Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att injicera autologt muskel-derived stamceller i närheten till de återkommande laryngeala nerv med hjälp av en elektrisk nervstimulator. Denna nya teknik kan bli användbar för behandling av hästdjur återkommande larynx neuropati.
Abstract
Återkommande larynx neuropati (RLN) vanligen drabbar hästar och kännetecknas av onormal andning ljud och motion intolerans. De återkommande laryngeala nerv visar lesioner av demyelinisering. Fördelen gäller stamceller för demyeliniserade nerver har påvisats i olika djurmodeller. Syftet med studien var att testa genomförbarheten och säkerheten för en peri-neuronala injektion av autologa muskel-derived mesenkymala stamceller till vänster återkommande larynx nerv hos friska hästar med hjälp av en elektrisk nervstimulator.
Muskel-derived stjälkar cell erhålls från fem friska Standardbred hästar genom provtagning 20 mg av muskelvävnad med en halvautomatisk 14 G biopsi nål från triceps muskeln. Rörelser i struphuvudet är övervakade via övre-luftvägarna video endoskopi. Den vänstra återkommande larynx nerven är närmade sig med en isolerad nervblockad nål. Nervstimulering används, börjar vid 2 mA och framgångsrika bortförandet av den vänstra arytenoid övervakas. Stimulering intensiteten minskas successivt. När en förlust av motoriska svaret observeras på 0,5 mA, 107 autolog muskel-derived stam celler injiceras. Två granskare, som är förblindade till den tidpunkten, Poäng larynx funktionen av hästarna före behandlingen och på dag 1, dag 7 och dag 28 efter injektion av cellerna. I en sjätte häst injiceras 1 mL 2% lidokain för att ytterligare bekräfta den korrekta positioneringen av nålen. Detta leder till en tillfällig förlamning i vänster arytenoid brosk.
Denna studie visar att de återkommande laryngeala nerv kan angripas med hjälp av en elektrisk nervstimulator och att elektrisk stimulering av nerven är väl tolereras av hästarna. Ingen ändring av larynx funktionen hos någon av hästarna efter injektion av stamcellerna. Ytterligare studier bör genomföras för att beskriva effekterna av en peri-neuronala injektion av autologa muskel-derived mesenkymala stamceller till hästar som lider av RLN.
Introduction
RLN är en gemensam patologi av övre luftvägarna hos hästar kännetecknas av varierande grad av arytenoid förlamning. Vänster sida av struphuvudet påverkas oftast. Förekomsten av sjukdomen kan nå upp till 35% i vissa häst populationer. Även om flera hypoteser försökte förklara etiologin och patogenesen vid denna sjukdom, fortfarande den exakta orsaken till RLN osäker. Patologin beskrivs som en distala axonopathy av återkommande larynx nerv med lesioner av demyelinisering men även viss grad av remyelination. Denna axonopathy leder till denervering av inneboende laryngeala muskler och samtidig atrofi1,2. Denna patologi är ofta långsamt progredierande och kan leda till en total förlust av arytenoid bortförandet av den drabbade sida3.
Drabbade hästar avger onormala respiratoriska ljud under träning, och ibland Visa motion intolerans i svårare fall. Den definitiva diagnosen görs av den endoskopisk undersökningen på en icke-drogad stående häst där en partiell eller total förlust av larynx bortförande observeras1,2,4. För närvarande är den vanligaste behandlingen laryngoplasty (även känd som ”återkoppling”), som ibland förknippas med en ventriculo-cordectomy. Även om den övergripande framgången av dessa operationer anses lika bra till utmärkt5, är postoperativa komplikationer mycket vanliga. Den vanligaste komplikationen är en gradvis förlust av bortförandet. Barnett et al. 6 rapporterade en förlust av minst en grad av bortförande inom de första sex veckorna efter operationen i minst 76% av hästar. Andra komplikationer, såsom protes misslyckande, hosta och luftvägar kontaminering, finns också rapporterade5.
Mesenkymala stamceller (MSC) har varit en del av häst medicin i forskning och praktik för mer än ett decennium, även om visat studier på deras effektivitet är fortfarande knappa. De två mest exploaterade källorna till mesenkymala stamceller hos hästar är benmärgen och fettvävnad7. Både urvalsmetoder är relativt invasiva och leder inte alltid till ett tillräckligt antal celler. Nyligen, Ceusters et al. 7 beskrivs kulturen av stamceller som härrör från tvärstrimmig muskelvävnad, vilket erhålls genom en mindre invasiv microbiopsy teknik.
MSCs klarar av självförnyelse, egen produktion, multipotency och differentiering7,8. Deras förmåga att differentieras till alla mesoderm härstamningar av fett, ben, muskler och brosk är nu väl etablerad9. Dock under särskilda miljöförhållanden, kan de differentieras till icke-mesenkymala härstamningar som nervceller, astrocyter och myelinating celler i det perifera nervsystemet och ryggmärgen9,10. MSCs har redan använts i flera neuropati modeller10,11. Deras förmåga att migrera in i områden av degenererad nervös vävnad och att regenerera neurala celler har visats efter en systemisk och lokal administration11. Dessutom kan Schwann-liknande celler från MSCs rekryterar makrofager att ta bort cellulära skräp och utsöndrar neurotrofa faktorer som främjar axonal tillväxt och remyelination9.
Syftet med denna studie är att beskriva tekniken med en nerv stimulator-guidad injektion av muskel-derived autologa stamceller nära vänster återkommande larynx nerv hos friska hästar. Vanligtvis används en nervstimulator ansluten till en injektionsnål för electro-lokalisering av perifera nerver för att tillämpa lokalanestetika för att området12. En svag likström impuls levereras i närhet till nerven att inducera ett motoriskt svar. Förmågan att producera detta motoriskt svar beror på flera parametrar, såsom det ledande området av nålen, någon impedansen i vävnaden, den nuvarande tillämpas, pulslängd och avståndet från nålen till nerven. Nerv stimulator nålar är utformade för att ha en mycket restriktiv ledande området på spetsen av nålen, medan resten av nålen är isolerad. Denna design hjälper till att exakt lokalisera nerven. Moderna nervstimulatorer anpassas till varierande vävnad impedanser och leverera konstant strömstyrka på datorn. Dessutom de flesta maskiner använder pulslängd av 0,1 s, så att parametrarna som är avgörande är den nuvarande tillämpas och avståndet till nålen. Förhållandet mellan nål-till-nerv avståndet och nödvändig att producera ett motoriskt svar beskrivs i Coulombs lag: E = kQ/r; där E är krävs stimulering avgiften, k är Coulombs konstant, Q är minimala krävs stimulering avgiften och r är avståndet mellan de två elektroderna. I electro-lokaliseringen av nerver anses avståndet mellan de två elektroderna vara den nål-till-nerv avstånd12. Elektrisk laddning avleder efter regeln om omvänd torget av nål-till-nerv avstånd13. Klinisk praxis har visat att motorn nerv stimulering på 0,5 mA är starkt korrelerad till den framgångsrika nervblockad och att en förlust av motorisk signal vid lägre strömmar hindrar användaren från administrering av oavsiktlig intraneuronala injektioner. Syftet med denna studie är att testa genomförbarheten och säkerheten av denna teknik i ett begränsat antal hästar. Om genomförbarheten och säkerheten hos denna teknik bekräftas, kan den lätt överföras till drabbade hästar. «««Vidare, equine RLN kan tjäna som modell för degenerativa neuropati.
Protocol
Studieprotokollet godkände kommissionen för etiska användningen av djur av Lièges universitet.
1. muskel Microbiopsy
- Identifiera webbplatsen prov av visuell inspektion och palpation, i långa huvudet av triceps muskeln, ungefärligt mittlinjen mellan peka av armbågen och peka av axeln.
- Klipp en zon av ca 2 x 2 cm2 med en elektrisk klippare. Tillämpa kirurgisk scrub bestående av polyiodide flytande tvål och alkohol komprimerar för 1 min över urklippta området. Injicera subkutant 1 mL 2% lidokain lösning med en 25 G nål i mitten av zonen klippta och desinficeras.
- Skrubba händer med antibakteriell tvål. Sätta på sterila handskar. Använda en disponibel steril draperi som en steril yta för att placera biopsi nålen och troakaren på.
- Arm halvautomatiska 14 G biopsin nålen genom att dra fjädermekanism som visas i siffror 1b och 1 c. Släppa biopsin nålen att bekanta sig med dess mekanism. Placera den väpnade biopsi nål på steril yta. Bekanta dig med troakaren, som består av en kanyl och en obturatorn som visas i figur 1en.
Figur 1 : Den biopsi nål set. Biopsi nål består av (en) kanylen och dess obturatorn och biopsi nål (uppifrån och ner). De andra panelerna visar biopsin nålen i dess (b) neutral och (c) beväpnad position. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Förbereda troakaren genom montering av kanylen och obturatorn och hålla dem i en låst position. Introducera troakaren vinkelrätt till huden genom tidigare okänsliggjorda zonen. Avancera troakaren till en position där spetsen av troakaren är ca 1,5 cm djupt i muskeln. Teckna en troakaren, dissociera kanylen från dess obturatorn och placera obturatorn på steril yta.
- Införa den väpnade biopsi nålen genom kanylen. Införa nålen och kanylen genom huden snittet in i muskeln. Avancera nålen till en position där spetsen på nålen är i mitten av det långa huvudet av triceps muskeln.
- Släppa biopsin nålen och dra sedan ut biopsin nålen tillsammans med kanylen. Dra ut biopsin nålen ur kanylen. Låt kanylen på den sterila ytan.
- Öppna biopsin nålen genom att dra fjädern med den ena handen och håller den med andra.
Obs: Preparatet blir synlig på spetsen av biopsin nålen. - Med hjälp av en andra person, öppna provet röret som innehåller prov medium. Använda 19 G injektionsnål för att ta bort den lilla muskel bit från biopsin nålen. Placera muskel provet provtagning medium. Nära röret med skruvlocket och försiktigt luta den 2 x för att säkerställa att provet flytande medium.
- Arm biopsin nålen. Ta av kanylen från steril yta och montera väpnade biopsi nål och kanyl. Införa väpnade nålen och kanylen genom huden snittet som tidigare beskrivits. Upprepa förfarandet för prov 2 – 3 x tills cirka 20 mg av muskelvävnad samplas. Stäng provtagning röret. Vrid försiktigt röret 2 x att blanda muskel bitar med provtagning medium.
- Skicka proverna till laboratoriet vid en konstant temperatur mellan 4-8 ° C.
Obs: Laboratoriet behandlar sedan provet. Protokollet kan pausas här. - Förfarandet är väl tolererad och ömhet vid provtagning sidan iakttas inte. I den osannolika händelsen av träningsvärk som observerats på webbplatsen provtagning, administrera lämplig smärtstillande behandling.
2. behandling av cellerna
Obs: Den stamceller används i denna studie har upprättats enligt den metod som beskrivs av Ceusters et al. 7. deras beskrivs också karakterisering av cellerna.
- Börja med att förbereda särskilda odlingssubstrat, DF20, genom att lägga till 20% av Värmeinaktiverade fetalt bovint serum, 5 mL av penicillin (1000 IE/mL)-streptomycin (10 000 µg/mL) och 2,5 mL av amfotericin B (250 µg/mL) till en flaska på 500 mL av en kommersiellt tillgänglig odlingsmedium med glutamin och fenolrött.
- Häll 150 µL DF20 odlingssubstrat i vart och ett av de inre 16 brunnarna i en 24-multi-bra maträtt. Häll resterande yttre brunnarna 1 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) [kaliumklorid (200 mg/L), kalium fosfat monofasiska (200 mg/L), natriumklorid (8,000 mg/L) och kaliumfosfat diphasic (2 160 mg/L)].
- Skölj den lilla muskeln bitar 2 x i PBS. Avgränsa dem i mycket små bitar med hjälp av en skalpell och pincett och placera en liten bit (storleken på spetsen av bladet skalpell) i varje inre-16 väl i flera skålen.
- Placera flera skålen i en inkubator som underhålls på följande villkor: 37 ° C, 21% O2och 5% CO2. Övervaka brunnarna varje dag under en inverterade Mikroskop och tillsätt 50 µL av DF20 om nödvändigt för att förhindra celler från att torka ut.
Obs: Efter ca 10 d blir det tillräckligt med celler odlas från explant att tillåta stamcellsforskning isolering. Protokollet kan pausas här. - När en halo av celler är synliga runt muskeln explants, ignorera explant av muskelvävnad. Lossa cellerna med 150 µL av en EDTA-innehållande trypsin lösning i varje brunn: kassera odlingsmediet, skölj cellerna med 1 mL PBS, kassera PBS och lägga till trypsin lösningen för högst 10 min vid 37 ° C. Lägg till odlingsmedium för att stoppa handlingen av trypsin, skörda cellsuspensionen och, sedan, Centrifugera cellsuspension vid 200 x g under 10 minuter vid 37 ° C. Avlägsna supernatanten och centrifugerade i en balanserad saltlösning.
- Överföra cellsuspension på en diskontinuerlig täthetlutningen av 3 lager (15%, 25% och 35%). Centrifugera röret som innehåller cellsuspensionen och diskontinuerliga täthet lutning lösningen vid 1,250 x g i 20 min vid 25 ° C. Använd inte bromsen av centrifugen. Observera de cell fraktionerna med olika tätheter som visas mellan de olika lagren av diskontinuerlig täthet lutning lösningen efter centrifugeringen.
- Fortsätta kulturen med bråket mellan 15 och 25%. Överföra den till ett rör och tvätta det med balanserade saltlösningen. Centrifugera cellsuspension vid 200 x g under 10 minuter vid 37 ° C. Kassera supernatanten. Fortsätt med att avbryta pelleten i 1 mL DF20. Prefill en cell kultur kolv, med en yta av 25 cm2, med 6 mL DF20. Cellerna och överför till den förfyllda cell kultur och kultur dem i en inkubator med följande villkor: 37° C, 21% O2och 5% CO2.
Obs: Protokollet kan pausas här. - Övervaka cellerna varje dag under en inverterade Mikroskop. Vid behov ändra odlingssubstratet (kassera det gamla mediet och tillsätt 6 mL nytt odlingsmedium). Bestämma cellulära sammanflödet genom att observera cell lager i kultur rätter, med ett optiskt mikroskop vid fördefinierade förstoring. Beräkna ytan av skålen som upptas av cellerna. Jobbar på en fast mikroskopiska förstoring för varje observation för att kunna utvärdera sammanflödet. När cellerna upptar 85% av ytan av skålen, Fortsätt med en passage av cellerna.
- När cellerna är konfluenta, lossa dem med ett EDTA-innehållande trypsin lösning med samma protokoll som beskrivs i steg 2,4. Sedan Centrifugera cellsuspension vid 200 x g under 10 minuter vid 37 ° C. Avlägsna supernatanten och fortsätta med resuspension av cellerna i 5 mL DF20. Placera dem i en cell kultur kolv 175 cm2 förfyllda med 25 mL DF20. Placera kolven i en inkubator med följande villkor: 37° C, 21% O2och 5% CO2.
Obs: Protokollet kan pausas här. - Övervaka cellerna varje dag under en inverterade Mikroskop. Vid behov ändra mediet (kassera det gamla mediet och tillsätt 30 mL nytt medium). När cellerna är konfluenta, lossa dem med trypsin-EDTA som beskrivs i steg 2,4. Sedan Centrifugera cellsuspension vid 200 x g under 10 minuter vid 37 ° C. Avlägsna supernatanten och avbryta cellerna i 6 mL DF20. Placera 1 mL cellsuspension i sex 175 cm2 kolvar, varje förfyllda med 25 mL DF20 och kultur dem vid 37 ° C i en CO2 inkubator (med 21% O2 och 5% CO2).
- Övervaka cellerna varje dag under en inverterade Mikroskop. Vid behov ändra mediet (kassera det gamla mediet och tillsätt 30 mL nytt medium i varje kolv). När cellerna är konfluenta, lossa dem med trypsin-EDTA som beskrivs i steg 2.5. Centrifugera dem 3 x 200 x g under 10 minuter vid 37 ° C och Kassera supernatanten vid varje steg.
- Räkna cellerna med hjälp av en Bürker räknar kammare och ett ljusmikroskop. Bered en cellulär suspension av 10 miljoner celler/mL av en specifik frysförvaring medium.
- Djupfrysar de terapeutiska doserna av 1 x 107 celler i 1 mL av frysförvaring medium och lagra dem i gasfasen flytande kväve tills deras användning.
Obs: Protokollet kan pausas här. - Leverera cellerna i injektionsflaskan på torris för slutlig användning.
3. injektion av cellerna
Obs: Två personer krävs för att utföra injektion av stamcellerna.
- Varma cellsuspensionen successivt till rumstemperatur. Sug upp suspensionen i en 2 mL spruta.
- Lugna hästen genom att injicera detomidin 10 µg/kg i halsvenen med 19 G injektionsnål. Vänta 5 min att se den fulla effekten av sedering, som blir synlig genom den karakteristiska head-down positionen av hästen.
- Klippa en zon 20 x 10 cm2 över vänster larynx regionen av hästen med en clipper, som visas i figur 2. Applicera sedan, en kirurgisk scrub polyiodide tvål och alkohol till regionen klippta.
- Placera en flexibel standard video endoskop via den vänstra näsborren av hästen och gå vidare mot nasofarynx. Justera placeringen av endoskopet tills en Helbild av både arytenoid brosk och struplocket erhålls. Håll endoskopet i denna position under förfarandet och vrid skärmen på video endoskop mot operatörerna.
- Anslut den stimulering/injektionsnålen till den nervstimulator negativ elektrod. Upprätthålla de sterila förhållandena av nålen. Anslut den positiva elektroden av nervstimulator till en elektrod lapp, som har fastnat i området i klippta hud.
- Anslut sprutan innehållande cellsuspensionen till raden injektion och prefill röret för att jaga luften av systemet. Kom ihåg volymen av systemet och förbereda en spruta med samma volym av steril koksaltlösning.
- Om inte bekant med denna teknik, använda en desinficerad 5 till 7 MHz linjärt ultraljud givare för att visualisera de anatomiska strukturerna i regionen av intresse. Använd en steril ultraljud koppling gel för att öka bildkvaliteten. Visualisera struphuvudet och de fartyg som kör i regionen dorsala i struphuvudet.
- När väl förtrogen med anatomin i regionen, införa stimulering/injektionsnålen mot den dorsolaterala aspekten av struphuvudet. När du närmar dig den dorsolaterala aspekten av struphuvudet, starta nervstimulator i 1 Hz stimulering läge med en ström av 2 mA.
- Flytta försiktigt nålen mot läge av återkommande larynx nerv medan du observerar den endoskopiska Visa på skärmen. Så snart den bortförande rörelsen av vänster arytenoid brosk syns på videoskärmen, minska nuvarande tills rörelsen försvinner samtidigt hålla nålen på plats.
- Identifiera en idealisk position av nålen. Överväga en förlust av motorisk respons vid 0,5 mA som det idealiska avståndet från nerven. När arytenoid brosk rörelser kvarstår vid strömmar lägre än 0,4 mA, injicera inte cellerna, som som kan resultera i en intraneuronala injektion.
- När förlusten av motoriska respons vid 0,5 mA observeras, injicera cellsuspensionen innehållande 107 autologa stamceller och spola raden injektion med saltlösning förberett steg i 3.6. Detta kommer att injicera resten av cellsuspensionen som återstod i injektion röret.
- Efter injektion av cellerna, ta ut nålen och endoskopet.
- Låt hästen återhämta sig från sedering. Ingen ytterligare behandling är nödvändig för biopsi platsen.
Representative Results
Studieprotokollet godkände kommissionen för etiska användningen av djur av Lièges universitet. Sex hästar från besättningen av forskning hästar vid Mont-le-Soie Equine Research Centre ingick i denna studie. I första hästen, var de återkommande laryngeala nerv lokaliserad av elektrostimulering. Figur 2 visar inställningen används med stimulering nålen isatt i den vänstra dorsolaterala aspekten av struphuvudet av hästen i nervstimulator. När förlusten av rörelsen av arytenoid brosk observeras på 0,5 mA, 1 mL 2% lidokain injiceras. Detta resulterade i en avsaknad av rörelse vid högre strömmar och en övergående förlamning av den vänstra arytenoid. Den kontroll endoskopi, 24 h senare avslöjade en fullständig återhämtning av funktionen arytenoid. Det fullständiga protokollet upprepades framgångsrikt i fem hästar. Ingen av hästarna visade en negativ reaktion till den muskel microbiopsy. I alla hästar, var ett tillräckligt antal celler odlas i den inställda tiden. De övre luftvägarna endoskopi utfördes i alla fem hästar och larynx funktion poängen jag eller II.1 enligt Robinson et al. 14 bestämdes. Alla hästar tolereras nervstimulering av återkommande larynx nerv mycket väl. Inga biverkningar observerades under eller efter stimulering eller injektion av stamcellerna.
Alla endoskopier spelades in och gjorde av två blindade kliniker. Det fanns ingen skillnad mellan före injektion poängen laryngeala funktioner och poängen erhålls på dag 1, 7 och 28 efter injektionen stamceller som testats av Wilcoxon rank analys15. Tabell 1 sammanfattar larynx värderingar för alla hästar vid olika tidpunkter, samt tiden från insättning av nålen till injektion av stamcellerna och den ström som provocerade arytenoid rörelsen när cellerna där injiceras.
De celler som har använts i den aktuella studien utarbetades enligt ett protokoll tidigare publicerade7. Cellerna från alla fraktioner kunde trilineage differentiering, uttryckt CD90 och CD44, uttryckligt inte CD45 och MHC II och hade clonogenic kapacitet. Cellerna i andelen 15 – 25% har valts för vidare bearbetning eftersom de visade det största uttrycket av CD90 och den största proliferativa kapaciteten.
Syftet med föreliggande studie var inte att testa effektiviteten av den stamceller för att regenerera en skadad perifer nerv men bara för att testa genomförbarheten av förfarandet och att bedöma säkerheten för stem cell injektionen till de återkommande laryngeala nerv i en smal l antal friska hästar. En frånvaro av några funktionella förändringar på endoskopisk bildtagning i de fem hästar upp till 28 dagar efter injektionen och frånvaro av kliniska tecken i fyra av de fem hästar upp till 1 år efter injektionen bekräftar genomförbarheten och säkerheten för förfarandet. En häst hade till vara euthanized under uppföljningsperioden av skäl som inte är relaterade till studien. Även om teknikerna bevisa för att vara säker på ett litet antal hästar, är antalet hästar som ingår i den aktuella studien för låg för att påvisa frånvaro av sällsynta händelser.
| Poäng före injektion | Dags att injektion (min) | Strömmen vid injektion (mA) | Poäng på dag 1 efter injektionen | Poäng dag 7 efter injektionen | Poäng vid dag 28 efter injektionen | |
| Häst 1 (Standardbred, mare, 16 år gammal) | II.1 | 12 | 0,5 | Jag | II.1 | II.1 |
| Häst 2 (Standardbred, mare, 22 år gammal) | Jag | 3 | 0,7 | Jag | Jag | Jag |
| Häst 3 (Standardbred, mare, 11 år) | II.1 | 4 | 0,5 | II.2 | II.1 | II.1 |
| Häst 4 (Standardbred, mare, 12 år) | Jag | 7 | 0,5 | Jag | II.1 | Jag |
| Häst 5 (Standardbred, mare, 10 år gammal) | Jag | 3 | 0,7 | II.1 | Jag |
Tabell 1: Signalment och larynx fungerar noter av hästarna. Den här tabellen visar tiden för injektion, lägsta strömmen provocera någon arytenoid rörelse innan injektionen och larynx värderingar för fem friska hästar före och på dag 1, 7 och 28 efter injektionen av autologa muskel-derived mesenkymala stamceller i närhet till vänster återkommande larynx nerv. Häst #5 var inte tillgänglig för kontroll vid dag 28 efter injektionen av skäl obesläktad till denna studie. Poängen avser de poängen som beskrivs av Robinson et al. 14. här, Poäng jag betyder att förflyttningar av båda arytenoid brosk var synkrona och symmetrisk och en komplett bortförande av båda arytenoid brosk kunde erhållas och underhålls. Poäng II.1 innebär att rörelserna av de arytenoid brosk var asynkron eller kan vara asymmetrisk vid vissa tidpunkter; en komplett bortförande av båda arytenoid brosk kan dock erhållits och underhålls.
Figur 2 : Inställning under injektion av stamcellerna. Nerv stimulering nålen förs på vänster sida av struphuvudet och riktad mot vänster återkommande larynx nerv. Nervstimulator ligger på 0,8 mA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det här protokollet beskriver en framgångsrik tillämpning av muskel-derived autologa stamceller på återkommande larynx nerverna i hästar med en nerv stimulator-guidad metod. Skörden av muskel microbiopsy preparatet, samt den isolering, kultur och karakterisering av stamcellerna, har beskrivits i detalj innan, medan injektion av dessa celler i närhet till en perifer nerv är ursprungliga. Electro-lokaliseringen av nerven med en elektrisk nervstimulator har tjänat för föreliggande studie och användes för att injicera mesenkymala stamceller i direkt närhet till de återkommande laryngeala nerv. Motoriska svaret övervakades av video endoskopi via nasofarynx. Om, under positionering av nålen, andra nerver stimuleras, var motsvarande rörelsen synlig på skärmen endoskopi. En framgångsrik stimulering av återkommande larynx nerv präglades av typiska bortförandet av arytenoid brosk. I en häst, var lokalbedövning injiceras för att framkalla en övergående förlamning av arytenoid muskeln. Även om lyckad implantation av cellerna i närhet till nerven inte har testats specifikt i den aktuella studien, bevisade electro-lokaliseringen av nerv och injektionen vid en låg ström att stamcellerna tillämpades nära nerven. Närheten av injectate till nerven visades ytterligare av en framgångsrik motor block som induceras av en injektion av lokalbedövning.
I de återstående fem hästarna, tiden från första stimulering tills framgångsrik stem cell injektionen varierade från 3 till 12 min. hästar var något drogad under förfarandet, vilket ökade deras överensstämmelse med elektrisk stimulering. Ingen av hästarna visade biverkningar när som helst, vilket indikerar att varaktigheten av stimulering kan förlängas vid behov att få bra nål positionering. En brant inlärningskurva förväntas observeras om operatören använder denna teknik regelbundet och i ett större antal hästar med varierande anatomi.
Hästar ofta lider RLN, som kännetecknas av olika grader av förlamning i vänster arytenoid brosk vilket leder till onormal andning ljud och utöva intolerans. En histologi av drabbade nerver avslöjar typiska lesioner av perifer neuropati16. Perifer neuropati är en term som används för att beskriva olika typer av perifer nerv skador leder till försämrad förnimmelser, rörelser eller organfunktioner. Orsakerna är mycket varierande och kan omfatta diabetes, näringsbrister, en behandling med specifika läkemedel, en traumatisk skada, ischemi eller en infektion, eller de kan vara idiopatisk. Oberoende av orsaken, perifera neuropatier dela gemensamma histopatologiska tecken, såsom Wallerian degeneration, distala axonopathy eller segmentell demyelinisering. Det har visat att administrering av mesenkymala stamceller till skadade perifera nerver kan vara fördelaktigt för deras föryngring. de bakomliggande mekanismerna är dock inte väl förstått. Traditionellt, tror vi att mesenkymala stamceller kommer endast differentieras till föräldraparets av fett, muskler, brosk och benvävnad, men under specifika förhållanden, de har visat att differentieras till myocyter17, astrocyter18 , och myelinating celler i perifert19 och centrala nervsystemet19. Under en in vitro- kultur, kommer att en exponering mot neuropeptider gynna differentiering av mesenkymala stamceller in i celler som uttrycker neuronala markörer21,22. Flera in-vivo studier har visat den positiva effekten av mesenkymala stamceller på nerv förnyelse och en funktionell återhämtning i råtta modeller av ischiasnerven skador10,23. Detta orsakas troligen av gynnsamma miljöförhållanden som bidrar till differentieringen av stamceller in vävnadsspecifika celler24. Framtida studier bör även undersöka denna teknik för förvaltning av pre differentierade celler i RLN-drabbade hästar.
Till bäst av vår kunskap är detta den första rapporten som beskriver användningen av en nervstimulator att lokalisera en perifer nerv för att injicera en specifik behandling in. Andra perifera nerver patologier i olika arter, såsom neuropatisk smärta, kan behandlas genom administrering av stamceller i närhet till den nerv25,26. Framtida studier bör testa effekten av denna teknik i kliniska patienter och undersöka risken för migration och differentiering av de injicerade cellerna potential.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Studien har finansierats av Mont-le-Soie Equine Research Centre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
| Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
| TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
| TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG - 14090C | |
| Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
| DMEM - F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
| Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
| Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
| 24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
| Trypsin | Life technologies | 12604 | |
| HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
| NaCl | Sigma | S8776 | |
| T-25 cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
| T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
| Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |
References
- Duncan, I. D., Griffiths, I. R., Madrid, R. E. A light and electron microscopic study of the neuropathy of equine idiopathic laryngeal hemiplegia. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (6), 483-501 (1978).
- Cahill, J. I., Goulden, B. E. Equine laryngeal hemiplegia. IV. Muscle pathology. New Zealand Veterinary Journal. 34 (11), 186-190 (1986).
- Dixon, P. M., et al. Laryngeal paralysis: a study of 375 cases in a mixed-breed population of horses. Equine Veterinary Journal. 33 (5), 452-458 (2001).
- Dixon, P. M., Robinson, E., Wade, J. F. Review of the pathological changes in equine recurrent laryngeal neuropathy. Havemeyer Workshop on Equine Laryngeal Neuropathy. Havemeyer Monograph Series No. 11. , R&W Publications. Newmarket, UK. 9-11 (2003).
- Biasutti, S., Dart, A. J., Jeffcott, L. B. A review of recent developments in the clinical application of prosthetic laryngoplasty for recurrent laryngeal neuropathy: Indications, complications and outcome. Equine Veterinary Education. 29 (6), 337-345 (2016).
- Barnett, T. P., O'Leary, J. M., Parkin, T. D. H., Dixon, P. M., Barakzai, S. Z. Long-Term Maintenance of Arytenoid Cartilage Abduction and Stability During Exercise After Laryngoplasty in 33 Horses. Veterinary Surgery. 42 (3), 291-295 (2013).
- Ceusters, J., et al. From skeletal muscle to stem cells: an innovative and minimally-invasive process for multiple species. Scientific Reports. 7 (1), 696 (2017).
- Ding, D. C., Shyu, W. C., Lin, C. Z. Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 20 (1), 5-14 (2011).
- Jiang, L., Jones, S., Jia, X. Stem Cell Transplantation for Peripheral Nerve Regeneration: Current Options and Opportunities. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), 94 (2017).
- Tohill, M., Mantovani, C., Wiberg, M., Terenghi, G. Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration. Neuroscience Letters. 362 (3), 200-203 (2004).
- Ji, J. F., He, B. P., Dheen, S. T., Tay, S. S. W. Interactions of Chemokines and Chemokine Receptors Mediate the Migration of Mesenchymal Stem Cells to the Impaired Site in the Brain After Hypoglossal Nerve Injury. Stem Cells. 22 (3), 415-427 (2004).
- Urmey, W. F. Using the nerve stimulator for peripheral or plexus nerve blocks. Minerva Anesthesiologica. 72 (6), 467-471 (2006).
- De Andrés, J., Sala-Blanch, X. Peripheral nerve stimulation in the practice of brachial plexus anesthesia: a review. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 26 (5), 478 (2001).
- Robinson, N. E. Consensus statements on equine recurrent laryngeal neuropathy: conclusions of the Havemeyer Workshop. Equine Veterinary Education. 16 (6), 333-336 (2004).
- The BMJ: Rank Score Tests. , Available from: https://www.bmj.com/about-bmj/resources-readers/publications/statistics-square-one/10-rank-score-tests (2018).
- Hahn, C. N., et al. Histological and ultrastructural evidence that recurrent laryngeal neuropathy is a bilateral mononeuropathy limited to recurrent laryngeal nerves. Equine Veterinary Journal. 40 (7), 666-672 (2008).
- Orlic, D., et al. marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410 (6829), 701-705 (2001).
- Kopen, G. C., Prockop, D. J., Phinney, D. G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proceedings of the National Academy of Science. 96 (19), 10711-10716 (1999).
- Dezawa, M., Takahashi, I., Esaki, M., Takano, M., Sawada, H. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone marrow stromal cells. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1771-1776 (2001).
- Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39 (3), 229-236 (2002).
- Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. Journal of Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
- Sanchez-Ramos, J., et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Experimental Neurology. 164 (2), 247-256 (2000).
- Farzamfar, S., et al. Sciatic nerve regeneration by transplantation of menstrual blood-derived stem cells. Molecular Biology Reports. 44 (5), 407-412 (2017).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Brini, A. T., et al. Therapeutic effect of human adipose-derived stem cells and their secretome in experimental diabetic pain. Scientific Reports. 7 (1), 9904 (2017).
- Liu, W., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Stem Cells for Treating Diabetic Neuropathy in Metabolic Syndrome. Biomed Research International. 2017, 8945310 (2017).
