Summary
Bu iletişim kuralı, Drosophila larva metabolomic GC-MS tabanlı analiz için hazırlamak açıklar.
Abstract
Metabolomics alanındaki son gelişmeler meyve sineği Drosophila melanogaster hayvan metabolizma çalışmak için güçlü bir genetik model olarak kurduk. Drosophila genetik araçları geniş dizi ara metabolizmasının büyük tarama alanı anket yeteneği ile birleştirerek, bir metabolomics yaklaşım diyet, genotip, hayat-tarih olayları ve çevre ipuçları arasındaki karmaşık etkileşimler ortaya çıkarabilir. Buna ek olarak, metabolomics çalışmalar roman enzimatik mekanizmaları keşfetmek ve görünüşte farklı metabolik yollar arasında daha önce bilinmeyen bağlantıları ortaya çıkarmak. Bu teknoloji Drosophila topluluk arasında daha yaygın kullanımını kolaylaştırmak için burada Drosophila larva örnekleri gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) için hazırlamak açıklar detaylı bir protokol sağlamak- metabolomic analizi dayalı. Bizim iletişim kuralı larva örnek koleksiyon, metaboliti ayıklama, kimyasal derivatization ve GC-MS çözümleme açıklamalarını içerir. Bu iletişim kuralı başarıyla tamamlanması amino asit, şeker ve organik asitler dahil glikoliz ve TCA döngüsü de dahil olmak üzere küçük kutup metabolitleri göreli bolluk ölçmek kullanıcılar izin verir.
Introduction
Meyve sineği Drosophila melanogaster ara metabolizma düzenleyen moleküler mekanizması eğitim için ideal bir sistem olarak ortaya çıkmıştır. Sadece çoğu metabolik yollar Drosophila ve insanlar arasında korunmuş ama anahtar besin sensörler ve büyüme düzenleyiciler, insülin, Tor ve myc, gibi aynı zamanda sinek1,2' aktif. Sonuç olarak, Drosophila insan hastalıkları diyabet ve obezite ateş ve kanser kadar çeşitli metabolik temeli keşfetmek için kullanılabilir. Bu bağlamda, Drosophila larva geliştirme hangi aerobik glikoliz veya Warburg etkisi olarak bilinen bir metabolik program çalışmak ideal çerçeve sağlar. Sadece birçok tümör aerobik glikoliz biyokütle karbonhidrat oluşturmak için kullanırken, öylesine Drosophila yapmak larva gelişimsel büyüme3,4,5tanıtmak için aerobik glikoliz harekete geçirmek. Bu benzerlikler arasında larva ve anlayış nasıl aerobik için anahtar bir model olarak Drosophila kurmak tümör metabolizma glikoliz düzenlenmiş vivo içindeolduğunu.
Anında metabolizma çalışmak için popüler bir model olarak ortaya çıkmıştır olmasına rağmen bireysel metabolitleri3, trehalose, trigliserid veya ATP gibi ölçmek için tasarlanmıştır yöntemleri en Drosophila çalışmaları güveniyor. Belirli bir iletişim kuralı her metaboliti ölçmek için gerekli olduğundan, tahlil tabanlı çalışmalar emek yoğun, pahalı ve ticari kitleri kullanarak ölçülen bu bileşikler karşı önyargılı vardır. Bir çözüm için bu kısıtlamalar Drosophila metabolizma eğitim daha etkili ve tarafsız bir yol sunan metabolomics alandan ortaya çıkmıştır. Tahlil tabanlı çalışmada farklı olarak, bir tek metabolomic Analizi aynı anda yüzlerce küçük molekül metabolitleri ölçebilir ve bir organizmanın metabolik durum6,7kapsamlı bir anlayış sağlamak. Bu teknik kapsamı Drosophila metabolik çalışmaların önemli ölçüde genişletti ve bu yeni ortaya çıkan alan8geleceği temsil eder.
Metabolomic çalışmalar öncelikle üç teknolojilerini kullanarak yapılır: (i) nükleer manyetik rezonans (NMR), (ii) sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) ve (III) gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS)9. Farklı avantajları ve dezavantajları her yaklaşım sunuyor ve tüm bu teknolojilerin başarıyla Drosophila metabolizma çalışmaya kullanılmıştır. Bizim laboratuarımızda yapılan araştırma üzerinde küçük, kutup metabolitleri odaklandığı öncelikle bir GC-MS tabanlı yöntemi kullanır. GC-MS birçok avantajı da dahil olmak üzere yüksek tekrarlanabilirlik, en yüksek çözünürlük, hassasiyet, kullanıcıyla sağlar ve hızlı tanımlanması için izin veren bir standart elektron etkisi (EI) spektral Kütüphane kullanılabilirliğini metabolik keşfetti Şekil10,11. Örnekleri hazırlanması için GC-MS, ancak, biraz karmaşık ve ayrıntılı bir dikkat gerektirir. Örnekleri gerekir toplanacak, yıkanmış, tartılır ve hızlı bir şekilde metabolik reaksiyonlar quenches bir şekilde dondurulmuş. Ayrıca, sinek karkas standart homojenizasyon protokolleri için dayanıklı ve en uygun metaboliti ayıklama emin olmak için bir boncuk değirmen gerektirir. Son olarak, GC-MS tarafından analiz örnekleri algılama12önce kimyasal derivatization geçmek zorundadır. Daha önce yayımlanmış yöntemleri tarif tüm bu adımları3,13,14iken, Acemi kullanıcının tekrarlanarak yüksek kalitede veri oluşturmasına olanak sağlayacak görsel iletişim kuralı hala gereklidir. Burada Drosophila larva örnekleri metabolomics GC-MS tabanlı analiz için hazırlamak nasıl gösterir. Bu iletişim kuralı tekrarlanarak birçok merkezi karbon metabolizması oluşturmak küçük kutup metabolitleri ölçmek Kullanıcı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. yumurta toplama
- Yetişkin erkek ve istenen genotip bakire kadın toplamak. Tek tek bu hayvanlara yiyecek şişe standart Bloomington medya ile 3-5 gün için yaş.
- Uygun matings kadar 50 bakire kadın ve 25 erkekler için yeni bir gıda şişe aktararak ayarlayın.
Not: Her genotip için en az altı bağımsız matings ayarlanmalıdır. Sadece bir örnek her (altı bağımsız matings toplanan Yani, altı örnekleri) çiftleşme üzerinden toplanacaktır. -
Pekmez yumurta döşeme kapaklar hazırlayın.
- 115 mL pekmezi ve agar 29 g H2O 2 lt şişeye içinde 700 mL ile karıştırın.
- Pekmez agar karışımı sıcak plaka üzerinde kaynatın.
- 70 ° C'ye serin
- Asit karışımı (20 mL % 85 fosforik asit ve 209 mL propiyonik asit H2O; 1 L 25 mL ekleyin Bir kahverengi şişe deposunda) ve 10 mL % 10 p-hidroksi-benzoic asit metil ester % 95 etanol içinde.
- Pekmez agar 35 x 10 mm2 doku kültürü çanak kapağı ve alt bölümünü içine dökün.
Not: pekmez ağar kaplamalar dökülmeden önce kapakları ve/veya 35 x 10 mm2 tabak tabanının kuytu bir Drosophila hisse senedi şişe (adım 1,6 olarak açıklanan) ağız içine sığacak emin olun. Bankası kullanılan plakalar marka bağlı olarak kullanılamayabilir.
- Taze Maya distile su ekleyerek yapıştırmak için etkin hale getirmek Kuru Maya (5 g Maya/7 mL su) karışım kadar katı bir yüzeye (yani, fıstık ezmesi tutarlılığını) kolayca yayılabilir bir hamur haline gelir.
- Yaklaşık 1.5 g Maya hamur bir pekmez yumurta döşeme kap yüzeyinde yayılmış.
- Dört hava delikleri bir plastik 6 oz. Drosophila hisse senedi şişe 22 G iğne kullanarak ters tarafı poke.
- Yeni şeklindeki sineklerin yiyecek şişe kültür şişe aktarın.
Not: Sinekler tarafından aktarılabilir olarak geçici bir anestezi veya şişe şişenin ağzına üst tutarak ve keskin bir benchtop karşı şişe dibinde dokunarak CO2 kullanarak. - Hızlı bir şekilde bir pekmez yumurta döşeme kap Maya Yapıştır ile yüzey Drosophila hisse senedi şişe ağız içine yerleştirin. Laboratuvar bant yerde yumurta döşeme kap güvenliğini sağlamak için kullanın.
Not: sinekler aktarmak için imzalat rahip olsaydı, tüm sinekler iyileşti kadar şişe yatay olarak benchtop üzerinde yer almalıdır. Sinekler tamamen mobil olduğunda, bir kuluçka pekmez yumurta döşeme kap alt kültür ile şişe yerleştirin. - Pekmez yumurta atarken kapağı günde en az bir kez ilk iki gün için hisse senedi şişeyi ters çevirme, benchtop karşı şişenin dibinde dokunarak, eski yumurta kap kaldırarak ve yeni bir yumurta kap şişenin ağzına getirdikten hemen değiştirin. Eski yumurta atarken kapağı atmak.
Not: Bu adım dişi yumurtalarını tutuyorsun değil ve senkronize nüfus topluluğu için sağlar sağlar. - Yeni bir yumurta döşeme kap sonra günde 3, 2 h sonra Değiştir hisse senedi şişe içine yerleştirin ve atın. Kaldırmak ve dört saat sonra ikinci yumurta atarken kapağı değiştirin. Bu yumurta döşeme kap Tarih, saat ve genotip ile alt etiket.
Not: Bu 4 h pencere sırasında toplanan yumurta analizi için kullanılır. Bu eşitleme özel gelişim aşamalarında analiz etmek için kritik bir adımdır. Yumurta bu şekilde birkaç gün için toplanabilir. - Yumurta döşeme kapaklar bir 60 x 15 mm2 Petri tabağı ve kuluçka istenilen sıcaklık ve nem yerine takın.
- Yumurta döşeme kapaklar her gün açlık, nüfus yoğunluğu veya kirlenme ile ilgili sorunlar için kontrol edin.
Not: Larva sürekli gelişimi sağlamak için yeterli gıda erişiminiz olmalıdır. Gerekirse, taze Maya Yapıştır deneyde kullanılacak Tüm yumurta döşeme kapaklar üzerindeki yayılabilir. Buna ek olarak, larva nüfus yoğunluğu çok yüksek ise larva kültür plaka dışarı dolaşmaya başlayacak. Yüksek nüfus yoğunluğu ve açlık wandering süre deneyimli ara nöbetleri tutarsız verilerde neden olur çünkü bu örnekler metabolomic analiz için kullanılmamalıdır. ~ 80 – 100 yoğunluğu orta orta üçüncü biçim (L3) plaka başına larva tavsiye edilir ikinci biçim larva (L2) veya plaka başına 40-50. Gözle görülür bakteri ve mantarlar ile kontamine örnekleri atılmalıdır.
2. larva örnek koleksiyonu
- İstenen sahne kadar yaş larvaları. L3 larva toplama, L2-L3 tüy dökme, örnekleri yeniden eşitleyin. Yeniden eşitleme işlemi yaygın gelişimsel kilometre taşı15ön vızıltısı kullanan bir yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak elde edilir. Alternatif olarak, orta-L3 larva sgs3 muhabir gen16kullanarak eşitlenebilir.
Not: Bu bağlamda, biz bulmak L2 orta larva (~ 60 yumurta döşeme sonra h) çoğu analizleri için idealdir larva gelişme bu aşamada hala nispeten zaman uyumlu olduğundan, özenle toplanan örnekleri var bu timepoint için geliştirmek için yeterli yiyecek ve yönetilebilir (aşağıya bakın) hayvanlar örnek başına sayısıdır. L3 geliştirme sırasında oluşan çok sayıda ecdysone bakliyat metabolizma üzerinde dramatik etkiler ve eserler eşitlenmemiş nüfus oluşturur çünkü bir ek eşitleme adım L3 larva için gereklidir. - Parçalanmış bir iğne hafifçe Maya Yapıştır agar kapalı kaldırmak için kullanın. Maya yeni bir pekmez agar kap üzerine yerleştirin.
Not: Çoğu larva pekmez agar ve Maya Yapıştır arasında arayüz, yiyeceğim. - Larva pekmez agar yeni maruz yüzeyinden toplamak için küçük bir fırça kullanın. Larvalar buz üzerinde 1,5 mL santrifüj tüpü yerleştirin.
Not: Her gelişim aşaması için uygun örnek boyutları aşağıdaki gibidir: 50 ilk biçim larva (L1); 25 orta-L2 larva; 20 erken L3 larva; 15 L3 orta veya geç L3 larvaları. - Yıkama ve büyük örnek kümesi toplarken örnekleri (adım 2,3 2,8 ile) küçük gruplar halinde (4-6 örnekleri) dondur. Örnekleri larva tüplerde yerleştirerek 20 dk içinde donmuş olmalısın.
Not: Diğer tüpler örnek transfer sırasında adım 3 ile girişime neden olabilir çünkü Eppendorf 1.5 mL tüpler Flex kullanmanızı öneririz. Örnekleri microfuge tüplerde toplanan gerekir. 3.1. adımda anlatılan boncuk tüpler örnekleri toplamayın. Seramik Boncuklar yanlış kitle ölçüm sonuçları ve kirletici örnek tanıttı NaCl yıkama çözüm korur. - Buz gibi %0,9 1 mL ekleyin NaCl içine tüp, kapağını kapatın ve dikey olarak tüp iyice larvalar yıkamak için ters çevirin.
- Tüp buz ~ 30 için geri koyun s. Bu süre içinde larva tüp alt batacağı ama Maya süspansiyon kalacaktır. Bir kez tüm larva gevşek Pelet oluşturdular, 1 mL pipet kullanarak NaCl çözüm kaldırın.
- Adım 2.4 ve adım 2.5 iki kez yineleyin veya son yıkama çözüm kadar temizleyin.
Not: Ek yıkama adımlar toplanan örnek Maya aşırı miktarda varsa gerekli olabilir. - 2.000 × g 4 ° C'de 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi
- Tüm kalıntı çözüm 200 µL pipet kullanarak kaldırın.
- Hemen örnek sıvı azot dondur.
Not: Bu adımda protokol duraklatılmış. Örnekleri-80 ° C'de 3 aya kadar saklanabilir
3. transferi örnekleri boncuk tüpler için
- Larva her örnek 1.5 mL microfuge tüpünden 1.4 mm Seramik Boncuklar içeren 2 mL screwcap tüpler aktarılması gerekir. Bu transfer adım için hazırlık olarak, bir etanol geçirmez işaretleyici (kapak üzerindeki işaretleri adımı sırasında 4.4 yok olacak) bir 2 mL screwcap boncuk tüp tarafında etiketlemek için kullanın.
- Dara doğru 0.01 mg ölçme yeteneğine sahip bir analitik denge kullanarak etiketlenmiş boncuk tüp kitle.
- Larva örnekleri-80 ° C'de depolanmış, örnek tüpler aktarmak için sıvı azot önceden içinde koyun.
- Uzun forseps 1,5 mL örnek tüp sıvı azot kaldırmak için kullanın dewar.
- Giyen nitril eldiven, donmuş kapmak Tüp, ters çevir ve keskin tüp kapağı donmuş Pelet çıkarmak için benchtop karşı pound. Hemen Pelet 2 mL önceden şeytan screwcap boncuk tüp içine dökün. Pelet çıkarmak başarısız olursa, tüp için sıvı azot dönmek ve tekrarlayın.
Not: Tüm microfuge tüpleri larva granül çıkarmak değil. Önerilen bir başka bir tüp kullanarak, analiz için numune toplama önce larva granül yerinden Eğer belirleyin. - Hızlı bir şekilde larva Pelet ve boncuk tüp kombine kitle ölçmek. Hemen örnek tüp sıvı azot yerleştirin. Larva Pelet kitle metabolomic verileri normalleştirmek için kullanılacaktır.
Not: Bu adımda protokol duraklatılmış. Örnekleri-80 ° C'de 3 aya kadar saklanabilir
4. örnek çıkarma
- Yer örnek-20 ° C benchtop soğutucu borular.
- Prechilled (-20 ° C) % 90 metanol her tüpün içine 2 µg/mL d4 süksinik asit içeren 0.8 mL ekleyin. Örnek-20 ° C benchtop soğutucu dönün.
Not: D4 süksinik asit bir iç standart olarak hizmet vermektedir. Sadece HPLC Sınıf H2O ve metanol kullanın. Metanol ve diğer organik solventler uçucu ve doğru hava deplasman pipetler kullanarak ölçmek zor olduğundan, bu adım ve tüm aşağıdaki adımları için pozitif deplasmanlı pipetler kullanmanızı öneririz. - Bir negatif kontrol 0.8 mL prechilled (-20 ° C) % 90 metanol 2 µg/mL d4 süksinik asit içeren bir boş boncuk tüp içine ekleyerek ayarlayın.
- Örnekler: 6.45 m/s 4 ° C sıcaklık kontrol odasında bulunan bir boncuk değirmen homogenizer kullanarak 30 saniye lunaparkçı.
Not: başarısızlık hızla ve tamamen larva Pelet homojenize değişkenlik metabolomics analizde yaygın kaynağıdır. Sadece 30 içinde larva doku dondurulmuş yok edebilecek homogenizers kullanın s. - Homojenize örnekleri tüpler-20 ° C benchtop soğutucu dönün ve onları en az 1 h için-20 ° C dondurucuda kuluçkaya.
- 20.000 × g veya maksimum hızda 4 ° C'de 5 min için tüpler santrifüj kapasitesi elde edilen çökelti kaldırmak için.
- 600 µL süpernatant ile yeni 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Çökelti rahatsız etmeyin. Acele Pelet süpernatant pipetting sırasında yerinden olur varsa, tüm süpernatant tüp dönüp 4,6 arasındaki adımları yineleyin.
- Örnek tüpler bir vakum santrifüje yerleştirin. Tüm tüpler santrifüj sızdırmazlık önce açık olduğundan emin olun. Tüm çözücü kaldırılana kadar örnekleri, oda sıcaklığında kuru (Bu adım genellikle ~ 16 tamamlamak için saat sürer).
Not: gerekirse, bu adımda protokol duraklatılmış. Kurutulmuş örnek-80 ° C'de depolanan
5. kimyasal Derivatization
- Kurutulmuş örnekleri-80 ° C'de depolanmış, açılmamış örnek tüpler bir vakum santrifüje yerleştirin ve 30 dk için kuru. Bu adımı örnek tüp açmadan önce gerçekleştirilmelidir.
Not: Bu adımı dondurucudan çıkardığında microfuge tüp dış toplar yoğunlaşma kaldırır. Protokol bu bölümünü H2için O son derece duyarlıdır ve tüm reaktifler mümkün olduğunca kuru tutmak için ekstra önlem alınmalıdır. -
Susuz pyridine 40 mg/mL methoxylamine hidroklorid (MOX) çözeltisi hazırlamak. Sadece susuz pyridine kullanın. MOX ve pyridine bir desiccator depolamak ve günlük MOX çözüm hazırlamak.
Dikkat: MOX ve pyridine zehirlidir. Bu çözüm duman başlıklı hazırlayın.- 1 mL Cam şırınga Kuru Isı tabancası kullanın.
- Şırınga iğne susuz pyridine şişe içine yerleştirin. 1 mL pyridine kaldırın ve MOX 40 mg içeren bir microfuge tüp ekleyin.
- Argon ile susuz pyridine şişe floş. Şişe mühür ve desiccator için dönmek.
- Pyridine MOX 600 rpm'de 10 dk 35 ° c termal bir mikser tüpte kuluçka tarafından çözülür.
- 40 mg/ml MOX 40 µL susuz pyridine çözümünde kurutulmuş örnek ekleyin.
- 10 s ve kısaca santrifüj için girdap (10.000 x g 20 s).
- 30 ° c termal bir karıştırıcı 600 RPM 1 h için kuluçkaya.
- 20.000 × g veya partikül madde kaldırmak için 5 dakika için en yüksek hızı santrifüj kapasitesi.
- 25 µL süpernatant ile 250 µL devre dışı cam microvolume eklemek ile bir Otomatik Örnekleyici şişe içine aktarın.
- N- metil -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) % 1'i içeren 40 µL eklemek TMCS.
Dikkat: MSTFA zehirlidir. Duman mahallede bu adımı gerçekleştirin.
Not: varsa, bu adımı Gerstel Otomatik Örnekleyici tarafından tamamlanabilir. - Bir kap üzerinde Otomatik Örnekleyici şişe yerleştirin ve crimper aracını kullanarak kapatın.
- Örnek 37 ° C'de (250 devir/dakika) sallayarak ile 1 saat kuluçkaya.
- Bir yağ asidi metil ester standart (ALEVLERİNİ) çözüm daha önce3desceribed hazırlayın. ALEVLERİNİ 3 µL robot otomatik örnekleyici hemen önce enjeksiyon kullanarak Otomatik Örnekleyici şişe ekleyin.
Not: Alevlerini tutma zaman kaydırma kalibre ve cihazlarının performansını kontrol etmek için kullanılır. Hiçbir robot otomatik örnekleyici kullanılabilir durumdaysa, alevlerini adımı sırasında 5,8 eklenebilir.
6. GC-MS algılama
Not: çoğu durumda, Kullanıcı bir kütle spektroskopisi çekirdek tesis yardımı ile bu adımı yürütecek. Bu iletişim kuralı bir 30 m, GC sütun 5 m koruma sütun ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır.
- Örnek sipariş rastgele.
-
GC-MS hazırlayın.
- Küme helyum taşıyıcı gaz akış hızı 1 mL/dak.
- Giriş sıcaklığı 250 ° C'ye ayarla
- Aşağıdaki Sıcaklık gradyanı yürütmek için GC programı:
- İlk sıcaklığı 95 ° c ile 1 dk bir tutun.
- 2 dk bir tutun ile 40 ° C/dk hızında 110 ° c sıcaklık artışı.
- 250 ° C-5 ° C/dak rampa tarafından artırmak.
- 330 ° c 4 dk son bir tutun ile 25 ° C/dk hızında artış.
- Solvent gecikme için 3,5 dk ayarlayın.
Not: Zaman GC-MS sistemine göre değiştirilebilir. Bu adımın amacı Dedektör zarar MSTFA ve MOX önlemektir.
- Derivatized örnek 1 µL GC-MS (10:1 oranı split) enjekte.
Not: örnek 2 µL doruklarına yoğunluğunu çok düşükse enjekte et. Örnekleri enjeksiyon sırasını randomize. - Kütle Spektrometre tam tarama modunda bir kitle 50-500 m aralığında faaliyet/z.
7. veri analizi
- Ya hedefli veya hedeflenmemiş bir yaklaşım kullanarak metabolomic veri analiz. Hedeflenen analiz metabolitleri, biz aşağıda tarif laktat ölçümleri gibi tanımlanmış bir dizi bolluğu ölçme üzerinde odaklanmıştır. Buna ek olarak, hedefsiz analiz iki örnek kümesi arasındaki önemli ölçüde değişti herhangi bir metabolik özelliği tanımlamak için tarafsız bir yaklaşım kullanır.
Not: Bizim laboratuvar öncelikle ücretsiz programlar MetAlign17 ve MetaboAnalyst18,19 veri analizi için kullanır. Hem kalite kontrol, normalleştirme ve veri işleme adımları yeterli bir açıklama bu yazının kapsamı dışındadır olduğundan, Kullanıcı veri işleme20,21' eayrılmış olan daha ayrıntılı iletişim kurallarına bakın, 22. Ayrıca, bu çözümleme için gereken adımları açıklayan bir akış şeması8başka bir yerde bulunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laktat dehidrogenaz dLDH etkinliği4ve genetik olarak uyumlu denetimleri eksikliği (dLDH) mutantlar L2 orta larva toplanmıştır ve yukarıda açıklanan protokolüne göre işlenir. Denetimleri ile karşılaştırıldığında, mutant larva laktat, pyruvate ve L-2-hydroxyglutarate4önemli değişiklikler sergi. Spectra bir AGILENT GC6890-5973i MS sistemi ile elde. GC-MS spectra örneği oluşturmak ile bizim protokol Şekil 1' de gösterilen. Birçok görünür özellikleri ve trehalose, normalde en büyük zirve bir larva örnek gösteren ve genellikle için dikkate değer bir tepe (Şekil 1AB) doygun. Bireysel spektrum negatif kontrol örneği Şekil 1 ciçinde gösterilir. Olmasına rağmen hala birkaç görünür doruklarına negatif kontrol örneğinde, Şekil 1A, Biçinde gösterilen deneysel örnekleri ile karşılaştırıldığında yoğunluğu ve tepeler sayısı azaltılır. Bu tepeler özellikle sütun taşma payı, dahili standart (d4 süksinik asit), alevlerini ve bulaşıcı yağ asitleri kaynaklanır. Başarısız olan numune hazırlama Şekil 1 ciçinde gösterilene benzer bir spektrum oluşturur.
Tüm spectra MetAlign17 kullanarak Önişlenmiş ve veri normalleştirilmiş dahili standart ve Pelet ile kitle. Daha sonra verileri istatistiksel analiz için MetaboAnalyst18,19 sunuldu. İlke bileşen analizi (PCA) açıkça iki grup birbirinden ayırmak ve her iki grup (Şekil 2A) hiçbir aykırı olduğunu gösterir. Daha fazla çözümleme dLDH (Şekil 2B)4kaybı tarafından etkilendiği bilinen metabolitleri önemli değişiklikler gösterir.
Resim 1 : Temsilcisi GC-MS spectra, Drosophila larva özü. (A-B) Tipik spectra vahşi türü (WT) ve dLDH mutantlar (KO) orta-L2 larva özler. (C) bir negatif kontrol (NC) örnek oluşturulan bir temsilcisi GC-MS spektrum. Bu yelpazenin Peaks'e çoğu dahili standart, alevlerini ve yağ asitleri. (D-F) WT örnekleri ile karşılaştırıldığında, KO örnekleri sergi (D) pyruvate düzeyleri yükselmiş ve laktat (E) ve (F) 2-hydroxyglutarate (2-HG) düzeyleri azalmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : İstatistiksel analiz vahşi türü (WT) ve dLDH arasında farklı metabolik profilleri gösterir nakavt (KO) larvaları. (A) PCA puanları arsa. (B) metabolitler dLDH mutantlar önemli değişiklikler gösteren. Tüm veri noktalarını 100 keyfi bir değere ayarlanmış WT denetim ortalaması göre çizilir. Önce analiz, veri d4 süksinik asit iç normalleştirilmiş standart ve larva cips kitle. Ortalama ± bir standart sapma gösterilen veriler. p < tüm metabolitleri bir iki uçlu tkullanımı için 0.01-test. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metabolomics ara metabolizma oluşturmak metabolik reaksiyonları incelemek için eşsiz bir fırsat sağlar. Bu teknoloji, duyarlılığını ancak, genetik arka plan, gelişimsel ipuçları ve çevresel stresleri, sıcaklık, nem, nüfus yoğunluğu ve besin kullanılabilirliği de dahil olmak üzere çeşitli duyarlı verileri işler. Bu nedenle, bir yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir metabolomics analiz gerektirir örnekleri son derece kontrollü koşullar altında toplanması. Burada birkaç değerlendirmeleri bu noktası3,8,23vurgulamak iken, tekrarlanabilirlik önlemek amacıyla tasarlanmış larva toplamak için bir adım-adım yöntemi sağlamak.
Değişkenlik metabolomics analiz en yaygın kaynağı gidermek veya durdurmak, örnek toplandıktan sonra metabolik reaksiyonlar için bir hatadan kaynaklanıyor. Bu bağlamda, sıvı nitrojen içinde dondurma üzerine metabolizma durur ve örnek-20 ° C metanol içinde homojen zaman metabolik enzimler yok olacak. Kullanıcı metanol ayıklama önce dondurulmuş bir örnek tutmak için özel önem veriyor varsayılarak, bizim iletişim kuralı bu yordam tarafından oluşturulan metabolomics veri larva metabolizma doğru bir kesitini temsil sağlamak için tasarlanmıştır. Kullanıcı veri değişkenlik kabul edilemez düzeyde deneyim, Kullanıcı toplama ve metaboliti ayıklama Protokolü önem verilerek (1) bu metabolizma hızla çeliklerini (adım 2,9 – 4.2) ve (2) bu olmasını sağlamaya reexamine örnek verimli % 90 metanol (adım 4.4) homojenize. Bu bağlamda, birçok boncuk fabrikaları örnekleri belirtilen süre içinde homojenize için yeterli güç sağlar ve önceki çalışmalar8' kullanılan bir enstrüman kullanmak için Kullanıcı teşvik ediyoruz.
Bizim iletişim kuralı da acemi Kullanıcı örnekleri tekrarlanarak derivatize için notu gerekir anahtar adımlar vurgular. Birçok metabolitleri volatilite veya zavallı termal kararlılık sınırlı nedeniyle bu GC-MS için önemlidir. Derivatization volatilite ve birçok metabolitleri, böylece tekrarlanarak ölçülebilir bileşikler sayısını artırarak termal kararlılığını artırır. Sonuç olarak, eksik derivatization uğramıştır örnekleri tekrarlanabilir pik alanları, yükseklikleri ve şekiller sergileyecektir. Biz burada vurgulamak gibi bir ortak başarısız derivatization örnek maruz kimyasal derivatization verimliliği azaltır su kaynağıdır. Bu nedenle, MSTFA, MOX ve pyridine, dahil olmak üzere tüm reaktifler nem-Alerjik koşullar altında tutulmalıdır. Kuru şartlarda korumanıza gerek de 30 dk için vakum santrifüj yoğunlaşma örnek girmek değil emin olmak için açmadan önce yerleştirilmelidir-80 ° c saklanır örnekleri hazırlamaya uzatır. Biz de GC-MS hassas bir teknolojidir ve sonuç olarak, daha büyük örnekleri mutlaka daha iyi veri oluşturmaz vurgulamak istiyorum. Bizim iletişim kuralı deneysel olarak sınanmış örneklerin boyutu sağlar ve tekrarlanarak merkezi karbon metabolizması çoğu metabolitleri ölçecektir. Bu metabolitler ve bazıları çok bol ve artan örnek boyutu doygunluk spektrum içinde sinyal için yol açacaktır. Aslında, sinyal için GC-MS enjeksiyon için doğru bir şekilde kullanılması gerekir için trehalose zaten bizim analiz ve 100: 1 bölünmüş oranında doymuş ölçmek Bu bileşik. Son olarak, Kullanıcı bir kutup ayıklama çözüm kullanın çünkü bizim protokol lipid çıkarma için uygun olmadığını dikkat etmelisiniz. Bizim iletişim kuralı da bazı yağ asidi sinyaller negatif kontrol örnek (Şekil 1B) görünür neden olan plastik tüpler ve ipuçları, mevcut olabilir yağ asitleri kirleticiler için hesaba katmaz.
Son olarak, burada ayrıntılı yöntemleri Drosophila metabolizma eğitimi için güçlü bir araç sağlar. Bu iletişim kuralı, ancak, Drosophila için spesifik değildir ve herhangi bir küçük omurgasız metabolik çalışmaları yürütmek için birkaç değişiklik ile kullanılabilir. Türü ne olursa olsun, bu basit yöntemi neredeyse tüm amino asitler, ara ürün glikoliz ve TCA döngüsü yanı sıra çok sayıda diğer küçük polar moleküller göreli miktar olanak sağlar. Drosophila topluluk için kullanılabilir benzersiz genetik araçları ile birlikte, bu tür metabolomic analiz anında metabolik araştırma ön planda yakın gelecekte yerleştirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Indiana Üniversitesi kütle spektroskopisi tesis ve Utah Üniversitesi Metabolomics çekirdek tesis bu iletişim kuralı en iyi duruma getirme konusunda yardım için teşekkür ederiz. J.M.T. tarafından ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R35GM119557 altında desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
References
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
- Sieber, M. H., Spradling, A. C. The role of metabolic states in development and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Li, H., et al. Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).
- Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth. Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).
- Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).
- Fiehn, O. Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
- Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. Metabolomic Studies in Drosophila. Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).
- Lenz, E. M., Wilson, I. D. Analytical strategies in metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).
- Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).
- Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).
- Garcia, A., Barbas, C. Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. Metz, T. O. , Humana Press Inc. Totowa, Nj. 191-204 (2011).
- Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 171-178 (1989).
- Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis. Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).
- Lommen, A. MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).
- Lommen, A. Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign. Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Wishart, D. S. Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst. Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).
