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Developmental Biology

गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (GC-MS) के लिए Drosophila लार्वा नमूनों की तैयारी-आधारित Metabolomics

Published: June 6, 2018 doi: 10.3791/57847
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Indiana University

Summary

यह प्रोटोकॉल GC-MS-आधारित metabolomic विश्लेषण के लिए Drosophila लार्वा तैयार करने के तरीके का वर्णन करता है ।

Abstract

metabolomics के क्षेत्र में हाल ही में अग्रिमों पशु चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली आनुवंशिक मॉडल के रूप में फल मक्खी Drosophila melanogaster की स्थापना की है । मध्यस्थ चयापचय के बड़े swaths सर्वेक्षण करने की क्षमता के साथ Drosophila आनुवंशिक उपकरण के विशाल सरणी के संयोजन के द्वारा, एक metabolomics दृष्टिकोण आहार, जीनोटाइप, जीवन इतिहास की घटनाओं, और पर्यावरण cues के बीच जटिल बातचीत प्रकट कर सकते हैं. इसके अलावा, metabolomics अध्ययन उपंयास एंजाइमी तंत्र की खोज और प्रतीत होता है असमान चयापचय रास्ते के बीच पहले से अज्ञात कनेक्शन को उजागर कर सकते हैं । आदेश में Drosophila समुदाय के बीच इस प्रौद्योगिकी के अधिक व्यापक उपयोग की सुविधा के लिए, यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि कैसे गैस के लिए Drosophila लार्वा नमूने तैयार करने के लिए क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-MS) प्रदान करते हैं- आधारित metabolomic विश्लेषण । हमारे प्रोटोकॉल लार्वा नमूना संग्रह, metabolite निष्कर्षण, रासायनिक derivatization, और जीसी-एमएस विश्लेषण का विवरण भी शामिल है । इस प्रोटोकॉल के सफल समापन उपयोगकर्ताओं एमिनो एसिड, शर्करा सहित छोटे ध्रुवीय चयापचयों के सापेक्ष बहुतायत को मापने के लिए, और कार्बनिक glycolysis और टीसीए चक्र में शामिल एसिड की अनुमति देगा ।

Introduction

फल मक्खी Drosophila melanogaster आणविक तंत्र है कि मध्यस्थ चयापचय को विनियमित अध्ययन के लिए एक आदर्श प्रणाली के रूप में उभरा है । न केवल सबसे चयापचय रास्ते Drosophila और मनुष्यों के बीच संरक्षित हैं, लेकिन मुख्य पोषक तत्व सेंसरों और ऐसे इंसुलिन, टो के रूप में विकास नियामकों, और myc, भी मक्खी में सक्रिय हैं1,2. नतीजतन, Drosophila मधुमेह और मोटापे से neurodegeneration और कैंसर से लेकर मानव रोगों के चयापचय आधार का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस संबंध में, Drosophila लार्वा विकास आदर्श ढांचा प्रदान करता है जिसमें एरोबिक glycolysis, या Warburg प्रभाव के रूप में जाना जाने वाला चयापचय कार्यक्रम का अध्ययन करना है । बस के रूप में कई ट्यूमर एरोबिक glycolysis का उपयोग करने के लिए कार्बोहाइड्रेट से बायोमास उत्पंन, तो क्या Drosophila लार्वा सक्रिय एरोबिक glycolysis को बढ़ावा देने के विकासात्मक विकास3,4,5। लार्वा और ट्यूमर चयापचय के बीच ये समानताएं कैसे एरोबिक glycolysis को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल के रूप में Drosophila स्थापित vivo मेंविनियमित है ।

तथ्य यह है कि मक्खी चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल के रूप में उभरा है के बावजूद, सबसे Drosophila अध्ययन तरीकों कि trehalose, ट्राइग्लिसराइड्स, या एटीपी के रूप में व्यक्तिगत चयापचयों3, को मापने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं पर भरोसा करते हैं. के बाद से एक विशिष्ट प्रोटोकॉल को मापने के लिए आवश्यक है प्रत्येक metabolite, परख आधारित अध्ययन कर रहे है श्रम गहन, महंगी, और उन यौगिकों कि वाणिज्यिक किट का उपयोग कर मापा जा सकता है के प्रति पक्षपाती । इन सीमाओं का एक समाधान metabolomics के क्षेत्र से उभरा है, जो Drosophila चयापचय का अध्ययन करने का एक अधिक कुशल और निष्पक्ष साधन प्रदान करता है । एक परख आधारित अध्ययन के विपरीत, एक एकल metabolomic विश्लेषण एक साथ छोटे अणु चयापचयों के सैकड़ों उपाय कर सकते है और एक जीव चयापचय स्थिति6,7की एक व्यापक समझ प्रदान करते हैं । यह तकनीक काफी Drosophila चयापचय अध्ययन के दायरे का विस्तार किया गया है और इस उभरते क्षेत्र के भविष्य8का प्रतिनिधित्व करता है ।

Metabolomic अध्ययन मुख्यतः तीन प्रौद्योगिकियों का उपयोग कर आयोजित कर रहे हैं: (i) नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), (ii) तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-ms), और (iii) गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (GC-ms)9. प्रत्येक दृष्टिकोण अलग फायदे और नुकसान प्रदान करता है, और इन प्रौद्योगिकियों के सभी सफलतापूर्वक Drosophila चयापचय का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । चूंकि हमारे प्रयोगशाला में किए गए अनुसंधान छोटे, ध्रुवीय चयापचयों पर केंद्रित है, हम मुख्य रूप से एक GC-एमएस-पद्धति आधारित काम करते हैं । GC-MS उच्च reproducibility, पीक संकल्प, संवेदनशीलता सहित लाभ के एक नंबर के साथ उपयोगकर्ता प्रदान करता है, और एक मानक इलेक्ट्रॉन प्रभाव की उपलब्धता (ेि) वर्णक्रमीय पुस्तकालय है, जो खोज की चयापचय की तेजी से पहचान के लिए अनुमति देता है 10,11सुविधाएं । GC-MS के लिए नमूनों की तैयारी, तथापि, कुछ जटिल है और विस्तार करने के लिए एक सावधान ध्यान देने की आवश्यकता है । नमूनों को एकत्र किया जाना चाहिए, धोया, तौला, और एक तरह से है कि जल्दी से चयापचय प्रतिक्रियाओं बुझती में जमे हुए । इसके अलावा, मक्खी लोथ मानक homogenization प्रोटोकॉल के लिए प्रतिरोधी है और एक मनका मिल की आवश्यकता के लिए इष्टतम metabolite निष्कर्षण सुनिश्चित करते हैं । अंत में, GC-MS द्वारा विश्लेषण नमूनों का पता लगाने से पहले रासायनिक derivatization से गुजरना चाहिए12. जबकि पहले प्रकाशित तरीकों के सभी इन चरणों का वर्णन3,13,14, एक दृश्य प्रोटोकॉल है कि नौसिखिए उपयोगकर्ता reproducibly उच्च गुणवत्ता डेटा उत्पंन करने की अनुमति होगी अभी भी जरूरत है । यहां हम प्रदर्शन कैसे GC-MS-आधारित metabolomics विश्लेषण के लिए Drosophila लार्वा नमूने तैयार करने के लिए । इस प्रोटोकॉल reproducibly छोटे ध्रुवीय चयापचयों कि केंद्रीय कार्बन चयापचय रचना के कई उपाय करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है ।

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Protocol

1. अंडा संग्रह

  1. वयस्क पुरुषों और वांछित पादी की कुंवारी महिलाओं को इकट्ठा । व्यक्तिगत रूप से 3-5 दिनों के लिए मानक ब्लूमिंगटन मीडिया के साथ एक भोजन की शीशी में इन जानवरों की उंर ।
  2. एक नए भोजन की शीशी के लिए ५० कुंवारी महिलाओं और 25 पुरुषों को स्थानांतरित करके उपयुक्त संभोग की स्थापना की ।
    नोट: प्रत्येक जीनोटाइप के लिए न्यूनतम छह स्वतंत्र सहवासों की स्थापना की जानी चाहिए. प्रत्येक सहवास से केवल एक नमूना एकत्रित किया जाएगा (अर्थात छः स्वतंत्र सहवास से एकत्र किए गए छः नमूने).
  3. गुड़ अंडे बिछाने टोपियां तैयार करते हैं ।
    1. एक 2 एल कुप्पी में एच2O के ७०० मिलीलीटर के साथ ११५ मिलीलीटर गुड़ और आगर के 29 ग्राम मिलाएं ।
    2. एक गर्म प्लेट पर गुड़ आगर मिश्रण उबाल लें ।
    3. ७० डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा ।
    4. एसिड मिश्रण के 25 मिलीलीटर (८५% फास्फोरस एसिड और २०९ एमएल propionic एसिड के 1 एल में एच2ओ के 20 मिलीलीटर जोड़ें; एक भूरे रंग की बोतल में स्टोर) और 10% पी के 10 मिलीलीटर-hydroxy-बेंजोइक एसिड मिथाइल एस्टर में ९५% इथेनॉल ।
    5. दोनों ढक्कन और एक ३५ x 10 मिमी2 ऊतक संस्कृति पकवान के नीचे भाग में गुड़ आगर डालो ।
      नोट: गुड़ आगार प्लेटें डालने से पहले, सुनिश्चित करें कि ढक्कन और/३५ x 10 मिमी2 प्लेट के आधार पर एक Drosophila शेयर बोतल के मुंह में snuggly फिट (१.६ कदम में वर्णित) । इस्तेमाल किया प्लेटों के ब्रांड पर निर्भर करता है, आधार प्रयोग करने योग्य नहीं हो सकता है ।
  4. एक्टिव ड्राई यीस्ट को आसुत पानी से जोड़कर ताजा यीस्ट पेस्ट बना लीजिये (5 ग्राम यीस्ट/मिश्रण का पेस्ट बन जाता है) जब तक कि आसानी से एक ठोस सतह (यानी, मूंगफली के मक्खन की संगति) पर फैलाई जा सकती है.
  5. एक गुड़ अंडे की सतह पर खमीर पेस्ट के लगभग १.५ ग्राम फैल टोपी बिछाने ।
  6. एक प्लास्टिक के विपरीत पक्षों में चार हवा छेद प्रहार 6 ऑउंस. Drosophila स्टॉक बोतल एक 22 जी सुई का उपयोग कर ।
  7. खाद्य शीशी से संस्कृति की बोतलों में नव साथी मक्खियों स्थानांतरण ।
    नोट: मक्खियों या तो एक अस्थाई संवेदनाहारी के रूप में सह2 का उपयोग करके या बोतल के मुंह में शीशी के ऊपर पकड़ और तेजी से एक benchtop के खिलाफ बोतल के नीचे दोहन द्वारा हस्तांतरित किया जा सकता है ।
  8. जल्दी से एक गुड़ अंडा-एक Drosophila शेयर बोतल के मुंह में सतह पर खमीर पेस्ट के साथ टोपी बिछाने जगह है । जगह में अंडे बिछाने टोपी सुरक्षित करने के लिए प्रयोगशाला टेप का प्रयोग करें ।
    नोट: यदि मक्खियों को हस्तांतरण से पहले anesthetized थे, बोतल benchtop पर क्षैतिज रखा जाना चाहिए जब तक सभी मक्खियों बरामद किया है । एक बार मक्खियों पूरी तरह से मोबाइल हैं, गुड़ अंडे के साथ एक मशीन में बोतल जगह संस्कृति के तल पर टोपी बिछाने ।
  9. गुड़ अंडे की जगह-टोपी बिछाने कम से पहले दो दिनों के लिए एक दिन में एक बार शेयर बोतल पलटने से, benchtop के खिलाफ बोतल के नीचे दोहन, पुराने अंडे की टोपी हटाने, और तुरंत बोतल के मुंह में एक नया अंडा टोपी रखकर । पुराने अंडे-टोपी बिछाने त्यागें ।
    नोट: यह कदम सुनिश्चित करता है कि महिलाओं को अपने अंडे नहीं पकड़ रहे है और सिंक्रनाइज़ आबादी के संग्रह के लिए अनुमति देता है ।
  10. एक नया अंडा प्लेस 3 दिन के बाद शेयर बोतल में टोपी बिछाने, 2 घंटे के बाद की जगह है, और त्यागें । निकालें और चार घंटे के बाद दूसरे अंडे की जगह टोपी बिछाने । इस अंडे के नीचे लेबल तारीख, समय, और जीनोटाइप के साथ टोपी बिछाने ।
    नोट: यह 4 एच खिड़की के दौरान एकत्र अंडे विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । यह सिंक्रनाइज़ेशन चरण विशिष्ट विकासात्मक चरणों का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है । अंडे इस तरीके से कई दिनों तक एकत्र किए जा सकते हैं ।
  11. अंडा डालें-एक मशीन में वांछित तापमान और आर्द्रता में एक ६० x 15 मिमी2 पेट्री प्लेट और जगह में टोपियां बिछाने ।
  12. भुखमरी, जनसंख्या घनत्व या संदूषण के साथ समस्याओं के लिए हर दिन अंडे बिछाने टोपियां का निरीक्षण करें ।
    नोट: लार्वा को सतत विकास सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त भोजन की पहुंच होनी चाहिए । यदि आवश्यक हो, ताजा खमीर पेस्ट सभी अंडे बिछाने टोपियां कि प्रयोग में इस्तेमाल किया जाएगा पर फैल सकता है । इसके अलावा यदि लार्वा जनसंख्या घनत्व बहुत अधिक है तो लार्वा कल्चरल प्लेट से बाहर भटकना शुरू हो जाएगा । इन नमूनों metabolomic विश्लेषण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि उच्च जनसंख्या घनत्व और भुखमरी के मध्यवर्ती मुक्केबाज़ी अनुभवी जबकि भटक असंगत डेटा में परिणाम होगा । एक घनत्व ~ 80-100 मध्य दूसरा instar लार्वा (L2) प्रति प्लेट या 40 – 50 मध्य तीसरे instar लार्वा (L3) प्रति प्लेट की सिफारिश की है । नमूने है कि बैक्टीरिया या कवक के साथ दूषित दिख रहे है छोड़ दिया जाना चाहिए ।

2. लार्वा नमूना संग्रह

  1. वांछित अवस्था तक आयु लार्वा । l3 लार्वा एकत्रित कर रहा है, तो L2-l3 गलते पर नमूने पुनः सिंक्रनाइज़ । reतुल्यकालन आमतौर पर एक पहले वर्णित विधि का उपयोग कर प्राप्त है कि एक विकासात्मक मील का पत्थर के रूप में पूर्वकाल spiracles का उपयोग करता है15। वैकल्पिक रूप से, मध्य L3 लार्वा एक sgs3 रिपोर्टर जीन16का उपयोग कर सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है ।
    नोट: इस संबंध में, हम मध्य L2 लार्वा (~ ६० ज के बाद अंडे बिछाने) आदर्श सबसे विश्लेषण के लिए उपयुक्त है क्योंकि लार्वा विकास अभी भी इस स्तर पर अपेक्षाकृत तुल्यकालिक है, ध्यान से एकत्र नमूनों को इस timepoint को विकसित करने के लिए पर्याप्त भोजन है, और नमूने प्रति पशुओं की संख्या प्रबंधनीय है (नीचे देखें) । l3 लार्वा के लिए एक अतिरिक्त सिंक्रनाइज़ेशन चरण आवश्यक है क्योंकि l3 विकास के दौरान होने वाली कई ecdysone दालें चयापचय पर नाटकीय प्रभाव होती हैं और वे अनसिंक्रनाइज़्ड आबादी में कलाकृतियों को उत्पन्न करेंगी ।
  2. एक विदारक सुई का उपयोग करने के लिए धीरे आगर बंद खमीर पेस्ट उठा । एक नया गुड़ आगर कैप पर खमीर प्लेस ।
    नोट: अधिकांश लार्वा गुड़ आगार और खमीर पेस्ट के बीच इंटरफेस पर खा जाएगा ।
  3. गुड़ आगार की नव प्रखरता सतह से लार्वा एकत्रित करने के लिए एक छोटी तूलिका का प्रयोग करें । लार्वा को बर्फ पर १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में रखें ।
    नोट: प्रत्येक विकासात्मक अवस्था के लिए उपयुक्त नमूना आकार निम्नानुसार हैं: ५० प्रथम instar लार्वा (L1); 25 मध्य L2 लार्वा; 20 अर्ली L3 लार्वा; 15 मध्य l3 या देर से l3 लार्वा ।
  4. धो और फ्रीज (चरण २.३ के माध्यम से २.८) छोटे बैचों में (चार से छह नमूने) एक बड़े नमूना सेट एकत्रित करते समय । नमूनों ट्यूबों में लार्वा रखने के 20 मिनट के भीतर जम जाना चाहिए ।
    नोट: हम अनुशंसा करते हैं Eppendorf १.५ मिलीलीटर फ्लेक्स ट्यूबों का उपयोग कर क्योंकि अन्य ट्यूबों चरण 3 पर नमूना हस्तांतरण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. नमूने microfuge ट्यूबों में एकत्र किया जाना चाहिए । चरण ३.१ में वर्णित मनका ट्यूबों में नमूने एकत्र न करें । सिरेमिक मोती NaCl धो समाधान है, जो गलत सामूहिक माप में परिणाम और नमूने में संदूषण परिचय बनाए रखने ।
  5. 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा ०.९% NaCl ट्यूब में जोड़ें, ढक्कन बंद करें, और अनुलंब रूप से लार्वा को धोने के लिए ट्यूब को अच्छी तरह से फ़्लिप करें ।
  6. बर्फ पर ट्यूब वापस प्लेस के लिए ~ 30 एस । इस दौरान लार्वा ट्यूब के नीचे तक डूब जाएगा, लेकिन यीस्ट सस्पेंशन में ही रहेगा । एक बार जब सभी लार्वा एक ढीला गोली का गठन किया है, एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर NaCl समाधान निकालें ।
  7. दोहराएँ चरण २.४ और चरण २.५ दो बार, या अंतिम वाश समाधान साफ़ है जब तक ।
    नोट: अतिरिक्त धोने कदम आवश्यक हो सकता है यदि एकत्र नमूने खमीर की एक अत्यधिक मात्रा में शामिल हैं ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए २,००० × जी पर नमूने केंद्रापसारक ।
  9. एक २०० µ l पिपेट का उपयोग कर सभी अवशिष्ट समाधान निकालें ।
  10. तुरंत तरल नाइट्रोजन में नमूना फ्रीज ।
    नोट: इस चरण पर प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है । नमूने-८० ° c पर 3 महीने तक के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।

3. मनका ट्यूबों के लिए नमूनों का स्थानांतरण

  1. प्रत्येक लार्वा नमूना १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब से एक 2 मिलीलीटर screwcap ट्यूबों १.४ mm सिरेमिक मोती युक्त स्थानांतरित किया जाना चाहिए । इस स्थानांतरण कदम के लिए तैयार करने में, एक 2 मिलीलीटर screwcap मनका ट्यूब के पक्ष लेबल के लिए एक इथेनॉल प्रूफ मार्कर का उपयोग करें (निशान पर चिह्न ४.४ कदम के दौरान नष्ट हो जाएगा) ।
  2. एक विश्लेषणात्मक संतुलन को मापने में सक्षम का उपयोग कर लेबल मनका ट्यूब के द्रव्यमान का धड़ा सही ०.०१ मिलीग्राम ।
  3. यदि लार्वा नमूने-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया, तरल नाइट्रोजन में जगह नमूना ट्यूबों हस्तांतरण करने से पहले ।
  4. तरल नाइट्रोजन देवर से १.५ मिलीलीटर नमूना ट्यूब निकालने के लिए लंबी संदंश का प्रयोग करें ।
  5. nitrile दस्ताने पहने हुए, जमे हुए ट्यूब, पलटना ले लो, और तेजी से benchtop के खिलाफ ट्यूब ढक्कन पाउंड जमे हुए गोली को उखाड़ फेंकना । तुरंत एक पूर्व में गोली डाल 2 मिलीलीटर screwcap मनका ट्यूब धड़ा । यदि गोली को हटाना विफल रहता है, तरल नाइट्रोजन और दोहराने के लिए ट्यूब वापस ।
    नोट: लार्वा छर्रों सभी microfuge ट्यूबों से बेदखल नहीं होगा । यदि लार्वा छर्रों विश्लेषण के लिए नमूनों का संग्रह करने से पहले उखाड़ फेंकना किया जा सकता निर्धारित अगर एक सिफारिश की तुलना में अन्य ट्यूब का उपयोग करना ।
  6. जल्दी से लार्वा गोली और मनका ट्यूब के संयुक्त जन को मापने । तुरंत तरल नाइट्रोजन में नमूना ट्यूब जगह है । लार्वा गोली जन metabolomic डेटा को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    नोट: इस चरण पर प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है । नमूने-८० ° c पर 3 महीने तक के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।

4. नमूना निष्कर्षण

  1. एक-20 ° c benchtop कूलर में नमूना ट्यूबों रखें ।
  2. एक ट्यूब में 2 µ जी/एमएल succinic-d4 एसिड युक्त (-20 डिग्री सेल्सियस) ९०% मेथनॉल की ०.८ मिलीलीटर जोड़ें । -20 ° c benchtop कूलर के लिए नमूना वापस ।
    नोट: succinic-d4 एसिड एक आंतरिक मानक के रूप में कार्य करता है । केवल HPLC ग्रेड एच2O और मेथनॉल का उपयोग करें । चूंकि मेथनॉल और अंय कार्बनिक सॉल्वैंट्स अस्थिर और सही हवा विस्थापन पिपेट का उपयोग कर मापने के लिए मुश्किल हैं, हम इस कदम के लिए सकारात्मक विस्थापन पिपेट और सभी निंनलिखित चरणों का उपयोग करने की सलाह देते हैं ।
  3. एक खाली मनका ट्यूब में 2 µ जी/एमएल succinic-d4 एसिड युक्त (-20 डिग्री सेल्सियस) ९०% मेथनॉल की ०.८ मिलीलीटर जोड़कर एक नकारात्मक नियंत्रण स्थापित करें ।
  4. एक 4 डिग्री सेल्सियस तापमान नियंत्रण कक्ष में स्थित एक मनका मिल homogenizer का उपयोग कर ६.४५ मी पर 30 दूसरे के लिए Homogenize नमूने ।
    नोट: विफलता के लिए तेजी से और पूरी तरह से homogenize लार्वा गोली metabolomics विश्लेषण में परिवर्तनशीलता का एक आम स्रोत है । केवल homogenizers है कि 30 एस के भीतर जमे हुए लार्वा ऊतकों को नष्ट करने में सक्षम है का उपयोग करें ।
  5. homogenized नमूने ट्यूबों के लिए-20 ° c benchtop कूलर लौटें और उंहें एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में कम से 1 ज के लिए गर्मी ।
  6. २०,००० × g या अधिकतम गति 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों के परिणामस्वरूप वेग को दूर करने के लिए ।
  7. एक नया १.५ एमएल microcentrifuge ट्यूब में supernatant के ६०० µ एल स्थानांतरण । हाला को परेशान न करें । supernatant pipetting करते समय हाला गोली उखाड़ फेंका जाता है, ट्यूब करने के लिए सभी supernatant वापस और कदम ४.६ दोहराएँ ।
  8. एक वैक्यूम केंद्रापसारक में नमूना ट्यूबों प्लेस । सुनिश्चित करें कि सभी ट्यूबों के केंद्रापसारक सील करने से पहले खुले हैं । सभी विलायक हटा दिया जाता है जब तक कमरे के तापमान पर नमूनों सूखी (इस कदम को आमतौर पर पूरा करने के लिए ~ 16 एच लेता है) ।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो प्रोटोकॉल इस चरण पर रोका जा सकता है । सूखे नमूना-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।

5. रासायनिक Derivatization

  1. सूखे नमूनों-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे, तो एक वैक्यूम केंद्रापसारक में खुला नमूना ट्यूबों जगह और 30 मिनट के लिए सूखी । यह चरण नमूना ट्यूब खोलने से पहले किया जाना चाहिए ।
    नोट: यह कदम microfuge ट्यूब के बाहर फ्रीजर से निकाल दिया जब पर एकत्र करता है कि संघनित्र निकालता है । प्रोटोकॉल के इस हिस्से को एच2O के लिए अत्यंत संवेदनशील है और अतिरिक्त एहतियात के रूप में संभव के रूप में शुष्क सभी रिएजेंट रखने के लिए लिया जाना चाहिए ।
  2. निर्जल pyridine में ४० मिलीग्राम/एमएल methoxylamine हाइडरोक्लॉराइड (मॉक्स) का समाधान तैयार करें । फक्त निर्जल pyridine उपयोग करा. एक desiccator में मॉक्स और pyridine की दुकान और मॉक्स समाधान प्रतिदिन तैयार करते हैं.
    सावधानी: मॉक्स और pyridine विषाक्त हैं । इस घोल को धुएं के हुड में तैयार करें ।
    1. एक गर्मी बंदूक का प्रयोग करने के लिए एक 1 मिलीलीटर ग्लास सिरिंज सूखी ।
    2. निर्जल pyridine की बोतल में सिरिंज की सुई डालें. pyridine के 1 मिलीलीटर निकालें और एक microfuge ट्यूब से युक्त ४० मिलीग्राम मॉक्स के लिए जोड़ें ।
    3. आर्गन के साथ निर्जल pyridine की बोतल को फ्लश कर दीजिये । बोतल सील और desiccator के लिए वापस ।
    4. ३५ ° c पर ६०० rpm पर 10 मिनट के लिए एक थर्मल मिक्सर में ट्यूब की मशीन द्वारा pyridine में मॉक्स भंग ।
  3. निर्जल pyridine में ४० मिलीग्राम/एमएल मॉक्स के ४० µ एल जोड़ें सूखे नमूने के लिए समाधान ।
  4. 10 एस के लिए भंवर और संक्षेप में केंद्रापसारक (१०,००० x 20 एस के लिए जी ) ।
  5. एक थर्मल मिक्सर में ६०० rpm पर 1 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  6. २०,००० × g या अधिकतम गति 5 मिनट के लिए कण बात को दूर करने के लिए ।
  7. २५० µ l के साथ एक नमूना शीशी में supernatant के 25 µ एल स्थानांतरण निष्क्रिय ग्लास microvolume संमिलित करें ।
  8. 1% TMCS युक्त n-मिथाइल-n-trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) के ४० µ l को जोड़ें ।
    सावधानी: MSTFA विषाक्त है । धुएं डाकू में इस कदम का प्रदर्शन ।
    नोट: उपलब्ध होने पर, यह चरण किसी Gersteler द्वारा पूरा किया जा सकता है ।
  9. एक नमूना शीशी पर एक टोपी प्लेस और एक समेटना उपकरण का उपयोग कर सील.
  10. मिलाते (२५० rpm) के साथ 1 घंटे के लिए ३७ ° c पर नमूना मशीन ।
  11. पहले desceribed3के रूप में एक फैटी एसिड मिथाइल एस्टर मानक (प्रसिद्धि) समाधान तैयार करें । इंजेक्शन के लिए तुरंत पहले एक रोबोट पारखी का उपयोग कर पारखी शीशी के लिए प्रसिद्धि के 3 µ एल जोड़ें.
    नोट: प्रसिद्धि प्रतिधारण समय शिफ्ट जांचना और साधन प्रदर्शन की जाँच करने के लिए उपयोग किया जाता है. यदि कोई रोबोट पारखी उपलब्ध नहीं है, फेम ५.८ कदम के दौरान जोड़ा जा सकता है ।

6. जीसी-एमएस डिटेक्शन

नोट: ज्यादातर मामलों में, उपयोगकर्ता एक जन स्पेक्ट्रोस्कोपी कोर सुविधा की सहायता से इस कदम का संचालन करेगा । इस प्रोटोकॉल एक 5 एम गार्ड कॉलम के साथ एक 30 एम, जीसी कॉलम के साथ इस्तेमाल किया जा करने के लिए बनाया गया है ।

  1. नमूना आदेश यादृच्छिक ।
  2. जीसी-MS तैयार करें ।
    1. हीलियम वाहक गैस प्रवाह दर निर्धारित करने के लिए 1 मिलीलीटर/
    2. २५० डिग्री सेल्सियस के लिए प्रवेश तापमान निर्धारित करें ।
    3. GC कार्यक्रम के लिए निंनलिखित तापमान ढाल निष्पादित:
      1. 1 मिनट की एक पकड़ के साथ ९५ ° c करने के लिए प्रारंभिक तापमान ।
      2. 2 मिनट की एक पकड़ के साथ ४० डिग्री सेल्सियस/मिनट की दर से ११० डिग्री सेल्सियस के तापमान में वृद्धि ।
      3. 5 ° c/मिनट रैंप से २५० ° c में वृद्धि ।
      4. 4 मिनट की एक अंतिम पकड़ के साथ 25 डिग्री सेल्सियस/मिनट की दर से ३३० डिग्री सेल्सियस में वृद्धि ।
    4. ३.५ मिनट के लिए विलायक देरी सेट ।
      नोट: GC-MS सिस्टम के अनुसार समय बदला जा सकता है । इस कदम का उद्देश्य MSTFA और मॉक्स को डिटेक्टर को नुकसान पहुंचाने से रोकना है ।
  3. derivatized नमूना के 1 µ एल इंजेक्षन में जीसी-MS (10:1 के विभाजन अनुपात).
    नोट: अगर चोटियों की तीव्रता बहुत कम है नमूना के 2 µ एल इंजेक्षन. नमूनों के इंजेक्शन आर्डर यादृच्छिक होने चाहिए ।
  4. पूर्ण स्कैन मोड में जन स्पेक्ट्रोमीटर संचालित 50 की एक बड़े पैमाने पर रेंज-500 m/

7. डेटा विश्लेषण

  1. लक्षित या अनटार्गेट किए गए दृष्टिकोण का उपयोग करके metabolomic डेटा का विश्लेषण करें । लक्षित विश्लेषण चयापचयों के एक निर्धारित सेट की बहुतायत को मापने पर ध्यान केंद्रित है, ऐसे स्तनपान माप है कि हम नीचे वर्णन के रूप में । इसके विपरीत, अनलक्षित विश्लेषण एक निष्पक्ष दृष्टिकोण का उपयोग करता है कि काफी दो नमूना सेट के बीच बदल गया है किसी भी चयापचय सुविधा की पहचान ।
    नोट: हमारी प्रयोगशाला मुख्य रूप से17 MetAlign और MetaboAnalyst18,19 डेटा विश्लेषण के लिए मुफ्त कार्यक्रमों का उपयोग करता है । गुणवत्ता नियंत्रण, सामान्यीकरण, और डेटा संसाधन कदम दोनों के एक पर्याप्त विवरण के बाद से इस पांडुलिपि के दायरे से बाहर हैं, हम और अधिक विस्तृत प्रोटोकॉल है कि डेटा संसाधन के लिए समर्पित कर रहे हैं20,21के लिए उपयोगकर्ता को संदर्भित, 22. इसके अतिरिक्त, इस विश्लेषण के लिए आवश्यक चरणों का वर्णन करने वाला एक प्रवाह चार्ट8कहीं पाया जा सकता है ।

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Representative Results

स्तनपान डिहाइड्रोजनेज (dLDH) म्यूटेंट, जो dLDH गतिविधि 4कमी है, और आनुवंशिक रूप से मिलान नियंत्रण मध्य L2 लार्वा के रूप में एकत्र किए गए और प्रोटोकॉल के अनुसार संसाधित ऊपर वर्णित है । जब नियंत्रण के साथ तुलना में, उत्परिवर्ती लार्वा स्तनपान, पाइरूवेट, और एल-2-hydroxyglutarate4में महत्वपूर्ण परिवर्तन का प्रदर्शन । स्पेक्ट्रा एक टेक्नोलॉजीज GC6890-5973i एमएस सिस्टम के साथ अधिग्रहीत किया गया था । हमारे प्रोटोकॉल के साथ GC-MS स्पेक्ट्रा उत्पन्न का एक उदाहरण चित्रा 1में दिखाया गया है. वहां कई दिखाई सुविधाओं और trehalose है, जो आम तौर पर एक लार्वा नमूना में सबसे बड़ी चोटी का प्रतिनिधित्व करता है और आम तौर पर (चित्र 1a, बी) के लिए एक उल्लेखनीय चोटी रहे हैं । ऋणात्मक नियंत्रण नमूना का व्यक्तिगत स्पेक्ट्रम चित्रा 1Cमें दिखाया गया है । हालांकि अभी भी नकारात्मक नियंत्रण नमूने में कई दिखाई चोटियों, तीव्रता और चोटियों की संख्या कम कर रहे हैं, जब चित्रा 1a, बीमें दिखाया प्रयोगात्मक नमूनों की तुलना में. इन चोटियों मुख्य रूप से कॉलम खून से परिणाम, आंतरिक मानक (succinic-d4 एसिड), प्रसिद्धि, और प्रदूषित फैटी एसिड होता है । विफल नमूना तैयारी चित्रा 1Cमें दर्शाए गए एक स्पेक्ट्रम के समान जेनरेट करेगी ।

सभी स्पेक्ट्रा MetAlign17 और डेटा आंतरिक मानक और गोली जन के साथ सामान्यीकृत थे का उपयोग करते हुए संसाधित किया गया । इसके बाद आंकड़ों को सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए MetaboAnalyst18,19 को प्रस्तुत किया गया । सिद्धांत घटक विश्लेषण (पीसीए) स्पष्ट रूप से दिखाता है कि दोनों समूह एक-दूसरे से अलग हैं और यह कि दोनों समूह (चित्र 2a) में कोई ग़ैर नहीं है. इसके अलावा विश्लेषण के नुकसान से प्रभावित होने के लिए जाना जाता चयापचयों में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाता है dLDH (चित्र बी2) 4।

Figure 1
चित्र 1 : प्रतिनिधि GC-MS Drosophila लार्वा निकालने के स्पेक्ट्रा । (A-B) मध्य L2 लार्वा के ठेठ स्पेक्ट्रा जंगली प्रकार (WT) और dLDH म्यूटेंट (KO) से अर्क । (ग) एक प्रतिनिधि GC-एमएस एक नकारात्मक नियंत्रण (नेकां) नमूना से उत्पंन स्पेक्ट्रम । इस स्पेक्ट्रम में चोटियों के अधिकांश आंतरिक मानक, प्रसिद्धि और फैटी एसिड से कर रहे हैं । (डी एफ) जब WT नमूनों के साथ तुलना में, KO नमूने का स्तर ऊंचा प्रदर्शन (D) पाइरूवेट और के स्तर में कमी आई (E) स्तनपान और (F) 2-hydroxyglutarate (2-पारा). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : सांख्यिकीय विश्लेषण जंगली प्रकार (WT) और dLDH पीटकर (KO) लार्वा के बीच विभिन्न चयापचय प्रोफाइल से पता चलता है. (A) पीसीए स्कोर प्लॉट । (ख) चयापचयों कि dLDH म्यूटेंट में महत्वपूर्ण परिवर्तन दर्शाते हैं. सभी डेटा बिंदुओं WT नियंत्रण का मतलब है, जो १०० के एक मनमाना मूल्य के लिए समायोजित किया गया के सापेक्ष साजिश रची है । विश्लेषण करने से पहले, डेटा succinic-d4 एसिड आंतरिक मानक और लार्वा गोली जन को सामान्यीकृत किया गया था । अर्थ ± एक मानक विचलन के रूप में दिखाया गया डेटा । दो-पुच्छ t-परीक्षण का उपयोग करके सभी चयापचयों के लिए p < 0.01 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

Metabolomics एक अद्वितीय अवसर चयापचय प्रतिक्रियाओं कि मध्यस्थ चयापचय रचना के सर्वेक्षण के लिए प्रदान करता है । इस तकनीक की संवेदनशीलता, तथापि, renders डेटा आनुवंशिक पृष्ठभूमि, विकास cues, और तापमान, आर्द्रता, जनसंख्या घनत्व, और पोषक तत्वों की उपलब्धता सहित पर्यावरणीय तनावों की एक किस्म के लिए अतिसंवेदनशील । इसलिए, एक उच्च गुणवत्ता और reproducible metabolomics विश्लेषण की आवश्यकता है कि नमूने उच्च नियंत्रित शर्तों के तहत एकत्र की है । हालांकि कई समीक्षाएं इस बिंदु पर जोर3,8,23, यहां हम लार्वा है कि reproducibility सुनिश्चित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है इकट्ठा करने के लिए एक कदम दर कदम विधि प्रदान करते हैं ।

एक metabolomics विश्लेषण में परिवर्तनशीलता का सबसे आम स्रोत एक विफलता से बुझाने के लिए उपजी है, या बंद करो, नमूने के बाद चयापचय प्रतिक्रियाओं एकत्र की है । इस संबंध में, चयापचय तरल नाइट्रोजन में ठंड पर रोक और चयापचय एंजाइमों नष्ट कर दिया जाएगा जब नमूना homogenized में है-20 ° c मेथनॉल. मान लें कि उपयोगकर्ता मेथनॉल निष्कर्षण करने से पहले जमे हुए एक नमूना रखने के लिए विशेष ध्यान देता है, हमारे प्रोटोकॉल सुनिश्चित करें कि metabolomics डेटा इस प्रक्रिया द्वारा उत्पंन लार्वा चयापचय का एक सटीक स्नैपशॉट का प्रतिनिधित्व करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । उपयोगकर्ता डेटा परिवर्तनशीलता के अस्वीकार्य स्तर अनुभव करना चाहिए, उपयोगकर्ता के संग्रह और विशेष ध्यान के साथ metabolite निष्कर्षण प्रोटोकॉल की जांच करना चाहिए (1) यह सुनिश्चित करने के लिए भुगतान किया है कि चयापचय तेजी से बुझती है (कदम 2.9-4.2) और (2) है कि नमूना कुशलता से ९०% मेथनॉल (चरण ४.४) में homogenized है । इस संबंध में, कई मनका मिलों निर्दिष्ट समय के भीतर नमूनों homogenize करने के लिए अपर्याप्त बल प्रदान करते है और हम उपयोगकर्ता एक उपकरण है कि पिछले अध्ययन8में इस्तेमाल किया गया है का उपयोग करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं ।

हमारे प्रोटोकॉल भी प्रमुख कदम है कि नौसिखिए उपयोगकर्ता derivatize नमूने reproducibly के क्रम में ध्यान देना चाहिए पर प्रकाश डाला गया । यह GC-MS के लिए आवश्यक है क्योंकि कई चयापचयों सीमित अस्थिरता या गरीब थर्मल स्थिरता है । Derivatization कई चयापचयों की अस्थिरता और थर्मल स्थिरता दोनों बढ़ जाती है, जिससे यौगिकों कि reproducibly मापा जा सकता है की संख्या में वृद्धि. नतीजतन, नमूने है कि अपूर्ण derivatization आया है गैर reproducible पीक क्षेत्रों, ऊंचाइयों, और आकार प्रदर्शन करेंगे । जैसा कि हम यहां पर जोर, विफल derivatization का एक आम स्रोत पानी के लिए नमूने के जोखिम है, जो रासायनिक derivatization क्षमता कम हो जाती है । इसलिए, MSTFA, मॉक्स, और pyridine सहित सभी एजेंट, नमी से मुक्त शर्तों के तहत रखा जाना चाहिए । शुष्क परिस्थितियों को बनाए रखने की जरूरत भी नमूनों कि-८० डिग्री सेल्सियस है, जो एक निर्वात में रखा जाना चाहिए की तैयारी के लिए विस्तार करने के लिए खोलने से पहले 30 मिनट के लिए यह सुनिश्चित करें कि संघनित्र नमूना दर्ज नहीं करता है । हम यह भी जोर देना चाहूंगा कि GC-MS एक संवेदनशील प्रौद्योगिकी है, और एक परिणाम के रूप में, बड़े नमूनों जरूरी बेहतर डेटा उत्पन्न नहीं होगा. हमारे प्रोटोकॉल प्रयोग नमूना आकार परीक्षण प्रदान करता है और reproducibly केंद्रीय कार्बन चयापचय में सबसे चयापचयों उपाय होगा । इन चयापचयों में से कुछ बहुत प्रचुर मात्रा में हैं और नमूना आकार बढ़ा स्पेक्ट्रम में संतृप्ति संकेत करने के लिए नेतृत्व करेंगे. वास्तव में, trehalose के लिए संकेत पहले से ही हमारे विश्लेषण में संतृप्त है और GC-MS इंजेक्शन के लिए 100:1 के एक विभाजित अनुपात सही इस परिसर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । अंत में, उपयोगकर्ता ध्यान दें कि क्योंकि हम एक ध्रुवीय निष्कर्षण समाधान का उपयोग करना चाहिए, हमारे प्रोटोकॉल लिपिड निष्कर्षण के लिए उपयुक्त नहीं है । हमारे प्रोटोकॉल भी फैटी एसिड दूषित पदार्थों है कि प्लास्टिक ट्यूबों और सुझावों पर मौजूद हो सकता है के लिए खाते में नहीं है, यही वजह है कि कुछ फैटी एसिड संकेतों नकारात्मक नियंत्रण के नमूने में दिखाई देते है (चित्र 1b) ।

अंत में, यहां विस्तृत तरीके Drosophila चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है । इस प्रोटोकॉल, तथापि, के लिए विशिष्ट नहीं है Drosophila और किसी भी छोटे invertebrate में चयापचय अध्ययन के संचालन के लिए कुछ संशोधनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रजातियों की परवाह किए बिना, इस सरल विधि लगभग सभी अमीनो एसिड, glycolysis में मध्यवर्ती और टीसीए चक्र, साथ ही अन्य छोटे ध्रुवीय अणुओं की एक संख्या के सापेक्ष ठहराव के लिए अनुमति देता है. जब अद्वितीय आनुवंशिक Drosophila समुदाय के लिए उपलब्ध उपकरणों के साथ संयुक्त, metabolomic विश्लेषण के इस प्रकार निकट भविष्य के लिए चयापचय अनुसंधान के सबसे आगे मक्खी स्थानों ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इंडियाना विश्वविद्यालय के जन स्पेक्ट्रोस्कोपी सुविधा और यूटा विश्वविद्यालय Metabolomics कोर सुविधा के सदस्यों के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन में सहायता के लिए धंयवाद । J.M.T. पुरस्कार संख्या R35GM119557 के अंतर्गत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जनरल मेडिकल साइंसेज के नेशनल इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Unsulfured blackstrap molasses Good Food, INC
Drosophila Agar Type II Genesee Scientific 66-103
Pyridine EMD Millipore PX2012-7
Methoxyamine hydrocholoride (MOX) MP Biomedicals, LLC 155405
MSTFA with 1% trimethylchlorosilane Sigma 69478
Fleischmann’s Active dry yeast AB Mauri Food Inc 2192
6oz Drosophila stock bottle Genesee Scientific 32-130
Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes)  Omni International SKU:19-627
Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet Agilent 5181-8872
Succinic acid-2,2,3,3-d4 Sigma 293075
SpeedVac Thermo  SC210A
o-Phosphoric acid Fisher Scientific A242-1
Propionic acid Sigma P5561
p-Hydroxy benzoic acid methyl ester Genesee Scientific 20-258
Bead Ruptor Omni International SKU:19-040E
ThermoMixer F1.5 Eppendorf 5384000012
MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block Benchmark Scientific H5000
Methanol Sigma 34860
1.5 mL centrifuge tube Eppendorf 22364111
Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish Corning Incorporated 353001
GC column Phenomex ZB-5MSi

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३६ Drosophila विकास जीवविज्ञान चयापचय metabolomics जीसी-MS glycolysis mitochondria
गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (GC-MS) के लिए <em>Drosophila</em> लार्वा नमूनों की तैयारी-आधारित Metabolomics
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Li, H., Tennessen, J. M. Preparation … More

Li, H., Tennessen, J. M. Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics. J. Vis. Exp. (136), e57847, doi:10.3791/57847 (2018).

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