Summary
Denne protokollen beskriver hvordan å forberede Drosophila Larvene GC-baserte metabolomic analyse.
Abstract
Nylige fremskritt innen metabolomics har etablert frukt fly Drosophila melanogaster som en kraftig genetisk modell for å studere dyr metabolisme. Ved å kombinere stort utvalg av Drosophila genetisk verktøy muligheten til å kartlegge store swaths av mellomledd metabolisme, kan en metabolomics tilnærming åpenbare komplekse interaksjoner mellom kosthold, genotype, livshistorie hendelser og miljømessige signaler. I tillegg kan metabolomics studier oppdage romanen enzymatisk mekanismer og avdekke tidligere ukjente forbindelser mellom tilsynelatende ulike metabolske veier. For å lette mer utbredt bruk av denne teknologien blant Drosophila samfunnet, her vi gir en detaljert protokoll som beskriver hvordan å forberede Drosophila larver prøver gass kromatografi-massespektrometri (GC-MS)- basert metabolomic analyse. Våre protokollen inneholder beskrivelser av larver prøvetaking, metabolitten utvinning, kjemiske derivatization og GC-MS analyse. Vellykket gjennomføring av denne protokollen tillater brukere å måle den relative overfloden av små polar metabolitter, inkludert aminosyrer, sukker og organiske syrer involvert i Glykolysen og TCA sykluser.
Introduction
Frukt fly Drosophila melanogaster har dukket opp som et ideelt system for å studere molekylære mekanismen som regulerer mellomledd metabolisme. Ikke bare er de fleste metabolske veier konservert mellom Drosophila og mennesker, men viktig næringsstoff sensorer og vekst regulatorer, som insulin, Tor og myc, er også aktive i fly1,2. Resultatet kan Drosophila brukes å utforske metabolske grunnlaget for menneskelige sykdommer spenner fra diabetes og fedme neurodegeneration og kreft. I denne forbindelse gir Drosophila larver utvikling den ideelle rammen i å studere et metabolske program kalt aerobe Glykolysen eller Warburg effekten. Like mange svulster bruker aerobic Glykolysen for å generere biomasse fra karbohydrater, så aktivere gjør Drosophila Larvene aerobic Glykolysen å fremme utviklingsmessige vekst3,4,5. Disse likhetene mellom larver og svulst metabolisme etablere Drosophila som en viktig modell for å forstå hvordan aerobic Glykolysen er regulert i vivo.
Til tross for det faktum at fly har dukket opp som en populær modell for å studere metabolisme, avhengige de fleste Drosophila studier av metodene som er utviklet for å måle personlige metabolitter3, som trehalose, triglyserider eller ATP. Siden en bestemt protokoll er nødvendig å måle hver metabolitten, er analysen-baserte studier arbeidskrevende, dyrt og partisk mot de forbindelsene som kan måles med kommersielle kits. En løsning på disse begrensningene har dukket opp fra feltet i metabolomics, som gir en mer effektiv og saklig måte å studere Drosophila metabolisme. I motsetning til en analysen-basert studie, kan en enkelt metabolomic analyse samtidig måle hundrevis av små molekyl metabolitter og gir en omfattende forståelse av en organismes metabolske status6,7. Denne teknikken har betydelig utvidet omfanget av Drosophila metabolske studier og representerer fremtiden for denne nye feltet8.
Metabolomic studier er hovedsakelig utført med tre teknologier: (i) kjernefysiske magnetisk resonans (NRM), (ii) flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS) og (iii) gass kromatografi-massespektrometri (GC-MS)9. Hver tilnærming tilbyr forskjellige fordeler og ulemper, og alle disse teknologiene har blitt brukt til å kunne studere Drosophila metabolisme. Siden forskning utført i vår lab er fokusert på små, polar metabolitter, bruker vi primært en GC-MS-basert metode. GC-MS gir brukeren en rekke fordeler, inkludert høy reproduserbarhet, høyeste oppløsning, følsomhet og tilgjengeligheten av et standard elektron innvirkning (EI) spectral bibliotek, som gir mulighet for rask identifisering av oppdaget metabolske funksjoner10,11. Utarbeidelse av prøver for GC-MS, men er noe komplisert og krever en spesiell oppmerksomhet for detaljer. Prøver må være samlet, vasket, veide og frosset på en måte som raskt slukker metabolske reaksjoner. Videre fly carcass er motstandsdyktig mot standard homogenisering protokoller og krever en perle mill å sikre optimal metabolitten utvinning. Endelig, prøver analysert av GC-MS må gjennomgå kjemiske derivatization før oppdagelsen12. Mens tidligere publiserte metodene beskriver alle disse trinnene3,13,14, er en visuell protokoll som ville tillate nybegynneren reproduserbar generere høy kvalitetsdata fortsatt behov. Her viser vi hvordan å forberede Drosophila larver prøver for GC-baserte metabolomics analyse. Denne protokollen lar brukeren reproduserbar måle mange av små polar metabolitter som utgjør sentrale karbon metabolisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. høsting
- Samle voksne menn og virgin kvinner av de ønskede genotyper. Individuelt alder disse dyrene i mat ampuller med standard Bloomington medier for 3-5 dager.
- Angi den aktuelle parring ved å overføre 50 jomfru kvinner og 25 menn til en ny mat medisinglass.
Merk: Minimum seks uavhengige parring bør settes opp for hver genotype. Bare ett eksempel hentes fra hver mating (dvs. seks prøver innhentet fra seks uavhengige parring). -
Forberede melasse egg-legging caps.
- Bland 115 mL av sirup og 29 g av agar med 700 mL H2O i en 2 L kolbe.
- Kok molasses agar blandingen på en kokeplate.
- Cool til 70 ° C.
- Legge til 25 mL av syre (20 mL av 85% fosforsyre og 209 mL propionsyre syre i 1 L H2O; Butikken i en brun flaske) og 10 mL 10% p-hydroxy-benzoic acid metyl ester i 95% etanol.
- Hell melasse agar i både lokket og nederste del av en 35 x 10 mm2 vev kultur parabol.
Merk: Før pouring melasse agar plater, være sikker på at lokk og/eller base av 35 x 10 mm2 plate passer snuggly i munnen på en Drosophila lager flaske (beskrevet i trinn 1.6). Avhengig av platene brukes, kan basen ikke brukes.
- Gjøre fersk gjær lime ved å legge til destillert vann til aktiv tørr gjær (5 g gjær/7 mL vann) til blandingen blir et lim som kan spres lett på en solid overflate (dvs., konsistensen av peanøttsmør).
- Spre ca 1,5 g gjær lim på overflaten av en sirup egg-legging cap.
- POKE fire lufthull inn i motsatte sider av en plast 6 oz. Drosophila lager flaske bruker en 22 G nål.
- Overføre nylig parret fluene fra mat ampullen i kultur flasker.
Merk: Fluer kan overføres ved hjelp av CO2 som en midlertidig bedøvelse eller ved å holde toppen av ampullen i munnen på flasken og kraftig trykke bunnen av flasken mot en Borstemmaskin. - Raskt plassere en sirup egg-legging lue med gjær lim på i munnen på en Drosophila lager flaske. Bruk laboratorium tape for å sikre egg-legging lokket på plass.
Merk: Hvis fluer bedøvet før overføring, flasken plasseres horisontalt på Borstemmaskin til alle fluer har gjenopprettet. Når fluene er helt mobile, plassere flasken i en inkubator med melasse egg-legging cap på bunnen av kulturen. - Erstatte melasse egg-legging hetten minst en gang om dagen for de to første dagene av vaskeløsningen lager, tappe bunnen av flasken mot Borstemmaskin, fjerne gamle egg hetten og umiddelbart å plassere en ny egg cap i munnen på flasken. Kast gamle egg-legging cap.
Merk: Dette trinnet sikrer at kvinner ikke holder eggene og tillater samling av synkronisert populasjoner. - Plassere en ny egg-legging cap i lager flasken etter dag 3, Erstatt etter 2 h, og kast. Fjerne og erstatte andre egg-legging cap etter fire timer. Etiketten bunnen av denne egg-legging lue med dato, tid og genotype.
Merk: Eggene samlet under 4 h vinduet brukes for analyse. Dette synkronisering er kritisk for analyse av bestemte utviklingsstadier. Egg kan samles på denne måten i flere dager. - Sett inn egg-legging caps i en 60 x 15 mm2 Petri plate og sted i en inkubator på ønsket temperatur og luftfuktighet.
- Inspisere egg-legging caps hver dag for problemer med sult, befolkningstetthet eller forurensning.
Merk: Larvene må ha tilgang til nok mat å sikre kontinuerlig utvikling. Om nødvendig kan fersk gjær lim spres på egg-legging bokstaver som skal brukes i eksperimentet . I tillegg hvis larver befolkningstettheten er for høy, begynner Larvene å vandre ut av kultur plate. Disse prøvene bør ikke brukes for metabolomic analyse fordi høy befolkningstetthet og mellomliggende utbrudd av sult opplevde mens vil resultere i inkonsekvente data. En tetthet på ~ 80-100 midt andre skikkelsen Larvene (L2) per plate eller 40-50 midten tredje skikkelsen Larvene (L3) per plate er anbefalt. Prøver som er synlig forurenset med bakterier eller sopp bør forkastes.
2. larver prøvetaking
- Alder Larvene til ønsket scenen. Hvis samle L3 larver, synkronisere eksempler på L2-L3 molt. Synkroniseringen er vanligvis oppnås med en tidligere beskrevet metode som bruker de fremre voksne som en utviklingsforstyrrelse milepæl15. Alternativt kan midt-L3 Larvene synkroniseres med en sgs3 reporter gen16.
Merk: I denne forbindelse, vi finne midt-L2 Larvene (~ 60 h etter egglegging) er ideell for de fleste analyser fordi larver utvikling er fortsatt relativt synkron på dette stadiet, nøye innsamlede eksemplene har tilstrekkelig mat å utvikle til denne timepoint, og antall dyr per prøve er håndterbart (se nedenfor). En ekstra Synkroniseringsserveren skritt er nødvendig for L3 Larvene fordi på mange isoinokosterone pulser som oppstår under L3 utvikling har dramatiske effekter på metabolismen og genererer gjenstander usynkroniserte bestander. - Bruk en dissecting nål for å løft gjær lim av agar. Plass gjær til en ny melasse agar cap.
Merk: De fleste Larvene spiser på grensesnittet mellom melasse agar og gjær lim. - Bruk en liten pensel til å samle larver fra nylig utsatte overflaten av molasses agar. Plass Larvene i en 1,5 mL sentrifuge rør på is.
Merk: Egnede utvalgsstørrelser for hver utviklingsstadiet er som følger: 50 første skikkelsen Larvene (L1); 25 midt-L2 Larvene; 20 tidlig L3 Larvene; 15 midt-L3 eller sent L3 larver. - Vask og fryse prøver (trinn 2.3 gjennom 2.8) i små grupper (fire til seks eksempler) mens samle store Prøvesett. Prøver må bli frosset innen 20 min til å plassere larver i rør.
Merk: Vi anbefaler at du bruker Eppendorf 1.5 mL Flex rør fordi andre rør kan forstyrre eksempel overføring i trinn 3. Prøver må samles i microfuge rør. Samler ikke prøver perle rør beskrevet i trinn 3.1. Keramiske perler beholde vaskeløsning NaCl, som resulterer i feil masse målinger og introduserer forurensninger i utvalget. - Legge 1 mL av iskalde 0,9% NaCl inn i røret, lukker lokket og vertikalt flip røret for å grundig vaske larvene.
- Sett røret tilbake på is ~ 30 s. Under denne gangen Larvene vil synke å bunnen av røret, men gjær vil forbli i suspensjon. Når alle Larvene har dannet en løs pellet, fjerne NaCl løsning ved hjelp av en 1 mL pipette.
- Gjenta trinn 2.4 og 2.5 to ganger, eller til den endelige vaskeløsningen er Fjern.
Merk: Ekstra vask skritt må være nødvendig hvis samlet utvalget inneholder en overdreven mengde gjær. - Sentrifuge prøvene 2000 × g for 1 min på 4 ° C.
- Fjerne alle rester løsning med en 200 µL pipette.
- Umiddelbart fryse prøven i flytende nitrogen.
Merk: Protokollen kan pauses på dette trinnet. Eksempler kan lagres i opptil 3 måneder på-80 ° C.
3. overføring av prøver å perle rør
- Hver larver prøve må overføres fra 1,5 mL microfuge røret til en 2 mL screwcap rør som inneholder 1,4 mm keramisk perler. I forberedelsene til denne overføringen trinn, kan du bruke en etanol-bevis markøren for å merke siden av en 2 mL screwcap perle tube (merking på lokket skal ødelegges under trinn 4.4).
- Tara masse merket perle røret med en analytical balanse stand til å måle nøyaktig 0,01 mg.
- Hvis larver prøver ble lagret ved-80 ° C, sett eksempel rør i flytende nitrogen, før overføring.
- Bruke lang pinsett fjerne 1,5 mL eksempel røret fra flytende nitrogen dewar.
- Iført nitrilhansker, grip den frosne rør Inverter og kraftig pund tube lokket mot Borstemmaskin å dislodge frosset pellets. Umiddelbart hell pellet i en pre tared 2 mL screwcap perle rør. Hvis pellet mislykkes å dislodge, returnere røret til flytende nitrogen og gjenta.
Merk: Larver pellets vil ikke fjerne fra alle microfuge rør. Hvis bruker et rør enn den anbefalte, bestemme hvis larver pellets kan forskyves før samle eksempler for analyse. - Raskt måle kombinert masse larver pellets og perle røret. Umiddelbart plassere eksempel røret i flytende nitrogen. Larver pellet masse brukes til å normalisere metabolomic dataene.
Merk: Protokollen kan pauses på dette trinnet. Eksempler kan lagres i opptil 3 måneder på-80 ° C.
4. eksempel utvinning
- Plass prøven rør i en 20 ° C Borstemmaskin kjøligere.
- Legge til 0,8 mL av prechilled (20 ° C) 90% metanol inneholder 2 µg/mL succinic-d4 acid i hver retning. Tilbake prøven til 20 ° C Borstemmaskin kjøligere.
Merk: Succinic-d4 syre fungerer som en intern standard. Bare bruke HPLC klasse H2O og metanol. Siden metanol og andre organiske løsemidler er flyktig og vanskelig å måle bruker luft forskyvning Pipetter, anbefales det at du bruker positive displacement Pipetter for dette trinnet og alle følgende. - Angi en negativ kontroll ved å legge til 0,8 mL av prechilled (20 ° C) 90% metanol inneholder 2 µg/mL succinic-d4 acid i en tom perle rør.
- Homogenize prøver 30 sekund på 6.45 m/s bruker en perle mill homogenizer ligger i et kontrollrom for 4 ° C temperatur.
Merk: Fullstendig homogenize larver pellets er en vanlig kilde til variasjoner i metabolomics analyse. Bruk bare homogenizers som kan ødelegge frossen larver vev innen 30 s. - Hjem homogenisert prøver rør til 20 ° C Borstemmaskin kjøligere ruge dem i 20 ° C fryser minst 1t.
- Sentrifuge rørene på 20.000 × g eller maksimum hastighet for 5 min på 4 ° C for å fjerne den resulterende utløse.
- Overføre 600 µL nedbryting av til en ny 1,5 mL microcentrifuge tube. Ikke forstyrr utløse. Hvis det bunnfall pellet blir forskyves mens pipettering nedbryting returnere alle nedbryting til røret og gjenta trinn 4.6.
- Plass prøven rør i et vakuum sentrifuge. Sørg for at alle rør er åpne før forsegle en sentrifuge. Tørr prøvene ved romtemperatur før alle løsemiddel fjernes (dette trinnet vanligvis tar ~ 16 h å fullføre).
Merk: Eventuelt protokollen kan pauses på dette trinnet. Tørket prøve kan lagres på-80 ° C.
5. kjemisk Derivatization
- Hvis tørket prøvene var lagret på-80 ° C, plassere uåpnet eksempel rør i et vakuum sentrifuge og tørr i 30 min. Dette trinnet må utføres før du åpner eksempel røret.
Merk: Dette trinnet fjerner kondens som samler seg på utsiden av microfuge røret når fjernet fra fryseren. Denne delen av protokollen er svært følsom for H2O og ekstra forholdsregler må tas å holde reagenser så tørr som mulig. -
Forberede en løsning av 40 mg/mL methoxylamine hydroklorid (MOX) i vannfri pyridine. Bare bruke vannfri pyridine. Lagre MOX og pyridine i en desiccator og forberede MOX løsningen daglig.
FORSIKTIG: MOX og pyridine er giftige. Klargjør denne løsningen i avtrekksvifte.- Bruk varmepistol tørke en 1 mL glass sprøyte.
- Sett inn nålen på sprøyten i flaske vannfri pyridine. Fjerne 1 mL av pyridine og legge til et microfuge rør som inneholder 40 mg MOX.
- Tømme flaske vannfri pyridine med argon. Forsegle flasken og tilbake til desiccator.
- Oppløse MOX i pyridine av rugende røret i en termisk mikser på 35 ° C i 10 min 600 RPM.
- Legge til 40 µL av 40 mg/mL MOX i vannfri pyridine løsning tørket prøven.
- Vortex for 10 s og kort sentrifuger (10 000 x g for 20 s).
- Ruge på 30 ° C i 1 time på 600 rpm i en termisk blandebatteri.
- Sentrifuge på 20.000 × g eller maksimumshastighet for 5 min å fjerne partikler saken.
- Overføre 25 µL av nedbryting til en autosampler hetteglass med en 250 µL deaktivert glass microvolume inn.
- Legge til 40 µL av N- metyl -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) som inneholder 1% TMCS.
FORSIKTIG: MSTFA er giftige. Utføre dette trinnet i avtrekksvifte.
Merk: Hvis dette trinnet kan utføres av en Gerstel autosampler. - Sett en cap på autosampler ampullen og forsegle benytter en crimper verktøyet.
- Inkuber prøven på 37 ° C i 1 time med skjelvende (250 rpm).
- Forberede en fettsyre metyl ester standard (FAMES) løsning som tidligere desceribed3. Legge til 3 µL av FAMES autosampler ampullen bruker en robot autosampler umiddelbart før injeksjon.
Merk: FAMEs brukes til å kalibrere tidsforskyvningen oppbevaring og sjekke instrumentytelsen. Hvis ingen robot autosampler er tilgjengelig, kan FAMEs legges under trinn 5,8.
6. GC-MS gjenkjenning
Merk: I de fleste tilfeller vil brukeren utføre dette trinnet med hjelp av en masse spectroscopy kjernen anlegget. Denne protokollen er utformet for å brukes med en 30 m, GC kolonne 5 m vakt kolonnen.
- Tilfeldig eksempel rekkefølgen.
-
Forberede GC-MS.
- Sett infusjonshastigheten spiralen carrier gass til 1 mL/min.
- Angi temperaturen til 250 ° C.
- Programmere GC utføre følgende temperaturgradient:
- Første temperatur 95 ° c med tak i 1 minutt.
- Øke temperaturen til 110 ° C frekvensen av 40 ° C/min med tak i 2 min.
- Øke til 250 ° C ved 5° C/min rampen.
- Øke 330 ° c frekvensen av 25 ° C/min med siste tak i 4 min.
- Angi løsemiddel forsinkelse 3,5 min.
Merk: Tiden kan endres i henhold til GC-MS systemet. Formålet med dette trinnet er å hindre MSTFA og MOX skade detektoren.
- Injisere 1 µL av derivatized prøven i GC-MS (dele forholdet 10:1).
Merk: Injisere 2 µL av prøve hvis intensiteten av toppene er for lav. Injeksjon rekkefølgen av prøver bør være randomisert. - Virker det masse spectrometer i sin helhet avsøke modus over en masse rekkevidde på 50-500 m/z.
7. dataanalyse
- Analysere metabolomic data ved hjelp av enten en målrettet eller uønskede tilnærming. Målrettet analyse fokuserer på måling av et definert sett med metabolitter, som laktat måling som vi beskriver nedenfor. Derimot bruker uønskede analyse upartiske tilnærming til å identifisere alle metabolske funksjoner som er betydelig endret mellom to Prøvesett.
Merk: Vår lab primært bruker gratis programmer MetAlign17 og MetaboAnalyst18,19 for dataanalyse. Siden en tilstrekkelig beskrivelse av både kvalitetskontroll, normalisering og databehandling trinnene er utenfor omfanget av dette manuskriptet, se vi brukeren mer detaljert protokoller som er viet til databehandling20,21, 22. I tillegg kan et flytdiagram beskriver trinnene som kreves for denne analysen finnes andre steder8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laktat dehydrogenase (dLDH) mutanter, som mangler dLDH aktivitet4og genetisk-matchet kontroller ble samlet Larvene midt-L2 og bearbeidet etter protokoll beskrevet ovenfor. Sammenlignet med kontrollene, utstilling mutant Larvene betydelige endringer i laktat, pyruvate og L-2-hydroxyglutarate4. Spectra anskaffet med Agilent GC6890-5973i MS system. Et eksempel på GC-MS spectra generere med våre protokollen er vist i figur 1. Det er mange synlige funksjoner en bemerkelsesverdig peak for trehalose, som normalt representerer den største fjelltoppen i en larver prøve og vanligvis overeksponert (figur 1AB). Individuelle spekteret av negativ kontroll prøven er vist i figur 1 c. Men det er fortsatt mange synlige topper i negativ kontroll prøven, redusert intensiteten og antall topper sammenlignet med de eksperimentelle prøvene som vist i figur 1A, B. Disse toppene skyldes primært kolonnen blø, interne standard (succinic-d4 acid), FAMEs og forurensende fettsyrer. Mislykkede eksempel forberedelse genererer et spekter som ligner den som vises i figur 1 c.
Alle spektra var forbehandles med MetAlign17 og data var normalisert med interne standard og pellets masse. Deretter ble dataene sendt til MetaboAnalyst18,19 for statistisk analyse. Prinsippet komponent analyse (PCA) viser tydelig at de to gruppene atskilt fra hverandre, og at det er ingen avvikende i hver gruppe (figur 2A). Videre analyse viser betydelige endringer i metabolitter kjent for tap av dLDH (figur 2B)4.
Figur 1 : Representant GC-MS spektra av Drosophila larver ekstrakt. (AB) Typisk spektra av midt-L2 larver utdrag fra vill-type (WT) og dLDH mutanter (KO). (C) en representant GC-MS spektrum generert fra en negativ kontroll (NC) prøve. De fleste av toppene i dette spekteret er fra interne standard, FAMEs og fettsyrer. (D-F) Sammenliknet med WT prøver, KO prøver utstillingen forhøyede nivåer av (D) pyruvate og redusert (E) laktat og (F) 2-hydroxyglutarate (2-HG). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Statistisk analyse viser forskjellige metabolske profiler mellom wild type (WT) og dLDH knockout (KO) larver. (A) PCA score tomten. (B) metabolitter som viser betydelige endringer i dLDH mutanter. Alle datapunktene tegnet inn i forhold til gjennomsnittet av WT kontrollen, som ble justert til en vilkårlig verdi på 100. Før analyse, dataene var normalisert til succinic-d4 syre interne standard og larver pellets masse. Dataene som gjennomsnittlig ± ett standardavvik. p < 0.01 for alle metabolitter bruker en tosidig t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metabolomics gir en enestående mulighet å kartlegge metabolske reaksjoner som utgjør mellomledd metabolisme. Følsomheten av denne teknologien, men gjengir data utsatt for genetisk bakgrunn, utviklingsmessige signaler og en rekke miljømessige påkjenninger, inkludert temperatur, fuktighet, befolkningstetthet og næringsstoffer tilgjengelighet. Derfor en høy kvalitet og reproduserbar metabolomics analyse krever at prøver samles under kontrollerte forhold. Mens flere anmeldelser understreke dette poenget3,8,23, gir her vi trinnvise metode for innsamling larver som er utformet for å sikre reproduserbarhet.
Den vanligste kilden spredningsgraden i en metabolomics analyse stammer fra slukke, eller stoppe, metabolske reaksjoner når prøven er samlet inn. I denne forbindelse, metabolisme vil stoppe ved frysing i flytende nitrogen og metabolsk enzym skal ødelegges når prøven er homogenisert i 20 ° C metanol. Forutsatt at du betaler spesiell oppmerksomhet til holder et utvalg frosset før metanol ekstraksjon, er våre protokollen utformet slik at de metabolomics dataene som genereres ved denne prosedyren representerer et nøyaktig bilde av larver metabolisme. Skal brukeren opplever uakseptable nivåer av data variasjon, brukeren bør reexamine innsamling og metabolitten utvinning protokollen med spesiell oppmerksomhet til (1) at stoffskiftet er raskt Let (trinn 2.9-4.2) og (2) at den prøven er effektivt homogenisert i 90% metanol (trinn 4.4). I denne forbindelse, mange perle mills sørge for tilstrekkelig styrke til homogenize prøver innenfor og vi oppfordrer brukeren til å bruke et instrument som er brukt i tidligere studier8.
Våre protokollen også fremhever nøkkeltrinn som nybegynneren må oppmerksom for å reproduserbar derivatize prøver. Dette er avgjørende for GC-MS fordi mange metabolitter begrenset volatilitet eller dårlig temperaturstabilitet. Derivatization øker både volatilitet og termisk stabilitet av mange metabolitter, og dermed øke antall forbindelser som kan måles reproduserbar. Resultatet vil prøver som har gjennomgått ufullstendig derivatization vise ikke-reproduserbar peak områder, høyder og figurer. Som vi fremheve her, er en vanlig kilde av mislykkede derivatization eksponering for eksempel vann, som reduserer kjemiske derivatization effektivitet. Derfor holdes reagenser, inkludert MSTFA, MOX og pyridine, under fuktighet uten betingelser. Behovet for å opprettholde tørre forhold strekker seg også å forberede prøver som lagres på-80 ° C, som bør plasseres i et vakuum sentrifuger i 30 min før åpning for å sikre at kondens ikke inn prøven. Vi vil også gjerne understreke at GC-MS er en teknologien, og som et resultat, større prøver vil ikke nødvendigvis generere bedre data. Våre gir eksperimentelt testet utvalgene og måler reproduserbar de fleste metabolitter i sentrale karbon metabolisme. Noen av disse metabolitter er veldig rikt og økt utvalgsstørrelsen vil føre til å signalisere metning i spekteret. Faktisk signalet for trehalose allerede er mettet i vår analyse og en del av 100: 1 GC-MS injeksjon må benyttes til å nøyaktig måle dette sammensatte. Endelig bør brukeren oppmerksom på at fordi vi bruker en polar utvinning løsning, våre protokollen ikke er riktig for lipid utvinning. Våre protokollen også høyde ikke for fettsyrer forurensninger som kan være til stede på plast rør og tips, derfor noen fettsyrer signaler vises i negativ kontroll prøven (figur 1B).
Til slutt metodene finnesher gir et kraftig verktøy for å studere Drosophila metabolisme. Denne protokollen, men er ikke spesifikke for Drosophila og kan brukes med noen endringer for å gjennomføre metabolske studier i noen små virvelløse dyr. Uavhengig av arter gir denne enkle metoden relative kvantifisering av nesten alle aminosyrer, mellomprodukter i Glykolysen og TCA syklusen, samt en rekke andre små polare molekyler. Kombinert med enestående genetisk verktøy tilgjengelig for Drosophila samfunnet, plasserer denne typen metabolomic analyse fly i forkant av metabolske forskning i overskuelig fremtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Takk til medlemmer av Indiana University masse Spectroscopy anlegget og University of Utah Metabolomics Core anlegg for hjelp til å optimalisere denne protokollen. J.M.T. støttes av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under prisen nummer R35GM119557.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
References
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
- Sieber, M. H., Spradling, A. C. The role of metabolic states in development and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Li, H., et al. Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).
- Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth. Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).
- Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).
- Fiehn, O. Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
- Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. Metabolomic Studies in Drosophila. Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).
- Lenz, E. M., Wilson, I. D. Analytical strategies in metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).
- Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).
- Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).
- Garcia, A., Barbas, C. Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. Metz, T. O. , Humana Press Inc. Totowa, Nj. 191-204 (2011).
- Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 171-178 (1989).
- Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis. Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).
- Lommen, A. MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).
- Lommen, A. Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign. Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Wishart, D. S. Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst. Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).
