Summary
Mindre arbetstagare av ant arten Colobopsis explodens är dissekeras för att isolera vaxliknande innehållet lagras i deras hypertrophied mandibular körtel reservoarer för efterföljande lösningsmedel-extraktion och analys med gaskromatografi-masspektrometri. Anteckning och identifiering av flyktiga beståndsdelar med hjälp av öppen programvara MetaboliteDetector beskrivs också.
Abstract
Syftet med detta manuskript är att presentera ett protokoll som beskriver metabolomiska analys av Bornean 'exploderande myror' som hör till gruppen Colobopsis Hypocysta (COCY). För detta ändamål är modell arten C. explodens begagnade. Myror som tillhör den mindre arbetare kasten äger distinkt hypertrophied mandibular körtlar (MGs). I territoriell strid använder de trögflytande innehållet i deras utvidgade mandibular körtel reservoarer (MGRs) för att döda rivaliserande leddjur i karakteristiska självmordsbenägen 'explosioner' av frivilliga bristning av den gastral integument (autothysis). Vi visar dissektion av arbetstagaren myror av denna art för isolering av gastral portion av vaxliknande MGR innehållet samt förteckning över de åtgärder som krävs för lösningsmedel-extraktion av de däri inneslutna flyktiga föreningarna med efterföljande gas kromatografi-masspektrometri (GC-MS) analys och förmodad identifiering av metaboliter som finns i extraktet. Förfarandet för dissektion utförs kylda villkor och utan användning av någon dissektion buffertlösning att minimera förändringar i den kemiska sammansättningen av MGR innehållet. Efter lösningsmedelsbaserade utvinning av flyktiga metaboliter som finns däri, presenteras nödvändiga åtgärder för att analysera proverna via vätska-injektion-GC-MS. Slutligen, databehandling och förmodad metabolit identifiering med användning av programvaran med öppen källkod, MetaboliteDetector visas. Med detta synsätt, profilering och identifiering av flyktiga metaboliter i MGRs av myror som hör till COCY gruppen via GC-MS och MetaboliteDetector programvaran blivit möjligt.
Introduction
Det övergripande målet för det arbetsflöde som presenteras här är allmän utredning av kemiska sammansättningar i sekret av insekter. Detta görs med det primära syftet att belysa de ekologiska rollerna av secretionen som helhet eller av enstaka föreningar därav. Dessutom är vi intresserade av att undersöka de metaboliska vägarna bakom de föreningar som finns i respektive sekret. Särskilt körtel innehållet från myrorna (Hymenoptera, Formicidae) har fått stigande intresse under de senaste åren, eftersom de ger källor hittills outforskade potentiellt bioaktiva föreningar (lim, antimikrobiella medel, etc.)1, 2. mindre arbetstagaren myror av vissa arter som tillhör den COCY grupp3,4 föreskriva sådana föreningar som ingår i deras hypertrophied MGRs som sträcker sig från mouthparts att gaster5,6. När hotas av förmodad fiender, mindre arbetstagare av C. explodens7 och vissa relaterade arter kan göra användning av deras MGR innehåll på ett ovanligt sätt: de offra sig själva genom spricker deras gastral vägg för att mata ut klibbiga innehållet i den MGRs explosionsartat på motståndaren, dör varefter förmodade fienden är frihetsberövad och kan även5,6,8,9. Syftet med utvecklingen och användningen av de häri presenteras metoderna var för att förbättra förståelsen av den kemiska sammansättningen och arten av preliminärt toxiska beståndsdelar i denna ant sekretion.
Därför presenterar vi ett protokoll för dissektion av C. explodens arbetstagaren myror att erhålla gastral portion av deras vaxliknande MGR innehåll med efterföljande lösningsmedel-extraktion och analys med GC-MS.
GC-MS-analys är en av de väletablerade metoderna för profilering och identifiering av flyktiga metaboliter (volatilome) från insekter. Typiska analyter i myror inkluderar cuticular kolväten10, semiokemikalier11, och i allmänhet, föreningar med biologisk aktivitet12. Prover kan erhållas från hela djur eller kroppsdelar och kroppsvätskor isolerade via dissektion av insekt13,14. Provberedningstekniker inkluderar extraktion av däri inneslutna metaboliter med användning av lösningsmedel14 eller headspace-fast-fas-microextraction (HS-SPME)15.
För metabolomiska studier är det viktigt att proverna fryses snabbt direkt efter provtagningen, för att minimera förändringar i den kemiska sammansättningen och kvantiteten av föreningarna. Myrorna används för denna studie dödades av snabb nedfrysning på plats i en cool väska fyllda med djupfryst kallt förpackningar. Proverna förvarades sedan i frys-20 ° C med generator-driven elektricitet, innan de transporteras till laboratoriet på torris. Dissektion proceduren presenteras här erbjuder möjligheten att isolera MGR innehållet utan att analysera hela myran eller gaster som helhet, eftersom det har gjorts tidigare för olika COCY arter16,17,18. Dessutom möjliggör presenteras protokollet också direkt tillgång och analys av de omgivande körtlar och vävnader, som den venom körtel (VG)5,8, Dufours körtel (GD)8eller tarmarna i andra biologiska studier, eller Kontrollera om möjligt cross-föroreningar infördes under hantering eller dissektion av myrorna. För att minimera förändringarna i den kemiska sammansättningen av MGR innehållet under dissektion, antingen genom upptining prover eller genom att använda kemikalier, var dissektion processen optimerad för att utföras på en kall-packning (-20 ° C), utan användning av någon ytterligare buffertar, tvättmaskin lösningar eller lösningsmedel. De prover som erhållits via denna metod lämpar sig för kvalitativa och kvantitativa frågor.
Dataanalys i syfte att förmodad metabolit annotering och identifiering sker via programvaran öppen källkod MetaboliteDetector19, som utvecklades för automatisk analys av GC-MS-baserad metabolomik data. Den upptäcker enda ion toppar i kromatogram, utför en avfaltning steg och extraherar de deconvoluted masspektra av kemiska föreningar som ingår i de analyserade proverna. Förmodad identifiering av föreningar med MetaboliteDetector bygger på beslutsamma retention index (RI; Kovats RI kan beräknas automatiskt av programvaran) samt likheten mellan de deconvoluted masspektrum. RI och spektrala match faktor kan vara dubbelkontrolleras mot antingen befintlig referens bibliotek (som kan importeras, om de är i formatet gemensamma NIST), eller mot ett etablerat eget bibliotek. Detta är i enlighet med riktlinjerna för (förmodad) sammansatta identifiering föreslog, t.ex., av den kemiska analysen arbetar gruppen (CAWG) av metabolomik standarder initiativ (MSI), där minst två oberoende och ortogonala data i förhållande till en äkta förening (här retention tid (RT) /RI och masspektrum) analyseras identiska experimentella förhållanden föreslås som behövs för att bekräfta icke-romanen metabolit identifieringar20.
Komplett experimentet utförs på MGR innehållet av COCY modell arten C. explodens, men stegen dissektion kan också anpassas till isolera de andra körtlarna som finns i den ant gaster. Dessutom kan presenterar vi ett protokoll för den omfattande analysen av volatilome av MGR innehållet, de mer generella delarna av arbetsflödet som beskriver extraktion, GC-MS mätning och data utvärderingen också användas för analys och (förmodad) identifiering av flyktiga metaboliter i allmänhet.
Eftersom de experiment som beskrivs i detta manuskript utförs på insekter, krävs ingen etisk godkännande. Fältarbete, provtagning av myrorna, liksom deras användning för publicering är förenliga med de riktlinjer som reglerar detta projekt genom den Universiti Brunei Darussalam, Bruneis forskning och Innovation Centre och Bruneis skogsavdelningen, Brunei Darussalam.
Protocol
1. insamling av myror
- Samla in mindre arbetstagaren myror med användning av en insugningsventil (figur 1).
- Omedelbart efter provtagningen, fixa myrorna genom snabb frysning vid-20 ° C och lagra dem på detta eller lägre temperatur tills analys.
2. isolering av MGR innehåll och GD från myrorna
- Innan dissektion av myror, förbereda följande:
- Ren glaset petriskål och dissektion instrumenten med hjälp av en blandning av metanol-vatten (MeOH/H2O; 1 + 1 v/v) och vävnader.
FÖRSIKTIGHET: MeOH är giftigt för människor. Alltid bära lämpliga handskar, en laboratorierock och skyddsglasögon och utföra rengöring under ett dragskåp. - Frysa den kall-packning och glaset petriskål till-20 ° C.
- Bestämma massorna 1,5 mL kort tråd injektionsflaskor inklusive skruvkapsyler med silikon/polytetrafluoreten (PTFE) septa och hålla dem på isen direkt bredvid mikroskopet.
Obs: Valet av provet injektionsflaskan är valfritt. Här sätts MGR innehållet direkt i kylda 1,5 mL injektionsflaskor av glas. Plast kan innehålla föreningar (t.ex. ftalater) som kan orsaka artefakter, som stör signalerna av målet metaboliter. - Placera det frysta cold-Packet i en låda gjord av extruderad styrencellplast. Placera Petri skålen på toppen av kalla förpackningen och Lägg en fryst Myra i skålen. Montera rutan under en stereo Mikroskop. Justera förstoringen (20 – 40 X) och fokus tills hela myran kan ses tydligt.
- Ren glaset petriskål och dissektion instrumenten med hjälp av en blandning av metanol-vatten (MeOH/H2O; 1 + 1 v/v) och vävnader.
- Kontrollera den frysta ant för integriteten hos dess gastral fack. För dissektion, ta bara myror med en intakt gaster region (figur 2A, B). Utesluta myror med platt gasters eller spår av härdade MGR innehåll på deras kroppens ytor från ytterligare analys (figur 2 c, D).
- Hugg efter den valda ant med ett par spetsig pincett på propodeum (första abdominal-segment) och med det andra paret av tången på bladskaft (näst buk segment). Lossa gaster regionen genom att försiktigt dra bort från resten av ant kroppen (figur 3A).
- Fixa den nu separerade ant gaster genom att hålla den med spetsig pincett på tergite 4. Ta tag tergite 1 (ligger bredvid bladskaft) med ett annat par spetsig pincett och ta försiktigt bort det genom att dra den bort (figur 3B). Upprepa detta även för tergites 2 och 3 (figur 3 c, D) tills gastral portion av MGRs (gul färgade i C. explodens arbetstagaren myror, men färgen på MG innehållet kan variera från vit över gult till rött i andra arter) är synlig för mest en del.
Obs: Genom att ta bort exoskelett, membranet i MGR också delvis försvinner. - Genom användning av en dissektion nål, ta försiktigt bort vaxliknande innehållet i de ihopkopplade MGRs genom att skrapa dem ur gastral facket (figur 3E). Bara ta bort de delarna av MGR innehållet som kan isoleras utan spricker andra körtlar som är närvarande i den ant gaster. Om mer kraft eller ansträngningar måste tillämpas för att erhålla MGR innehållet som helhet, att acceptera dess ofullständiga avlägsnande (figur 4).
- Plocka upp MGR innehållet genom att försiktigt röra vid dem med spetsen på dissektion nålen tills de fastnar på den. Sedan överföra MGR innehållet i en kyld 1,5 kort tråd injektionsflaskan med känd Taravikt massa.
- Ta bort klibbiga MGR innehållet från spetsen av dissektion nålen, flytta nålspetsen på väggen i injektionsflaskan med prov och smutskasta dem på väggen. Stäng flaskan och placera den på is tills nästa MGR innehållet är isolerade.
- För att senare kontrollera eventuella korskontaminering av MGR innehåll provet av föreningar med ursprung från intilliggande GD (avsnitt 6), också samla DGs från myror, där de är fortfarande intakt (figur 4) och sätta dem i en separat HPLC-injektionsflaska.
- Alltid rengöra petriskål och dissektion instrument med MeOH/H2O (1 + 1 v/v), när du byter från körteln till körtel eller från ant till ant.
- För ett analysprov, kombinera reservoar innehållet eller körtlar av flera myror.
Obs: Antalet körtlar eller deras innehåll som används för ett analysprov kan variera beroende på experiment design. Här, var antingen MGR innehållet eller av fem myror generaldirektorat poolade för att erhålla ett analysprov.
3. lösningsmedel-utvinning av isolerad körtel innehållet
- Bestämma massorna av de analytiska proverna (här, MGR innehållet eller intilliggande körtlar poolats från fem myror).
- Lägg till iskall högrena etylacetat (EtOAc) i ett konstant förhållande av 1:14 volymvikt och vortex proverna för 5 min kylda villkor; Här utförs vid 7 ° C i ett Termostatstyrt laboratorium.
- Centrifugera proverna för 10 min vid 3 820 x g vid 7 ° C och överföra supernatanterna (ca 55 – 75 µL för MGR innehåll extrakt som erhålls från fem myror) till nedkylda 1,5 mL kort tråd injektionsflaskor innehållande 0,1 mL mikro-vändskär. Tätt försegla flaskorna med skruvlock innehållande hål och röd gummi/PTFE septa.
Obs: Om analys inte kan genomföras omedelbart, hålla extraktet vid-80 ° C tills analys, men det rekommenderas att analysera prover omedelbart efter beredning för att minimera risken för kemiska förändringar under frysning/upptining cykeln.
4. GC-MS
- För en fullständig sekvens för mätning av GC-MS, förbereda följande lösningar, varje i en injektionsflaska med 1,5 mL i korta tråd:
- Förbered blandningen RI standard genom att späda ut de kommersiellt tillgängliga alkane standardlösningarna till en slutlig koncentration på 8 mg/L per förening använder hexan.
- Förbereda en lösningsmedel-tom bestående av ren EtOAc.
- Plats i injektionsflaskor innehållande 1) lösningsmedel-tomt, 2) RI standard blandning, 3) MGR innehåll extrahera, och 4) GD innehåll extrakt i kylda facket (10 ° C) av den autosampler kopplat till gaskromatografen (GC).
Obs: Det rekommenderas att minimera tidsspannet varje injektionsflaska förvaras i autosampler före mätning. För kritiska prover, som MGR innehåll provet, kan injektionsflaskan placeras i autosampler omedelbart före analys. - För varje prov, injicera en 1 µL alikvotens i GC-MS för kromatografisk separation på en kolumn som är lämplig för föreningarna som mål (här: HP - 5MS UI kolumn).
- Ange lämpliga GC parametrar, som kan se ut enligt följande:
- Använda helium som bärgas och ställa in en konstant kolumn flödet av 1 mL/min. Ställ en ugn temperatur ramp start från 40 ° C med en stadga för 2 min, följt av en ramp på 10 ° C/min upp till 330 ° C med hålltid på 7 min. inställd ingångstemperatur på 270 ° C.
- Välj och justera vid behov split kvoterna för GC-MS injektion som resulterar i adekvat peak former och stödnivåer för föreningar av intresse (figur 5).
Observera: I exemplet presenteras var det nödvändigt att mäta GD extraktet på split förhållandet 2:1 och RI standard blandningen i splitless läge. MGR innehåll extraktet analyserades på split förhållandet 2:1 och en andra gång på 50: 1. - Ställa in AUX temperaturen till 350 ° C.
- Ange parametrarna för den-masspektrometer (MS) enligt följande: MS källa temperatur 230 ° C, MS Quad temperatur 150 ° C, skanningsområde från låg massa 30 till högmässa 500, lösningsmedel fördröjning 4,1 min (för lösningsmedel-blank och experimentell prover) eller 6,1 min (för RI standard blandning) , respektive. Inställt cirka 3 skanningar/s samplingshastighet.
Obs: MS parametrar, särskilt den MS scan-, samplingshastighet, och cykeltid kan påverka peak plockning och spektrum deconvolution och måste beaktas när du väljer parameterinställningar för korrekt resultatutvärdering med programvaran MetaboliteDetector.
- Ange lämpliga GC parametrar, som kan se ut enligt följande:
- När mätningen är klar exportera som. AIA-projekt fil (utförs här med användning av data analys programvaran levereras med GC) på en bärbar datalagring.
- Välj fil | Exportera data till AIA format..., sedan kolla Skapa ny katalog och klicka på OK. Välj önskad lagringsplats (t.ex., USB-flashminne) och klicka på Öppna. Välj filerna som ska exporteras och slå på ---> ikonen. Bekräfta med att klicka på processen.
5. metabolit detektering och identifiering med hjälp av MetaboliteDetector programvara
- Innan du startar analysen av datan arkivera, öppna MetaboliteDetector och välj verktyg | Inställningar, och ange parametrarna som krävs enligt följande (enskilda ark med MetaboliteDetector indikeras i fetstil):
- I bladet utseende, ange tidsskalan till Min och aktivera alternativet axlar etiketter.
- I bladet Deconvolution, ställa in parametrar för Peak inställningar till: Peak tröskel: 10 och Minimum topphöjd (buller enheter): 10. Avmarkera möjliggörande av baslinjen justering. Ställa in parametrar för metaboliten upptäckt att: lagerplatser och skanning: 10, Deconvolution bredd (skanningar): 5, krävs intensitet (% av basen peak): 0 och erforderligt antal toppar: 10.
- I bladet identifiering, ange alternativet Sök i biblioteket till: sammansatta Lib: 'CalibrationLibrary_Alkanes' och att NIST (NIST sqlite bibliotek kan ingå i formatet .lbr). Ställa in parametrar som följer: Max. RI skillnaden: 10, Cutoff Poäng: 0.9, Pure/orent sammansättning: 0.5, antal fragment: 2, Minimum antal identiska frag.: 1. Använd skalas lib: kryssas; Likheten Poäng: Spec. likhet; Massa filter: m/z 207, 221, 281, 355 och 1147 (för kända föroreningar som härrör från den stationära fasen av GC-kolumnen).
- I bladet sätts kvantifiering parametrar till: antal kvantifiering joner: 3, minimala avståndet mellan efterföljande joner: 5 och Minimal krävs Kvalitetsindex: 1. utesluta kvantifiering jonerna 207, 221, 281, 355 och 1147.
Obs: Vid hög upplösning MS data, dessutom ange följande parametrar i bladet centroiden till: Peak tröskeln börjar: 10, Peak tröskel slut: -5, och Maximal baslinje avstånd: 30, FWHM: 0,5.
- Importera filerna i den. CDF-format som ingår i den genererade. AIA-projektfil som. NetCDF i MetaboliteDetector programvara genom att välja fil | Importera | NetCDF import. Välj ikonen mapp-formade och markera sedan filerna i kategorierna provet som skall importeras och behandlas: 1) lösningsmedel-tomt, 2) RI calibrants, 3) MGR innehåll extrakt och 4) GD innehåll extrakt. Bekräfta med OK för att starta databehandling. Efter bearbetning, Välj Stäng i fönstret som visas.
- Välj filen för RI kalibrering och bestämning av RI värdena för föreningar som ingår i MGR extraktet | Öppna och välj den fil som innehåller data för de RI-calibrants.
- När RI standard filen öppnas, Välj förstoringsglaset . Bekräfta det visasende fönstret med OK.
- För korrekt RI kalibrering, kolla utbudet av detekterbara alkaner i filen RI standard.
- Därför Välj triangeln som visas under maximum av den första toppen, med ursprung från den första Alkan (med den lägsta RT, figur 6) kan upptäckas genom att klicka en gång på den.
- Kontrollera hit med högsta spektrum likheten ('Spec. sim.', max poäng = 1) jämfört med alkane bibliotek posterna (figur 6).
- För att verifiera identiteten hos den föreslagna Alkan förening, jämföra dess masspektrum till massa spektrumet i litteraturen, exempelvis NIST kemi WebBook22.
- Avgöra den sista Alkan detekterbara i RI standard blandningen genom att räkna till sista alkane toppen i kromatogrammet.
- För RI kalibrering, Välj verktyg | RI-Calibration Wizard. Välj Nästa.
- Klicka på ikonen för mappen-formade och välj filen som innehåller kromatogrammet för RI standard blandningen. Välj Nästa.
- Välj det bibliotek som innehåller poster för den Alkan calibrants i fönstret dök upp.
- Markera de bibliotek transaktionerna av alla alkanes detekterbara i RI standard filen och klicka på den >> ikon. Efter att ha valt >>, välja Nästa.
- Kontrollera den RTs som anges för varje detekterbara alkane i tabellen visas. I detta syfte kontrollera den RTs som skildras i huvudfönstret för varje alkane genom att klicka på respektive triangeln (figur 7). Om nödvändigt (figur 8), korrigera RT i kalibreringstabellen manuellt genom att dubbelklicka i fältet respektive, skriver att välja droppa-ned menyn, och välja rätt föreslog RT. Alternativt i RT med hjälp av tangentbordet ( (Se figur 9).
- När RT för varje alkanen är korrekt, Välj Nästa. Klicka på Nästa i fönstret visasende visar tabellen RI kalibrering.
- Välj symbolen grön + i fönstret visasende Kromatogrammet urval , Välj datafilen av lösningsmedel-Tom och filer av körteln extrakt och välj Nästa. Ställ in parameterinställningarna i fönstret visas följande: inaktivering av baslinjen justering, Peak tröskel: 5, Minimal topphöjd: 5, lagerplatser och skanning: 10 och Deconvolution bredd: 5. slå Nästa och sedan börja att utföra RI beräkningen av de föreningar som ingår i de valda exempelfilerna.
- För anteckning och identifiering av de valda metaboliterna MGR extraktet, öppna datafilen uppmätta MGR innehåll extraktet, som RIs har beräknats enligt ovan (steg 5.3.9), genom att välja fil | Öppna och välja den önskade data i filen.
- Välj verktyg | Inställningar | Deconvolution och ändra tröskeln Peak samt den minsta topphöjden (buller enheter) både till 5. Välj ikonen förstoringsglaset och bekräfta fönstret visasende varning igen med OK.
- Klicka på en triangel visas under högst en topp sevärdheter och jämföra dess masspektrum med de som finns i NIST-biblioteket genom att välja ikonen NIST .
- Välj den första resulterande träffen av NIST-sökning (figur 10).
- Om den resulterande spektrum likheten av sammansatta av intresse är över den valda spektrum likhet poängen (här ≥ 0.9) jämfört med en NIST-post (figur 10), leta upp RI (för liknande stationära fasen av GC kolumn, filmtjocklek och kolumn diameter) ges för denna förening i litteraturen (t.ex. NIST kemi WebBook22).
- Beräkna den relativa skillnaden mellan referensen NIST RI (eller de i genomsnitt RIs när flera RI värden ges) och den experimentellt härledda RI. Om skillnaden är lika eller mindre än den användarspecificerade tolererade maxvärdet (här, ≤ ±1%), utse föreningen som kommenterad' '.
- Upprepa steg 5.4.2–5.4.5 för alla föreningar av intresse i MGR exempelfilen.
- För sammansatta identifiering, jämföra RI och masspektra av standardlösningar (t.ex. 2 – 100 mg/L) mätt på samma villkor som beskrivs i avsnitt 4 till dem av de kommenterad föreningarna.
- Analysera standarden som förklaras i avsnitt 4 och bearbeta resulterande data enligt beskrivningen för Alkan- och MGR innehåll körtel data i steg 4.4 och 5.2.
- Kalibrera de uppgifter som erhållits från standarden genom att välja verktyg | RI-calibration Wizard | Nästa och välja samma RI standard fil som används innan. Välj Nästa, sedan igen Nästa och välj den fil som innehåller data förvärvas från standardlösningen i grön + -symbolen. Tryck Nästa och sedan börja att beräkna RI för standard föreningen.
Obs: Om analysen av standarden inte kan utföras omedelbart efter provanalys, det rekommenderas att analysera RI calibrants igen och att utföra nya RI kalibrering och beräkning för standarden. - Öppna filen respektive för standard och bekräfta sin identitet genom att jämföra dess spektrum med NIST-biblioteket som förklaras i steg 5.4.2.
- Efter bekräftelse av standarden identitet, tillsätt masspektrum och RI av standarden sammansatta till hotellets bibliotek. För detta ändamål, klicka på symbolen grön + och ange önskat namn i posten bibliotek. Bekräfta med OK att lägga till massa spektrumet och RI av standarden sammansatta till biblioteket. Om den nya posten inte kan ses i biblioteket, aktivera knappen Uppdatera .
Obs: Om RI kalibreringen utfördes framgångsrikt, de RI som bestäms av MetaboliteDetector visas i respektive bibliotek-post. När du har skapat posten bibliotek för standarden, identifiering av denna metabolit i MG extrakt baserat på en kombination av RI och spectra likheten är möjligt. - Öppna filen MGR innehåll igen. Välj verktyg | Inställningar | Identifiering. Nu, som RI av standard föreningen beräknas och tillsätts posten bibliotek, ändra den Likheten Poäng från Spectrum likheten till Kombinerade Poäng.
- Klicka på förstoringsglaset och välj triangeln under den förening som har beskrivits i steg 5.4.5.
- Klicka in på träffen och kontrollera värdet för den 'likheten totalpoängen' (OSS, förkortat av metaboliten detektorn som 'Övergripande simil.'), med tanke på en kombination av spektrum likheten och RI likheten Poäng (figur 11).
Obs: Om en träff hittades i hotellets bibliotek, det kommer att visas till höger i huvudfönstret. - Om OSS är tröskelvärdet för användardefinierade (här ≥ 0.9, också anges med grön färg på triangeln), utse föreningen som 'identifierade' (figur 11).
6. kontroll av MGR innehåll extrakt för föroreningar av GD innehåll
- Öppna filen kalibrerad av GD provet som RIs föreningar redan har beräknats med MetaboliteDetector (steg 5.3.9).
- För en överlagring av kromatogrammet erhålls efter mätning av MG innehåll provet och GD provet, Välj verktyg | Kromatogrammet overlay och välj de två respektiva filerna via ikonen gröna + . Bekräfta med OK.
- Visa överlägget, välja bladet visasende Kromatogrammet Overlay på botten av fönstret.
- Kontrollera för överlappning av föreningar mellan halten MGR extrahera (figur 12) och GD innehållet extrahera och Exkludera överlappande föreningar från ytterligare MGR innehållsanalys.
Representative Results
En schematisk arbetsflöde de experimentella huvudstegen förmodad metabolit identifiering i körtel sekret från C. explodens visas i figur 13. Dessutom ges en schematisk översikt över de viktigaste kroppsdelar av COCY arbetstagaren myror används för presenterade experimentet som kompletterande figur S1 A, B. De stora steg från dissektion av myrorna tills förmodad metabolit identifiering i MGR innehållet illustreras i Kompletterande figur S2.
För att isolera MGR innehållet lämpar sig för volatilome analys, kvarstod ett kylt tillstånd under transport, lagring, och även under processen dissektion. I detta syfte frystes myrorna omedelbart efter sin samling med användning av en insekt hygienfilter (avsnitt 1 och figur 1) i situ. Efter förvaring i 2 dagar i frys-20 ° C transporterades ant proven på torris till Österrike, där de omedelbart sattes vid-80 ° C tills vidare analys. Myror lämplig väljas för isolering av innehållets MGR uppvisar en gaster region som är runda och intakt (figur 2A) och i bästa fall välfylld med MGR innehåll, som indikeras av MGR synliga mellan tergites (figur 2B). Gasters av myror som inte är lämpliga för vidare analys visas i figur 2 c, D. De viktigaste stegen (steg 2.3-2.6) involverade i processen isolering av MGR innehållet från COCY myror illustreras i figur 3. Isolerade MGR innehållet (gul C. explodens, men färgerna kan variera från vitt till rött i andra arter som tillhör gruppen COCY) visas i figur 14.
När dissekera myrorna för deras MGR innehåll, bör vara försiktig att inte punktera eller brista eventuella andra körtlar eller tarmarna (steg 2.5). Figur 4 visar en dissekerade ant gaster som fortfarande innehåller två andra, intakt körtlar (GD och VG) efter isolering av halten MGR. Ett exempel på synlig kontamination av innehållet av ant tarmarna visas i figur 15. Eftersom korskontaminering med GD innehållet, ligger under MGR, inte kan undvikas helt, avbildas en del av protokollet för att analysera dessa körtlar för jämförelse av resulterande signaler med signalerna från MGR innehåll extraktet (avsnitt 6). När förfarandet dissektion sker korrekt, är det möjligt att få ca 0,75-1.2 mg MGR innehåll per ant. För protokollet beskrivs här var MGR innehållet i fem myror poolade för att ta emot upprepade prover av 3,9-5,9 mg vardera.
Isolerad körtel reservoar innehållet var extraheras med EtOAc (avsnitt 3) och analyseras av GC-MS (avsnitt 4). Mätning av MG innehåll extrakt av C. explodens arbetstagaren myror resulterar i ett kromatogram bestående av toppar och masspektrum för dussintals förmodad MGR innehåll föreningar (figur 5). De två dominerande metaboliter 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-ethanone (ID 4) och 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (ID 5) MG innehåll extraktet orsakade kolumn överbelastning, varför samma prov analyserades igen split på en högre förhållandet mellan 50: 1 ( Figur 5, infälld). Möjliga korskontaminering av MGR innehållet av väljare GD exempelvis vore synlig som ytterligare toppar i GC-MS kromatogrammet uppvisar sena RTs, start från ca minut 29 (figur 12). Exklusive kromatografiska toppar och masspektrum föreningar också återfinns i lösningsmedel är tomt, med ursprung från den stationära fasen i kolumnen GC eller från innehållet i GD i den ant gaster och efterföljande behandling med MetaboliteDetector programvara resulterade i cirka 110 MGR innehåll föreningar med en signal till brus baserat på ≥ 10. För senare metabolit annotering och identifiering med programvaran MetaboliteDetector, kromatogram kalibrerades och RI värdena bestämdes för uppmätta exempelfilerna (steg 5.3 och delsteg, figur 6, figur 7 , Figur 8 , (Se figur 9). De upptäckta förmodad MGR innehåll metaboliterna var annotated baserat på en kombination av spektrumet liknar NIST-biblioteket, som utgjorde en integrerad del av programvaran MetaboliteDetector i exemplet presenteras (steg 5,4 och delsteg, figur 10 ). Dessutom RI värden det finns i litteraturen för samma eller jämförbar stationär fas, filmtjocklek och diameter på kolumnen GC ansågs för sammansatta annotation (steg 5.4.4 och 5.4.5). Efter inställning strikt matchningskriterier och bekräftelse av RIs och masspektrum genom användning av standarder, som förklaras i avsnittet protokoll för en standard förening (steg 5.4.7-5.4.15 och figur 11), var det möjligt att bekräfta identiteten för ca 10 % av de upptäckta metaboliterna. Eftersom en detaljerad rapport om volatilome av C. explodens MGR innehåll publiceras någon annanstans, föreliggande studie fokuserade på de metaboliter som har redan beskrivit i en tidigare publikation Jones et al. 17 (arter häri utsetts KB02-108; Se även Cook et al. 23). tabell 1 ger en översikt över dessa identifierade föreningar.
Figur 1: Schematisk ritning av en insekt insugningsventil. Till ett lock som tätar en flaska eller behållare, görs två hål, där två slangar sätts. Öppnandet av en tub (T1) som vetter mot insidan av flaskan försluts med en maskstorlek som är fin nog att blockera insekter. Dessutom görs hål i röret att underlätta utbyte av luft. I slutet av röret T2 är pekade noga mot insekter som sugs in i injektionsflaskan med provtagning av aspirera genom T1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: intakt jämfört med trasiga gaster. (A) intakt gaster lämplig för dissektion. (B) intakt gaster nästan helt fylld med MGR innehåll, även lämplig för dissektion. (C) och (D) brutit ant gasters med utkastade och härdade MGR innehåll (gul), möjligen bruten under bristning av den gaster integument under provtagning. Dessa myror är undantagna från dissektion, utvinning och vidare analys. T: tergite. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: stora steg involverade i processen dissektion. (A) Separation av gaster regionen från resten av ant kroppen. (B) Peeling off exoskelett: tergite 1, tergite 2 (C) och tergite 3, varefter innehållet i de ihopkopplade gul färgade MGRs är nästan helt synlig (D). (E) ta bort klibbiga MGR innehållet med hjälp av en dissektion nål. T: tergite. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Ant gaster efter isolering av MGR innehållet. De två andra körtlarna som finns i gaster (VG: venom körtel, och GD: Dufours körtel) kan ses. Efter avlägsnande av MGR innehållet (rester efter isolering kan ses i gult), bör båda fack fortfarande intakt. Dessa körtlar kan analyseras på samma sätt som MGR innehållet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa totala ion nuvarande (TIC) kromatogram av MGR innehåll extraktet. De två vanligast förekommande GC-MS topparna resulterade i mer symmetriskt formade kromatografiska toppar, när en högre delningsfaktorn (50: 1) valdes i stället för det vanliga förhållandet 2:1 (se infälld). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: bestämning av första detekterbara alkane i RI standard kromatogrammet. Triangeln under peak högst den första Alkan-toppen är markerad. Alkanen eluerar vid 6.31 min och visar högsta spektrum likheten (här, 'Spec. sim.') till posten bibliotek 'Alkane_C09'. För att bekräfta alkane identitet, är masspektrum jämfört med ett bibliotek (t.ex. NIST kemi WebBook22). I exemplet presenteras identifieras nonan av dess molekylära jonen med ett m/z-värde av 128. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: RI kalibrering med hjälp av en n-alkane standard blandning. Den RI standard datafil har öppnats och funktionen 'RI-kalibrering-Wizard' valt. Rätt matchning av retentionstiden i RI som skildras i kalibreringstabellen bör kontrolleras. RT 6.31 min för alkane_C09 (nonan) visas korrekt i tabellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: fel RTs visas i kalibreringstabellen. RTs visas inte korrekt (antingen visas genom ett fel RT-värde eller ett saknat RT värde visas som -1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Manuell korrigering av fel RTs i kalibreringstabellen. Fel värden kan korrigeras manuellt genom att infoga rätt RT för de respektive alkanen, som visas här för Alkane_C39. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: jämförelse av masspektrum av valda förening till NIST-bibliotek transaktioner. När du har valt den peak maximal eluering på 6,16 min (RI 891) och aktivering av funktionen 'NIST-söka' (röd cirkel), visas ett spektrum likheten mellan 0,99 för 2-heptanon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: metabolit identifiering MGR innehåll extraktet. Masspektrum och den RI med ursprung från den sammansatta eluering på RI 891 i kromatogrammet för provet jämförs med eget bibliotek posterna som innehåller RIs och spektra av uppmätta standard föreningar. Om Poäng för den övergripande likheten (OSS, förkortat i metaboliten detektor 'Övergripande simil.' genomföra masspektrum och RI) mellan en förening i hotellets bibliotek och en förening i provet filen är ≥ 0.9, föreningen betecknas som 'identifieras'. Här är OSS mellan posten eget bibliotek av 2-heptanon och den sammansatta eluering på RI 891 0,96, vilket resulterar i identifiering av 2-heptanon MGR innehållet extrahera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 12: överlagring av TIC kromatogrammet sektioner (min 29 till min 35) av GD innehållet extrahera (röd) och MGR innehållet extrahera (blå). Topp arealerna för överlappande (förmodad) föreningar är högre i GD innehåll extrakt än i MGR innehållet extrakt; dessa föreningar potentiellt härstammar från GD och betraktas därför som (mindre) föroreningar i MGR innehållet extrakt. När det gäller C. explodens MGR innehåll extraktet, kromatografiska toppar med ursprung från en förmodad GD förorening kan hittas på cirka 29 min, och denna del av kromatogrammet kan undantas från ytterligare analys av MGR innehållet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 13: Schematisk arbetsflöde från ant prover till metaboliten anteckning/identifiering i körtel reservoar innehåll extrakt efter GC-MS analys. Det protokoll som presenteras här förklarar alla experimentella åtgärder från isolering av MGR innehållet via dissekering av myran och GC-MS analys samt data utvärdering (anges i svart). Som ett alternativ, kan insekt utsöndringen också vara genererade och insamlade i situ (visas i grått). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 14: isolerade vaxartad MGR innehållet före extraktion. (A) innehållet i de två MGRs hålla ihop, men (B) de kan också vara separerade efter isolering. I C. explodens, färgen på MGR innehållet är orange-gul, men kan variera från vitt till rött i andra arter i gruppen COCY. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 15: Illustration av en isolerad MGR sekretion smittat av beståndsdelarna i den insektsvaxer tarmar (brun). Dessa typer av MGR isolat är undantagna från utvinning och vidare analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| ID | Metaboliten | Trivialt namnge | InCHI sträng | Summaformel | ||||||
| 1 | Heptan-2-one | InChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/ h3 - 6H 2, 1-2H 3 | C7H14O | |||||||
| 2 | n-Undecane | InChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3 | C11H24 | |||||||
| 3 | n-Heptadecane | InChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3 | C17H36 | |||||||
| 4 | 1-(2,4,6-Trihydroxyphenyl)-ethanone | Monoacetylphloroglucinol | InChI = 1S/C8H8O4/c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 3 - 7 (8) 12/h2-3,10-12H, 1H 3 | C8H8O4 | ||||||
| 5 | 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-One | Noreugenin | InChI = 1S/C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5/h2-4.11, 13H, 1H 3 | C10H8O4 | ||||||
Tabell 1: metaboliter identifierades i EtOAc extrakt av MGR innehållet isolerade från C. explodens mindre arbetstagaren myror. Valda metaboliter presenteras.
Kompletterande figur S1. Översikt över de viktigaste kroppsdelar som tillhör COCY myror (mindre arbetare) presenteras i detta manuskript. (A) The MGRs visas i gult. Deras gastral delen används för volatilome analys. (B), gastral portion av MGRs ligger nedanför tergites 1 till 3. T: tergite. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande figur S2. Schematisk översikt över presenterade experimentet. De stora steg från dissektion av myran tills förmodad identifiering av metaboliter i MGR innehållet är illustrerade. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Discussion
I detta manuskript presenterar vi ett komplett protokoll för att analysera volatilome av innehållet i de hypertrophied MGRs av C. explodens mindre arbetstagaren myror. Eftersom myrorna används här kan ”explodera” och mata ut deras MGR innehåll okontrollerat vid beröring med pincett, är det rekommenderat att använda en 'mjuka' samling teknik som tillhandahålls av en insekt hygienfilter (figur 1). För vissa ant arter inklusive COCY myror, kan det vara nödvändigt att begränsa det maximala antalet myror till fem personer per 50 mL injektionsflaska, eftersom annars självförgiftning av myrorna (t.ex. genom ackumulering av myrsyra i headspace) kan förekomma. För frysning myrorna i fältet, får en cool väska fyllda med djupfryst kallt förpackningar användas. Proverna bör frusna snabbt och lagras kylda villkor (t.ex., -20 ° C, bästa vid-80 ° C), men det rekommenderas inte att döda och lagra myrorna i flytande kväve, eftersom ökad skada i deras körtlar har observerats med denna metod.
Metoden presenteras buffert - och lösningsmedelsfri dissektion är lämplig för att erhålla vaxliknande mandibular körtel reservoar innehållet samt andra körtlar närvarande i frysta arbetstagaren myror. För volatilome analys av MGR innehållet i C. explodensär viktiga aspekter beaktas under dissektion kontinuerlig kylning av myran (steg 2.1.4) och minimera cross-föroreningar av MG prov med andra körteln innehåll/vätskor i den ant gaster (steg 2.5, figur 4och figur 15). En betydande del av frysta myrorna skadas, antingen eftersom myrorna 'exploderade' under provtagning eller var transportskadad på torris från webbplatsen för provtagning till laboratoriet. Om regionen gaster är trasig, är dessa myror inte lämpliga för vidare analys (figur 2 c, D). Om bara antenner och ben saknas eller ã¤r brutna, kan dessa myror fortfarande användas för utvinning av MGR innehåll och ytterligare analys. Eftersom MGR innehåll kyls har C. explodens myror en vaxliknande konsistens är det enkelt att isolera dem med användning av dissektion nålar (steg 2.5, figur 3Eoch figur 14). Ytterligare försiktighet måste vidtas vid hantering av den klibbiga MGR innehåll. Det kan sticka till något komma i fysisk kontakt med det och också ofta följer dissektion tången, vilket ökar risken för förorening av andra prover. Det är nödvändigt att bara röra MGR innehållet med dissektion nålen och omedelbart överför det till i injektionsflaskor av glas som används för utvinning (steg 2.5 och 2.6). Dessutom rekommenderas att rengöra dissektion utrustningen med en MeOH/H2O blandning när du växlar mellan myror eller körtel-typer (steg 2,8).
Körtel innehållet i andra ant arter kan finnas i flytande form även under kyla med kallt förpackningar. I detta fall hela körteln inklusive membranet kan först isoleras och punkterade efteråt för att få innehållet. Flytande sekret kan också erhållas med hjälp av fina kapillär pipetter. Med en genomsnittlig kroppslängd på ca 4-5 mm (utan antenner) tillhör arbetare av C. explodens de mindre arterna i gruppen COCY. Deras ofta svullna gaster består av ca 2-2,5 mm i längd och 1-1,5 mm i bredd. Arbetstagare av så vitt största kända arter i gruppen COCY kan nå en storlek av ca 8 mm i kroppslängd med en gaster av ca 3 mm i längd och 2,5 mm i bredd. Eftersom protokollet är väl lämpad att dissekera och utreda enskilda myror och gasters av den storleken av olika COCY arter, här används dissektion instrument och mikroskopet kan behöva anpassas för att vara tillämplig för mindre myror eller mindre organ. Dessutom kanske antalet myror per analysprov ökas också.
Samtidigt dissekera myran för MGR innehållet, är det viktigt att inte skada någon andra körtlar eller tarmarna - vars innehåll kan cross-förorena provet (steg 2.5, figur 4 och figur 15). I optimala fall, hålls efter utvinning av MGR innehållet, generaldirektoratet, samt VG synbart intakt (figur 4). Föroreningar med innehållet GD, som ligger under MGRs, är svårt att helt undvika. Orsakerna till detta kan även partiell störningar körteln integritet under transport på torris från provtagning-webbplatsen till laboratoriet. Det är också möjligt att generaldirektorat som skadats under provtagning eller håller på att explodera, som vi har märkt för MGR i ett antal undersökta myror. Eftersom GD innehållet kan analyseras på samma sätt som MGR innehåll (avsnitten 3 och 4), kan resultaten jämföras med resulterande data efter analys av MGR innehåll proverna (avsnitt 6). När det gäller MGR innehåll extrakt erhållits från C. explodens myror, börja de föreningar som också ingår i GD eluera sent i kromatogrammet (figur 12). Att förhindra att ta miste på GD föreningar för MGR beståndsdelar, respektive metaboliterna kan undantas från ytterligare analys. Det är känt att generaldirektoraten kan också innehålla (mycket) volatila föreningar1,24, som vanligtvis eluera tidigt i GC-kromatogrammet från studier på andra ant arter.
I tidigare studier behandlar den kemiska sammansättningen av MGR innehållet i COCY myror, hela myror eller deras hela gasters var analyserat16,17,18,23, medan här i MGR innehållet själva erhölls via dissektion av myrorna.
Analysera dissekerade MGR innehållet tillåter utredarna att utföra en rad biokemiska studier, inklusive identifiering av metaboliter som finns däri. Eftersom den utförda studien här fokuserar på identifiering av flyktiga beståndsdelar som ingår i MGR av C. explodens, valdes GC-MS för sin analys (avsnitt 4). För detta, bör extrakten idealiskt mätas omedelbart efter beredning eller lagras vid-80 ° C fram till analys. Det bör noteras att (extended) lagring kan orsaka kemiska förändringar av extrakt (se anteckningar efter steg 3.3 och 4.2). Eftersom koncentrationen av MGR innehållet kan omfatta en rad flera storleksordningar, kan det vara nödvändigt att analysera MGR extrakt på olika GC split nyckeltal. Eftersom de två huvudsakliga föreningarna i MGR innehållet extrakt av myrorna tagit att exemplifiera det protokoll som orsakade kolumn överbelastning när split förhållandet 2:1 användes, analyserades detta prov en andra gång i högre split förhållandet 50: 1 (steg 4.3.1.2and figur 5). GC-MS parameterinställningarna presenteras i avsnitt 4 är lämpliga för data som genereras med GC-MS enheter anges i Tabell för material. Bredvid den RI calibrants (steg 4.1.1), bör ett lösningsmedel-tomt (steg 4.1.2) också analyseras för att identifiera icke-biologiska artefakter och föroreningar under efterföljande dataanalys. För metaboliten identifiering är det också viktigt att mäta autentiska standarder av kommenterad föreningar på samma villkor GC-MS som används för att analysera provextrakt (steg 5.4.7and efter). För att förbättra noggrannheten och tillförlitligheten hos de slutliga uppgifterna, rekommenderas det att analysera alla prov kategorier (vätska-blank RI calibrants, provextrakt och standarder) inom samma mätning sekvens. Dessutom bör de autentiska normerna analyseras vid en koncentration av jämförbara som observerats för provextrakt. Detta bidrar till att förbättra noggrannheten av RI värden och likheten mellan och massa standardspektrum, vilket slutligen leder till ökad och mer meningsfulla metabolit anteckning/identifiering. I detta syfte kan normerna upprepade gånger mätas med olika split faktorer.
För metaboliten identifiering, den sofistikerade programvaran, används MetaboliteDetector för spectra deconvolution och RI och spectra jämförelsen till ett genomfört NIST-bibliotek samt om en etablerad eget bibliotek (avsnitt 5). Det rekommenderas att köra MetaboliteDetector på en 64-bitars LINUX-baserat operativsystem (t.ex. KUBUNTU) och kopiera den genererade *. CDF datafiler (steg 4,4) från den Bärbar datalagring på den lokala hårddisken. MetaboliteDetector kan importera GC-MS rådata i centroiden eller profil netCDF-format. Programvara för de flesta GC-MS instrument bör kunna konvertera inspelade rådata till detta format19. Innan du börjar i analys av data, rekommenderas det starkt att läsa litteraturen som finns för tidigare MetaboliteDetector programvaruversioner att bli bekant med funktionerna och grafiska gränssnitt19,25, 26.
För RI kalibrering och efterföljande beräkning av RI-värde av de sammansatta topparna som är närvarande i provextrakt används ett bibliotek som innehåller RIs och spektra av RI calibrants (här, n-alkaner). Sådana ett bibliotek kan antingen vara egenföretagare etablerat, eller en redan existerande ('CalibrationLibrary_Alkanes') kan vara hämtade27. Medföljande standard standardbiblioteket innehåller RIs och spectra för n-alkaner alltifrån C09 till C39 som har analyserats enligt beskrivningen i avsnitt 4. Det medföljande biblioteket gör det möjligt för användare som arbetar med metabolit detektor att direkt börja med kalibreringen av deras uppgifter. Om det behövs, kan detta bibliotek också utökas med ytterligare poster för ytterligare alkanes. Baserat på likheten mellan referens och experimentellt härledda RIs och masspektrum (se steg 5.3 och delsteg, figur 7, figur 8, bild 9), anteckning eller identifiering av föreningar kan vara utfört (steg 5,4 och delsteg, (Se figur 11). Det är också viktigt att efter automatisk databehandling med MetaboliteDetector, användaren kommer att manuellt kontrollera för rätt peak plockning och spektrum deconvolution genom att inspektera masspektra underliggande 'triangeln' för varje förmodad förening av intresse. Dessutom beroende på GC-MS instrumenteringen och parameterinställningarna används för data generation, kan anpassningar av de presenterade MetaboliteDetector inställningarna behövas. Programvaran MetaboliteDetector är kapabla att utföra många fler användbara operationer än förklarade i detta manuskript, t.ex. visning av extraherade ion nuvarande (EIC) kromatogram, export av kromatogram som .csv, automatisk batch-kvantifiering av föreningar och många fler.
Det protokoll som presenteras i detta manuskript kan fungera som förslag på experiment som utförs av andra forskare med fokus på isolering av körtlar eller körtel innehållet från insekter, volatilome analys, samt metabolit identifiering.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Finansiering för denna studie erhölls genom Wien Science och Technology Fund (WWTF) LS13-048 till ISD. Speciellt tack till Diane W. Davidson (University of Utah, nu pensionerad) för att dela sin kunskap om Bornean COCY myrorna med oss. Vi uppskattar administrationerna av Kuala Belalong fältet studier Center (KBFSC) och Universiti Brunei Darussalam (UBD) för projektgodkännande samt Bruneis skogsavdelningen och Bruneis forskning och Innovation Centre för behörighet att samla in myror och godkännande och utfärdandet av exporttillstånd. Speciellt tack till UBD och KBFSC personal, särskilt Muhammad Salleh bin Abdullah Bat, Teddy Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, Chan Chin Mei och Kushan Tennakoon för att underlätta vår forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP | Sarstedt | 62,559,001 | see Figure 1 in manuscript |
| PVC Tubings | Rehau | 290 4489 | see Figure 1 in manuscript |
| Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size | Antstore | 1000378 | see Figure 1 in manuscript |
| Freezer | Severin | KS 9890 | -20 °C or lower |
| polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm | Thorsten Koch | 4260308590481 | |
| Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm | Aldrich | BR455742 | |
| Cold pack 150 mm x 100 mm | Elite Bags | 1998 | freeze to -20 °C |
| Bucket with crushed ice | |||
| 1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening | La-Pha-Pack | 11090500 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151799 | |
| Stereomicroscope | Bresser | 5806100 | |
| Forceps, Superfine Tip curved | Medizinische Instrumente May, Norman May | PI-0005B | |
| Forceps, Superfine Tip straight | blueINOX | BL-3408 | |
| Dissection needle 140 mm, pointed, straight | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110301 | |
| Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën | fisher scientific | 15654740 | |
| Distilled water | |||
| Rotizell-Tissue-Tücher | Carl Roth GmbH + Co.KG | 0087.2 | |
| Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % | Carl Roth GmbH + Co.KG | 4442.1 | freeze to -20 °C |
| Vortex Genie 2 | neoLab | 7-0092 | |
| 0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip | La-Pha-Pack | 06090357 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum, 45° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151819 | |
| Alkane standard solution C8-C20 | Sigma-Aldrich | 04070 | |
| Alkane standard solution C21-C40 | Sigma-Aldrich | 04071 | |
| n-Hexane SupraSolv | Merck | 104371 | |
| GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister | Gerstel | ||
| Agilent Gas chromatograph 6890 N | Agilent | ||
| Gooseneck splitless Liner | Restek | 22406 | |
| Helium (5.0 - F50) | Messer | 102532501 | |
| GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent Mass Selective Detector 5975B | Agilent | ||
| MSD ChemStation Data Analysis Application software | Agilent | ||
| MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| Calibration Library for MetaboliteDetector | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| MD Conversion Tool for NIST-library | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 |
References
- Morgan, E. D. Chemical sorcery for sociality: exocrine secretions of ants (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecol News. 11, 79-90 (2008).
- Betz, O. Biological adhesive systems. , Springer. 111-152 (2010).
- Laciny, A., Zettel, H., Druzhinina, I. Workers, soldiers, and gynes-morphometric characterization and description of the female castes of Camponotus singularis (Smith, 1858)(Hymenoptera, Formicidae). Deutsche Entomologische Zeitschrift. 63, 183 (2016).
- Ward, P. S., Blaimer, B. B., Fisher, B. L. A revised phylogenetic classification of the ant subfamily Formicinae (Hymenoptera: Formicidae), with resurrection of the genera Colobopsis and Dinomyrmex. Zootaxa. 4072 (3), 343-357 (2016).
- Davidson, D. W., Salim, K. A., Billen, J. Histology of structures used in territorial combat by Borneo's 'exploding ants'. Acta Zoologica. 93 (4), 487-491 (2012).
- Davidson, D., et al. An experimental study of microbial nest associates of Borneo's exploding ants (Camponotus [Colobopsis] species). Journal of Hymenoptera Research. 18 (2), 341-360 (2009).
- Laciny, A., et al. Colobopsis explodens sp.n., model species for studies on "exploding ants" (Hymenoptera, Formicidae), with biological notes and first illustrations of males of the Colobopsis cylindrica group. ZooKeys. , (2018).
- Maschwitz, U., Maschwitz, E. Platzende Arbeiterinnen: eine neue Art der Feindabwehr bei sozialen Hautflüglern. Oecologia. 14 (3), 289-294 (1974).
- Davidson, D. W., Lessard, J. P., Bernau, C. R., Cook, S. C. The tropical ant mosaic in a primary Bornean rain forest. Biotropica. 39 (4), 468-475 (2007).
- Martin, S., Drijfhout, F. A review of ant cuticular hydrocarbons. Journal of chemical ecology. 35 (10), 1151 (2009).
- Pickett, J. Chromatography and isolation of insect hormones and pheromones. , Springer. 299-309 (1990).
- Tragust, S., et al. Ants disinfect fungus-exposed brood by oral uptake and spread of their poison. Current Biology. 23 (1), 76-82 (2013).
- Menzel, F., Blüthgen, N., Schmitt, T. Tropical parabiotic ants: highly unusual cuticular substances and low interspecific discrimination. Frontiers in Zoology. 5 (1), 16 (2008).
- Hogan, C. T., Jones, T. H., Zhukova, M., Sosa-Calvo, J., Adams, R. M. Novel mandibular gland volatiles from Apterostigma ants. Biochemical Systematics and Ecology. 72, 56-62 (2017).
- Augusto, F., Valente, A. L. P. Applications of solid-phase microextraction to chemical analysis of live biological samples. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 21 (6), 428-438 (2002).
- Davidson, D. W., et al. Nutrition of Borneo's 'exploding' ants (Hymenoptera: Formicidae: Colobopsis): a preliminary assessment. Biotropica. 48 (4), 518-527 (2016).
- Jones, T., et al. The chemistry of exploding ants, Camponotus spp.(cylindricus complex). Journal of chemical ecology. 30 (8), 1479-1492 (2004).
- Voegtle, H. L., Jones, T. H., Davidson, D. W., Snelling, R. R. E-2-ethylhexenal, E-2-ethyl-2-hexenol, mellein, and 4-hydroxymellein in Camponotus species from Brunei. Journal of chemical ecology. 34 (2), 215-219 (2008).
- Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
- Stein, S. Retention indices by NIST mass Spec data Center. NIST Chemistry Webbook, NIST Standard Reference Base. (69), (2010).
- NIST Chemistry WebBook. NIST Standard Reference Database Number 69. , Available from: http://webbook.nist.gov/chemistry/ (2018).
- Cook, S. C., Davidson, D. W. Nutritional and functional biology of exudate-feeding ants. Entomologia Experimentalis et Applicata. 118 (1), 1-10 (2006).
- Abdalla, F. C., Cruz-Landim, C. d Dufour glands in the hymenopterans (Apidae, Formicidae, Vespidae): a review. Revista Brasileira de Biologia. 61 (1), 95-106 (2001).
- Hiller, K. MetaboliteDetector. Documentation. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/wiki/index.php/Documentation (2010).
- Nieke, C. MetaboliteDetector - Development Version. , Available from: http://md.tu-bs.de/system/files/Downloads/MD-Development-Version-Documentation.pdf (2012).
- Hiller, K., Koschnitzki, N. MetaboliteDetector. Download. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 (2017).
