Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Drosophila Larven für GC-MS-basierte Metabolomic Analyse vorzubereiten.
Abstract
Die jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der Metabolomik haben der Taufliege Drosophila Melanogaster als ein leistungsfähiges genetischen Modell für tierischen Stoffwechsel etabliert. Durch die Kombination von der Vielzahl der Drosophila genetische Werkzeuge mit der Fähigkeit, große Schwaden des intermediären Stoffwechsels Umfrage, kann ein Metabolomik Ansatz komplexe Wechselwirkungen zwischen Ernährung, Genotyp, Lebensgeschichte Veranstaltungen und ökologische Hinweise offenbaren. Darüber hinaus können Metabolomik Studien entdecken Sie neuartige enzymatische Mechanismen und bisher unbekannte Verbindungen zwischen scheinbar disparaten Stoffwechselwege zu entdecken. Um eine breitere Nutzung dieser Technologie unter den Drosophila -Community zu erleichtern, bieten wir hier ein detailliertes Protokoll, der beschreibt, wie Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) vorbereiten- Metabolomic Analyse basiert. Unser Protokoll enthält Beschreibungen der Larven Musterkollektion, Metabolit Extraktion, chemische Derivatisierung und GC-MS-Analyse. Erfolgreichen Abschluss dieses Protokolls ermöglicht es Benutzern, die relative Häufigkeit von kleinen polaren Metaboliten, darunter Aminosäuren, Zucker und organischen Säuren beteiligt in Glykolyse und der TCA-Zyklen zu messen.
Introduction
Die Fruchtfliege Drosophila Melanogaster ist entstanden, als ein ideales System für das Studium des molekularen Mechanismus, der intermediären Stoffwechsel regulieren. Nicht nur sind die meisten Stoffwechselwege konserviert zwischen Mensch und Drosophila , aber wichtigen Nährstoff Sensoren und Wachstumsregulatoren, wie Insulin, Tor und Myc, sind auch aktiv in die Fliege1,2. Drosophila ist dadurch lässt sich die metabolische Grundlagen menschlicher Erkrankungen, Diabetes und Adipositas bis hin zu Neurodegeneration und Krebs zu erforschen. In diesem Zusammenhang bietet Drosophila Larvalentwicklung den idealen Rahmen, um eine metabolische Studiengang als aerobe Glykolyse oder der Warburg-Effekt bekannt. So wie viele Tumoren aerobe Glykolyse Biomasse aus Kohlenhydraten zu generieren, aktivieren Sie also dazu Drosophila Larven aerobe Glykolyse zur Förderung der entwicklungspolitischen Wachstum3,4,5. Diese Ähnlichkeiten zwischen Larven und Tumor-Stoffwechsel Drosophila als ein Modell für das Verständnis wie aerobe etablieren Glykolyse ist geregelt in Vivo.
Trotz der Tatsache, die die Fliege als ein beliebtes Modell für Stoffwechsel entstanden ist, setzen die meisten Drosophila Studien auf Methoden, die entworfen sind, um die einzelnen Metaboliten3, wie Trehalose, Triglyceride oder ATP zu messen. Da ein bestimmtes Protokoll erforderlich ist, um jede Metaboliten zu messen, sind Assay-basierten Studien arbeitsintensiv, teuer und voreingenommen gegenüber dieser Verbindungen, die mit kommerziellen Kits gemessen werden kann. Eine Lösung für diese Einschränkungen entstanden aus dem Bereich der Metabolomik, sorgt für eine effizientere und unvoreingenommene Mittel der Drosophila Stoffwechsel. Im Gegensatz zu einem Assay-basierten Studie kann eine einzelne Metabolomic Analyse gleichzeitig Hunderte von niedermolekularer Metaboliten zu messen und bieten ein umfassendes Verständnis von einem Organismus Stoffwechsellage6,7. Diese Technik hat die Drosophila metabolische Studien deutlich erweitert und repräsentiert die Zukunft dieser aufstrebenden Feld8.
Metabolomic sind in erster Linie Studien mit drei Technologien: (i) Kernspinresonanz (NMR), (Ii) flüssige Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und (Iii) Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)9. Jeder Ansatz bietet deutliche Vorteile und Nachteile, und alle diese Technologien wurden verwendet, um erfolgreich studieren Drosophila Stoffwechsel. Da die Forschung in unserem Labor auf kleine, polaren Metaboliten gerichtet ist, beschäftigen wir in erster Linie eine GC-MS-basierte Methode. GC-MS bietet dem Anwender eine Reihe von Vorteilen, einschließlich hohe Reproduzierbarkeit, Peak Auflösung, Empfindlichkeit, und die Verfügbarkeit einer standard Elektron Auswirkungen (EI) spektrale Bibliothek, ermöglicht eine schnelle Bestimmung entdeckt metabolische Funktionen10,11. Die Vorbereitung der Proben für GC-MS, jedoch ist etwas komplex und erfordert eine sorgfältige Aufmerksamkeit zum Detail. Proben müssen gesammelt, gewaschen, gewogen und in einer Weise, die schnell Stoffwechselreaktionen stillt eingefroren. Darüber hinaus fliegende Karkasse ist resistent gegen standard Homogenisierung Protokolle und erfordert eine Rührwerksmühle um optimale Metabolit Extraktion zu gewährleisten. Zu guter Letzt müssen Proben von GC-MS analysiert chemische Derivatisierung vor Erkennung12unterzogen werden. Während zuvor veröffentlichte Methoden alle diese Schritte3,13,14 beschreiben, ist eine visuelle Protokoll, die den unerfahrenen Benutzer reproduzierbar hochwertige Daten generieren lassen würde noch benötigt. Hier zeigen wir wie Drosophila Larven Proben für Metabolomik GC-MS-basierte Analyse vorzubereiten. Dieses Protokoll ermöglicht dem Benutzer, reproduzierbar Messen viele der kleinen polaren Metaboliten, die zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsel zu komponieren.
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Protocol
1. die Eizellentnahme
- Ausgewachsene Männchen und jungfräulichen Weibchen der gewünschten Genotypen zu sammeln. Individuell Alter dieser Tiere in einer Lebensmittel Durchstechflasche mit Bloomington Standardmedien für 3 – 5 Tage.
- Die entsprechenden Paarungen durch die Übertragung von 50 jungfräulichen Frauen und 25 Männer zu einem neuen Lebensmittel-Fläschchen eingerichtet.
Hinweis: Ein Minimum von sechs unabhängigen Verpaarungen sollten für jeden Genotyp eingerichtet werden. Nur eine Probe wird aus jeder Verpaarung (d. h. sechs Proben von sechs unabhängigen Paarungen) gesammelt werden. -
Bereiten Sie Melasse eierlegende Kappen.
- Mischen Sie 115 mL Melasse und 29 g Agar mit 700 mL H2O in eine 2 L Flasche.
- Kochen Sie die Melasse Agar Mischung auf einer heißen Platte.
- Auf 70 ° c abkühlen lassen
- Fügen Sie 25 mL saure Mischung (20 mL 85 % Phosphorsäure und Propionsäure 209 mL in 1 L H2O; Store in einer braunen Flasche) und 10 mL 10 % p-hydroxy-Benzoesäure Acid Methylester in 95 % igem Ethanol.
- Gießen Sie die Melasse-Agar in Deckel und Boden Teil einer 35 x 10 mm2 Gewebekultur Schüssel.
Hinweis: Vor dem Gießen Melasse Agarplatten, sicher sein, dass die Deckel und/oder Basis der 35 x 10 mm2 Platte Snuggly in den Mund einer Drosophila Lager Flasche passen (im Schritt 1.6 beschrieben). Je nach Marke von Platten verwendet könnte die Basis nicht verwendet werden.
- Frischen Hefe einfügen durch Zugabe von destilliertem Wasser zu aktivieren Trockenhefe (5 g Hefe/7 mL Wasser) bis die Mischung wird eine Paste, die auf einer festen Oberfläche (d. h., die Konsistenz der Erdnussbutter) leicht verbreitet werden kann.
- Ca. 1,5 g Hefe Paste auf der Oberfläche einer Melasse eierlegende Kappe zu verbreiten.
- Stecken Sie vier Luftlöcher in gegenüberliegenden Seiten aus einem Kunststoff 6 Unzen Drosophila Lager Flasche mit einer 22 G Nadel.
- Übertragen Sie die neu verknüpften fliegen aus der Lebensmittel Durchstechflasche in Kultur Flaschen.
Hinweis: Fliegen können übertragen werden, indem Sie entweder mit CO2 als eine vorübergehende Betäubung oder von der Spitze der Ampulle in die Mündung der Flasche halten und scharf Tippen auf den Boden der Flasche gegen eine Benchtop. - Setzen Sie schnell eine Melasse eierlegende Kappe mit Hefe-Paste auf der Oberfläche in den Mund einer Drosophila Lager Flasche. Verwenden Sie Labor Band um eierlegende GAP im Ort zu sichern.
Hinweis: Wenn fliegen narkotisierten vor der Übertragung waren, sollte die Flasche horizontal der Benchtop auferlegt werden bis alle fliegen erholt haben. Einmal fliegen völlig mobil sind, stellen Sie die Flasche in einem Inkubator mit der Melasse eierlegende Kappe an der Unterseite der Kultur. - Die Verschlusskappe Melasse eierlegende mindestens einmal täglich für die ersten beiden Tage durch Umkehrung der Lager Flasche, durch Tippen auf den Boden der Flasche gegen die Benchtop entfernen die alte Ei-Kappe und sofort eine neue Ei-Kappe in die Mündung der Flasche platzieren. Entsorgen Sie die alte eierlegende Kappe.
Hinweis: Diese Schritt wird sichergestellt, dass die Weibchen ihre Eier nicht halten und ermöglicht die Sammlung von synchronisierten Populationen. - Legen Sie eine neue eierlegende Kappe in die Lager Flasche nach Tag 3, ersetzen nach 2 h, und verwerfen. Entfernen Sie und ersetzen Sie die zweite Eiablage GAP nach vier Stunden. Beschriften Sie diese eierlegende Kappe mit Datum, Uhrzeit und Genotyp.
Hinweis: Die Eier gesammelt während dieser 4 h-Fenster werden für die Analyse verwendet werden. Diese Synchronisierung Schritt ist wichtig für die Analyse von bestimmter Entwicklungsstadien. Eier können auf diese Weise für mehrere Tage gesammelt werden. - Legen Sie die eierlegende Kappen in ein 60 x 15 mm2 Petri und Ort in einem Inkubator auf die gewünschte Temperatur und Luftfeuchtigkeit.
- Überprüfen Sie die eierlegende Kappen jeden Tag Probleme mit Hunger, Bevölkerungsdichte oder Kontamination.
Hinweis: Die Larven müssen Zugang zu ausreichender Ernährung, kontinuierliche Entwicklung zu gewährleisten. Falls erforderlich, kann frische Hefe einfügen auf eierlegende Großbuchstaben verteilt werden, die im Experiment verwendet werden. Außerdem, wenn die Larven Bevölkerungsdichte zu hoch ist, startet Larven aus der Kultur-Platte zu Wandern. Diese Proben sollten nicht für Metabolomic Analyse benutzt werden, weil die hohe Bevölkerungsdichte und Fortgeschrittene Anfälle von Hunger erlebt beim Wandern zu inkonsistenten Daten führen werden. Eine Dichte von ca. 80 – 100 mittlere zweiten Instar Larven (L2) pro Platte oder 40 – 50 mittlere dritte Instar Larven (L3) pro Platte wird empfohlen. Proben, die sichtlich mit Bakterien oder Pilzen kontaminiert sind, müssen entsorgt werden.
2. Larven Musterkollektion
- Alter Larven bis die gewünschte Stufe. Wenn L3 Larven sammeln, resynchronize Proben bei der Häutung L2-L3. Resynchronisation wird häufig durch eine zuvor beschriebenen Methode, die die vorderen Atemlöcher als eine Entwicklungsstörung Meilenstein15 nutzterreicht. Alternativ können Mitte L3-Larven mit ein sgs3 Reporter-gen16synchronisiert werden.
Hinweis: In diesem Zusammenhang finden wir Mitte L2 Larven (~ 60 h nach der Eiablage) eignen sich ideal für die meisten Analysen, weil Larvalentwicklung zu diesem Zeitpunkt noch relativ synchron ist, sorgfältig gesammelte Proben haben angemessene Nahrung, diese Timepoint zu entwickeln und die Anzahl der Tiere pro Probe ist überschaubar (siehe unten). Ein zusätzliche Synchronisation Schritt ist erforderlich für L3-Larven, weil die zahlreichen Ecdyson Impulse, die während der L3 Entwicklung auftreten dramatische Auswirkungen auf den Stoffwechsel haben und Artefakte in nicht synchronisierten Populationen erzeugt. - Verwenden Sie eine sezierenden Nadel um zu heben Sie vorsichtig die Hefe-Paste aus dem Agar. Legen Sie die Hefe auf eine neue Melasse-Agar-Kappe.
Hinweis: Die meisten Larven fressen an der Schnittstelle zwischen der Melasse-Agar und die Hefe-Paste. - Verwenden Sie einen kleinen Pinsel, um Larven von der abgebrochenen Oberfläche des Nährbodens Melasse zu sammeln. Legen Sie die Larven in einem 1,5 mL Zentrifugenröhrchen auf Eis.
Hinweis: Geeignete Stichprobengröße für jede Entwicklungsstufe sind wie folgt: zuerst instar 50 Larven (L1); 25 Mitte L2 Larven; 20 frühen L3-Larven; 15 Mitte L3 oder späten L3-Larven. - Waschen Sie und frieren Sie Proben (Schritte 2,3 bis 2,8) in kleinen Chargen (vier bis sechs Proben ein) während einer großen Muster-Set zu sammeln. Proben müssen innerhalb von 20 min des Legens der Larven in Rohre eingefroren werden.
Hinweis: Wir empfehlen Eppendorf 1,5 mL Flex Rohre verwenden, da andere Röhren Probentransfer bei Schritt 3 stören können. Proben müssen in Microfuge Röhren gesammelt werden. Sammeln Sie keine Proben in den Wulst Röhren im Schritt 3.1 beschrieben. Keramische Perlen behalten die NaCl Waschlösung, die führt zu ungenauen massenmessungen und Verunreinigungen in der Probe führt. - Fügen Sie 1 mL eiskaltes 0,9 % NaCl in das Rohr, den Deckel schließen und vertikal spiegeln das Rohr gründlich um die Larven zu waschen.
- Setzen Sie den Schlauch wieder auf Eis für ~ 30 s. Während dieser Zeit Larven werden auf den Boden des Rohres sinken, aber Hefe bleibt in der Schwebe. Sobald alle Larven eine lose Pellets gebildet haben, entfernen Sie die NaCl-Lösung mit einer 1 mL-Pipette.
- 2.4 und 2.5 Schritt zweimal wiederholen, oder bis der letzte Waschlösung ist klar.
Hinweis: Zusätzliche waschen Schritte möglicherweise erforderlich, wenn die gesammelten Probe eine übermäßige Menge an Hefe enthält. - Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.000 × g für 1 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie alle verbleibenden Lösung mit einer Pipette 200 µL.
- Sofort frieren Sie die Probe in flüssigem Stickstoff ein.
Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden. Proben können bis zu 3 Monate bei-80 ° c gelagert werden
3. Übertragung der Proben auf Bead Tubes
- Jede Larven Probe muss auf eine 2 mL-Schraubverschluss-Röhrchen mit 1,4 mm Keramik Perlen aus der 1,5 mL Microfuge Tube übertragen werden. Verwenden Sie in Vorbereitung auf diesen Transfer Schritt einen Ethanol-Beweis-Marker an die Seite einer 2 mL Schraubverschluss Wulst Röhre beschriften (Markierungen auf dem Deckel werden bei Schritt 4.4 zerstört).
- Tara die Masse der beschrifteten Bead Tube mit einer Analysenwaage genau messen 0,01 mg.
- Wenn Larven Proben bei-80 ° C gelagert wurden, legen Sie Probenröhrchen in flüssigem Stickstoff vor der Übertragung.
- Lange Pinzette verwenden, um das 1,5 mL Probenröhrchen von flüssigem Stickstoff entfernen Dewar.
- Nitrilhandschuhe, greifen die gefrorenen Rohr, umkehren und scharf Pfund den Schlauch Deckel gegen die Tischplatte, die gefrorene Kugel zu verdrängen. Sofort Gießen Sie das Pellet in eine vorher tarierten 2 mL Schraubverschluss Bead Tube. Wenn die Pellets nicht zu verdrängen, das Rohr zu flüssigem Stickstoff zurück und wiederholen.
Hinweis: Larven Pellets werden nicht von allen Microfuge Röhren vertreiben. Wenn einen Schlauch als dem empfohlenen verwenden, festzustellen Sie, ob Larven Pellets vor dem Sammeln von Proben für die Analyse verdrängt werden können. - Die kombinierte Masse der Larven Pellet und Bead Tube schnell zu messen. Legen Sie das Probenröhrchen sofort in flüssigem Stickstoff. Die Larven Pellet Masse wird verwendet, um die Metabolomic Daten zu normalisieren.
Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden. Proben können bis zu 3 Monate bei-80 ° c gelagert werden
4. Probe Extraktion
- Legen Sie die Probenröhrchen in einem Benchtop-20 ° C kühler.
- Hinzugeben Sie 0,8 mL prechilled (-20 ° C) 90 % Methanol mit 2 µg/mL Bernsteinsäure-d4 Säure in jedes Rohr. Zurück die Probe der Benchtop-20 ° C kühler.
Hinweis: Die Bernsteinsäure-d4-Säure dient als interner Standard. Verwenden Sie nur HPLC Klasse H2O und Methanol. Da Methanol und anderen organischen Lösungsmitteln flüchtige und schwierig, genau zu messen, mit Luft Hubraum Pipetten sind, empfehlen wir Positive Verschiebung Pipetten für diesen Schritt und alle folgenden Schritte. - Richten Sie eine Negativkontrolle durch Zugabe von 0,8 mL prechilled (-20 ° C) 90 % Methanol mit 2 µg/mL Bernsteinsäure-d4 Säure in eine leere Bead Tube.
- Homogenisieren von Proben für 30 Sekunden bei 6,45 m/s mit einer Wulst Mühle Homogenisator befindet sich in einem Kontrollraum 4 ° C Temperatur.
Hinweis: Die Nichtbeachtung der Larven Pellet rasch und vollständig zu homogenisieren ist eine Sourceschaltung der Variabilität der Metabolomik Analyse. Verwenden Sie nur Homogenisatoren, die zerstören, gefrorene Larven Gewebe innerhalb von 30 s. - Zurückkehren Sie die homogenisierte Proben-Röhrchen zu-20 ° C Benchtop Kühler und inkubieren sie in einem Gefrierschrank-20 ° C für mindestens 1 h.
- Zentrifugieren Sie die Rohre mit 20.000 × g oder maximale Geschwindigkeit für 5 min bei 4 ° C um die daraus resultierenden Niederschlags zu entfernen.
- Übertragen Sie 600 µL des Überstands zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Stören Sie den Niederschlag nicht. Wenn das voreilige Pellet, beim pipettieren des Überstands verdrängt wird alle überstand in das Röhrchen zurück und wiederholen Sie Schritt 4.6.
- Legen Sie die Probenröhrchen in einer Vakuum-Zentrifuge. Achten Sie darauf, dass alle Röhren geöffnet sind, vor dem Versiegeln der Zentrifuge. Die Proben bei Raumtemperatur trocknen, bis alle Lösungsmittel entfernt ist (dieser Schritt dauert in der Regel ~ 16 h in Anspruch).
Hinweis: Falls erforderlich, kann das Protokoll an dieser Stelle angehalten werden. Getrocknete Probe kann bei-80 ° c gelagert werden
(5) chemische Derivatisierung
- Wenn die getrockneten Proben bei-80 ° C gelagert wurden, ungeöffnete Probenröhrchen in einer Vakuum-Zentrifuge und für 30 min trocknen. Dieser Schritt muss ausgeführt werden, vor dem Öffnen des probenröhrchens.
Hinweis: Diese Schritt entfernt das Kondenswasser, das an der Außenseite des Microfuge Rohres Entnahme aus der Tiefkühltruhe sammelt. Dieser Teil des Protokolls ist extrem empfindlich gegenüber H2O und zusätzliche Vorsichtsmaßnahme getroffen werden, um alle Reagenzien so trocken wie möglich zu halten. -
Bereiten Sie eine Lösung von 40 mg/mL Methoxylamine Hydrochlorid (MOX) in wasserfreiem Pyridin. Verwenden Sie nur wasserfreies Pyridin. Speichern von MOX und Pyridin in den Exsikkator gestellt und bereiten Sie täglich die MOX-Lösung.
Achtung: MOX und Pyridin sind giftig. Bereiten Sie diese Lösung in der Dunstabzugshaube.- Verwenden einer Heißluftpistole eine 1 mL Spritze mit Glas zu trocknen.
- Stechen Sie die Nadel der Spritze in die Flasche von wasserfreiem Pyridin. 1 mL Pyridin zu entfernen und Hinzufügen einer Microfuge Röhre mit 40 mg von MOX.
- Spülen Sie die Flasche von wasserfreiem Pyridin mit Argon. Verschließen Sie die Flasche und in den Exsikkator zurück.
- Lösen Sie MOX in die Pyridin durch das Rohr in einem thermischen Mischer bei 35 ° C für 10 min bei 600 u/min Inkubation auf.
- Die getrocknete Probe 40 µL von 40 mg/mL MOX in wasserfreiem Pyridin Projektmappe hinzufügen.
- Wirbel für 10 s und kurz Zentrifuge (10.000 X g für 20 s).
- Inkubation bei 30 ° C für 1 h bei 600 u/min in einem thermischen Mischer.
- Zentrifugieren Sie bei 20.000 × g oder maximale Geschwindigkeit für 5 min um den Feinstaub zu entfernen.
- Übertragen Sie 25 µL des Überstands in einem Autosampler Fläschchen mit einem Glaseinsatz Microvolume 250 µL deaktiviert.
- Hinzufügen von 40 µL des N- Methyl -N- Trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) mit 1 % TMCS.
Achtung: MSTFA ist giftig. Führen Sie diesen Schritt in der Dunstabzugshaube.
Hinweis: Falls vorhanden, kann dieser Schritt durch eine Gerstel-Autosampler ausgeführt werden. - Setzen Sie eine Kappe auf dem Autosampler Fläschchen und Dichtung mit einem Crimper Tool.
- 1 Stunde mit schütteln (250 u/min) inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C.
- Fatty Acid Methyl Ester (Kamera) Standardlösung als zuvor Desceribed3vorbereiten. Der Autosampler Durchstechflasche mit einem Roboter Autosampler unmittelbar vor der Injektion fügen Sie 3 µL FAMES hinzu.
Hinweis: FAMEs dienen zur Retention Time-Shift zu kalibrieren und prüfen die Geräteleistung. Wenn keine Roboter Autosampler verfügbar ist, können Berühmtheiten während Schritt 5.8 hinzugefügt werden.
6. GC-MS-Detektion
Hinweis: In den meisten Fällen wird der Benutzer mit Hilfe einer Massenspektroskopie Core Facility diesen Schritt durchführen. Dieses Protokoll soll mit einem 30 m, GC-Säulen mit einer Vorsäule 5 m verwendet werden.
- Zufällig die Probe bestellen.
-
Bereiten Sie das GC-MS.
- Die Helium-Träger-Gas-Durchfluss bis 1 mL/min eingestellt.
- Legen Sie die Vorlauftemperatur bis 250 ° C.
- Programmieren der GC der folgenden Temperaturgradient ausführen:
- Anfängliche Temperatur 95 ° c mit einen Einfluß von 1 min.
- Erhöhen Sie die Temperatur auf 110 ° C mit einer Rate von 40 ° C/min einen Halt von 2 min.
- Bis 5° C/min Rampe auf 250 ° C ansteigen.
- Bis 330 ° C mit einer Rate von 25 ° C/min einen letzten Halt von 4 min erhöhen.
- Solvent Verzögerung auf 3,5 min einstellen
Hinweis: Die Zeit kann nach dem GC-MS-System geändert werden. Dieser Schritt soll MSTFA und MOX verhindern Beschädigungen des Detektors.
- Injizieren Sie 1 µL der derivatisierte Probe in das GC-MS (split-Verhältnis von 10:1).
Hinweis: Spritzen Sie 2 µL der Probe, wenn die Intensität der Peaks zu niedrig ist. Die Injektion Reihenfolge der Proben sollte randomisiert werden. - Das Massenspektrometer in full-Scan-Modus zu betreiben, über einen Massenbereich von 50 – 500 m/Z.
7. die Datenanalyse
- Metabolomic Datenanalyse verwenden entweder eine gezielte oder ungezielte Ansatz. Gezielte Analyse konzentriert sich auf die Messung der Fülle an einen definierten Satz von Metaboliten, wie z. B. die Laktat-Messungen, denen wir weiter unten beschreiben. Im Gegensatz dazu verwendet ungezielte Analyse eine unvoreingenommene Herangehensweise, um jede metabolische Funktion zu identifizieren, die zwischen den zwei Sample-Sets erheblich geändert wird.
Hinweis: Unser Labor verwendet in erster Linie die kostenlose Programme MetAlign17 und MetaboAnalyst18,19 für die Datenanalyse. Da eine angemessene Beschreibung der Qualitätskontrolle, Normalisierung, sowohl die Datenverarbeitung Schritte gehen über den Rahmen dieser Handschrift, verweisen wir den Benutzer auf ausführlichere Protokolle, die Datenverarbeitung20,21gewidmet sind, 22. Darüber hinaus kann ein Flussdiagramm beschreibt die Schritte für diese Analyse an anderer Stelle8gefunden.
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Representative Results
Laktat-Dehydrogenase (dLDH) Mutanten, die dLDH Aktivität4und genetisch passenden Steuerelemente fehlen wurden als Mitte-L2 Larven gesammelt und nach oben beschriebenen Protokoll verarbeitet. Im Vergleich zu Kontrollen zeigen mutierte Larven signifikante Veränderungen in Laktat, Pyruvat und L-2-Hydroxyglutarate-4. Spektren wurden mit einem Agilent GC6890-5973i MS-System erworben. Ein Beispiel für die GC-MS Spektren erzeugen mit unserem Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt. Es gibt viele sichtbare Funktionen und ein bemerkenswerten Höhepunkt für Trehalose, die normalerweise der größte Peak in einer larvalen Probe und in der Regel übersättigt (Abbildung 1AB). Das individuelle Spektrum der Negativkontrolle Probe ist in Abbildung 1dargestellt. Obwohl es noch einige sichtbare Gipfel in der negativ-Kontrolle-Probe immer, die Intensität und die Anzahl der Spitzen sinken im Vergleich zu den experimentellen Proben gezeigt in Abb. 1A, B. Diese Spitzen resultieren im Wesentlichen aus Spalte bluten, der interne Standard (Bernsteinsäure-d4-Säure), FAMEs und kontaminierenden Fettsäuren. Fehlgeschlagene Probenvorbereitung generiert ein Spektrum ähnlich dem in Abbildung 1gezeigt.
Die Spektren wurden vorverarbeitet, mit MetAlign17 und Daten wurden mit dem internen Standard und Pellet normalisiert Masse. Anschließend wurden die Daten MetaboAnalyst18,19 für die statistische Analyse vorgelegt. Prinzip-Komponente (Analysis, PCA) zeigt deutlich, dass die beiden Gruppen voneinander trennen, gibt es keine Ausreißer in beiden Gruppen (Abbildung 2A). Weitere Analyse zeigt signifikante Veränderungen in der Metaboliten, bekannt durch den Verlust von dLDH (Abb. 2 b)4betroffen sein.
Abbildung 1 : Vertreter GC-MS-Spektren von Drosophila Larven Extrakt. (A-B) Typische Spektren von Mitte-L2 Larven Auszüge aus Wildtyp (WT) und dLDH Mutanten (KO). (C) eine repräsentative GC-MS Spektrum erzeugt aus einer Negativkontrolle (NC). Die meisten von den Gipfeln in diesem Spektrum sind aus internem Standard, Berühmtheiten und Fettsäuren. (D-F) Im Vergleich mit WT Proben die KO Proben Ausstellung erhöhte Niveaus von (D) Pyruvat und Laktat (E) und (F) 2-Hydroxyglutarate (2-HG) verringerte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Statistische Analyse zeigt die verschiedenen Stoffwechselprofile zwischen Wildtyp (WT) und dLDH Knockout (KO) Larven. (A) PCA Partituren Plot. (B) -Metaboliten, die Veränderungen im dLDH durch Mutation entstehende Variationen aufweisen. Alle Datenpunkte werden bezogen auf den Mittelwert des WT-Steuerelements gezeichnet, die auf einen beliebigen Wert von 100 eingestellt wurde. Vor der Analyse, Daten auf die interne Bernsteinsäure-d4-Säure normalisiert war standard und Larven pellet-Masse. Angaben als Mittelwert ± eine Standardabweichung. p < 0,01 für alle Metaboliten mit einer zwei-tailed t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Metabolomik bietet eine einmalige Gelegenheit die Stoffwechselreaktionen vermessen, die intermediären Stoffwechsel zu komponieren. Die Empfindlichkeit dieser Technologie macht jedoch Daten anfällig für genetische Hintergrund, Entwicklungsstörungen Cues und eine Vielzahl von Umweltbelastungen, einschließlich Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Bevölkerungsdichte und nährstoffverfügbarkeit. Daher eine hohe Qualität und reproduzierbare Metabolomik Analyse erfordert, dass Proben unter sehr kontrollierten Bedingungen gesammelt werden. Während einige Beiträge zu, dieser Punkt3,8,23 betonen, bieten hier wir eine schrittweise Methode zum Sammeln von Larven, die entworfen ist, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
Die häufigste Ursache der Variabilität in der Metabolomik-Analyse ergibt sich aus einem Ausfall zu stillen oder zu stoppen, metabolische Reaktionen nach die Probe erfasst werden. In diesem Zusammenhang Stoffwechsel stoppt beim Einfrieren in flüssigem Stickstoff und metabolische Enzyme werden zerstört werden, wenn die Probe bei-20 ° C Methanol homogenisiert wird. Geht man davon aus, dass der Nutzer besonderes Augenmerk zahlt auf eine Probe vor der Extraktion von Methanol gefroren zu halten, ist unser Protokoll soll sicherstellen, dass die Metabolomik-Daten durch dieses Verfahren erzeugt eine genaue Momentaufnahme der Larven Stoffwechsel darstellen. Sollten die User experience inakzeptablen Daten Variabilität, der Benutzer sollte überdenken, die Sammlung und Metabolit Extraktion-Protokoll unter besonderer Berücksichtigung zu gewährleisten (1) die Stoffwechsel ist schnell abgeschreckt (Schritte 2,9 – 4.2) und (2), die Probe wird effizient in 90 % Methanol (Schritt 4.4) homogenisiert. In diesem Zusammenhang viele Perlen Mühlen bieten nicht genügend Kraft, um Proben innerhalb der angegebenen Zeit zu homogenisieren und wir empfehlen den Benutzer, ein Instrument zu verwenden, die in früheren Studien8verwendet worden ist.
Unser Protokoll unterstreicht auch wichtige Schritte, die der unerfahrenen Benutzer beachten muss, um reproduzierbar Proben derivatize. Dies ist wichtig für GC-MS, da viele Metaboliten Volatilität oder schlechte thermische Stabilität besitzen. Derivatisierung erhöht die Volatilität und die thermische Stabilität von vielen Metaboliten, wodurch die Anzahl der Verbindungen, die reproduzierbar gemessen werden können. Infolgedessen werden Proben, die unvollständige Derivatisierung unterzogen wurden nicht reproduzierbaren Peakflächen, Höhen und Formen aufweisen. Da wir hier betonen, ist eine häufige Ursache für fehlgeschlagene Derivatisierung Exposition der Probe zu Wasser, das die chemische Derivatisierung Effizienz sinkt. Daher müssen alle Reagenzien, einschließlich MSTFA, MOX und Pyridin, Feuchtigkeit-freien Bedingungen gehalten werden. Die Notwendigkeit, trockene Bedingungen beizubehalten erstreckt sich auch auf die Probenvorbereitung, die bei-80 ° C gespeichert werden, die in einer Vakuum-Zentrifuge für 30 min vor dem Öffnen, um sicherzustellen, dass Kondensation nicht die Probe tritt platziert werden soll. Wir möchten auch betonen, dass die GC-MS ist eine sensible Technologie, und infolgedessen werden größere Proben nicht unbedingt bessere Daten generieren. Unser Protokoll bietet experimentell geprüften Stichprobengrößen und reproduzierbar messen die meisten Metaboliten im zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsel. Einige dieser Metaboliten sind sehr reichlich und erhöhte Stichprobenumfang führt zur Sättigung des Spektrums zu signalisieren. In der Tat, das Signal für Trehalose in unserer Analyse und eine Split-Verhältnis von 100: 1 bereits gesättigt ist, für GC-MS-Injektion zu genau verwendet werden, muss Messen dieser Verbindung. Schließlich sollte der Benutzer beachten Sie, dass unser Protokoll da wir eine polare Extraktionslösung verwenden, nicht geeignet für Lipid-Extraktion ist. Unser Protokoll berücksichtigt auch nicht für Fettsäuren Verunreinigungen, die auf die Kunststoff-Rohre und Tipps, weshalb einige Fettsäure-Signale in die negative Kontrollprobe (Abbildung 1 b) angezeigt.
Zu guter Letzt die hier beschriebenen Methoden ist ein leistungsstarkes Tool für Drosophila Stoffwechsel. Dieses Protokoll jedoch ist nicht spezifisch für Drosophila und kann mit wenigen Änderungen für metabolische Dirigierstudium in jeder kleinen Wirbellosen verwendet werden. Unabhängig von der Spezies kann diese einfache Methode für relative Quantifizierung von fast allen Aminosäuren, Zwischenprodukte in Glykolyse und den TCA-Zyklus, sowie eine Anzahl von anderen kleinen polare Moleküle. In Verbindung mit der unvergleichlichen genetische Werkzeuge der Drosophila -Community zur Verfügung stellt diese Art der Metabolomic Analyse die Fliege an der Spitze der metabolischen Forschung für die absehbare Zukunft.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Vielen Dank an die Indiana University Masse Spektroskopie Anlage und der University of Utah Metabolomik Core Facility für die Unterstützung bei der Optimierung dieses Protokolls. J.M.T. wird durch das National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Preis Anzahl R35GM119557 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
References
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