Summary
Colobopsis explodens属短調の労働者はガスクロマトグラフィー質量分析法による後続の溶媒抽出および分析のための肥大下顎腺貯水池内のワックスのようなコンテンツを分離する解剖しました。注釈およびオープン ソース ソフトウェア MetaboliteDetector を使用して揮発性成分の同定についても述べる.
Abstract
本稿の目的は、ボルネオ '爆発アリ' Colobopsis チガヤ(COCY) グループに属するのメタボローム解析を記述するプロトコルを提示することです。このため、モデル種C. explodensは使用されるです。マイナーなワーカー カーストに属するアリでは、特徴的な肥大下顎腺 (MGs) を所有しています。領土の戦闘で彼らは特徴的な自殺 '爆発' 自主的な破断による gastral の外皮 (autothysis) のライバル節足動物を殺すためにその拡大下顎腺貯水池 (MGRs) の粘性の内容を使用します。ワックスのような MGR の内容だけでなく、その後ガスとそこに含まれている揮発性化合物の溶媒抽出に必要な必要な手順を一覧表示の gastral 部分の分離のこの種の働きアリの解離を示すクロマトグラフィー質量分析法 (GC/MS) 分析と抽出液に含まれる代謝物の推定同定。解剖手順は MGR 内容の化学組成の変化を最小限に抑えるため、郭清の緩衝液を使用せず、冷却条件下で行われます。そこに含まれる揮発性代謝物の溶剤抽出後液体注入 GC/MS によるサンプルの解析に必要な手順が掲載されています。最後に、データ処理およびオープン ソース ソフトウェアの使用で推定代謝物同定、MetaboliteDetector が表示されます。このアプローチでは、プロファイリング及び、COCY に属するアリの MGRs 揮発性代謝物の同定は、GC-MS と可能になる MetaboliteDetector ソフトウェアを介してグループします。
Introduction
ここで紹介するワークフローの全体的な目標は、昆虫の分泌物の化学組成の一般的な調査です。これは、全体として分泌またはそれらの単一化合物の生態学的役割の解明の第一の目的で行われます。また、それぞれの分泌物である化合物の基礎となる代謝経路の調査に興味を持っています。今までは未踏査の潜在的生物活性化合物 (接着剤、抗菌剤、等)1,のソースを提供するため上昇の過去数年間、興味アリ (ハチ目, 守) から特に腺内容を得てください。2。 COCY グループ3,4に属しているいくつかの種のマイナーな働きアリの肥大 MGRs 口器からガスター5,6に拡張に含まれているそのような化合物があります。推定敵によって脅かされたときマイナー c. explodens7の労働者およびいくつかの種を作ることができる関連の MGR の使用は、異常な方法で目次: の付箋の内容を取り出すに彼らの gastral の壁の破裂によって生贄に彼ら、相手に爆発的 mGRs と推定される敵は拘留しても死ぬ5,6,8,9。開発の目的と本提案手法の使用は、化学成分の理解とこの ant 分泌の一応有毒成分の性質を改善するためでした。
このため、後続の溶媒抽出と GC-MS による解析で、ワックスのような MGR 内容の gastral の部分を取得するc. explodens働きアリの解剖のためのプロトコルを提案する.
ガスクロマトグラフィー質量分析は、プロファイルや昆虫から揮発性代謝物 (volatilome) の同定によく確立された方法の 1 つです。体表炭化水素10、情報化学物質11、一般的に、化合物の生物学的活性12がアリに興味の典型的な analytes あります。動物個体や体の部分や昆虫13,14解離を介して分離液から採取することができます。試料前処理技術、そこに含まれる代謝物の抽出溶剤14またはヘッド スペース-固相-固相マイクロ抽出 (SPME-HS)15の使用があります。
メタボローム研究のサンプルが固定されること急速にサンプリング後直接化学成分との化合物の量の変化を最小限に抑えるために不可欠です。この研究のために使用されるアリは冷凍コールド パック詰めクールなバッグで敷地内急速凍結によって殺されました。サンプルされた発電機駆動電力を使用して彼らはドライアイスの実験室に運ばれた前に-20 ° C のフリーザーで保存されます。ここに示す解剖手順では、それは異なる COCY 種16,17,18の前に行われている、全体として全体のアリか、ガスターを分析せず MGR の内容を分離する可能性を提供しています。さらに、提示されたプロトコルこともできます直接アクセスと周囲の腺や毒液腺 (VG)5,8デュフールの腺 (DG)8、または他の生物学的研究でまたは腸のような組織の分析処理またはアリの解剖中に導入可能なクロス汚染をチェックします。冷たいパック (-20 ° C)、任意の追加のバッファーを使用せずに実施される最適化された切離プロセス分解サンプルまたは化学物質を使用して、解剖時に MGR 内容の化学組成の変化を最小限に抑えるソリューション、または溶剤を洗浄します。この方法で得られた試料は、定性的および定量的な質問に答えることに適しています。
推定代謝産物アノテーションと同定のためのデータ分析は、MetaboliteDetector19, GC MS メタボロミクス データの自動解析のために開発されたオープン ソース ソフトウェアを介して行われます。単一イオン ピーク、クロマト グラムにデコンボリューション手順を実行して化合物分析のサンプルに含まれる deconvoluted の質量スペクトルを抽出を検出します。MetaboliteDetector 化合物の推定同定は、deconvoluted の質量スペクトルの類似性だけでなく、決定保持指標 (RI; ソフトウェアによって自動的に計算することができますアート RI) に基づいています。RI とスペクトルは一致する要因は、どちらか既存の参照ライブラリに対して (つまり、インポートできますが、共通の NIST 形式内にある場合)、または確立された社内ライブラリに対してクロス チェックすることができます。これは識別のため (推定) 化合物、例えば、によって、化学分析作業グループ (CAWG) メタボロミクス基準イニシアティブ (MSI) のガイドラインに基づき、2 つの独立し、直交データの最小値本格的な化合物を基準にして (ここで保持時間 (RT)/RI と質量スペクトル) のもとで分析非小説代謝物同定20を確認するために必要として、同一の実験条件を提案します。
COCY モデル種c. explodens、MGR コンテンツの完全な実験を行い、解剖の手順も ant ガスターで現在他の腺を分離する適応できます。また、MGR コンテンツ、抽出を記述するワークフローの汎用的な部分の volatilome の包括的な分析のためのプロトコルを提案する GC MS 測定とデータ評価も使用できます分析、および (推定上)一般的に揮発性代謝物の同定。
昆虫の本稿に記載されている実験を行い、倫理的な承認は必要ありません。マレーシア ブルネイ ・ ダルサラーム国、ブルネイの研究、イノベーション センター、ブルネイの農林部、ブルネイを通じてこのプロジェクトを規制するガイドラインに従って、フィールドの仕事、出版物のための使用と同様、アリは、サンプリング・ ダルサラーム国。
Protocol
1. アリのコレクション
- 吸引装置 (図 1) を用いるマイナーな働きアリを収集します。
- サンプリング、直後に-20 ° C で急速凍結によってアリを修正し、解析まで低温で保管します。
2. MGR 内容とアリから DG の分離
- アリの解剖の前に次の準備をします。
- きれいにガラス シャーレとメタノール-水混合物 (メタノール/H2O; 1 + 1 v/v) と組織郭清の楽器。
注意: メタノールは人間に有毒であります。常に適切な手袋、白衣、ゴーグルを着用し、ヒューム フードの下でクリーニングを実行します。 - 冷たいパック、ガラス シャーレに-20 ° C を凍結します。
- シリコーン/ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) 隔壁を有するスクリュー キャップを含む 1.5 mL 短いスレッド バイアルの大衆を決定し、直接顕微鏡の横にある氷のそれらを保ちます。
注: サンプル バイアルの選択はオプションです。ここでは、MGR 内容はガラス製冷却 1.5 mL バイアルに直接配置されます。プラスチックは、ターゲット代謝物の信号に干渉するアーティファクトを引き起こす可能性のある化合物 (フタル酸エステル類など) を含めることができます。 - 押し出し発泡スチロール製の箱に冷凍の冷たいパックを配置します。冷たいパックの上にペトリ皿を置くし、皿に冷凍アリを入れてください。ステレオの顕微鏡の下のボックスをマウントします。全体のアリを明確に見ることができるまで、倍率 (20-40 倍) とフォーカスを調整します。
- きれいにガラス シャーレとメタノール-水混合物 (メタノール/H2O; 1 + 1 v/v) と組織郭清の楽器。
- その gastral のコンパートメントの完全性の冷凍の ant をチェックします。解剖、そのままガスター領域 (図 2 aB) とアリだけを取る。フラット gasters またはさらに分析 (図 2D) から自分の身体の表面硬化の MGR コンテンツの痕跡アリを除外します。
- 細い鉗子、同属での 1 つのペアを選択した ant をつかむ (最初の腹部のセグメント) と葉柄 (腹部第 2 セグメント) で鉗子の他のペア。優しく ant 体 (図 3 a) の残りの部分から引き離し、ガスター地域をデタッチします。
- 4 節背板で細い鉗子で保持することによって今区切られた ant ガスターを修正します。細い鉗子の別のペアの横にある、葉柄) 1 節背板をつかむし、(図 3 b) を剥がしてそれを慎重に取り外します。Tergites 2 および 3 (図 3、D) gastral 部分まで、MGRs のもこの手順を繰り返します ( C. explodens働きアリの黄色が、MG コンテンツの色黄色の上の他の種が赤に白から範囲) は最も目に見える部分。
注: 外骨格を外して、MGR の膜も一部削除されます。 - 解剖針を用いて、やさしく gastral コンパートメント (図 3E) それらをスクラッチでペア MGRs のワックスのような内容を削除します。Ant ガスターで現在他の腺を破裂せず分離することができます MGR コンテンツのそれらの部分を削除だけです。多くの力や努力は全体として MGR コンテンツの取得に適用される必要がある、その不完全な除去 (図 4) を受け入れます。
- 彼らはそれに固執するまで解離針の先端でそれらに触れて優しくで MGR 内容を拾います。知られている冷却 1.5 短いスレッド バイアルに MGR 内容を転送風袋質量。
- 解剖針の先端から粘着性の MGR の内容を削除するには、サンプル瓶の壁に針の先端を移動し、壁にそれらを中傷します。バイアルを閉じて次の MGR 内容が分離まで、氷の上に配置します。
- 後で隣接する DG (セクション 6) 由来化合物によるコンテンツの MGR のサンプルの可能な交差汚染のチェック、また蟻のまま (図 4) が彼らであり、別の高速液体クロマトグラフィー バイアルに入れてから DGs を収集します。
- ペトリ皿とメタノール/H2O 解剖器具を常に清潔 (1 + 1 v/v)、腺の腺または ant からアリに変更するとき。
- 1 つの分析試料の貯蔵所の内容または複数アリの腺を組み合わせます。
注: 腺またはその内容を 1 つの分析試料の使用数は実験デザインによって異なります。ここでは、MGR 内容または 5 アリの DGs のいずれかを 1 つの分析試料を取得する集めた。
3. 分離腺内容の溶媒抽出
- (ここで、MGR 内容または 5 アリからプール隣接する腺) 分析試料の質量を決定します。
- 1:14 の比が一定で冷たい純度の高い酢酸エチル (エチル) を追加 w/v と渦冷却条件の下で 5 分間サンプルここでは、恒温室で 7 ° C で実行されます。
- 7 ° C で 3,820 × g で 10 分間のサンプルを遠心し、培養上清を転送 (5 アリから得られた MGR コンテンツ抽出物の約 55-75 μ L) 1.5 mL の予冷に短いスレッド バイアル含む 0.1 mL のマイクロ チップ。しっかりとスクリュー キャップの穴と赤いゴム/テフロン隔壁を含むとバイアルにシールします。
分析はすぐに実施することはできない場合、注意: 抽出-80 ° c まで凍結/融解サイクル中に化学変化のリスクを最小限に抑えるため作製直後にサンプルを分析する分析が、それを推奨します。
4. GC-MS
- 完全な GC MS 測定シーケンスのそれぞれ 1.5 mL 短いスレッド バイアルに以下のソリューションを準備します。
- 8 mg/L の化合物ごとの最終的な集中に市販のアルカンの標準溶液を希釈することによって RI calibrant の混合物を準備ヘキサンを使用しています。
- 溶媒ブランクを準備純粋なエチルから成る。
- 1) 溶剤の空白、3) MGR の内容、2) RI calibrant 混合物を含むバイアルを抽出、場所、4) DG 内容をガスクロマト グラフ (GC) と結合したオートサンプラーの冷却トレイ (10 ° C) に抽出します。
注: オートサンプラ、測定前に各バイアルを保持期間を最小限に抑えることをお勧めします。MGR のコンテンツのサンプルのような重要なサンプルのバイアルは、オートサンプラ、解析の前にすぐに置かれるかもしれません。 - 各サンプルでは、ターゲット化合物の適切な列にクロマト グラフ分離の GC MS に 1 μ L 分注を注入 (ここで: HP-5 MS UI 列)。
- 適切な GC パラメーターは、以下のように設定します。
- キャリアガスとしてヘリウムを使用し、1 mL/分 40 ° C から始まって 2 分、最大 10 ° C/分のランプに続いてホールド オーブン温度ランプ 330 ° C、7 分のホールド時間 270 ° 入口温度設定セットの定数の列の流れを設定C.
- 選択、必要な場合、十分なピーク形状は、GC-MS 射出用の分割比率と関心 (図 5) の化合物の強度を調整します。
注: 例で提示された必要だった DG の抽出物は分割比率 2:1 とスプリットレス モードで RI calibrant の混合物を測定します。分割比率 2:1、2 回目 50: 1 で MGR のコンテンツ抽出を行った。 - 補助の温度を 350 ° C に設定します。
- 質量分析計 (MS) のパラメーターを次のように設定: MS 源泉温度 230 ° C、4.1 (溶媒ブランクと実験的サンプル) のための分または (RI calibrant の混合物) の 6.1 分遅くなる MS クワッド温度 150 ° C、高質量 500、溶剤に低質量 30 からスキャン範囲、それぞれ。スキャン レートを約 3 スキャン/秒に設定します。
注: MS のパラメーター、特に、MS スキャン、サンプリング レート、サイクル時間ピーク ピッキングとスペクトル ・ デコンボリューションに影響を与える可能性があり、MetaboliteDetector ソフトウェアと適切なデータ評価のためのパラメーター設定を選択するときに考慮しなければなりません。
- 適切な GC パラメーターは、以下のように設定します。
- 測定が完了すると、データをエクスポートします。AIA プロジェクト ファイル (GC 付属データ解析ソフトウェアを使ってここで実行されます) ポータブル データ ストレージ デバイス。
- ファイルを選択 |... AIA 形式にデータをエクスポート作成新しいディレクトリをチェックし、 [ok]をクリックします。募集ストレージの場所 (例えば、USB フラッシュ ドライブ) を選択し、開くをクリックします。エクスポートして--->アイコンをヒットするファイルを選択します。プロセスをクリックするとを確認します。
5. 代謝物の検出と MetaboliteDetector ソフトウェアの使用との識別
- MetaboliteDetector を開くデータ ファイルの分析を開始する前に、ツールを選択 |設定、(MetaboliteDetector の個々 のシートは、太字で示してあります) 次のように必要なパラメーターを設定。
- シート外観で分にタイム スケールを設定し、軸ラベル] オプションを有効にします。
- デコンボリューションシートでピーク設定をするためのパラメーターを設定: ピークしきい値: 10、および最小ピーク高さ (ノイズ ユニット): 10。ベースラインの調整を有効にするチェック ボックスをオフします。代謝産物の検出するためのパラメーターを設定: ビン/スキャン: 10、デコンボリューション幅 (スキャン): 5、所要強度 (基本ピークの %): 0、および必要な数のピークの: 10。
- 識別シートでライブラリの検索オプションを設定: 化合物ライブラリ: 'CalibrationLibrary_Alkanes' と nist (NIST sqlite ライブラリは、.lbr 形式で含まれることができます)。パラメーターを次のように設定: 最大。RI の違い: 10、カットオフ スコア: 0.9、ピュア/不浄組成: 0.5 の場合、フラグメント数: 同一 frag の 2、最小数: 1。 使用スケール lib: カチカチ音をたてた。類似性スコア: 仕様の類似性;大容量フィルター: m/z (の GC カラムの固定相から生じる知られている汚染物質) 1147、355、281 221 207。
- シートで定量化パラメーターを設定: 定量イオン数: 3、その後イオン間距離: 5 と最低限必要な品質インデックス: 1。 1147、355、281 221 207 定量イオンを除外します。
メモ: 高分解能 MS データ、場合さらに以下のパラメーターで設定シートに重心: ピークしきい値を開始: 10、ピークのしきい値の終わり:-5 と最大基準距離: 30、半値幅: 0.5。
- ファイルをインポートします。CDF 形式内に生成されます。AIA プロジェクト ファイルとして。ファイルを選択して MetaboliteDetector ソフトウェアに NetCDF |インポート |NetCDF インポート。フォルダーの形をしたアイコンを選択し、インポートおよび処理するサンプル カテゴリのファイルを選択: 1) 溶媒ブランク、2) RI calibrants、3) MGR コンテンツ抽出、4) DG コンテンツ抽出。データの処理を開始する[ok]で確定します。処理後、表示されるウィンドウで閉じるを選択します。
- RI 校正と MGR エキスに含まれている化合物の RI 値の決定は、ファイルを選択 |オープンRI calibrants のデータを含むファイルを選択します。
- RI calibrant ファイルが開かれた後は、虫眼鏡のアイコンを選択します。Ok ボタンでウィンドウが表示されてを確認します。
- 適切な RI の校正、RI calibrant ファイルで検出可能なアルカンの範囲を確認してください。
- このため、それを一度クリックして (最低の RT では、図 6) で検出可能なアルカンの最初から発信された、最初のピークの最大の下に表示される三角形を選択します。
- スペクトルの類似性が最も高いヒットをチェック (' 仕様 sim.', 最大スコア = 1) アルカン ライブラリ エントリ (図 6) と比較して。
- 推奨されるアルカン化合物の id を確認するには、文学、例えば、 NIST 化学 WebBook22で与えられた質量スペクトルにその質量スペクトルを比較します。
- 最後のクロマト グラムで表示されるアルカン ピークを数えることによって最後のアルカン RI calibrant 混合物中に検出を確認します。
- RI 校正用ツールを選択 |RI チャンネルキャリブレーション ウィザード。次を選択します。
- フォルダーの形をしたアイコンにクリックし、RI calibrant 混合物のクロマト グラムを含むファイルを選択します。次を選択します。
- [出演] ウィンドウでアルカン calibrants のエントリを含むライブラリを選択します。
- RI calibrant ファイルで検出可能なすべてのアルカンのライブラリ エントリを選択し、クリックして、 >>アイコン。選択した後>>、次を選択します。
- RTs の出現テーブルに各検出アルカンの記載を確認してください。このため、それぞれの三角形 (図 7) をクリックして各アルカンのメイン ウィンドウに描かれている RTs をチェックします。キーボード (の助けを借りて、RT にドロップ ダウン メニューを選択して RT。 また、正しい提案を入力必要 (図 8) にそれぞれのフィールドをダブルクリックして手動でキャリブレーション テーブルで RT が解決しない場合図 9)。
- 各アルカンの RT が正しい場合は、次を選択します。次の RI キャリブレーション テーブルを示すウィンドウが表示されてクリックします。
- クロマト グラムの選択ウィンドウが表示されて、緑+シンボル、抽出溶媒ブランクのデータ ファイルと腺のファイルを選択し、次選択します。[パラメーター設定ウィンドウが表示されて次のように: しきい値をピークのベースラインの調整を無効にする、: 5、最小ピーク高さ: 5、箱/スキャン: 10 とデコンボリューション幅: 5次とヒットし、開始の RI の計算を実行するには。選択したサンプル ファイルに含まれている化合物。
- アノテーションは、MGR 抽出で選ばれた代謝物の同定を RIs を (ステップ 5.3.9)、上記のように計算されている測定の MGR コンテンツ抽出のデータ ファイルを開くファイルを選択する |オープン募集データ ファイルを選択するとします。
- ツールを選択 |設定 |デコンボリューション、最小ピーク高さ (ノイズ ユニット) 両方と同様、ピークのしきい値を 5 に変更します。虫眼鏡アイコンを選択し、 [ok]をもう一度警告ウィンドウが表示されてを確認します。
- 最大の関心のピークの下に表示される三角形の上にクリックし、 NISTアイコンを選択して NIST ライブラリに格納されているものとその質量スペクトルを比較します。
- NIST 検索 (図 10) の最初の結果ヒットを選択します。
- 興味の化合物の結果のスペクトルの類似性は、選択したスペクトルの類似性スコアを超えている場合 (ここで 0.9) (GC の列、膜厚、および列のような固定相の RI を見て NIST エントリ (図 10) に比べると、直径) (例えば、 NIST 化学 WebBook22) の文献でこの化合物の与えられました。
- 実験的派生 RI NIST 参照 RI (または複数の RI 値が与えられたときの平均の RIs) の相対的な差を計算します。差が等しいまたはユーザーが指定した最大許容値未満 (ここで ≤ ± 1%)、指定として化合物 ' 付きます」。
- MGR のサンプル ファイルに含まれる興味のすべての化合物の 5.4.2–5.4.5 の手順を繰り返します。
- 化合物を同定、RI と標準溶液の質量スペクトルを比較 (例えば2-100 mg/L) 注釈付きの化合物のセクション 4 で説明されているように、同じ条件下で測定します。
- セクション 4 で説明したように標準を分析し、前述のアルカンと手順 4.4 と 5.2 で MGR コンテンツ腺データ結果のデータを処理します。
- ツールを選択して、標準から取得したデータを校正 |RI チャンネルキャリブレーション ウィザード |次前に使用したのと同じ RI calibrant ファイルを選択するとします。再度次と選択データを含むファイルから取得した標準液グリーン+のシンボルをクリックして、次を選択します。次とヒットし始める標準化合物の RI を計算します。
注: 標準の分析は、サンプル分析の後すみやかに実行できない場合、勧め RI calibrants をもう一度分析して標準の新しい RI の校正および計算を実行します。 - 標準のそれぞれのファイルを開き、5.4.2 の手順で説明したように、NIST ライブラリとそのスペクトルの比較によってその身元を確認します。
- 標準のアイデンティティの確認の後館内の図書室に質量スペクトルと化合物の標準の RI を追加します。このため、グリーン+シンボルをクリックし、ライブラリ エントリの優先する名前を入力します。化合物ライブラリの標準の RI と質量スペクトルを追加する[ok]を確認します。ライブラリに新しいエントリを見ることができない、する場合は、更新ボタンをアクティブにします。
注: RI キャリブレーションが正常に実行された場合 MetaboliteDetector によって決定 RI 表示されますそれぞれのライブラリのエントリで。標準のライブラリのエントリを作成すると、RI の組み合わせに基づく MG 抽出でこの代謝物の同定、スペクトルの類似性があります。 - MGR コンテンツ データ ファイルを再度開きます。ツールを選択 |設定 |識別。今、標準化合物の RI は、計算され、ライブラリのエントリを追加と、スコアの結合にスペクトルの類似性から類似性スコアを変更します。
- 虫眼鏡のアイコンをクリックし、手順 5.4.5 でアノテーションされている化合物の下に三角形を選択します。
- ヒットにクリックし、'全体的な類似性スコア' に指定された値を確認 (OSS、'全体の類似 'として代謝産物の検出器によって省略)、スペクトルの類似性と RI の類似性の組み合わせを考慮したスコア (図 11)。
注: ヒットは、館内の図書室で発見された場合、メイン ウィンドウの右側にあるに表示されます。 - OS がユーザー定義のしきい値 (ここ ≥ 0.9、三角形の緑の色によっても示されます) を超える場合、指定化合物 '識別' (図 11)。
6. DG コンテンツによって汚染の MGR コンテンツ抽出物のチェック
- MetaboliteDetector (ステップ 5.3.9) を持つ化合物の RIs がすでに計算されて DG サンプルの校正のファイルを開きます。
- MG コンテンツのサンプルと DG サンプルの測定後に得られたクロマト グラムのオーバーレイ、ツールを選択 |クロマト グラムのオーバーレイグリーン+アイコンを介して 2 つのそれぞれのファイルを選択します。Ok ボタンで決定します。
- オーバーレイを表示するには、ウィンドウの下部に表示されるクロマト グラムのオーバーレイシートを選択します。
- MGR コンテンツ間の物質の重複チェックを抽出 (図 12) と DG のコンテンツを抽出し、さらに MGR のコンテンツ分析から重複する化合物を除外します。
Representative Results
C. explodensの腺分泌物で推定代謝物同定実験手順の一覧図ワークフローは、図 13に示すです。また、提示実験用 COCY 働きアリの最も重要な体の部分の図式的な概観は、補足図 S1 A, Bとして提供されます。補足図 S2に MGR コンテンツの推定代謝物同定までアリの郭から主な手順を示します。
MGR volatilome 解析に適したコンテンツを分離するため、輸送、貯蔵、全土、切離プロセス中も冷却状態が維持されました。このために、アリは昆虫の吸引器 (セクション 1 および図 1)、その場での使用で自分のコレクションの直後に凍結されました。-20 ° C のフリーザーの 2 日間の貯蔵, 後 ant サンプルは、彼らすぐに置かれた-80 ° C でさらに分析までオーストリアにドライアイスに運ばれました。アリの MGR のコンテンツの分離を選択する適切な展示ラウンドであるガスター領域とそのまま (図 2 a)、tergites (図 2 b) の間に見える MGR によって示される MGR コンテンツと一緒に充実した最高のケース。さらに分析のために適しているないアリの gasters は図 2Dに表示されます。主な手順 (手順 2.3 2.6) MGR 内容の分離プロセスに関与する COCY アリから図 3に示します。( C. explodens、しかし色の場合黄色の COCY グループに属する他の種が赤に白から範囲できます) 分離の MGR の内容は図 14のとおりです。
その MGR 内容にアリを切り裂く場合穿刺または他の腺や腸 (ステップ 2.5) を破壊しないように注意が必要があります。図 4は、MGR コンテンツの分離後まだ 2 つ他、そのまま腺 (DG と英領バージン諸島) が含まれています, ant ガスターを示します。Ant 腸の内容による目に見える汚染の例を図 15に示します。DG の内容の MGR の下にあるクロス汚染を完全に回避することはできません、ので結果信号と MGR のコンテンツ抽出 (セクション 6) から信号の比較のためこれらの腺を分析するプロトコルの一部が描かれています。解剖手順が正常に完了したら、それは約 0.75 1.2 を得ること MGR コンテンツ ant あたりの mg。ここで説明したプロトコルの 3.9 5.9 mg ごとのサンプルを繰り返し 5 アリの MGR 内容を集めた。
分離腺貯留層の内容は (セクション 3) エチルで抽出され、GC-MS (セクション 4) によって分析します。C. explodens働きアリ MG コンテンツ抽出物の測定は、ピークの推定 MGR コンテンツ化合物 (図 5) の数十の質量スペクトルを構成するクロマト グラムの結果します。2 つの支配的な代謝物質 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl) エサノン (ID 4) と 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (ID 5) MG コンテンツ抽出列がオーバー ロードの原因、同じサンプルを行った理由は再び高いで分割比 50: 1 (の図 5、くぼみ)。たとえば、DG の成分による MGR コンテンツの可能な交差汚染は約分 29 (図 12) から始まって、後半の RTs を出展 - GC/MS クロマト グラムのピークを追加として目に見えるでしょう。MetaboliteDetector と溶媒ブランク、GC カラムの固定相または ant ガスターに DG の内容から元およびそれに続く処理は、クロマト グラフのピークおよび化合物のマススペクトルを除くソフトウェアは、信号対雑音比 ≥ 10 で約 110 MGR コンテンツ化合物で起因しました。後の代謝産物アノテーションおよび MetaboliteDetector ソフトウェアの識別、クロマト グラムの目盛りが付いていたし、RI 値を求めた測定サンプル ファイル (5.3 のステップとサブステップ、図 6, 図 7, 図 8, 図 9)。コンテンツ代謝産物の検出の推定 MGR は、スペクトルの類似性 (5.4 のステップとサブステップ、図 10 の例で提示された MetaboliteDetector ソフトウェアの不可欠な部分を形成する NIST ライブラリの組み合わせに基づいて注釈).また、RI 値が同じまたは同等の静止した段階の文献で見つけた膜厚と GC カラムの直径と考えられていた複合注釈 (手順 5.4.4 と 5.4.5)。標準の使用によって厳密な一致条件および RIs と質量スペクトルの確認を設定し終えたら、1 つの標準化合物 (5.4.7-5.4.15 の手順と図 11) のプロトコル セクションで説明したように、約 10 の身元を確認することが可能だった検出された代謝物の %。ジョーンズらによって前の文書に記載されているそれらの代謝産物に焦点を当てた本の研究以来、 C. explodensの MGR コンテンツの volatilome に関する詳細なレポートを別の場所に発行します。17 (種記載番号:kb02 108 として示される; クックらも参照してください。23).表 1はこれらの特定の化合物の概要を説明します。
図 1: 昆虫の吸引器の図。バイアルまたはコンテナーのシール蓋に 2 つのフレキシブル チューブがつないでいる 2 つの穴はなされます。バイアルのインテリアが直面している 1 つの管 (T1) のオープニングは、昆虫をブロックするのに十分な細かいメッシュで密封されます。さらに、穴は、チューブに空気の交換を容易にするため作られています。管 T2 の端 T1 から吸引によってサンプリング バイアルに吸い込ま、昆虫へ密接に指摘しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: そのまま壊れたガスターと。(A) そのままガスター郭清に適しています。(B) そのままガスターはほぼ完全に解離にも適した MGR コンテンツでいっぱい。(C)、(D) が壊れてアリガスターズ噴出と硬化 MGR コンテンツ (黄色)、サンプリング中にガスター外皮の破断中に壊れた可能性があります。これらのアリは、郭清、抽出、および詳細な分析から除外されます。T: 節背板。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 切離プロセスに関連する手順を主要な。アリの体の残りの部分からガスター地域の (A) 分離。(B) 外骨格を剥離: 節背板 1、節背板 2 (C) と節背板 3、その後ペアの黄色着色された MGRs の内容がほぼ完全に目に見える (D)。(E) 解剖針の助けによって粘着性がある MGR コンテンツを削除します。T: 節背板。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: MGR 内容の分離後 Ant ガスター 。他の 2 つの腺が、ガスターの存在 (英領バージン諸島: 毒液腺と DG: デュフールの腺) 見ることができます。両方のコンパートメントは MGR コンテンツ (残り物分離は黄色で見ることができる後) を除去した後はそのままはずです。これらの腺は、MGR の内容と同じ方法で分析できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 総イオンの代表的なクロマト グラム (TIC) 現在 MGR コンテンツ抽出の。2 つの最も豊富な GC-MS のピークにより、さらに対称形、クロマト グラフのピークの分割比率が高い (50: 1) は、通常 2:1 の比率ではなく選ばれたとき (はめ込み式を参照)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: RI calibrant クロマト グラムの最初の検出可能なアルカンの定量します。最初のアルカン ピークの最大の下に三角形が選択されます。アルカンは 6.31 分を示して、最高スペクトルの類似性 (ここで ' sim 仕様。 ') ライブラリのエントリ 'Alkane_C09' を示しています。アルカン本人を確認、質量スペクトルはライブラリ (例えば、 NIST 化学 WebBook22) と比較されます。提示の例では、ノナンは 128 の m/z 値とその分子イオンによって識別されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: アルカン標準混合物の使用を RI 校正します。データ ファイルが開かれている RI calibrant と選択 ' RI チャンネルキャリブレーション ウィザード」機能。校正表に描かれている RI に保持時間の一致する正しいをチェックする必要があります。6.31 分 alkane_C09 の RT (ノナン) はテーブルで正しく表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 間違った RTs がキャリブレーション テーブルに表示されます。RTs が正しく表示されない (どちらか間違っている RT 値または-1 と表示される不足している RT 値によって示されている)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: 校正表で間違って RTs の手動補正します。間違った値をそれぞれアルカンの正しい RT を挿入することによって Alkane_C39 のためにここに示すように、手動で修正できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 10: NIST ライブラリ エントリへ選ばれた化合物の質量スペクトルの比較。ピーク最大溶出 6.16 分 (RI 891) と NIST 検索機能 (赤い円) の活性化を選択すると、2-ヘプタノンの 0.99 のスペクトルの類似性が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 11: MGR コンテンツ抽出液中代謝物同定します。質量スペクトルと試料のクロマト グラムの里 891 で化合物の溶出に由来する RI は、RIs と測定標準化合物のスペクトルを含む社内ライブラリのエントリと比較されます。場合 '全体的な類似性スコア' (OSS、として「全体的な類似' 質量スペクトルと RI を実装する代謝産物の検出器の省略) 社内ライブラリの化合物とサンプル中の化合物ファイルは 0.9、化合物は、'同定' に指定されています。ここでは、2-ヘプタノンの社内ライブラリのエントリと RI 891 で化合物溶出の OSS は 0.96、2-ヘプタノン MGR コンテンツの識別の結果を抽出です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 12: DG コンテンツの TIC クロマト グラム セクション (分 29 分 35) のオーバーレイは、(赤) を抽出し、MGR コンテンツ抽出 (青) です。MGR のコンテンツよりもエキスを抽出; コンテンツの DG で重畳 (推定) の化合物に対応するピーク面積が多いこれらの化合物は、潜在的 DG に属し、MGR コンテンツ (マイナー) 汚染物質の抽出物と見なされます。C. explodens MGR コンテンツ抽出の場合約分 29、推定 DG 汚染からクロマト グラフのピークを見つけることができます、クロマト グラムのこの部分は、さらに MGR コンテンツの分析から除外することができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 13: 代謝産物アノテーション/腺貯留層のコンテンツの識別に ant のサンプルからスケマティック ワークフロー抽出 GC-MS 分析後。ここで提示されたプロトコル経由で ant とガスクロマトグラフィー質量分析の解剖 MGR 内容の分離から始まるすべての実験的手順を説明します (黒で示される) データの評価だけでなく。代わりに、昆虫の分泌物可能性があります生成および収集の in situ (灰色で示されている)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 14: 分離抽出前にワックスの MGR 内容。(A) 2 つの MGRs の内容は一緒に、スティックが、(B) 彼らすることができます分離後分離します。C. explodensMGR のコンテンツの色はオレンジ黄色が COCY グループの他の種が赤に白から範囲することができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 15: 昆虫の腸 (ブラウン) の成分による交差汚染分離の MGR 分泌のイラスト。MGR 分離のこれらのタイプは、抽出とさらに詳しい分析から除外されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ID | 代謝物 | とるに足らない名前 | インチの文字列 | 合計の方式 | ||||||
| 1 | Heptan 2 つ | InChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/h3-6 H 2、1-2 H 3 | C7H14O | |||||||
| 2 | n ウンデカン | InChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3 | C11H24 | |||||||
| 3 | n ヘプタデカン | InChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3 | C17H36 | |||||||
| 4 | 1-(2,4,6-Trihydroxyphenyl) エサノン | Monoacetylphloroglucinol | インチ = 1/C8H8O4/c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 3 8 12/h2-3,10-12 H、1 H 3 | C8H8O4 | ||||||
| 5 | 5,7-Dihydroxy-2-methylchromen-4-one | Noreugenin | インチ = 1/C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5/h2-4,11、13 H、1 H 3 | C10H8O4 | ||||||
表 1: C. explodensマイナーな働きアリから分離した MGR 目次、EtOAc で識別される代謝物抽出します。選択した代謝物が掲載されています。
補足図 S1。本稿では COCY アリ (マイナーな労働者) に属する最も重要な体の部分を説明します。(A)、MGRs が黄色で表示されます。彼らの gastral の部分は、volatilome 分析のため使用されます。(B)、MGRs の gastral の部分は、tergites 1 に 3 の下に位置しています。T: 節背板。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 S2。提示実験の概要。代謝物 MGR コンテンツに存在の推定同定までアリの解離からの主要な手順を示します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Discussion
本稿では、 C. explodensマイナーな働きアリの肥大 MGRs、コンテンツの volatilome を分析するための完全なプロトコルを提案する.アリがここで使用される可能性があります '爆発' 鉗子で触れたときの自由な方法で彼らの MGR の内容を取り出すので、昆虫の吸引器 (図 1) によって提供される、'の柔らかい' コレクション手法を使用することをお勧めします。COCY アリを含むいくつかの ant の種、それ以外の場合 (例えば、ヘッド スペースのギ酸の蓄積によって) アリの自己中毒が発生するので、50 mL バイアルあたり 5 人にアリの最大数を制限する必要がある場合があります。フィールドでアリを凍結冷凍コールド パック詰めクールなバッグを使用可能性があります。サンプルを急速に凍結し、冷却条件 (例えば-20 ° C、-80 ° c 最高) の下に格納する必要があります、それは殺すために、このメソッドとその腺のダメージ増加が観察されているので、液体窒素でアリを格納は推奨されません。
提示されたバッファーと無溶剤郭清方法はワックスのような下顎腺貯留層内容だけでなく、他の腺を冷凍働きアリに存在を取得に適しています。C. explodensの MGR のコンテンツの volatilome 分析、解剖時に考慮すべき主要な面は、ant (ステップ 2.1.4) の連続冷却と MG サンプル他腺内容/水分の存在とのクロス汚染を最小限に抑えるant ガスター (手順 2.5、 図 4、および図 15)。冷凍アリのかなりの部分が壊れている、か、アリ '爆発' サンプリング中またはドライアイス サンプリング サイトから研究所への輸送中に破損していたため。ガスター領域が壊れている場合、これらのアリ、さらに分析 (図 2D) のため適していません。触角と足が見つからないか壊れている、場合にのみ、これらのアリを使用して、MGR の内容とさらに詳しい分析の抽出可能性があります。MGR 内容が冷却されるのでc. explodensアリはそれはストレートな解剖針 (図 14図 3 e、ステップ 2.5) を用いて分離するワックスのような一貫性を持っています。追加のケアは、コンテンツ付箋 MGR を処理しながら撮影する必要があります。それと物理的な接触に入って来る何かに固執する可能性がありますしても郭清の鉗子は、他のサンプルの汚染のリスクが増大に固執します。解剖針で MGR コンテンツでのみ接するし、すぐに (手順 2.5 および 2.6) の抽出に使用されるガラス瓶に転送する必要があります。また、蟻または腺型 (手順 2.8) 間の切り替え時にメタノール/H2O の混合物と解離装置をきれいにすることをお勧めします。
他の蟻種の腺内容もコールド パックで冷却中に液体の状態で存在があります。この場合、まず、膜を含む全体の腺が分離し、コンテンツを取得その後パンクします。液体の分泌物は、細かい毛細管ピペットの助けを得られるかもしれない。約 4-5 mm (アンテナ) なしの平均体長、 C. explodensの労働者は COCY グループの小型種に属する。彼らのしばしば腫れガスターには、約 2 〜 2.5 mm 長さ、幅 1 〜 1.5 mm が装備されています。COCY グループの今までのところ最大の既知の種の労働者ガスター サイズ約 3 mm 長さ、幅 2.5 mm の体長約 8 mm のサイズに達することができます。細かく分析し個々 の蟻との異なるサイズの gasters 調査プロトコルが適していますので、COCY 種、ここは郭清楽器を使用、顕微鏡は小さい蟻またはより小さい器官の適応する必要があります。さらに、分析試料当たりアリの数も同様に増加する必要があります。
MGR コンテンツの ant を解剖しながら他の腺または腸の内容が交差汚染サンプル (ステップ 2.5、図 4と図 15) に損傷を与えることが重要です。最適な場合、DG、MGR 目次抽出後英領バージン諸島だけでなく、目に見えて保持されますそのまま (図 4)。内容、MGRs の下に位置する DG の汚染は完全に避けるために困難です。この理由は、ドライアイス サンプリング サイトから研究所への輸送中に腺整合性の部分的な破壊もあります。また、調査アリの数で MGR の気づいている我々 にもサンプリング中や爆発の過程で DGs が破損可能です。MGR (セクション 3 および 4) の内容と同じように DG 内容を分析することができます、ので、MGR コンテンツ サンプル (セクション 6) の分析の後、結果を結果のデータと比較できます。MGR コンテンツ エキスc. explodensアリから得られる場合も DG に含まれる化合物は溶出クロマト グラム (図 12) の後半を開始します。MGR 成分化合物の DG の誤認を防ぐために、それぞれの代謝物は、さらに分析から除外することができます。他の蟻種の研究からそれは DGs 含むことができるまた (高い) 揮発有機化合物1,24, GC クロマト グラムの早い段階で溶出するが通常知られています。
COCY の MGR 内容の化学組成を扱う前の研究でアリ、全体のアリの全体 gasters が分析16,17,18,23, 一方ここ、MGR の内容自分自身がアリの解剖によって得られました。
切り裂かれた MGR 内容を分析調査官の生化学的研究は、そこに含まれる代謝物の同定を含む広い範囲を実行することができます。ここで行われた研究は、 C. explodensの MGR に含まれる揮発性成分の同定に焦点を当てて、ガスクロマトグラフィー質量分析 (セクション 4) の選択されました。このため、抽出物理想的にする準備した直後に測定したか分析まで-80 ° C で保存します。それは、(拡張) 記憶が (3.3 と 4.2 の手順の後のメモを参照) 抽出物の化学変化を引き起こす可能性があります注意してください。MGR 内容の濃度は、桁違いの範囲をカバー可能性があります、ので分割比別の GC で MGR の抽出物を分析する必要があります。MGR コンテンツの 2 つの主要な化合物は、分割比率 2:1 を使用した場合、列がオーバー ロード発生プロトコルを例示する撮影アリの抽出、のでこのサンプルを 50: 1 (ステップ 4.3.1.2and図 5) の高い分割比率で 2 回行った。セクション 4 に示されて GC-MS によるパラメーター設定は、材料のテーブルで指定した GC-MS デバイスで生成されたデータに適しています。RI calibrants (ステップ 4.1.1)、横には、以降のデータ解析中に非生物学的成果物や汚染物質を認識する溶媒ブランク (ステップ 4.1.2) を分析する必要があります。代謝物同定、また注釈付き化合物サンプル抽出物 (手順 5.4.7and 以下) を分析するために使用されると同じ GC MS 条件下の本格的な基準を測定することが重要としてます。精度と最終データの信頼性を改善するためには、同じ測定シーケンス内のすべてのサンプル カテゴリ (溶媒ブランク、RI calibrants、抽出、および基準) を分析することをお勧めします。さらに、本格的な基準は、サンプル抽出物の観察に匹敵する濃度分析必要があります。これは RI 値とサンプルと最終的に増加しより意味のある代謝産物アノテーション/識別につながる標準質量スペクトルの類似性の精度を高めるのに役立ちます。このため、基準繰り返し測定できる異なる分割係数を用いたします。
代謝物同定、洗練されたソフトウェア実装された NIST-ライブラリにも確立された所内の図書室 (セクション 5) としてスペクトル デコンボリューションと RI とスペクトル比較のため MetaboliteDetector が使用されます。64 ビット LINUX ベース オペレーティング システム (例えばKUBUNTU) で MetaboliteDetector を実行して、生成されたコピーにお勧めです *。ローカルのハード ドライブ上にポータブル データ ストレージ デバイスから CDF データ ファイル (手順 4.4)。MetaboliteDetector は、重心またはプロファイルの netCDF 形式で生の GC-MS データのインポートが可能です。ほとんどの GC-MS 機器のソフトウェアはこの形式19に記録された raw データを変換できる必要があります。データの分析を開始する前に強くお勧め機能やグラフィカル ユーザー インターフェイス19,25、に精通する前の MetaboliteDetector ソフトウェアのバージョンに利用可能な文献を読む26。
RI 校正、サンプル抽出物の存在の複合ピークの後続の RI 値計算、RIs および RI calibrants (ここで n アルカン) のスペクトルを含むライブラリを使用します。このようなライブラリは自己確立されたどちらかすることができますまたは既存の 1 つ ('CalibrationLibrary_Alkanes') がダウンロードした27をすることができます。提供されている既定の calibrant ライブラリでは、RIs とアルカンに至る C09 C39 セクション 4 で説明されているように分析されているスペクトルを含まれています。指定されたライブラリが直接データの校正プロセスを開始する代謝産物の検出器を使用できます。必要な場合、このライブラリはさらにアルカンの追加エントリの拡張もできます。参照および実験的派生 RIs と質量スペクトル (5.3 のステップとサブステップ、図 7、図 8図 9参照) の類似性に基づいて、注釈または化合物の識別することができます (ステップ 5.4 とサブ手順を実行図 11)。また、重要なこと MetaboliteDetector と自動データ処理の後、ユーザーが手動でチェック正しいピークのピッキングとスペクトルのデコンボリューション興味の各推定化合物 '三角形の基になる質量スペクトルを調べることによってです。また、GC MS 装置およびデータの生成に使用されたパラメーター設定、によって提示された MetaboliteDetector 設定は必要かもしれません。MetaboliteDetector ソフトウェアの自動バッチ数量 .csv としてこの原稿、イオン抽出クロマト グラム (EIC) 現在の表示など、クロマト グラムのエクスポートで説明したよりも多くのより便利な操作を実行することが可能です。化合物、および多く。
本稿で提示されたプロトコルは、腺または腺内容昆虫、volatilome 分析、代謝物の同定からの分離に焦点を当て、他の研究者によって実験のための提案として使用できます。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究のための資金はウィーン科学技術基金 (WWTF) LS13 048 ISD にから得た。特別な感謝は、私たちとボルネオ COCY アリについての彼女の知識を共有してダイアン ・ w ・ デビッドソン (ユタ大学; 現在は引退) に移動します。クアラルンプール Belalong フィールド研究センター (KBFSC) とマレーシア ブルネイ ・ ダルサラーム国 (UBD) プロジェクトの承認のと同様、ブルネイの農林部とブルネイの研究とイノベーション センター アリを収集するための許可行政を申し上げますと承認、輸出許可の発行。特別な感謝は、私たちの研究を促進するため UBD と KBFSC スタッフ、特にムハンマド サレ アブドラビン バット、テディ チュアおしっこ李、Masnah Mirasan、Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli、Rodzay Wahab、ちゃんあごメイ、クシャン Tennakoon に移動します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP | Sarstedt | 62,559,001 | see Figure 1 in manuscript |
| PVC Tubings | Rehau | 290 4489 | see Figure 1 in manuscript |
| Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size | Antstore | 1000378 | see Figure 1 in manuscript |
| Freezer | Severin | KS 9890 | -20 °C or lower |
| polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm | Thorsten Koch | 4260308590481 | |
| Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm | Aldrich | BR455742 | |
| Cold pack 150 mm x 100 mm | Elite Bags | 1998 | freeze to -20 °C |
| Bucket with crushed ice | |||
| 1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening | La-Pha-Pack | 11090500 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151799 | |
| Stereomicroscope | Bresser | 5806100 | |
| Forceps, Superfine Tip curved | Medizinische Instrumente May, Norman May | PI-0005B | |
| Forceps, Superfine Tip straight | blueINOX | BL-3408 | |
| Dissection needle 140 mm, pointed, straight | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110301 | |
| Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën | fisher scientific | 15654740 | |
| Distilled water | |||
| Rotizell-Tissue-Tücher | Carl Roth GmbH + Co.KG | 0087.2 | |
| Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % | Carl Roth GmbH + Co.KG | 4442.1 | freeze to -20 °C |
| Vortex Genie 2 | neoLab | 7-0092 | |
| 0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip | La-Pha-Pack | 06090357 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum, 45° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151819 | |
| Alkane standard solution C8-C20 | Sigma-Aldrich | 04070 | |
| Alkane standard solution C21-C40 | Sigma-Aldrich | 04071 | |
| n-Hexane SupraSolv | Merck | 104371 | |
| GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister | Gerstel | ||
| Agilent Gas chromatograph 6890 N | Agilent | ||
| Gooseneck splitless Liner | Restek | 22406 | |
| Helium (5.0 - F50) | Messer | 102532501 | |
| GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent Mass Selective Detector 5975B | Agilent | ||
| MSD ChemStation Data Analysis Application software | Agilent | ||
| MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| Calibration Library for MetaboliteDetector | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| MD Conversion Tool for NIST-library | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 |
References
- Morgan, E. D. Chemical sorcery for sociality: exocrine secretions of ants (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecol News. 11, 79-90 (2008).
- Betz, O. Biological adhesive systems. , Springer. 111-152 (2010).
- Laciny, A., Zettel, H., Druzhinina, I. Workers, soldiers, and gynes-morphometric characterization and description of the female castes of Camponotus singularis (Smith, 1858)(Hymenoptera, Formicidae). Deutsche Entomologische Zeitschrift. 63, 183 (2016).
- Ward, P. S., Blaimer, B. B., Fisher, B. L. A revised phylogenetic classification of the ant subfamily Formicinae (Hymenoptera: Formicidae), with resurrection of the genera Colobopsis and Dinomyrmex. Zootaxa. 4072 (3), 343-357 (2016).
- Davidson, D. W., Salim, K. A., Billen, J. Histology of structures used in territorial combat by Borneo's 'exploding ants'. Acta Zoologica. 93 (4), 487-491 (2012).
- Davidson, D., et al. An experimental study of microbial nest associates of Borneo's exploding ants (Camponotus [Colobopsis] species). Journal of Hymenoptera Research. 18 (2), 341-360 (2009).
- Laciny, A., et al. Colobopsis explodens sp.n., model species for studies on "exploding ants" (Hymenoptera, Formicidae), with biological notes and first illustrations of males of the Colobopsis cylindrica group. ZooKeys. , (2018).
- Maschwitz, U., Maschwitz, E. Platzende Arbeiterinnen: eine neue Art der Feindabwehr bei sozialen Hautflüglern. Oecologia. 14 (3), 289-294 (1974).
- Davidson, D. W., Lessard, J. P., Bernau, C. R., Cook, S. C. The tropical ant mosaic in a primary Bornean rain forest. Biotropica. 39 (4), 468-475 (2007).
- Martin, S., Drijfhout, F. A review of ant cuticular hydrocarbons. Journal of chemical ecology. 35 (10), 1151 (2009).
- Pickett, J. Chromatography and isolation of insect hormones and pheromones. , Springer. 299-309 (1990).
- Tragust, S., et al. Ants disinfect fungus-exposed brood by oral uptake and spread of their poison. Current Biology. 23 (1), 76-82 (2013).
- Menzel, F., Blüthgen, N., Schmitt, T. Tropical parabiotic ants: highly unusual cuticular substances and low interspecific discrimination. Frontiers in Zoology. 5 (1), 16 (2008).
- Hogan, C. T., Jones, T. H., Zhukova, M., Sosa-Calvo, J., Adams, R. M. Novel mandibular gland volatiles from Apterostigma ants. Biochemical Systematics and Ecology. 72, 56-62 (2017).
- Augusto, F., Valente, A. L. P. Applications of solid-phase microextraction to chemical analysis of live biological samples. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 21 (6), 428-438 (2002).
- Davidson, D. W., et al. Nutrition of Borneo's 'exploding' ants (Hymenoptera: Formicidae: Colobopsis): a preliminary assessment. Biotropica. 48 (4), 518-527 (2016).
- Jones, T., et al. The chemistry of exploding ants, Camponotus spp.(cylindricus complex). Journal of chemical ecology. 30 (8), 1479-1492 (2004).
- Voegtle, H. L., Jones, T. H., Davidson, D. W., Snelling, R. R. E-2-ethylhexenal, E-2-ethyl-2-hexenol, mellein, and 4-hydroxymellein in Camponotus species from Brunei. Journal of chemical ecology. 34 (2), 215-219 (2008).
- Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
- Stein, S. Retention indices by NIST mass Spec data Center. NIST Chemistry Webbook, NIST Standard Reference Base. (69), (2010).
- NIST Chemistry WebBook. NIST Standard Reference Database Number 69. , Available from: http://webbook.nist.gov/chemistry/ (2018).
- Cook, S. C., Davidson, D. W. Nutritional and functional biology of exudate-feeding ants. Entomologia Experimentalis et Applicata. 118 (1), 1-10 (2006).
- Abdalla, F. C., Cruz-Landim, C. d Dufour glands in the hymenopterans (Apidae, Formicidae, Vespidae): a review. Revista Brasileira de Biologia. 61 (1), 95-106 (2001).
- Hiller, K. MetaboliteDetector. Documentation. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/wiki/index.php/Documentation (2010).
- Nieke, C. MetaboliteDetector - Development Version. , Available from: http://md.tu-bs.de/system/files/Downloads/MD-Development-Version-Documentation.pdf (2012).
- Hiller, K., Koschnitzki, N. MetaboliteDetector. Download. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 (2017).
