Summary
이 프로토콜 GC-MS 기반 metabolomic 분석 초파리 애벌레를 준비 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
Metabolomics의 분야의 최근 발전 동물 물질 대사 공부에 대 한 강력한 유전자 모델 초파리 melanogaster 과일 파리를 설립 했다. 결합 하 여 초파리 유전자 도구의 광대 한 배열을 조사 중간 대사의 큰 swaths 하는 기능, 대사체학 접근 다이어트, 유전자 형, 생활 역사 사건과 환경 신호 사이 복잡 한 상호 작용을 밝힐 수 있다. 또한, 대사체학 연구 소설 효소 기계 장치를 발견 하 고 겉보기에 서로 다른 대사 경로 사이 이전에 알려지지 않은 연결을 밝히기 수 있습니다. 초파리 지역 사회 중이 기술을 더 광범위 한 사용을 촉진 하기 위하여 여기 우리 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS)에 대 한 초파리 애벌레 샘플을 준비 하는 방법을 설명 하는 상세한 프로토콜 제공- metabolomic 분석을 기반 으로합니다. 우리의 프로토콜 애벌레 샘플 수집, 대사 산물 추출, 화학 derivatization 및 GC-MS 분석에 대 한 설명을 포함합니다. 이 프로토콜의 성공적인 완료는 분해와 TCA 주기에서 아미노산, 당 분, 유기 산 관련된을 포함 하 여 작은 극 지 대사 산물의 관계 되는 풍부를 측정 하는 사용자 수 있게 됩니다.
Introduction
과일 파리 초파리 melanogaster 중간 신진 대사를 조절 하는 분자 메커니즘을 공부 하는 이상적인 시스템으로 떠오르고 있다. 대부분 대사 경로 보존 초파리 와 인간 사이 뿐만 아니라 주요 영양소 센서 및 성장 레 귤 레이 터, 인슐린, 토르, myc, 등 비행1,2활성도 있습니다. 그 결과, 초파리 는 당뇨병과 비만에서 neurodegeneration, 암에 이르기까지 인간의 질병의 변화 기초를 탐구 하 사용할 수 있습니다. 이와 관련, 초파리 애벌레 개발 호 기성 분해, 또는 바르 부르 크 효과로 알려진 신진 대사 프로그램을 공부 하는 이상적인 프레임 워크를 제공 합니다. 마찬가지로 많은 종양 호 기성 분해를 사용 하 여 탄수화물에서 바이오 매스를 생성, 그래서 할 초파리 애벌레 활성화 촉진 발달 성장3,,45호 기성 분해. 애벌레 사이의 이러한 유사성 및 종양 물질 대사 이해 어떻게 에어로빅에 대 한 주요 모델 초파리 를 설치 분해는 레 귤 레이트 된 vivo에서.
즉석 대사 공부에 대 한 인기 모델로 떠오르고 있다 사실에도 불구 하 고 대부분 초파리 연구는 개별 대사 산물3, 트 레 할 로스, 트리 글리세라이드, ATP 등을 측정 하도록 설계 된 방법에 의존. 특정 프로토콜 각 대사 산물을 측정 하는 데 필요한, 이후 분석 결과 기초를 둔 학문은 노동 집약, 비싸고, 그 화합물 상업 키트를 사용 하 여 측정할 수 있는 쪽으로 편 파. 이러한 제한 사항에 대 한 해결책의 대사체학, 초파리 대사 공부 보다 효율적이 고 공평한 방법을 제공 분야에서 나왔다. 분석 결과 기반 연구와 달리 단일 metabolomic 분석 수 있습니다 동시에 작은 분자 대사 산물의 수백을 측정 하 고 유기 체의 대사 상태6,7에 대 한 포괄적인 이해를 제공. 이 기술은 크게 초파리 대사 연구의 범위를 확장 했다 그리고이 신흥 분야8의 미래를 나타냅니다.
Metabolomic 연구는 주로 세 가지 기술을 사용 하 여 실시: (i) 핵 자기 공명 (NMR), (ii) 액체 크로마토그래피-질량 분석 (MS LC), 및 (iii) 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS)9. 각 접근 제공 뚜렷한 장점과 단점, 그리고 이러한 모든 기술은 성공적으로 초파리 대사 공부 하 사용 되었습니다. 때문에 실험실에서 실시 하는 연구, 극 지 대사 산물에 초점을 맞추고, 우리가 주로 GC-MS 기반 메서드를 사용 합니다. GC-MS 장점, 높은 재현성, 최대 해상도, 감도, 등의 번호와 사용자를 제공 하 고의 급속 한 식별 수 있는 표준 전자 영향 (EI) 스펙트럼 라이브러리의 가용성 변화 발견 기능10,11. 그러나 GC-ms, 샘플의 준비, 다소 복잡 하 고 세부 사항에 주의 요구 한다. 샘플 수집, 세척, 몸 무게, 고 대사 반응을 신속 하 게 냉각 하는 방식으로 냉동 있습니다. 또한, 비행 시체는 표준 균질 프로토콜에 저항 하며 최적의 대사 산물 추출 되도록 비드 밀. 마지막으로, GC-MS 분석 샘플 탐지12이전 화학 derivatization를 겪어야 한다. 이전에 게시 방법이 단계3,,1314의 모든 설명, 동안 reproducibly 고품질 데이터를 생성 하는 초보자 사용자 있도록 시각적 프로토콜 여전히 필요 합니다. 여기 GC-MS 기반 대사체학 분석 초파리 애벌레 샘플을 준비 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜 reproducibly 측정 하는 중앙 탄소 물질 대사를 구성 하는 작은 극 지 대사 산물의 많은 사용자를 수 있습니다.
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Protocol
1. 달걀 컬렉션
- 성인 남성 및 원하는 genotypes의 처녀 여성을 수집 합니다. 개별적으로 3-5 일에 대 한 표준 블루밍턴 미디어와 식품 유리병에서이 동물을 나이.
- 새로운 음식 유리병에 50 처녀 암컷과 25 남성을 전송 하 여 적절 한 matings를 설정 합니다.
참고: 최소 6 개의 독립적인 matings 설정 되어야 합니다 각 유전자 형에 대 한. 하나의 샘플 각 짝짓기 (즉, 6 개의 독립적인 matings에서 수집 된는 6 샘플)에서 수집 됩니다. -
당 밀 계란-누워 모자를 준비 합니다.
- 115 mL 당 밀의과 한 천의 29 g H2O 2 L 플라스 크에 700 mL와 함께 믹스.
- 당 밀 뜨거운 접시에 한 천 혼합물을 끓인 다.
- 70 ° c에 냉각
- 산 믹스 (20 mL의 85% 인산 H2O; 1 L에 209 mL 프로 산 25 mL를 추가 갈색 병에 게)와 95% 에탄올에 10% p hydroxy benzoic 산 메 틸 에스테 르의 10 mL.
- 35 x 10 m m2 조직 배양 접시의 뚜껑과 하단 부분에 당 밀 한 천 하 거 라.
참고: 하기 전에 당 밀 한 천 배지를 따르고, 반드시 뚜껑 / 35 x 10 m m2 접시의 기초 (단계 1.6에서 설명) 초파리 재고 병의 입에 snuggly 적합. 사용 하는 접시의 브랜드에 따라 기본 사용할 수 없습니다 수 있습니다.
- 증류수를 추가 하 여 붙여넣기 신선한 효 모에 활성 만들기 건조 효 모 (5 g 효 모/7 물) 혼합물까지 된다 (즉, 땅콩 버터의 일관성) 고체 표면에 쉽게 퍼질 수 있는 붙여넣기.
- 당 밀 계란-누워 뚜껑의 표면에 누 룩 반죽의 약 1.5 g을 확산.
- 6 온스 초파리 재고 병 22 G 바늘을 사용 하 여 플라스틱의 반대 측에 4 개의 공기 구멍을 찌른.
- 문화 병으로 음식 유리병에서 새로 성관계 파리를 전송.
참고: 파리에서 전송 될 수 있습니다 임시 마 취 또는 병의 입에서 유리병의 상단을 급격히는 벤치탑에 대 한 병의 바닥을 도청 하 여 CO2 를 사용 하 여. - 신속 하 게 초파리 재고 병의 입에 표면에 효 모 반죽과 당 밀 계란-누워 모자를 배치 합니다. 실험실 테이프를 사용 하 여 안전한 장소에 계란-누워 모자.
참고: 만약 파리 마 취 전에 전송 했다, 병 두어야 한다 가로 벤치탑에 모든 파리 회복 될 때까지. 파리는 완전히 모바일, 일단 당 밀 계란-누워 캡 아래쪽의 문화 인큐베이터에서 병을 놓습니다. - 처음 2 일 동안 하루에 적어도 한 번 반전 주식 병, 벤치탑에 대 한 병의 바닥을 두드리고, 오래 된 계란 모자를 제거 고 즉시 병의 입에 새로운 계란 모자를 배치 하 여 당 밀 계란-누워 모자를 교체 합니다. 오래 된 달걀에 누워 모자를 삭제 합니다.
참고:이 단계를 통해 여성 그들의 계란을 들고는 동기화 된 인구의 컬렉션에 대 한 수 있습니다. - 새로운 달걀 누워 모자 주식 병으로 하루 3, 2 시간 후 교체 후 놓고 삭제 합니다. 제거 하 고 4 시간 후 두 번째 계란-누워 캡을 바꿉니다. 날짜, 시간, 및 유전자 형이 낳는 캡의 하단을 레이블을 지정 합니다.
참고: 알이 4 h 창 동안 수집 분석을 위해 사용 됩니다. 이 동기화 단계는 특정 발달 단계를 분석 하기 위한 중요 한. 계란은 몇 일 동안 이러한 방식으로 수집할 수 있습니다. - 원하는 온도 습도에 인큐베이터에 장소와 60 x 15 m m2 페 트리 접시에 계란-누워 모자를 삽입 합니다.
- 계란-누워 모자 기아, 인구 밀도 또는 오염 문제에 대 한 매일 검사 합니다.
참고: 애벌레 지속적인 개발을 보장 하기 위해 적절 한 음식에 액세스할 수 있어야 합니다. 필요한 경우, 신선한 효 모 반죽 실험에 사용 될 모든 계란-누워 모자에 퍼질 수 있다. 또한, 애벌레 인구 밀도가 너무 높은 경우에, 애벌레 문화 판에서 방황 시작 됩니다. 이러한 샘플 때문에 높은 인구 밀도 및 기아 방황 하는 동안 경험의 중간 관찰 됩니다 일치 하지 않는 데이터 metabolomic 분석에 사용할 수 없습니다. ~ 80-100의 밀도 중간 두 번째 탈피 애벌레 (L2) 또는 40-50 접시 당 중간 세 번째 탈피 애벌레 (L3) 접시 당 것이 좋습니다. 가시 세균 이나 곰 팡이로 오염 된 샘플을 폐기 해야한다.
2. 애벌레 샘플 컬렉션
- 원하는 단계까지 애벌레 나이. L3 유 충 수집, L2-L3 탈피에서 샘플을 다시 동기화. 재 동기화 발달 이정표15앞쪽 spiracles를 사용 하 여 앞에서 설명한 방법을 사용 하 여 일반적으로 이루어집니다. 또는, 중반 L3 애벌레 sgs3 기자 진16를 사용 하 여 동기화 수 있습니다.
참고: 이와 관련, 우리 찾을 중반 L2 애벌레 (달걀 누워 후 ~ 60 h)는이 단계에서 애벌레의 개발은 여전히 상대적으로 동기 때문에 대부분의 분석에 이상적, 신중 하 게 수집한 샘플 개발이 timepoint에 적절 한 음식 그리고 샘플 당 동물의 수는 관리 (아래 참조). 추가 동기화 단계는 L3 애벌레 L3 개발 하는 동안 발생 하는 수많은 ecdysone 펄스 신진 대사에 대 한 극적인 효력이 때문에 동기화 되지 않은 인구에 있는 아티팩트를 생성 합니다. - 부드럽게 리프트는 agar에서 효 모 반죽을 해 바늘을 사용 합니다. 새로운 당 밀 한 천 모자에 누 룩을 놓습니다.
참고: 대부분 애벌레 당 밀 한 천 및 효 모 반죽 사이의 인터페이스에서 먹을 것 이다. - 당 밀 agar의 새로 노출 된 표면에서 애벌레를 수집 하는 작은 붓을 사용 합니다. 얼음에 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 애벌레를 놓습니다.
참고: 각 발달 단계에 대 한 적절 한 샘플 크기는 다음과 같습니다: 50 먼저 탈피 하는 애벌레 (L1); 25 중반 L2 애벌레; 20 초 L3 유 충; 15 L3 중반 또는 후반 L3 유 충입니다. - 세척 하 고 큰 샘플 세트를 수집 하는 동안에 작은 배치 (4 ~ 6 샘플) 샘플 (2.8 통해 2.3 단계)를 고정. 샘플 튜브에 있는 애벌레를 배치의 20 분 이내 동결 해야 합니다.
참고: 다른 튜브 3 단계에서 샘플 전송을 방해할 수 있기 때문에 Eppendorf 1.5 mL 플렉스 튜브를 사용 하 여 것이 좋습니다. 샘플은 microfuge 관에서 수집 해야 합니다. 3.1 단계에서 설명한 구슬 튜브에서 샘플을 수집 하지 않습니다. 세라믹 구슬 부정확 한 질량 측정 결과 및 오염 물질을 소개 하는 샘플에 NaCl의 세척 솔루션을 유지 합니다. - 추가 1 mL의 얼음 처럼 차가운 0.9 %NaCl, 튜브에 뚜껑을 닫고 세로로 대칭 이동 튜브를 철저 하 게 씻어 애벌레.
- 튜브를 다시 얼음 ~ 30 위 s. 이 시간 동안, 애벌레는 튜브의 하단 싱크대 것 이다 하지만 효 모 현 탁 액에서 남아 있을 것 이다. 모든 애벌레 느슨한 펠 릿 형성, NaCl 솔루션 1 mL 피 펫을 사용 하 여 제거.
- 최종 세척 솔루션 때까지 취소 또는 단계 2.4와 2.5 단계를 두 번, 반복.
참고: 추가 세척 단계는 누 룩의 과도 한 금액을 포함 하는 수집 된 샘플 하는 경우 필요할 수 있습니다. - 4 ° c.에 1 분 동안 2000 × g 에서 샘플을 원심
- 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 모든 잔여 솔루션을 제거 합니다.
- 즉시 액체 질소에 샘플을 동결.
참고: 프로토콜은이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다. 샘플-80 ° c.에 3 달까지 동안 저장 될 수 있다
3입니다. 비드 튜브 샘플의 전송
- 각 애벌레 샘플 1.4 m m 세라믹 구슬을 포함 하는 2 mL screwcap 튜브 1.5 mL microfuge 관에서 전송 되어야 합니다. 이 전송 단계에 대 한 준비, 2 mL screwcap 구슬 튜브 (뚜껑에 표시는 4.4 단계 파괴 될 것 이다)의 측면을 에탄올 증거 마커를 사용 합니다.
- 0.01 mg를 정확 하 게 측정 분석 균형을 사용 하 여 레이블이 지정 된 비드 튜브의 대량 포장
- 애벌레 샘플-80 ° C에 저장, 전송 액체 질소 사전에 샘플 튜브를 배치 합니다.
- 긴 집게를 사용 하 여 액체 질소에서 1.5 mL 샘플 튜브를 제거 dewar.
- 입고 니트 릴 장갑, 잡아는 냉동 튜브, 반전, 그리고 예리하게 언된 펠 릿을 꺼내 려 벤치탑에 대 한 튜브 뚜껑을 파운드. 즉시 미리 tared 2 mL screwcap 구슬 튜브에 펠 릿을 부 어. 펠 릿을 꺼내 려 실패, 액체 질소에 튜브를 반환 하 고 반복 합니다.
참고: 애벌레 펠 릿은 모든 microfuge 관에서 분리 하지 하십시오. 권장 다른 튜브를 사용 하 여, 애벌레 알 약 샘플 분석에 대 한 수집 전에 dislodged 수 있습니다 경우 결정 합니다. - 빠르게 애벌레 펠 릿과 구슬 튜브의 결합 된 질량을 측정 합니다. 바로 액체 질소로 샘플 튜브를 놓습니다. 애벌레 펠 릿 질량 metabolomic 데이터를 정규화 하는 데 사용 됩니다.
참고: 프로토콜은이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다. 샘플-80 ° c.에 3 달까지 동안 저장 될 수 있다
4. 샘플 추출
- 쿨러는-20 ° C 벤치탑에서 샘플 튜브를 놓습니다.
- 각 튜브에 2 µ g/mL 호박-d4 산을 포함 하는 prechilled (-20 ° C) 90% 메탄올의 0.8 mL를 추가 합니다. 쿨러-20 ° C 벤치탑에 샘플을 반환 합니다.
참고: 호박-d4 산 내부 표준으로 제공합니다. 만 HPLC 급료 H2O와 메탄올을 사용 합니다. 때문에 메탄올 및 다른 유기 용 매 휘발성과 공기 변위 펫을 사용 하 여 정확 하 게 측정 하기 어려운,이 단계와 다음 단계를 모두에 대 한 긍정적인 변위 펫을 사용 하는 것이 좋습니다. - 빈 구슬 튜브에 2 µ g/mL 호박-d4 산을 포함 하는 prechilled (-20 ° C) 90% 메탄올의 0.8 mL을 추가 하 여 부정적인 제어를 설정 합니다.
- 6.45 m/s 4 ° C 온도 제어 실에 있는 비드 밀 균질 화기를 사용 하 여 30 초 동안 샘플을 균질.
참고: 실패를 신속 하 고 완전 하 게 균질 애벌레 펠 릿 대사체학 분석에 가변성의 일반적인 소스입니다. 만 30 애벌레 조직을 동결를 파괴 수 있는 균질을 사용 하 여 s. - 쿨러-20 ° C 벤치탑에 무 균된 샘플 튜브를 반환 하 고 적어도 1 시간을 위한-20 ° C 냉동 실에 그들을 품 어.
- 결과 침전 제거 하 4 ° C에서 5 분에 대 한 20000 × g 또는 최대 속도에서 튜브를 원심.
- 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브에는 상쾌한의 600 µ L를 전송 합니다. 침전을 방해 하지 마십시오. 촉진 펠 릿 되는 상쾌한 pipetting 동안 빠질 경우 모든 상쾌한 튜브를 반환 하 고 단계 4.6을 반복 합니다.
- 진공 원심 분리기에 샘플 튜브를 놓습니다. 원심 분리기를 밀봉 하기 전에 모든 튜브는 열려 있어야 합니다. 모든 용 매 제거 될 때까지 실 온에서 샘플을 건조 (이 단계는 일반적으로 완료 ~ 16 시간 걸립니다).
참고: 필요한 경우 프로토콜 수 수 일시 중지이 단계에서. 말린된 샘플-80 ° c.에 저장 될 수 있다
5. 화학 Derivatization
- 말린된 샘플-80 ° C에서 저장, 개봉된 샘플 튜브 진공 원심 분리기에 놓고 30 분 동안 건조 합니다. 샘플 튜브를 열기 전에이 단계를 수행 해야 합니다.
참고:이 단계는 응축을 냉장고에서 제거 하는 때 microfuge 관의 외부에 제거 됩니다. 프로토콜의이 부분은 매우 민감한 H2O 하 고 여분의 주의 모든 시 약을 가능한 건조 유지 하 이동 해야 합니다. -
무수 피리 딘에서 40 mg/mL methoxylamine 염 (MOX)의 솔루션을 준비 합니다. 무수 피리 딘을 사용 합니다. MOX 그리고 pyridine는 desiccator에 저장 하 고 매일 MOX 솔루션을 준비.
주의: MOX, pyridine 독성이 있다. 증기 두건에서이 솔루션을 준비 합니다.- 열 총을 사용 하 여 1 mL 유리 주사기를 건조.
- 무수 피리 딘 병에 주사기의 바늘을 삽입 합니다. 피리 딘 1 mL을 제거 하 고 포함 된 MOX의 40 mg microfuge 관에 추가.
- 무수 피리 딘 아르곤과의 병을 플러시. 병을 밀봉 하 고는 desiccator 돌아갑니다.
- 잠복기 600 rpm에서 10 분 동안 35 ° C에서 열 믹서에 관 하 여는 pyridine에 MOX를 분해.
- 무수 피리 딘 솔루션에 말린된 샘플 40 mg/mL MOX의 40 µ L를 추가 합니다.
- 10 s 그리고 짧게 원심 분리기에 대 한 소용돌이 (10000 x g 20에 대 한 s).
- 열 믹서에 600 rpm에서 1 h 30 ° C에서 품 어.
- 20000 × g 또는 입자 물질을 제거 하 5 분에 대 한 최대 속도 원심.
- 250 µ L 비활성화 유리 microvolume 삽입 autosampler 유리병에 상쾌한의 25 µ L를 전송 합니다.
- 40 µ L N-메 틸-N-trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) 포함 하는 1%의 추가 TMCS.
주의: MSTFA은 독성이 있습니다. 증기 두건에서이 단계를 수행 합니다.
참고: 지금까지 사용 가능한 경우에이 단계는 Gerstel autosampler에 의해 완료할 수 있습니다. - Autosampler 유리병에 모자를 놓고 뇌관 집게 도구를 사용 하 여 밀봉 합니다.
- 진동 (250rpm)와 함께 1 시간 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.
- 이전 desceribed3지방산 메 틸 에스테 르 표준 (FAMES) 솔루션을 준비 합니다. 사용 하 여 주입 직전 로봇 autosampler autosampler 유리병에 FAMES의 3 µ L를 추가 합니다.
참고: FAMEs는 보존 시간 이동 보정 및 악기 성능 확인 하는 데 사용 됩니다. 사용할 수 없는 로봇 autosampler 이면 FAMEs 5.8 단계 추가할 수 있습니다.
6. GC-MS 검색
참고: 대부분의 경우에서 사용자 질량 분광학 핵심 시설의 도움으로이 단계를 수행 합니다. 이 프로토콜은 30 m, 5 m 가드 열 GC 열 함께 사용 하도록 설계 되었습니다.
- 무작위 샘플 주문.
-
GC-MS를 준비 합니다.
- 1 mL/min를 헬륨 캐리어 가스 유량 설정 합니다.
- 입구 온도 250 ° c.를 설정
- 프로그램 실행 다음 온도 기울기에 GC:
- 1 분의 보류와 95 ° C를 초기 온도.
- 2 분의 보류와 40 ° C/min의 속도로 110 ° C에 온도 증가.
- 250 ° C에 5 ° C/min 램프에 의해 증가.
- 4 분의 마지막 보류와 25 ° C/min의 속도로 330 ° c 증가.
- 3.5 분 용 지연을 설정 합니다.
참고: 시간 GC-MS 시스템에 따라 변경할 수 있습니다. 이 단계의 목적은 손상 된 검출기에서 MSTFA 및 MOX를 방지 하기 위해입니다.
- (10: 1의 비율로 분할) GC-MS에 derivatized 샘플의 1 µ L를 삽입할.
참고: 봉우리의 강도 너무 낮은 경우 샘플의 2 µ L를 주사. 샘플의 주입 순서를 무작위로 한다. - 50-500 m의 대량 범위 전체 스캔 모드에서 질량 분석기를 작동/z.
7. 데이터 분석
- 대상 또는 타겟이 불분명 한 방법 중 하나를 사용 하 여 metabolomic 데이터를 분석 합니다. 타겟된 분석 측정 하는 대사 산물, 우리는 아래 설명 하는 젖 산 측정 등의 정의 된 집합의 풍부에 집중 된다. 반면, 타겟이 불분명 한 분석 크게 두 샘플 세트 사이 변경 모든 신진 대사 기능을 식별 하는 공평한 접근을 사용 합니다.
참고: 연구소 주로 사용 하 여 무료 프로그램 MetAlign17 와 MetaboAnalyst18,19 데이터 분석에 대 한. 품질 관리, 표준화, 및 데이터 처리 단계에 대 한 적절 한 설명이이 원고의 범위 때문에, 우리는 참조 하십시오 사용자 데이터 처리20,21에 헌신 하는 더 상세한 프로토콜 22. 또한,이 분석에 필요한 단계를 설명 하는 순서도 찾을 수 있습니다 다른 곳에서8.
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Representative Results
젖 산 효소 dLDH 활동4, 그리고 유전자 일치 컨트롤 부족 (dLDH) 뮤턴트 중순 L2 애벌레로 수집 되었고 위에서 설명한 프로토콜에 따라 처리. 컨트롤과 비교 될 때 돌연변이 애벌레 젖 산, pyruvate, 및 L-2-hydroxyglutarate4에 상당한 변화를 전시 한다. 스펙트럼은 애질런트 GC6890 5973i MS 시스템으로 인수 했다. GC-MS 스펙트럼의 예로 생성 우리의 프로토콜 그림 1에 표시 됩니다. 많은 기능을 볼 수 있으며 일반적으로 애벌레 샘플의 가장 큰 피크를 나타냅니다 하 고 일반적으로, 트 레 할 로스에 대 한 주목할 만한 피크 oversaturated (그림 1AB). 부정적인 컨트롤 샘플의 개별 스펙트럼 그림 1C에 표시 됩니다. 비록 여전히 부정적인 컨트롤 샘플에서 몇 가지 눈에 띄는 봉우리는, 실험 샘플 그림 1A, B에표시와 비교 하는 때에 강도 및 봉우리의 수 감소 된다. 이 봉우리는 주로 열 출혈, 내부 표준 (d4 호박 산), FAMEs, 오염 지방산에서 결과. 실패 한 샘플 준비 그림 1C에 표시 된 것과 유사한 스펙트럼을 생성 합니다.
모든 스펙트럼은 MetAlign17 를 사용 하 여 전처리 및 데이터 내부 표준 및 펠 릿 표준화 했다 질량. 그 후, 데이터는 통계 분석을 위한 MetaboAnalyst18,19 를 제출 했다. 원리 구성 요소 분석 (PCA)는 두 그룹이 서로에서 분리 하 고 (그림 2A) 어느 그룹에 없는 국외 자는 명확 하 게 보여줍니다. 추가 분석 dLDH (그림 2B)4의 손실에 의해 영향을 받을 것으로 알려져 대사에 중요 한 변화를 보여줍니다.
그림 1 : 초파리 의 대표 GC-MS 스펙트럼 애벌레 추출. (A-B) 중순-L2 애벌레의 전형적인 스펙트럼 돌연변이 (코) 야생 유형 (WT) 및 dLDH 에서 추출 합니다. (C)는 대표적인 GC-MS 스펙트럼 부정적인 제어 (NC) 샘플에서 생성 된. 이 스펙트럼에서 봉우리의 대부분 FAMEs 내부 기준과 지방산에서. (D-F) 비교 될 때 WT 샘플, 코 샘플 전시 (D) pyruvate의 레벨을 상승 하 고 젖 산 (E) 와 (F) 2-hydroxyglutarate (2-HG)의 레벨을 감소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 통계 분석 결과 야생 타입 (WT)와 dLDH 사이 다른 신진 대사 프로필 녹아웃 (KO) 애벌레. (A) PCA 점수 플롯. DLDH 돌연변이에 상당한 변화 하는 (B) 대사 산물 모든 데이터 요소 100 임의의 값에 조정 했다 WT 컨트롤의 평균을 기준으로 그려집니다. 분석, 사전 데이터는 호박-d4 산 내부에 정규화 되었는지 표준 및 애벌레 작은 질량. 평균 ± 1 표준 편차로 표시 하는 데이터입니다. p < 두 꼬리 t를 사용 하 여 모든 대사 산물에 대 한 0.01-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
대사체학 중간 대사를 구성 하는 대사 반응을 조사 하는 최상의 기회를 제공 한다. 그러나이 기술의 감도 데이터 유전 배경, 발달 단서와 다양 한 환경 스트레스, 온도, 습도, 인구 밀도, 그리고 양분 가용성을 포함 하 여 렌더링 합니다. 따라서, 높은 품질과 재현성 대사체학 분석이 매우 제어 조건 하에서 샘플을 수집 하는 것. 여러 리뷰가 포인트3,,823강조, 여기 우리가 재현성을 보장 하도록 설계 된 애벌레를 수집에 대 한 단계별 방법을 제공 합니다.
대사체학 분석에 가변성의 가장 일반적인 소스는 끄다, 또는 중지, 샘플 수집 후 신진 대사 반응 하는 실패에서 유래한 다. 이와 관련, 액체 질소에서 동결 시 대사는 정지 하 고 샘플은-20 ° C 메탄올에 무 균 때 대사 효소를 파괴 될 것 이다. 사용자 샘플 메탄올 추출 전에 냉동 유지에 특별 한 관심을 지불, 그 가정 우리의 프로토콜이이 절차에 의해 생성 된 metabolomics 데이터 애벌레 대사의 정확한 스냅샷을 나타내는 되도록 설계 되었습니다. 사용자 데이터 가변성의 용납할 수 없는 수준의 경험 사용자 (1) 그 대사는 급속 하 게 담금질된 (2.9-4.2 단계) 및 (2) 그 수 있도록 특별 한 주의 함께 수집 및 대사 산물 추출 프로토콜을 재검토 해야 합니다 샘플은 90% 메탄올 (단계 4.4)에 효율적으로 무 균. 이와 관련, 지정된 된 시간 내 샘플을 균질 하 게 부족 한 힘을 제공 하는 많은 비드 밀 하 고 우리가 이전의 연구8에 사용 된 악기를 사용 하 여 사용자를 권장 합니다.
우리의 프로토콜 또한 초보자 사용자 reproducibly 샘플을 derivatize 위해 주의 해야 하는 주요 단계를 강조 표시 합니다. 많은 대사 산물 변동 또는 가난한 열 안정성 제한 때문에 이것은 GC-MS 필수적입니다. Derivatization은 휘발성 그리고 reproducibly 측정 될 수 있는 화합물의 수를 증가 하는 그로 인하여 많은 대사 산물의 열 안정성을 증가 시킵니다. 결과적으로, 불완전 한 derivatization 받은 샘플 재현할 피크 넓이, 높이, 및 모양을 전시할 것 이다. 우리 여기 강조로 실패 한 derivatization의 일반적인 소스 물, 화학 derivatization 효율 감소에 샘플의 노출 됩니다. 따라서, MSTFA, pyridine, MOX, 등 모든 시 약은 습기 없는 조건 하에서 유지 되어야 한다. 건조 상태를 유지 하는 필요는 또한 응축 샘플을 입력 하지 않으면 되도록 열기 전에 30 분 동안 진공 원심 분리기에서 두어야 한다-80 ° C에 저장 된 샘플 준비를 확장 합니다. 우리 또한 GC-MS 민감한 기술 이며 그 결과, 반드시 큰 샘플 더 나은 데이터를 생성 하지 것입니다 강조 하 고 싶습니다. 우리의 프로토콜 실험적으로 테스트 샘플 크기 하며 reproducibly 중앙 탄소 물질 대사에서 대부분 대사 산물을 측정 하는 것입니다. 이러한 대사 산물의 일부는 매우 풍부 하 고 증가 샘플 크기 신호 채도 스펙트럼에서 이어질 것입니다. 사실, 신호 GC-MS 주입을 정확 하 게 사용 해야 합니다에 대 한 트 레 할 로스 우리의 분석 및 분할 비율 100: 1의에 이미 포화에 대 한 측정이 화합물. 마지막으로, 사용자는 우리 폴라 추출 솔루션을 사용 하기 때문에 우리의 프로토콜 적합 하지 않습니다 지질 추출 주의 해야 한다. 우리의 프로토콜 또한 지방산 오염 물질을 수 있을 플라스틱 튜브 및 팁, 일부 지방산 신호 부정적인 컨트롤 샘플 (그림 1B)에 표시 하는 이유는 고려 하지 않습니다.
마지막으로, 여기서 설명 하는 방법 초파리 대사 공부를 위한 강력한 도구를 제공 합니다. 그러나,이 프로토콜을 초파리 특정 하 고 어떤 작은 무척추동물에 대사 연구 수행에 대 한 몇 가지 수정 사용할 수 있습니다. 종에이 간단한 메서드는 거의 모든 아미노산, 다른 작은 극 지 분자의 수 뿐만 아니라 분해와 TCA 주기에서 중간체의 상대적인 정량화에 대 한 수 있습니다. 초파리 커뮤니티에 사용할 수 있는 탁월한 유전자 도구와 결합 하면,이 metabolomic 분석의이 유형은 비행 장래 대사 연구의 최전선에 배치 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
인디애나 대학 질량 분광학 시설 및 대학의 유타 대사체학 핵심 시설 지원이이 프로토콜 최적화에 대 한 회원 들에 게 감사. J.M.T.에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 수상 번호 R35GM119557에서 국립 보건원의 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
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