 종족의 사소한 작업자 개미 gaster5,6는 mouthparts에서 확장 하는 그들의 hypertrophied MGRs에 포함 된 이러한 화합물을 제공할 수 있습니다. 상 상속 적에 의해 위협 될 때 작은 C. explodens7 의 노동자와 일부 관련 종 만들 수 있는 특이 한 방법으로 그들의 관리자의 사용 내용: 그들은 파열 그들의 gastral 벽의 끈적끈적한 콘텐츠를 추출 하 여 자신을 희생는 MGRs는 상대에 폭발적으로 상 상속 적 억류 되 고 심지어 수 있습니다 그러자 죽을5,6,,89. 개발의 목적 및 본 제시 방법의 사용이 개미 분 비의 가칭 독성 성분의 자연과 화학 성분의 이해를 개선 하는 데 했다.
이 위해, 선물이 그들의 왁 스 같은 MGR 내용 다음 용 매 추출 및 GC-MS 분석의 gastral 부분을 얻기 위해 C. explodens 작업자 개미의 해 부에 대 한 프로토콜.
GC-MS 분석 프로 파일링 및 곤충에서 휘발성 대사 산물 (volatilome)의 식별에 대 한 확고 한 방법 중 하나입니다. 개미에 대 한 관심의 일반적인 analytes cuticular 탄화수소10, semiochemicals11를 포함 하 고 일반적으로, 생물 학적 활동12화합물. 전체 동물 또는 신체 부위 및 곤충13,14의 해 부를 통해 고립 된 체액에서 샘플을 얻을 수 있습니다. 샘플 준비 기술 포함 용 제14 또는 헤드 스페이스-솔리드-위상-미 (HS-SPME)15의 사용과 거기에 포함 된 metabolites의 추출.
Metabolomic 연구는 샘플 냉동 빠르게 직접 샘플링, 후 화학 성분 및 화합물의 양을 최소화 하기 위해 생명 이다. 이 연구에 대 한 사용 개미 급속 동결 현장 deep-frozen 차가운 팩으로 채워진 멋진 가방에 의해 사망 했다. 샘플 다음 드라이 아이스에 실험실에 수송 되었다 그들은 전에 발전기 구동 전기를 사용 하 여-20 ℃ 냉동 고에 저장 되었다. 여기 해 부 절차로 다른 COCY 종16,,1718전에 완료 되었습니다 전체 개미 나는 gaster는 전체적으로 분석 하지 않고 MGR 내용을 분리 가능성을 제공 합니다. 또한, 제시 프로토콜 또한 수 있습니다 직접 액세스 및 주변 동맥 및 조직, 독 동맥 (VG)5,8, 조용의 선 (DG)8, 또는 다른 생물학 연구에서 또는 내장의 분석 확인 가능한 교차 오염 처리 또는 개미의 해 부 동안에 소개 합니다. 녹고 샘플 또는 화학 물질을 사용 하 여 해 부, 동안 MGR 내용의 화학 성분의 변화를 최소화, 해 부 과정은 최적화에 감기에 팩 (-20 ° C), 어떤 추가 버퍼를 사용 하지 않고 실시 하 세척 솔루션, 또는 용 매입니다. 이 방법을 통해 얻은 샘플은 질적, 양적 질문 적합 합니다.
상 상속 대사 산물 주석 및 식별을 위해 데이터 분석 MetaboliteDetector19, 대사체학 GC-MS 기반 데이터의 자동 분석을 위해 개발 된 오픈 소스 소프트웨어를 통해 이루어집니다. Chromatograms에 단일 이온 봉우리 deconvolution 단계를 수행 하 고 deconvoluted 질량 스펙트럼 분석된 샘플에 포함 된 화합물의 추출 검색. MetaboliteDetector로 화합물의 상 상속 식별은 deconvoluted 질량 스펙트럼의 유사성 뿐만 아니라 결정된 보존 인덱스 (RI, 소프트웨어에 의해 자동으로 계산 Kovats 리 수)를 기반으로 합니다. RI 및 스펙트럼 일치 요소 (가져올 수 있는, 일반적인 NIST 형식에 있는 경우) 하거나 기존 참조 라이브러리, 또는 설립된 사내 도서관에 대 한 크로스 체크 될 수 있습니다. 어디에 두 개의 독립적이 고 직각 데이터의 최소 식별을 위해 (putative) 화합물, 예를 들어, 여는 화학 분석 작업 그룹 (CAWG) 대사체학 표준 이니셔티브 (MSI)의 지침에 따라 이것이 본격적인 화합물을 기준으로 (여기 보존 시간 (RT) /RI 및 질량 스펙트럼)에서 분석 비 소설 대사 산물 식별20를 확인 하는 필요에 따라 제안 하는 동일한 실험 조건.
COCY 모델 종 C. explodens, MGR에 완전 한 실험을 실시 하지만 절 개 단계 또한 개미 gaster에 다른 샘을 적용할 수 있습니다. 또한, 우리 MGR 콘텐츠를 추출, 설명 하는 워크플로 일반적인 부분의 volatilome의 포괄적인 분석을 위한 프로토콜을 제시 하는 동안 GC-MS 측정 및 데이터 평가 또한 사용할 수 있습니다 분석 (상 상속) 일반적으로 휘발성 metabolites의 식별입니다.
이 원고에 설명 된 실험 곤충에 수행 됩니다, 이후 윤리적 승인이 요구 됩니다. Universiti 브루나이, 브루나이 연구와 혁신 센터 및 브루나이 임업 부, 브루나이 통해이 프로젝트를 통제 하는 지침에 따라 현장 작업, 개미, 게시에 대 한 그들의 사용의 샘플링은 다입니다.
Protocol
1입니다. 개미의 컬렉션
- 흡 인기 (그림 1)의 사용으로 작은 노동자 개미를 수집 합니다.
- 샘플링, 직후-20 ° C에서 급속 동결 하 여 개미를 해결 하 고 분석까지 이것 또는 낮은 온도에서 그들을 저장 합니다.
2. 절연 MGR 내용과 개미에서 DG의
- 개미의 해 부 하기 전에 다음을 준비 합니다.
- 청소 유리 샬레와 메탄올-물 혼합물 (MeOH/H2O; 1 + 1 v/v)를 사용 하 여 조직 해 부 악기.
주의: MeOH 인 간에 게 독성이 있다. 항상 적절 한 장갑, 랩 코트와 고글, 착용 하 고 연기 후드 청소를 수행. - 감기 팩 및 유리-20 ° c.를 페 트리 접시 고정
- 1.5 mL 짧은 스레드 튜브 실리콘/소계 (PTFE) septa와 나사 모자 등의 대 중을 확인 하 고 현미경 옆 직접 얼음에 그들을 유지.
참고: 샘플 유리병의 선택 사항입니다. 여기, MGR 내용은 유리 냉각된 1.5 mL 튜브에 직접 배치 됩니다. 플라스틱 화합물 (예: phthalates) 아티팩트를 대상 대사 산물의 신호에 방해가 발생할 수 있습니다 포함할 수 있습니다. - 압출된 폴리스 티 렌 거품으로 만들어진 상자에 냉동된 냉 팩을 놓습니다. 감기 팩 위에 페 트리 접시를 놓고 요리에 냉동된 개미를 넣어. 스테레오 현미경 상자를 탑재 합니다. 모든 개미는 명확 하 게 볼 수 있습니다 때까지 확대 (20-40 X) 및 초점을 조정 합니다.
- 청소 유리 샬레와 메탄올-물 혼합물 (MeOH/H2O; 1 + 1 v/v)를 사용 하 여 조직 해 부 악기.
- 그것의 gastral 구획의 무결성에 대 한 냉동된 개미를 확인 하십시오. 해 부, 그대로 gaster 지역 (그림 2A, B)만 개미를 가져가 라. 플랫 gasters 또는 추가 분석 (그림 2C, D)에서 그들의 몸 표면에 강화 된 MGR 콘텐츠의 개미를 제외 합니다.
- 뾰족한 집게는 propodeum에의 한 쌍을 가진 선택 된 개미를 잡아 (첫 번째 복 부 세그먼트)와 잎 자루 (두번째 복 부 세그먼트)에서 집게의 다른 쌍. 부드럽게 개미 시체 (그림 3A)의 나머지 부분에서 당기고 gaster 영역을 분리 합니다.
- Tergite 4에서 뾰족한 집게로 잡고 지금 분리 된 개미 gaster 수정. 또 한 쌍의 뾰족한 집게와 tergite 1 (는 잎 자루 옆에 위치)을 부드럽게 (그림 3B)와 벗 하 여 그것을 제거. 2와 3 (그림 3C, D) gastral 부분까지 tergites는 MGRs의 위해 이것을 또한 반복 ( C. explodens 노동자 개미에 색깔 노란색 하지만 MG 콘텐츠의 색상 다른 종에 빨간색 노란색 이상 화이트에서 배열할 수 있다) 가장에 대 한 표시 부분입니다.
참고:는 외 골격을 제거 하 여는 MGR의 막 또한 부분적으로 제거 됩니다. - 절 개 바늘을 사용 하 여 부드럽게 gastral 구획 (그림 3E)에서 그들을 긁 적 하 여 짝된 MGRs의 왁 스 같은 내용을 제거 합니다. 만 개미 gaster에 다른 동맥 파열 없이 고립 될 수 있는 MGR 콘텐츠의 그 부분을 제거 합니다. 있다면 더 힘 이나 노력 MGR 콘텐츠 전체에 적용 될, 그것의 불완전 한 제거 (그림 4) 동의 합니다.
- 그들을 만져 부드럽게 해 부 바늘의 팁까지 그들은 그것에 막대기 MGR 내용을 선택 합니다. 다음 알려진 된 냉각된 1.5 짧은 스레드 유리병에 MGR 내용을 전송 대량 포장.
- 에서 제거 하려면 스티커 MGR 내용을 해 부 바늘의 팁, 샘플 유리병의 벽에 바늘 끝을 이동 하 고는 벽에 얼룩. 유리병을 닫고 MGR 내용이 격리 될 때까지 얼음에 그것을 배치.
- 나중에 확인 하기 위해 MGR 콘텐츠 샘플의 가능한 상호 오염 인접 한 DG (6 절)에서 발생 하는 화합물에 의해, 또한 개미, 그들은 여전히 그대로 (그림 4)와 별도 HPLC 유리병에 넣어에서 DGs를 수집 합니다.
- 항상 청소 페 트리 접시와 해 부 악기 MeOH/H2O (1 + 1 v/v), 동맥에서 동맥 또는 개미 개미에서 변경할 때.
- 한 분석 샘플, 저수지 내용 또는 여러 개미의 분 비를 결합 하 여.
참고: 땀 샘 또는 그들의 내용을 분석 한 샘플에 대 한 사용 수가 실험 설계에 따라 달라질 수 있습니다. 여기, MGR 내용 또는 5 개미의 DGs를 하나의 분석 샘플 풀링된 했다.
3. 절연된 선 내용의 용 매 추출
- (여기, MGR 내용 또는 인접 한 샘 5 개미에서 풀링된) 분석 시료의 질량을 결정 합니다.
- 얼음 처럼 차가운 순도 에틸 아세테이트 (EtOAc) 1시 14분의 일정 비율에 추가 w/v 및 소용돌이 냉각 조건; 5 분에 대 한 샘플 여기, thermostated 실험실에서 7 ° C에서 수행.
- 3820 x g 7 ° C에 10 분에 대 한 샘플을 원심과 supernatants 전송 (약 55-75 µ L 5 개미 로부터 얻은 MGR 콘텐츠 추출) 사전 냉각된 1.5 mL로 짧은 스레드 포함 0.1 mL 마이크로-삽입 리 바이 알. 단단히 구멍 및 빨간 고무/PTFE septa 나사 모자와 튜브를 봉인.
참고: 분석 즉시 밖으로 실행 될 수 없습니다, 경우 추출에서 유지-80 ° C까지 분석, 하지만 그것은 냉동/해 동 주기 동안 화학 변경의 위험을 최소화 하기 위해 준비 후 즉시 샘플을 분석 하 것이 좋습니다.
4입니다. GC-MS
- 완전 한 GC-MS 측정 순서에 대 한 1.5 mL 짧은 스레드 유리병에서 각각 다음과 같은 솔루션을 준비:
- RI calibrant 혼합물을 준비 하는 화합물 당 8 mg/L의 최종 농도에 상용 알칸 표준 솔루션을 diluting 하 여 제 초 제를 사용 하 여.
- 용 매-빈 준비 순수 EtOAc 구성 된.
- 1) 용 매-빈, 2) RI calibrant 혼합물, MGR 3) 콘텐츠를 포함 하는 튜브를 추출, 장소와 4) DG 콘텐츠 autosampler 가스 크로마 토 그래프 (GC)에 결합의 냉각된 트레이 (10 ° C)에서 추출 합니다.
참고: 각 유리병 측정 전에 autosampler에 보관 기간을 최소화 하기 위해 추천 된다. MGR 콘텐츠 샘플 같은 중요 한 샘플에 대 한 유리병 분석 직전 autosampler에 배치 될 수 있습니다. - 각 샘플에 대 한 주입 1 µ L aliquot 컬럼에 분리 대상 화합물에 대 한 적합 한 열에 대 한 GC-MS (여기: HP-5 MS UI 열).
- 다음과 같이 보일 수 있습니다 적절 한 GC 매개 변수 설정:
- 캐리어 가스도 헬륨을 사용 하 고 1 mL/분 세트 최대 10 ° C/min의 경사로 의해 다음 2 분 동안 보류와 40 ° C에서 시작 하는 오븐 온도 램프 330 ° C, 7 분의 지속 시간 설정 입구 온도 270 °의 일정 한 열 흐름 설정 C.
- 선택 하 고 필요한 경우 적절 한 피크 모양 귀착되는 GC-MS 주입에 대 한 분할 비율 및 농도 (그림 5)의 화합물에 대 한 조정.
참고: 제시 예에서 그것은 분할의 비율은 2: 1와 splitless 모드에서 RI calibrant 혼합물에 DG 추출 측정 하는 데 필요한. MGR 콘텐츠 추출 물 2: 1의 분할 비율 50: 1에서 두 번째 시간에서 분석 했다. - 보조 온도 350 ° c.를 설정
- 질량 분석기 (MS)의 매개 변수를 다음과 같이 설정: MS 온도 230 ° C 소스, MS 쿼드 온도 150 ° C, 질량 500, 용 매에 낮은 질량 30에서 스캔 범위 지연 4.1 (용 매-빈과 실험 샘플)에 대 한 분 또는 6.1 분 (RI calibrant 혼합물)에 대 한 각각. 약 3 검사/s 스캔 속도 설정 합니다.
참고: MS 매개 변수, 특히는 MS 스캔-, 샘플링 레이트, 사이클 시간 피크 따기와 스펙트럼 deconvolution에 영향을 미칠 수 있습니다 그리고 MetaboliteDetector 소프트웨어를 사용 하 여 적절 한 데이터 평가 대 한 매개 변수 설정을 선택할 때 고려 되어야 한다.
- 다음과 같이 보일 수 있습니다 적절 한 GC 매개 변수 설정:
- 측정 완료 되 면 데이터를 내보냅니다. AIA는 휴대용 데이터 저장 장치에 파일 (GC와 함께 제공 하는 데이터 분석 소프트웨어의 사용과 여기를 수행)를 프로젝트.
- 파일을 선택 | Aia는 형식... 데이터 내보내기, 다음 새 디렉터리를 만들기를 확인 하 고 확인을 클릭 합니다. 원하는 저장 위치 (예를 들어, USB 플래시 드라이브)를 선택 하 고 열기를 클릭 합니다. 파일 내보낼 수 고 ---> 아이콘을 선택 합니다. 확인 프로세스를 클릭 합니다.
5. 대사 산물 검출 및 MetaboliteDetector 소프트웨어를 사용 하 여 식별
- 데이터 파일의 분석을 시작 하기 전에 MetaboliteDetector, 도구를 선택 | 설정, (MetaboliteDetector의 개별 시트는 굵게 표시 됩니다) 다음과 같이 필요한 매개 변수를 설정:
- 시트 모양에서 분 시간 규모를 설정 하 고 축 레이블 옵션을 사용 합니다.
- 시트 Deconvolution을 최대 설정에 대 한 매개 변수를 설정: 피크 임계값: 10, 및 최소 피크 높이 (소음 단위): 10. 초기 조정의 사용 선택을 취소 합니다. 대사 산물을 검출에 대 한 매개 변수 설정: 쓰레기통/스캔: 10, Deconvolution 폭 (검사): 5, 필요한 강도 (기본 피크의 %): 0, 그리고 봉우리의 필요한 번호: 10.
- 시트 식별, 라이브러리 검색 옵션을 설정: 복합 Lib: 'CalibrationLibrary_Alkanes'와 NIST (NIST sqlite 라이브러리는.lbr 형식에 포함 될 수 있습니다). 매개 변수를 다음과 같이 설정: 최대. RI 차이: 10, 커트 오프 점수: 0.9, 순수/Impure 구성: 0.5, 조각 수: 2, 최소 수 동일한 파편.: 1. 사용 lib 확장: 쳤 다; 유사성 점수: 규격 유사성; 질량 필터: 207, 221, 281, 355, 및 1147 (GC 열의 고정 단계에서 발생 하는 알려진된 오염 물질)에 대 한 m/z.
- 시트에 정량화 는 매개 변수를 설정: 정량화 이온의 수: 후속 이온 사이의 3, 최소한의 거리: 5, 그리고 최소한의 필요한 품질 지: 1. 207, 221, 281, 355, 및 1147 정량화 이온을 제외.
참고: 높은 해상도 MS 데이터, 경우 또한 다음 매개 변수를 설정 시트에서에 중심 : 피크 임계값 시작: 10, 피크 임계값 끝:-5, 그리고 최대한 기준선 거리: 30, FWHM: 0.5.
- 가져오기 파일에는. CDF 형식에는 생성 된 포함 된입니다. 으로 aia는 프로젝트 파일입니다. 파일을 선택 하 여 MetaboliteDetector 소프트웨어에 NetCDF | 가져오기 | NetCDF 가져오기. 폴더 모양의 아이콘을 선택 하 고 다음 샘플 범주를 가져오고 처리에 대 한 파일 선택: 1) 용 매-빈, 2) RI calibrants, 3) MGR 콘텐츠 추출, 및 4) DG 콘텐츠 추출. 확인 데이터 처리 시작을 확인 합니다. 처리 후, 나타나는 창에 가까운 선택 합니다.
- RI 교정 및 MGR 추출 물에 포함 된 화합물에 대 한 RI 값의 결정에 대 한 파일을 선택 | 오픈 RI calibrants의 데이터를 포함 하는 파일을 선택 하십시오.
- RI calibrant 파일을 연 후 돋보기 아이콘을 선택 합니다. 나타나는 확인창을 확인 합니다.
- 적절 한 리 교정에 대 한 RI calibrant 파일에서 감지 알칸의 범위를 확인 합니다.
- 이 위해, 그것에 한 번 클릭 하 여 감지 (최저 RT, 그림 6)와 함께 첫 번째 알칸에서 발생 하는 첫 번째 피크의 최대 아래 나타나는 삼각형을 선택 합니다.
- 가장 높은 스펙트럼 유사성으로 히트 확인 (' 규격 sim.', 최대 점수 = 1) 알칸 라이브러리 항목 (그림 6)에 비해.
- 문학, 예를 들어, NIST 화학 WebBook22에서 주어진 질량 스펙트럼에는 질량 스펙트럼을 비교 하 여 제안된 알칸 화합물의 id를 확인 하려면 있습니다.
- 알칸 피크는 크로마에 나타나는 마지막 계산 하 여 마지막 알칸 RI calibrant 혼합물에서 감지를 결정 합니다.
- RI 교정에 대 한 도구를 선택 | RI-교정 마법사. 다음을 선택 합니다.
- 폴더 모양의 아이콘으로 클릭 하 고 RI calibrant 혼합물의 크로마를 포함 하는 파일을 선택 합니다. 다음을 선택 합니다.
- 나타난된 창에서 알칸 calibrants에 대 한 항목이 포함 된 라이브러리를 선택 합니다.
- RI calibrant 파일에서 모든 알칸 감지의 라이브러리 항목을 선택 하 고 클릭 합니다 >> 아이콘. 선택한 후 >>, 다음선택.
- RTs 나타나는 테이블에 각 감지 알칸에 대해 나열 된 확인 하십시오. 이 위해 각각 삼각형 (그림 7)에 클릭 하 여 각 알칸 대 한 주 창에 표시 하는 RTs를 확인 하십시오. 드롭-다운 메뉴를 선택 하 고 정확한 실시간 또는 제안 선택 키보드 (의 도움으로 RT에 입력 필요 (그림 8), 각 필드를 두 번 클릭 하 여 수동으로 교정 테이블에서 RT를 해결, 그림 9)입니다.
- 각 알칸 대 한 RT 올바른 경우 다음을 선택 합니다. 다음 에 나타나는 창 리 보정 테이블 표시를 클릭 합니다.
- 그린 + 기호가 나타나는 크로마 선택 창에서 용 매-빈의 데이터 파일 선 파일 추출, 선택 선택 하 고 . 다음과 같이 나타나는 창에서 매개 변수 설정을 설정: 기준 조정의 비활성화, 피크 임계값: 5, 최소한의 피크 높이: 5, 쓰레기통/스캔: 10, 그리고 Deconvolution 폭: 5. 충돌 다음 및 다음 시작 의 RI 계산을 수행 하 선택한 예제 파일에 포함 된 화합물입니다.
- 주석 및 MGR 추출에서 선택한 대사 산물의 식별, 측정된 MGR 콘텐츠 추출에 RIs는 계산 (5.3.9 단계) 위에서 설명한 대로의 데이터 파일을 열고 파일을 선택 하 여 | 오픈 원하는 데이터 파일을 선택 하 고.
- 도구를 선택 | 설정 | Deconvolution 5 최소 피크 높이 (소음 단위) 둘 다로 서 피크 임계값을 변경 하 고. 돋보기 아이콘을 선택 하 고 확인을 다시 나타나는 경고 창 확인.
- 관심의 최대의 최대 아래 나타나는 삼각형에 클릭 하 고 NIST 아이콘을 선택 하 여 NIST 라이브러리에 저장 하는 것 들과 그것의 질량 스펙트럼을 비교.
- NIST-검색 (그림 10)의 첫 번째 결과 히트를 선택 합니다.
- 관심의 화합물의 결과 스펙트럼 유사성이 선택한 스펙트럼 유사성 점수 보다 (여기 ≥ 0.9) (GC, 필름 두께 및 열 비슷한 고정 된 단계에 대 한 RI를 조회 NIST 항목 (그림 10)에 비해, 직경)이이 화합물을 (예를 들어, NIST 화학 WebBook22) 문학에 대 한.
- NIST 참조 RI (또는 여러 RI 값 주어진 평균된 RIs) 사이의 상대적인 차이 실험적으로 파생된 RI를 계산 합니다. 차이 또는으로 화합물을 지정 하는 값 보다 작은 사용자 지정 최대 용납 (여기, ≤ ± 1%), ' 주석 첨부 '.
- MGR 샘플 파일에 포함 된 관심의 모든 화합물에 대 한 5.4.2–5.4.5 단계를 반복 합니다.
- 화합물의 식별에 대 한 RI 및 표준 솔루션의 질량 스펙트럼을 비교 (예를 들어, 2-100 mg/L) 주석된 화합물의 섹션 4에서 설명한 대로 동일한 조건 하에서 측정.
- 섹션 4에서 설명한 표준 분석 고 알칸 및 MGR 콘텐츠 선 데이터 4.4와 5.2 단계에 설명 된 대로 결과 데이터를 처리 합니다.
- 도구를 선택 하 여 표준에서 획득 데이터 보정 | RI-교정 마법사 | 다음 사용 하기 전에 같은 RI calibrant 파일을 선택 하 고. 다음, 다음 다시 다음 선택 데이터를 포함 하는 파일 취득 표준 솔루션에서 그린 + 기호를 클릭 하 여 합니다. 다음 다음 시작 하 고 표준 화합물에 대 한 RI를 계산 했다.
참고: 표준의 분석 샘플 분석 후 신속 하 게 수행할 수 없습니다, 경우이 좋습니다 RI calibrants를 다시 분석 하 고 표준에 대 한 새로운 RI 교정 및 계산을 수행 하기. - 표준에 대 한 해당 파일을 열고 고의 정체성 NIST 라이브러리의 스펙트럼의 비교 단계 5.4.2에서에서 설명 합니다.
- 표준의 정체성의 확인, 후 질량 스펙트럼과 표준 화합물의 리 내부 라이브러리에 추가 합니다. 이 위해 그린 + 기호에 클릭 하 고 라이브러리 항목의 기본 이름을 입력 합니다. 확인 질량 스펙트럼을 추가 하 고 표준 라이브러리에 화합물의 리와 함께 확인 합니다. 라이브러리에 새 항목을 볼 수 없습니다, 경우 새로 고침 단추를 활성화 합니다.
참고: RI 교정 성공적으로 수행 했다, MetaboliteDetector에 의해 결정 하는 RI 표시 됩니다 해당 라이브러리 항목에. 표준 라이브러리 항목을 만든 후 MG 추출에서이 대사 산물의 식별 RI의 조합에 따라 그리고 스펙트럼 유사도 가능 합니다. - MGR 콘텐츠 데이터 파일을 다시 엽니다. 도구를 선택 | 설정 | 식별. 자, 표준 화합물의 RI 계산 라이브러리 항목에 추가 변경 유사성 점수 스펙트럼 유사성 에서 결합 된 점수.
- 돋보기 아이콘에 클릭 하 고 단계 5.4.5에서에서 화합물 주석이 달린 아래 삼각형을 선택 합니다.
- 히트에 클릭 하 고 '전반적인 유사성 점수'에 대 한 값을 확인 (OSS, 대사 산물 검출기로 ' 전체 simil.' 약식), 스펙트럼 유사성 및 RI 유사성의 조합을 고려 점수 (그림 11).
참고: 히트 사내 도서관에서 발견 되었다, 그것은 메인 윈도우의 오른쪽에 표시 될 것입니다. - 경우는 OSS 사용자 정의 임계값 (여기 ≥ 0.9, 또한 삼각형의 녹색 색상으로 표시), 화합물 '식별된' (그림 11) 지정 합니다.
6. MGR 콘텐츠 추출 DG 콘텐츠에 의해 오염에 대 한 확인
- MetaboliteDetector (단계 5.3.9)로 화합물의 RIs 이미 계산 되어 있다 DG 샘플의 보정된 파일을 엽니다.
- MG 콘텐츠 샘플의 DG 샘플 측정 후 얻은 크로마의 오버레이 선택 도구 | 크로마 오버레이 그린 + 아이콘을 통해 각각 두 개의 파일을 선택 하십시오. 확인확인 합니다.
- 오버레이 보려면 창의 맨 아래에 나타나는 크로마 오버레이 시트를 선택 합니다.
- MGR 콘텐츠 사이 화합물의 중복 확인 (그림 12)를 추출 하 고 DG 콘텐츠 추출 및 추가 MGR 콘텐츠 분석에서 겹치는 화합물을 제외.
Representative Results
C. explodens 의 동맥 분 비에서 상 상속 대사 산물 식별 실험 단계 목록 도식 워크플로 그림 13에 표시 됩니다. 또한, COCY 노동자 개미 제시 실험에 대 한 사용의 가장 중요 한 신체 부분에 대 한 도식 개요 보충 그림 S1 A, B로제공 됩니다. MGR 콘텐츠에서 putative 대사 산물 식별까지 개미의 해 부에서 주요 단계 보충 그림 S2에 설명 됩니다.
MGR 내용을 volatilome 분석에 적합을, 전송, 저장, 전역 하 고 또한 해 부 과정에서 냉각된 상태가 유지 되었다. 이 위해, 개미는 곤충 흡 인기 (제 1과 그림 1) 현장에서의 사용과 그들의 컬렉션 직후 동결 했다. -20 ° C 냉장고에서 2 일 동안 저장 후 ant 샘플 오스트리아, 어디 그들은 즉시 투입 됐다-80 ° C에 추가 분석까지 드라이 아이스에 수송 되었다. 개미 MGR 콘텐츠 격리에 대 한 선택에 적합 한 전시는 라운드 gaster 지역 고 그대로 (그림 2A)와 tergites (그림 2B) 사이의 표시 MGR에 표시 된 대로 MGR 콘텐츠로 잘 갖춰져 최상의 경우에. 추가 분석을 위해 적합 하지 않은 개미의 gasters 그림 2C, D에에서 표시 됩니다. 단계 (단계 2.3-2.6) MGR 내용의 격리 프로세스에 관련 된 COCY 개미에서 그림 3에 설명 됩니다. ( C. explodens, 하지만 색상의 경우 노란색에서에서 배열할 수 있다 백색 COCY 그룹에 속하는 다른 종에 빨간색) 격리 MGR 내용이 그림 14에 표시 됩니다.
때 자신의 MGR 콘텐츠에 대 한 개미를 해 부, 배려 하지 거 나 다른 분 비 또는 창 자 (2.5 단계) 파열을 한다. 그림 4 는 MGR 콘텐츠 격리 후 여전히 두 개의 다른, 그대로 동맥 (DG와 VG)을 포함 해 부 개미 gaster를 보여준다. 개미 내장의 내용에 의해 보이는 오염의 예는 그림 15에 표시 됩니다. MGR, 아래 있는 DG 내용으로 교차 오염을 완전히 피할 수 없습니다, 때문이 동맥의 결과 신호 MGR 콘텐츠 추출 (6 절)에서 신호를 비교 분석 하는 프로토콜의 일부 그려져 있습니다. 해 부 절차 완료 되 면 제대로, 그것은 약 0.75-1.2 얻을 수 개미 당 MGR 콘텐츠 mg. 여기에 설명 된 프로토콜에 대 한 5 개의 개미 MGR 내용은 3.9 5.9 밀리 그램의 반복적인 샘플을 받을 수 풀링된 했다.
절연된 선 저수지 내용은 EtOAc (제 3) 추출 되었고 GC-MS (제 4)에 의해 분석. C. explodens 작업자 개미 콘텐츠 MG 추출의 측정 봉우리와 수십 putative MGR 콘텐츠 화합물 (그림 5)에 대 한 질량 스펙트럼의 크로마 구성에서 발생 합니다. 두 개의 지배적인 metabolites 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-ethanone (ID 4) 및 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (ID 5)는 MG 콘텐츠 추출 열 과부하 발생 같은 샘플 분석 하는 이유는 다시는 더 높은에 분할 비율 50: 1 ( 의 그림 5, 오목). MGR 콘텐츠는 DG의 성분에 의해 가능한 교차 오염을 예 분 29 (그림 12)에서 시작 하는 늦은 RTs 전시 GC-MS 크로마 추가 봉우리로 볼 수 것 이다. 용 매-빈, GC 열의 고정 단계에서 또는 개미 gaster에 DG의 내용에서 원래 및 후속 처리는 MetaboliteDetector와 발견 또한 크로마 봉우리와 화합물의 질량 스펙트럼을 제외 소프트웨어는 신호 소음 비율 ≥ 10를 가진 대략 110 MGR 콘텐츠 화합물 귀착되는. 나중 대사 산물 주석 및 MetaboliteDetector 소프트웨어와 함께 식별는 chromatograms 했다 보정 하 고 RI 값 측정된 샘플 파일 (5.3 단계와 하위 단계,, 그림 6 그림 7 에 대 한 결정 , 그림 8 , 그림 9)입니다. 검색 된 putative MGR 콘텐츠 metabolites NIST-라이브러리, 제시 예 (5.4 단계와 하위 단계, 그림 10에에서 MetaboliteDetector 소프트웨어의 필수적인 부분을 형성에 스펙트럼 유사성의 조합에 따라 주석 했다 ). 또한, RI 값이 동일 하거나 유사한 고정 단계에 대 한 문학에서 발견 필름 두께 직경의 GC 열 고려 되었다 화합물 주석이 (단계 5.4.4 5.4.5)에 대 한. 표준 사용 하 여 엄격한 일치 조건 및 RIs 및 질량 스펙트럼의 확인을 설정한 후 한 표준 화합물 (단계 5.4.7-5.4.15 및 그림 11)에 대 한 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 가능 했다 약 10의 정체성을 확인 하 검색 된 대사 산물의 %입니다. MGR 콘텐츠의 C. explodens 의 volatilome에 대 한 상세한 보고서는 다른 곳에서 출판 될 것입니다, 이후 현재 연구는 존스 외. 여 이전 발행물에 이미 설명 되었습니다 그 대사 산물에 초점을 맞춘 17 (종 여기 KB02-108로 지정, 쿡 외. 참고 23). 표 1 이 확인 된 화합물에 대 한 개요를 제공 합니다.
그림 1: 도식 그리기 곤충 흡 인기의. 물개는 유리병 또는 컨테이너 뚜껑에 두 개의 구멍 만들어집니다, 두 개의 유연한 튜브를 통해 배치 됩니다. 유리병의 내부를 직면 한 튜브 (T1)의 오프닝은 곤충을 차단할 정도로 미세 메쉬 봉인 됩니다. 또한, 공기의 교류를 촉진 하기 위하여 튜브에 구멍이 만들어집니다. 튜브 t 2의 끝은 T1 통해 발음 하 여 샘플링 유리병으로 빨려는 곤충으로 밀접 하 게 지적 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 깨진된 gaster 대 그대로. (A) 그대로 gaster 해 부를 위해 적당 한. (B) 그대로 gaster 거의 완전히 MGR 콘텐츠, 또한 해 부 적합으로 가득합니다. (C) (D) 깨진 개미 gasters 분출과 강화 된 MGR 콘텐츠 (노란색), 가능 하 게 샘플링 하는 동안 gaster 외피의 파열 동안 깨진. 이 개미는 해 부, 추출, 및 추가 분석에서 제외 됩니다. T: tergite입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 단계 해 부 과정에 관련 된 주요. (A) 개미 시체의 나머지 부분에서 gaster 영역의 분리. (B)는 외 골격 벗: tergite 1, tergite 2 (C), 및 tergite 3, 후 짝된 노란 색된 MGRs의 내용이 거의 완전 하 게 표시 (D). (E) 해 부 니 들의 도움으로 스티커 MGR 콘텐츠를 제거. T: tergite입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 개미 gaster MGR 내용의 격리 후. 두 개의 다른 동맥은 gaster에 존재 (VG: 독 동맥, 및 DG: 조용의 선) 볼 수 있습니다. MGR 콘텐츠 (왼쪽-오버 후 노란색으로 격리를 볼 수 있습니다)의 제거 후, 두 구획 여전히 그대로 해야 합니다. 이 동맥은 MGR 내용으로 같은 방식으로 분석할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: MGR 콘텐츠 추출의 대표 총 이온 전류 (TIC) 크로마. 두 개의 가장 풍부한 GC-MS 봉우리 결과 더 높은 분할 비율 (50: 1) 일반 2:1 비율 대신 선정 되었다 때 컬럼에 봉우리를 대칭 모양 ( 삽입참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: RI calibrant 크로마에 첫 감지 알칸의. 첫 번째 알칸 피크의 피크 최대 아래 삼각형 선택 됩니다. 알칸 6.31 분 elutes 고 높은 스펙트럼 유사성 (여기, ' 규격 심 ') 'Alkane_C09' 라이브러리 항목을 보여 줍니다. 알칸 id를 확인 하려면 질량 스펙트럼 라이브러리 (예를 들어, NIST 화학 WebBook22)에 비교 됩니다. 제시 등 nonane m/z 값이 128의 분자 이온에 의해 식별 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: n-알칸 표준 혼합물의 사용과 RI 교정. 데이터 파일을 열 리 calibrant 그리고 선택 ' 리-보정-마법사 ' 기능. 교정 테이블에서 묘사 된 RI에 보존 시간의 정확한 일치 검사 되어야 한다. Alkane_C09에 대 일 분의 RT (nonane) 테이블에 제대로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 잘못 된 RTs 교정 테이블에 표시 됩니다. RTs는 올바르게 표시 되지 않습니다 (중 잘못 RT 값-1로 표시 누락 RT 값의 표시). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: 교정 테이블에 잘못 된 RTs의 수동 수정. 잘못 된 값 각각 알칸에 대 한 올바른 RT를 삽입 하 여 다음과 같이 Alkane_C39에 대 한 수동으로 수정 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10: NIST 라이브러리 항목을 선택 하 신된 화합물의 질량 스펙트럼의 비교. 선택한 후 6.16 분 (리 891) 및 ' NIST-검색 ' 기능 (빨간 원)의 활성화에 피크 최대 방출, 2 heptanone 0.99의 스펙트럼 유사성 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 11: MGR 콘텐츠 추출에서 대사 산물 식별. 질량 스펙트럼과 크로마 샘플의에 리 891에 복합 방출에서 발생 하는 RI RIs 및 측정된 표준 화합물의 스펙트럼을 포함 하는 내부 라이브러리 항목을 비교 합니다. 경우 ' 전반적인 유사성 점수 ' (OSS, ' 전체 simil.' 질량 스펙트럼 및 RI로 대사 산물 검출기에 약식) 사내 도서관에서 화합물과 샘플에서 화합물 사이의 파일 ≥ 0.9, 화합물 '발견'으로 지정 됩니다. 여기, 2 heptanone의 사내 라이브러리 항목 및 RI 891에 복합 방출 사이 OSS 0.96, MGR 콘텐츠에서 2 heptanone 식별에서 결과 추출입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 12: TIC 크로마 섹션 (분 35 분 29)의 DG 콘텐츠의 오버레이 추출 (빨간색)와 MGR 콘텐츠 추출 (블루). 피크 지역 해당 (putative) 화합물을 중복 하는 콘텐츠 관리자 콘텐츠에서 보다 추출 추출; DG에서 높은 잠재적으로이 화합물은 DG에서 발생 하 고 MGR 콘텐츠에서 (작은) 오염 물질 추출로 그러므로 간주 됩니다. C. explodens MGR 콘텐츠 추출 경우 putative DG 오염에서 발생 하는 컬럼에 봉우리 약 분 29에서 찾을 수 있습니다 그리고이 부분의 크로마 MGR 콘텐츠의 추가 분석에서 제외할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 13: 개미 샘플에서 대사 산물 주석/선 저수지 콘텐츠에서 식별에 도식 워크플로 GC-MS 분석 후 추출. 여기에 제시 된 프로토콜 설명 개미와 GC-MS 분석의 해 부를 통해 MGR 내용의 격리에서 시작 하는 모든 실험 단계 뿐만 아니라 데이터 평가 (블랙에 표시). 대 안으로, 곤충의 분 비 생성 하 고 수집 제자리에 (회색에서 표시) 수도 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 14: 밀랍 MGR 내용을 추출 전에 절연. (A) 두 MGRs의 내용을 함께, 하지만 (B) 그들은 또한 수 분리 후 분리. C. explodens, MGR 콘텐츠의 색상 주황색 황색을 띠는, 하지만 COCY 그룹의 다른 종에서 빨간색 흰색에서 범위 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 15: 곤충의 내장 (브라운)의 성분에 의해 교차 오염 된 격리 MGR 분 비의 그림. 이러한 유형의 MGR 분리 추출 및 추가 분석에서 제외 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| ID | 대사 산물 | 찮은 이름 | 인치 문자열 | 합계 공식 | ||||||
| 1 | Heptan-2-하나 | InChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/h3-6 H 2, 1-2 H 3 | C7H14O | |||||||
| 2 | n-Undecane | InChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3 | C11H24 | |||||||
| 3 | n-Heptadecane | InChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3 | C17H36 | |||||||
| 4 | 1-(2,4,6-Trihydroxyphenyl)-ethanone | Monoacetylphloroglucinol | 인치 = 1/C8H8O4/c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 3-7 (8) 12/h2-3,10-12 H, 1 H 3 | C8H8O4 | ||||||
| 5 | 5,7-Dihydroxy-2-methylchromen-4-one | Noreugenin | 인치 = 1/C10H8O4/c 1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5/h 2-4,11, 13 H 1 H 3 | C10H8O4 | ||||||
표 1: C. explodens 보조 작업자 개미 로부터 격리 MGR 내용의 대사는 EtOAc에서 식별 된 추출. 선택한 대사 되 게 됩니다.
보충 그림 S1입니다. COCY 개미 (사소한 노동자)에 속하는 가장 중요 한 본체 부품의 개요가이 원고에 제시. (A)는 MGRs는 노란색으로 표시 됩니다. 그들의 gastral 부분 volatilome 분석에 사용 됩니다. (B)는 MGRs의 gastral 부분 tergites 1 ~ 3 아래 위치 해 있습니다. T: tergite입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림의 S2 준된 실험의 개요 개요. MGR 콘텐츠에 대사 산물의 putative 식별까지 개미의 해 부에서 중요 한 단계는 설명 됩니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 원고에서 선물이 volatilome C. explodens 보조 작업자 개미 hypertrophied MGRs 있는 콘텐츠 분석을 위한 완벽 한 프로토콜. 때문에 여기에서 사용 하는 개미 수 '폭발' 집게와 접촉 하는 때 통제 방식에서 MGR 내용을 추출, 곤충 흡 인기 (그림 1)에 의해 제공 하는 '소프트' 컬렉션 기술 사용 하는 것이 좋습니다. COCY 개미를 포함 한 일부 개미 종, 그것 때문에 발생할 수 있습니다 그렇지 않으면 자기는 개미 (예를 들어, 는 headspace에 포 름 산의 축적에 의해)의 중독 개미 50 mL 유리병 당 5 개인의 최대 수를 제한 해야 합니다. 필드에 개미, 동결에 대 한 멋진 가방 deep-frozen 차가운 팩으로 박제를 사용할 수 있습니다. 샘플을 급속 동결 하 고 냉각된 조건 (예를 들어, -20 ° C,-80 ° C에서 최고)에서 저장 한다 하지만 죽 일 때문에 그들의 땀 샘의 공격력이이 방법으로 관찰 되었다 액체 질소에 개미를 저장 하는 권장 되지 않습니다.
제시 버퍼 및 솔벤트 프리 해 부 방법론은 왁 스와 같은 악의 선 저수지 내용 뿐만 아니라 다른 샘 냉동된 노동자 개미에 얻는 적합 합니다. Volatilome C. explodens의 MGR 콘텐츠의 분석을 위해 절 개 하는 동안 고려해 야 할 주요 측면은 개미 (단계 2.1.4)의 연속 냉각 및 다른 선 내용/유체에 MG 샘플의 교차 오염 최소화 개미 gaster (2.5 단계 그림 4및 그림 15). 냉동된 개미의 상당한 부분을 손상 될 수 있습니다, 때문에 개미가 '폭발' 샘플링 하는 동안 또는 실험실에 샘플링 사이트에서 드라이 아이스에 전송 하는 동안 손상 되었다. Gaster 영역이 깨진 경우 이러한 개미 추가 분석 (그림 2C, D)에 대 한 적합 하지 않습니다. 안테나와 다리 인 없거나 깨진 경우에이 개미는 MGR 내용과 추가 분석의 추출에 대 한 여전히 사용할 수 있습니다. MGR 내용의 냉각 C. explodens 개미 스트레이트-앞으로 해 부 바늘 (2.5 단계, 그림 3E, 그림 14)의 사용으로 그들을 분리 하는 왁 스 같은 일관성을 가질. 추가 관리 콘텐츠 스티커 MGR을 처리 하는 동안 수행 될 필요가 있다. 그것은 그것으로 신체 접촉으로 오고 아무것도에 충실 수 있습니다 하 고 또한 종종 다른 샘플의 오염의 위험을 증가 해 부 집게를 준수 합니다. 그것은 해 부 바늘 MGR 콘텐츠를 터치 하 고 즉시 추출 (2.5 및 2.6 단계)에 사용 되는 유리 튜브에 그것을 전송 해야 합니다. 또한, 개미 또는 선 종류 (단계 2.8) 사이 전환할 때 MeOH/H2O 혼합 해 부 장비를 청소 하는 것이 좋습니다.
다른 개미 종 선 내용을 차가운 팩으로 냉각 중에 액체 상태로 존재할 수 있습니다. 이 경우에, 먼저 멤브레인을 포함 한 전체 선 고립 되며 이후에 콘텐츠 구멍. 액체 분 비 미세 모 세관 펫의 도움으로 얻을 수 있습니다. (안테나) 없이 약 4-5 m m의 평균 몸 길이, C. explodens 의 노동자는 COCY 그룹의 작은 종에 속한다. 그들의 자주 부 어 gaster는 약 2-2.5 m m 길이 및 폭에서 1-1.5 m m 구성 되어 있습니다. 그래서 멀리 가장 큰 알려진된 종의 COCY 그룹의 노동자 약 3 m m 길이 및 폭에서 2.5 m m의 gaster 크기 몸 길이 약 8 m m의 크기를 도달할 수 있다. 때문에 프로토콜 잘 해 부 및 개별 개미와 다른 크기의 gasters 조사에 적합 한 COCY 종, 여기 절 개 악기를 사용 하 고 현미경 작은 개미 나 작은 장기에 대 한 적용할 수 있도록 적응 해야 할 수도 있습니다. 또한, 분석 샘플 당 개미의 수 또한 증가 할 수 있습니다.
MGR 콘텐츠에 대 한 개미를 해 부를 하는 동안 그것은 다른 샘 창 자-는 내용의 수 있습니다 크로스-오염 샘플 (단계 2.5, 그림 4 와 그림 15)를 손상 하지 것이 중요. 최적의 경우 DG, MGR 내용의 추출 후 VG 뿐만 아니라 가시 지켜진다 그대로 (그림 4). 아래는 MGRs 있는 DG의 내용으로 오염은 완전히 피하기 어렵다. 이것을 위한 이유는 실험실에 샘플링 사이트에서 드라이 아이스에 전송 하는 동안 선 무결성의 부분 파괴를 포함할 수도 있습니다. 우리는 다양 한 조사 개미에에서 MGR에 대 한 눈치는 DGs 샘플링 하는 동안 또는 폭발, 과정에서 손상 될 가능성 이기도 합니다. 이후는 MGR 목차 (섹션 3, 4)으로 DG 내용을 같은 방법으로 분석 될 수 있다, 결과 MGR 콘텐츠 샘플 (6)의 분석 후 결과 데이터를 비교할 수 있습니다. MGR 콘텐츠 추출 물 C. explodens 개미 로부터 얻은 경우는 DG에도 포함 된 화합물 elute 크로마 (그림 12)에 늦게 시작 합니다. DG 착각을 방지 하기 위해 MGR 성분에 대 한 화합물, 각각 metabolites 추가 분석에서 제외 될 수 있습니다. 다른 개미 종에 대 한 연구에서 그 DGs 또한 포함 될 수 있습니다 (높은) 휘발성 화합물1,24는 일반적으로 초기에 GC 크로마 elute 알려져 있다.
COCY의 MGR 내용의 화학 성분과 상대 하는 이전 연구에서 개미, 전체 개미 또는 그들의 전체 gasters 했다 분석된16,17,,1823, 반면 여기는 MGR 내용 스스로 개미의 절 개를 통해 얻은 했다.
해 부 MGR 내용을 분석 광범위 한 포함 된 metabolites의 식별을 포함 한 생 화 확 적인 연구를 수행 하는 조사 수 있습니다. 이후 여기에 수행된 연구 C. explodens의 MGR에 포함 된 휘발성 성분의 식별에 초점을 맞춘, GC-MS 분석 (제 4)에 대 한 선정 되었습니다. 이 위해 추출 해야 이상적으로 될 준비 후 즉시 측정 또는 분석까지-80 ° C에 저장. 그것은 (확장된) 저장 (3.3-4.2 단계 후 메모 참조) 추출의 화학 변경 될 수 있습니다 주목 해야한다. MGR 내용의 농도 여러 자릿수로의 범위를 커버 수 있습니다, 이후 그것은 다른 GC 분할 비율에 MGR 추출 분석 필요할 수 있습니다. MGR 내용에서 두 가지 주요 화합물 추출 열 과부하 분할의 비율은 2:1 사용 하는 경우 발생 하는 프로토콜을 예시로 이동 하는 개미, 이후이 샘플 높은 분할 비율 50: 1 (단계 4.3.1.2and 그림 5)의 두 번째 시간을 분석 했다. GC-MS 매개 변수 설정 섹션 4에는 재료의 테이블에에서 지정 된 GC MS 디바이스와 생성 된 데이터에 적합 합니다. RI calibrants (4.1.1 단계), 옆 이후의 데이터 분석 중 생물학적 인 인공 물과 오염 물질을 인식 하도 용 매-빈 (4.1.2 단계)를 분석 합니다. 대사 산물 식별, 그것도 정통 표준 샘플 추출 물 (5.4.7and 다음 단계)를 분석 하는 데 사용 같은 GC-MS 조건 주석된 화합물의 측정 하는 것이 중요. 정확성과 최종 데이터의 신뢰성 향상, 동일한 측정 시퀀스 내에서 모든 샘플 카테고리 (용 매-빈, RI calibrants, 샘플 추출 및 표준)을 분석 하는 것이 좋습니다. 또한, 본격적인 표준 샘플 추출에 대 한 관찰에 비해 농도에 분석 되어야 합니다. RI 값 및 샘플 사이의 마지막으로 증가 하 고 더 의미 있는 대사 산물 주석/식별 이어질 것입니다 표준 질량 스펙트럼 유사성의 정확도 향상 시킬 수 있습니다. 이 위해 표준 반복적으로 측정할 수 다른 분할 요소를 사용 하 여.
대사 산물 식별, 정교한 소프트웨어에 대 한 MetaboliteDetector 스펙트럼 deconvolution 및 RI와 스펙트럼 비교 구현된 NIST-라이브러리에도 설립된 사내 도서관 (5)로 사용 됩니다. 그것은 64 비트 리눅스 기반 운영 체제에 (예를 들어, 쿠분투) MetaboliteDetector를 실행 하 고 복사 하 여 생성 된 것이 좋습니다 *. CDF 데이터 파일 (단계 4.4) 로컬 하드 드라이브에 휴대용 데이터 저장 장치에서. MetaboliteDetector는 중심 또는 netCDF 포맷에 원시 GC-MS 데이터를 가져올 수 있습니다. 대부분 GC-MS 장비의 소프트웨어가 형식19에 기록 된 원시 데이터를 변환할 수 있어야 합니다. 데이터 분석을 시작 하기 전에 것이 좋습니다 읽고 문학을 기능과 그래픽 사용자 인터페이스19,25, 이전 MetaboliteDetector 소프트웨어 버전 26.
RI 교정 및 샘플 추출에 복합 봉우리의 후속 RI 값 계산, RIs와 RI calibrants (여기에서, n-알칸)의 스펙트럼을 포함 하는 라이브러리 사용 됩니다. 이러한 라이브러리 중 하나를 수 자체 설립 또는 기존 한 ('CalibrationLibrary_Alkanes') 다운로드27일 수 있다. 제공 된 기본 calibrant 라이브러리 RIs 및 n-알칸 C39 C09에서 배열 섹션 4에서 설명한 대로 분석을 위한 스펙트럼을 포함 한다. 제공 된 라이브러리 사용자가 직접 그들의 데이터의 교정 과정을 시작 하는 대사 산물 검출기와 작업을 수 있습니다. 필요한 경우,이 라이브러리는 더 알칸에 대 한 추가 항목 또한 확장할 수 있습니다. 참조 및 실험적으로 파생된 RIs 및 질량 스펙트럼 (5.3 단계와 하위 단계, 그림 7, 그림 8, 그림 9참조)의 유사성을 바탕으로, 주석 또는 화합물의 식별 될 수 있습니다 (5.4 단계 및 하위 단계를 수행 그림 11)입니다. 그것은 또한 그 MetaboliteDetector와 자동화 된 데이터 처리 후 사용자 수동으로 확인 합니다 정확한 피크 따기와 스펙트럼 deconvolution 관심의 putative 각 화합물에 대 한 '삼각형'을 기본 질량 스펙트럼을 검사 하 여 중요 한. 또한, GC-MS 계측 및 데이터 생성에 사용 되는 매개 변수 설정에 따라 제시 MetaboliteDetector 설정의 적응은 필요할 수 있습니다. MetaboliteDetector 소프트웨어는.csv, 자동 배치-정량화의로이 원고, 추출 된 이온 전류 (EIC) chromatograms의 예를 들어, 표시, chromatograms의 수출에 설명 보다 많은 유용한 작업을 수행할 수 있는 화합물, 그리고 더 많은입니다.
이 원고에 제시 하는 프로토콜의 분 비 또는 대사 산물 식별 뿐만 아니라 곤충, volatilome 분석에서 선 내용을 격리에 초점을 맞추고 다른 연구자에 의해 수행 하는 실험에 대 한 제안 될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
비엔나 과학 및 기술 기금 (WWTF) LS13-048 ISD 통해 얻은이 연구에 대 한 자금. 특별 한 감사 합니다 우리와 함께 보 COCY 개미에 대 한 그녀의 지식을 공유 하기 위한 다이앤 W. 데이비슨 (유타 대학, 지금 은퇴)로 이동 합니다. 우리 쿠 본관 필드 연구 센터 (KBFSC) 및 프로젝트 승인을 위해 Universiti 브루나이 다 루 살람 (UBD)으로 브루나이 임업 부와 브루나이 연구 및 권한 개미를 수집 하기 위해 혁신 센터의 행정 감사 및 승인 하 고 수출 허가의 발급입니다. 특별 감사는 우리의 연구 촉진을 위한 UBD 및 KBFSC 직원, 특히 무하마드 살 레 빈 압둘라 박쥐, 테 디 Chua 꼬마 리, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, 찬 턱 메이, Kushan Tennakoon로 이동 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP | Sarstedt | 62,559,001 | see Figure 1 in manuscript |
| PVC Tubings | Rehau | 290 4489 | see Figure 1 in manuscript |
| Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size | Antstore | 1000378 | see Figure 1 in manuscript |
| Freezer | Severin | KS 9890 | -20 °C or lower |
| polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm | Thorsten Koch | 4260308590481 | |
| Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm | Aldrich | BR455742 | |
| Cold pack 150 mm x 100 mm | Elite Bags | 1998 | freeze to -20 °C |
| Bucket with crushed ice | |||
| 1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening | La-Pha-Pack | 11090500 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151799 | |
| Stereomicroscope | Bresser | 5806100 | |
| Forceps, Superfine Tip curved | Medizinische Instrumente May, Norman May | PI-0005B | |
| Forceps, Superfine Tip straight | blueINOX | BL-3408 | |
| Dissection needle 140 mm, pointed, straight | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110301 | |
| Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën | fisher scientific | 15654740 | |
| Distilled water | |||
| Rotizell-Tissue-Tücher | Carl Roth GmbH + Co.KG | 0087.2 | |
| Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % | Carl Roth GmbH + Co.KG | 4442.1 | freeze to -20 °C |
| Vortex Genie 2 | neoLab | 7-0092 | |
| 0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip | La-Pha-Pack | 06090357 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum, 45° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151819 | |
| Alkane standard solution C8-C20 | Sigma-Aldrich | 04070 | |
| Alkane standard solution C21-C40 | Sigma-Aldrich | 04071 | |
| n-Hexane SupraSolv | Merck | 104371 | |
| GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister | Gerstel | ||
| Agilent Gas chromatograph 6890 N | Agilent | ||
| Gooseneck splitless Liner | Restek | 22406 | |
| Helium (5.0 - F50) | Messer | 102532501 | |
| GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent Mass Selective Detector 5975B | Agilent | ||
| MSD ChemStation Data Analysis Application software | Agilent | ||
| MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| Calibration Library for MetaboliteDetector | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| MD Conversion Tool for NIST-library | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 |
References
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