Summary
Aquí, presentamos un protocolo para inyectar autólogas células derivadas de músculo en la proximidad al nervio laríngeo recurrente con la ayuda de un estimulador de nervio eléctrico. Esta nueva técnica podría ser de utilidad para el tratamiento de la neuropatía laríngea recurrente equina.
Abstract
Neuropatía laríngea recurrente (Galerla) comúnmente afecta a caballos y se caracteriza por la intolerancia de sonidos y ejercicio respiratoria anormal. El nervio laríngeo recurrente muestra lesiones de desmielinización. El beneficio de la aplicación de células madre a demyelinated nervios ha sido demostrado en varios modelos animales. El objetivo del estudio era probar la viabilidad y seguridad de una inyección peri-neuronales de autólogas derivado de músculo las células madre mesenquimales para el nervio laríngeo recurrente izquierdo en caballos sanos mediante el uso de un estimulador de nervio eléctrico.
Células derivadas de músculo tallos se obtienen de cinco caballos Standardbred sanos mediante el muestreo de 20 mg de tejido muscular con una aguja para biopsia 14 G semiautomática del músculo tríceps. Movimientos de la laringe son monitoreados a través de la Endoscopia video de vías respiratorias superiores. El nervio laríngeo recurrente izquierdo es abordado con una aguja de bloqueo nervioso aislada. Estímulo del nervio se aplica, a partir de 2 mA y el exitoso secuestro de aritenoides izquierdo se controla. La intensidad de la estimulación se reduce progresivamente. Cuando se observa una pérdida de la respuesta del motor a 0.5 mA, 107 autólogo derivado de músculo tallo las células se inyectan. Dos examinadores, que están cegados hasta el punto de tiempo, puntuación de la función laríngea de los caballos antes del tratamiento y en el día 1, día 7 y el día 28 después de la inyección de las células. En un caballo de sexto, se inyecta 1 mL de lidocaína al 2% para confirmar aún más la correcta posición de la aguja. Esto conduce a una parálisis temporal del cartílago aritenoideo izquierdo.
Este estudio demuestra que el nervio laríngeo recurrente puede ser abordado con la ayuda de un estimulador de nervio eléctrico y que la estimulación eléctrica del nervio es bien tolerado por los caballos. Se observó ninguna modificación de la función laríngea en cualquiera de los caballos después de la inyección de las células madre. Estudios adicionales deben realizarse para describir los efectos de una inyección peri-neuronales de autólogas derivado de músculo células madre mesenquimales a los caballos sufren de Galerla.
Introduction
Galerla es una patología común de la vía aérea superior en los caballos caracterizada por diversos grados de parálisis aritenoidea. El lado izquierdo de la laringe es más comúnmente afectado. La prevalencia de la enfermedad puede alcanzar hasta un 35% en ciertas poblaciones del caballo. Aunque varias hipótesis intentaron explicar la etiología y la patogenia de esta enfermedad, la causa exacta de la Galerla sigue siendo incierta. La patología se describe como un axonopathy distal del nervio laríngeo recurrente con las lesiones de desmielinización pero también cierto grado de remielinización. Este axonopathy conduce a la denervación de los músculos laríngeos intrínsecos y atrofia concomitante1,2. Esta patología suele ser lentamente progresiva y puede llevar a una pérdida total de la abducción aritenoidea del lado afectado3.
Caballos afectados emiten sonidos respiratorios anormales durante el ejercicio y, a veces, muestran intolerancia del ejercicio en los casos más graves. El diagnóstico definitivo se hace por el Examen endoscópico en un caballo sedado no permanente donde una pérdida parcial o total de abducción laríngea se observa1,2,4. Actualmente, el tratamiento más común es laryngoplasty (también conocido como "tie-back"), que a veces se asocia con un ventriculo-cordectomy. Aunque la tasa de éxito de estas cirugías es considerada como buena a excelente5, las complicaciones postoperatorias son muy comunes. La complicación más común es una pérdida gradual de la abducción. Barnett et al. 6 informó una pérdida de al menos un grado del secuestro dentro de las primeras seis semanas después de la cirugía en al menos el 76% de los caballos. Otras complicaciones, como falla de prótesis, tos y contaminación de las vías respiratorias, son también reportados5.
Las células madre mesenquimales (MSCs) han sido una parte de la medicina equina en la investigación y la práctica durante más de una década, aunque comprobado son todavía escasos los estudios sobre su eficacia. Las dos fuentes más comúnmente explotadas de células madre mesenquimales adultas en los caballos son la médula ósea y tejido adiposo7. Ambas técnicas de muestreo son relativamente invasivos y no siempre conducen a un número suficiente de células. Recientemente, Ceusters et al. 7 describe la cultura de las células madre derivadas de tejido de músculo estriado, que se obtiene por una técnica menos invasiva de la microbiopsy.
MSCs son capaces de auto renovación, auto generación, multipotencia y diferenciación7,8. Su capacidad de diferenciarse en todos los linajes mesodérmicos de grasa, hueso, músculo y cartílago está ahora bien establecido9. Sin embargo, bajo condiciones ambientales específicas, pueden diferenciarse en linajes no mesenquimales como neuronas, astrocitos y células myelinating de sistema nervioso periférico y la médula espinal9,10. MSCs ya han sido utilizados en varios modelos de neuropatía10,11. Se ha demostrado su capacidad para migrar a las áreas de tejido nervioso degenerado y a regenerar las células de los nervios después de una administración sistémica y local11. Por otra parte, las células de Schwann como derivadas de MSCs pueden reclutar macrófagos para eliminar los residuos celulares y segregan factores neurotróficos, promover el crecimiento axonal y remielinización9.
El objetivo de este estudio es describir la técnica de una nervio estimulador guiado por la inyección de células madre autólogas derivadas de músculo cerca de nervio laríngeo recurrente izquierdo en caballos sanos. Normalmente, se utiliza un estimulador del nervio conectado a una aguja de inyección para la electro-localización de nervios periféricos para aplicar anestésicos locales a eso de la zona12. Un impulso débil corriente directa se suministra en proximidad al nervio para inducir una respuesta de motor. La capacidad de producir esta respuesta motor depende de varios parámetros, tales como el área de conductor de la aguja, cualquier impedancia de los tejidos, la corriente aplicada, la duración del pulso y la distancia entre la aguja y el nervio. Agujas de estimulador del nervio están diseñadas para tener una zona conductora muy restrictiva en la punta de la aguja, mientras que el resto de la aguja está aislado. Este diseño ayuda a localizar precisamente el nervio. Moderno nerviosa se adapta a diferentes impedancias de tejido y entrega el amperaje constante en la máquina. Además, la mayoría de las máquinas utiliza una duración de pulso de 0,1 s, por lo que los parámetros determinantes son la corriente aplicada y la distancia a la aguja. Ley de Coulomb describe la relación entre la distancia de la aguja al nervio y la corriente necesaria para producir una respuesta de motor: E = kQ/r; donde E es la carga de la necesaria estimulación, k es la constante de Coulomb, Q es la carga mínima de estimulación necesaria y r es la distancia entre los dos electrodos. En la electro-localización de los nervios, la distancia entre los dos electrodos se considera la distancia de la aguja al nervio12. Carga eléctrica se disipa después de la regla del cuadrado inverso de la distancia de la aguja al nervio13. Práctica clínica ha demostrado que el motor del nervio estímulo en 0.5 mA está altamente correlacionado con el exitoso bloque de nervio y que una pérdida de señal motor en corrientes inferiores evitará que el usuario administrar inyecciones intraneuronales accidental. El objetivo de este estudio es probar la viabilidad y seguridad de esta técnica en un número limitado de caballos. Si se confirman la viabilidad y seguridad de esta técnica, puede ser fácilmente transferido a los caballos afectados. Además, Galerla puede servir como un modelo para la neuropatía periférica degenerativa equina.
Protocol
La Comisión para el uso ético de los animales de la Universidad de Lieja aprobó el protocolo de estudio.
1. músculo Microbiopsy
- Identificar el sitio de ejemplo por inspección visual y palpación de la cabeza larga del músculo tríceps, aproximadamente de la línea media entre el punto del codo y del hombro.
- Clip de una zona de aproximadamente 2 x 2 cm2 con una maquinilla eléctrica. Aplicar lavado quirúrgico de poliyoduro jabón líquido y comprime el alcohol durante 1 minuto sobre el área recortado. Inyectar por vía subcutánea 1 mL de solución de lidocaína 2% con una aguja de 25 G en el centro de la zona recortada y desinfectada.
- Frote las manos con jabón antibacterial para manos. Colóquese guantes estériles. Utilice un paño estéril desechable como una superficie estéril para colocar la aguja de la biopsia y el trocar en.
- Brazo de la aguja para biopsia 14 G semiautomática tirando el mecanismo de resorte como se muestra en las Figuras 1b y 1C. Lanzamiento de la aguja de biopsia para familiarizarse con su mecanismo. Coloque la aguja para biopsia armado sobre la superficie estéril. Familiarizarse con el trocar, que consiste en una cánula y un obturador como se muestra en la figura 1un.
Figura 1 : El conjunto de aguja de biopsia. El conjunto de aguja de biopsia consiste en (una) la cánula y su obturador y la biopsia de aguja (de arriba a abajo). Los otros paneles muestran la aguja de biopsia en su (b) neutro y (c) posición de armado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Preparar el trocar la cánula y el obturador y mantenerlos en una posición bloqueada. Introducir el trocar perpendicular a la piel a través de la zona anteriormente desensitized. Haga avanzar el trocar a la posición donde la punta del trocar se aproximadamente 1,5 cm de profundidad en el músculo. Sacar el trocar, disociar la cánula de su obturador y coloque el obturador sobre la superficie estéril.
- Introducir la aguja para biopsia armados a través de la cánula. Introducir la aguja y la cánula a través de la incisión de la piel en el músculo. Avanzar la aguja a una posición donde la punta de la aguja está en el centro de la cabeza larga del músculo tríceps.
- Suelte la aguja para biopsia y luego saque la aguja de biopsia, junto con la cánula. Tire de la aguja para biopsia de la cánula. Dejar la cánula en la superficie estéril.
- Abrir la aguja de biopsia tirando de la primavera con una mano y sosteniendo con la otra.
Nota: La muestra se hace visible en la punta de la aguja de biopsia. - Con la ayuda de una segunda persona, abra el tubo de muestra que contiene el medio de la muestra. Utilice una aguja de hipodérmica 19 G para quitar la pieza de músculo pequeño de la aguja para biopsia. Coloque la muestra de músculo en el medio de muestreo. Cierre el tubo con el tapón de rosca y suavemente incline x 2 para asegurar que la muestra esté flotando en el medio.
- Brazo de la aguja de biopsia. Tome la cánula de la estéril superficie y volver a montar la aguja de la biopsia armados y la cánula. Introducir la aguja armada y la cánula a través de la incisión en la piel como se describió anteriormente. Repita el procedimiento de la muestra x 2 – 3 hasta que se muestrean aproximadamente 20 mg de tejido muscular. Cierre el tubo de muestreo. Gire suavemente el tubo de 2 x para mezclar las piezas de músculo con el medio de muestreo.
- Enviar las muestras al laboratorio a una temperatura constante entre 4 a 8 ° C.
Nota: El laboratorio luego procesará la muestra. El protocolo puede hacer una pausa aquí. - El procedimiento es bien tolerado y no se observa dolor en la parte de muestreo. En el caso de dolor muscular en el sitio de muestreo, administrar un tratamiento analgésico adecuado.
2. tratamiento de las células
Nota: Las células madre utilizadas en este estudio han sido preparadas según el método descrito por Ceusters et al. 7. su artículo también describe la caracterización de las células.
- Empezar por preparar el medio de cultivo específico, DF20, mediante la adición de 20% de inactivadas por calor suero fetal bovino, 5 mL de penicilina (1.000 UI/mL)-estreptomicina (10.000 μg/mL) y 2,5 mL de anfotericina B (250 μg/mL) a una botella de 500 mL de un disponible en el mercado medio de cultivo con glutamina y rojo de fenol.
- Vierta 150 μL de medio de cultivo DF20 en cada uno de los 16 pozos interiores de un plato 24-multi-well. Vierta 1 mL de tampón fosfato salino (PBS) [cloruro de potasio (200 mg/L), potasio Fosfato monofásica (200 mg/L), cloruro de sodio (8.000 mg/L) y fosfato de potasio difásico (2.160 mg/L)] en los pocillos exteriores restantes.
- Enjuague el músculo pequeño piezas x 2 en PBS. Separar en trozos muy pequeños con la ayuda de un bisturí y pinzas y coloque un pedazo pequeño (del tamaño de la punta de la hoja de bisturí) en cada interno 16 bien del plato varios pocillos.
- Coloque el plato varios pocillos en una incubadora que mantenga en las condiciones siguientes: 37 ° C, 21% O2y 5% CO2. Vigilar los pozos de todos los días bajo un microscopio invertido y añadir 50 μl de DF20 si es necesario para evitar que las células de la desecación.
Nota: Después de aproximadamente 10 d, habrá suficientes células de explante para permitir el aislamiento de células madre. El protocolo puede hacer una pausa aquí. - Cuando un halo de células es visible en el músculo de explantes, deseche el explante del tejido muscular. Separar las células mediante el uso de 150 μL de una solución de tripsina EDTA que contiene en cada pocillo: desechar el medio de cultivo, lavar las células con 1 mL de PBS, descartar el PBS y añadir la solución de tripsina para un máximo de 10 min a 37 ° C. Agregar medio de cultivo para detener la acción de la tripsina, la suspensión de células de la cosecha y, luego, centrifugar la suspensión de células a 200 x g durante 10 min a 37 ° C. Deseche el sobrenadante y suspender el sedimento en una solución de sal equilibrada.
- Transferir la suspensión de células en un gradiente de densidad discontinuo de 3 capas (15%, 25% y 35%). Centrifugar el tubo que contiene la suspensión de células y la solución de gradiente de densidad discontinuo a 1.250 x g por 20 min a 25 ° C. No use el freno de la centrifugadora. Tenga en cuenta las fracciones de células con diferentes densidades que aparecerán entre las diferentes capas de la solución del gradiente de densidad discontinuo después de la centrifugación.
- Continuar la cultura con la fracción entre el 15 y el 25%. Transferir a un tubo y lávelo con una solución salina equilibrada. Centrifugue la suspensión de células a 200 x g durante 10 min a 37 ° C. Deseche el sobrenadante. Proceder a suspender el sedimento en 1 mL de DF20. Rellenar previamente un frasco de cultivo celular, con una superficie de 25 cm2, con 6 mL de DF20. Las células de transferencia en el matraz de cultivo de células prellenadas y cultura en una incubadora con las condiciones siguientes: 37° C, 21% O2y 5% CO2.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. - Supervisar las células todos los días bajo un microscopio invertido. Cambiar el medio de cultivo si es necesario (Deseche el medio viejo y añadir 6 mL de medio de cultivo nuevo). Determinar la confluencia celular mediante la observación de las capas en los platos de la cultura, utilizando un microscopio óptico a una ampliación predefinida. Estimar la superficie del plato que está ocupado por las células. Trabajo en un aumento microscópico fijo para cada observación para poder evaluar la confluencia. Cuando las células ocupan el 85% de la superficie del plato, proceda con el paso de las células.
- Cuando las células son confluentes, separar con una solución de tripsina que contiene el EDTA con el mismo protocolo como se describe en el paso 2.4. Luego, centrifugar la suspensión de células a 200 x g durante 10 min a 37 ° C. Deseche el sobrenadante y proceder con la resuspensión de las células en 5 mL de DF20. Colocarlos en un frasco de cultivo celular de 175 cm2 Prellenado con 25 mL de DF20. Colocar el matraz en una incubadora con las condiciones siguientes: 37° C, 21% O2y 5% CO2.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. - Supervisar las células todos los días bajo un microscopio invertido. Cambiar el medio si es necesario (Deseche el medio viejo y añadir 30 mL de medio nuevo). Cuando las células son confluentes, separe con tripsina-EDTA como se describe en el paso 2.4. Luego, centrifugar la suspensión de células a 200 x g durante 10 min a 37 ° C. Deseche el sobrenadante y suspender las células en 6 mL de DF20. Colocar 1 mL de la suspensión celular en seis frascos de 175 cm2 , cada uno Prellenado con 25 mL de DF20 y cultivo a 37 ° C en un incubador de CO2 (con 21% de O2 y 5% CO2).
- Supervisar las células todos los días bajo un microscopio invertido. Cambiar el medio si es necesario (Deseche el medio viejo y añadir 30 mL de medio nuevo en cada frasco). Cuando las células son confluentes, separe con tripsina-EDTA como se describe en el paso 2.5. Centrifugarlos 3 x a 200 x g durante 10 min a 37 ° C y descarte el sobrenadante en cada paso.
- Contar las células con la ayuda de un Bürker contando a cámara y un microscopio de luz. Preparar una suspensión celular de 10 millones de células/mL de un medio específico de la criopreservación.
- Congelación de dosis terapéuticas de 1 x 107 células en 1 mL de medio de congelación y guárdelos en la fase de vapor de nitrógeno líquido hasta su uso.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. - Las células en la cubeta de hielo seco para uso final de la nave.
3. inyección de las células
Nota: Se requieren dos personas para realizar la inyección de las células madre.
- Calentar la suspensión de células progresivamente a la temperatura ambiente. Aspirar la suspensión en una jeringa de 2 mL.
- SEDAR el caballo inyectando detomidina 10 μg/kg en la vena yugular con aguja hipodérmica 19 G. Espere 5 minutos ver el efecto completo de la sedación, que se hace visible por la característica posición de cabeza del caballo.
- Clip de una zona de 20 x 10 cm2 en la región laríngea izquierda del caballo con un clipper, como se muestra en la figura 2. Luego, aplicar un lavado quirúrgico de poliyoduro jabón y alcohol para la región recortada.
- Colocar un endoscopio flexible de vídeo estándar a través de la fosa nasal izquierda del caballo y avanzar hacia la nasofaringe. Ajuste la posición del endoscopio hasta que se obtiene una vista completa de cartílagos aritenoideo y la epiglotis. Mantener el endoscopio en esta posición durante el procedimiento y gire a la pantalla de video endoscopio hacia los operadores.
- Conecte la aguja de estimulación, inyección al electrodo negativo del estimulador del nervio. Mantener las condiciones estériles de la aguja. Conectar el electrodo positivo del estimulador del nervio con un remiendo del electrodo, que se pega a la zona de piel recortada.
- Conectar la jeringa que contiene la suspensión de células de la línea de inyección y rellenar previamente el tubo para el aire del sistema de la persecución. Recuerde que el volumen del sistema y preparar una jeringa con el mismo volumen de solución salina estéril.
- Si no estás familiarizado con esta técnica, utilizar un transductor de ultrasonido lineal de 5 a 7 MHz desinfectadas para visualizar las estructuras anatómicas en la región de interés. Utilizar un ultrasonido estéril gel de acoplamiento para aumentar la calidad de imagen. Visualizar la laringe y los vasos que se ejecutan en la región dorsal de la laringe.
- Una vez familiarizado con la anatomía de la región, introducir la aguja de estimulación, inyección hacia el aspecto dorsolateral de la laringe. Cuando se aproxime el aspecto dorsolateral de la laringe, iniciar el estimulador del nervio en el modo de estimulación de 1 Hz con una corriente de 2 mA.
- Suavemente mueva la aguja hacia la posición del nervio laríngeo recurrente observando la vista endoscópica en la pantalla. Tan pronto como el movimiento de abducción del cartílago aritenoideo izquierdo es visible en la pantalla de vídeo, reduzca la corriente hasta que desaparezca el movimiento manteniendo la aguja en el lugar.
- Identificar la posición ideal de la aguja. Considerar una pérdida de respuesta motor en 0.5 mA como la distancia ideal del nervio. Cuando persisten movimientos del cartílago aritenoideo con corrientes inferiores a 0,4 mA, no inyectar las células, ya que puede causar una inyección intraneuronal.
- Cuando la pérdida de respuesta de motor en 0.5 mA se observa, inyectar la suspensión celular con células madre autólogas de 107 y descargue la línea de inyección con la solución salina preparada en el paso 3.6. Esto inyectará el resto de la suspensión que quedaba en el tubo de inyección.
- Después de la inyección de las células, sacar la aguja y el endoscopio.
- Deje que el caballo a recuperarse de la sedación. Ningún tratamiento adicional es necesario para el sitio de la biopsia.
Representative Results
La Comisión para el uso ético de los animales de la Universidad de Lieja aprobó el protocolo de estudio. En este estudio se incluyeron seis caballos de la manada de caballos de la investigación en el centro de investigación equina de Mont-le-Soie. En el primer caballo, fue localizado el nervio laríngeo recurrente por electroestimulación. La figura 2 muestra la configuración utilizada, con la aguja de estimulación en el aspecto dorsolateral izquierdo de la laringe del caballo en el estimulador de nervio. Cuando se observa la pérdida de movimiento del cartílago aritenoideo a 0.5 mA, 1 mL de lidocaína al 2% se inyecta. Esto dio lugar a una ausencia de movimiento en corrientes más altas y una parálisis transitoria de los aritenoides izquierdo. La endoscopia de control, 24 horas más tarde, revelaron una recuperación completa de la función del aritenoidea. El protocolo completo se repitió con éxito en cinco caballos. Ninguno de los caballos mostraron una reacción negativa a la microbiopsy muscular. En todos los caballos, un número suficiente de células fueron cultivado en el tiempo. La endoscopia de la vía aérea superior fue realizada en cinco todos los caballos y las puntuaciones de la función laríngea de I o II.1 según Robinson et al. se determinaron 14 . Todos los caballos toleran el estímulo del nervio del nervio laríngeo recurrente muy bien. No se observó ninguna reacción adversa durante o después de la estimulación o la inyección de las células madre.
Endoscopias todas fueron grabadas y anotó por dos clínicos cegados. No hubo diferencias entre las puntuaciones de pre-inyección de las funciones laríngeas y las puntuaciones obtenidas en el día 1, 7 y 28 después de la inyección de células madre, según las pruebas de Wilcoxon rank análisis15. La tabla 1 resume las puntuaciones laríngeas de todos los caballos en diferentes puntos temporales, así como el momento de la inserción de la aguja para la inyección de las células y la corriente que provocó el movimiento aritenoideo cuando las células donde se inyecta.
Las células que se han utilizado en el presente estudio se prepararon según un protocolo previamente publicados7. Las células de todas las fracciones fueron capaces de diferenciación del trilineage, expresaron CD90 y CD44, no expresaron CD45 y MHC II y tenían capacidades clonogenic. Las células de la fracción de 15 – 25% han sido elegidas para su posterior procesamiento porque mostraron la mayor expresión de CD90 y la mayor capacidad proliferativa.
El objetivo del presente estudio fue no poner a prueba la eficacia de la aplicación de células madre para la regeneración de un nervio periférico dañado pero sólo para probar la factibilidad del procedimiento y para evaluar la seguridad de la inyección de células madre para el nervio laríngeo recurrente en un pequeño l número de caballos sanos. La ausencia de cambios funcionales en la proyección de imagen endoscópica en los cinco caballos hasta 28 días después de la inyección y la ausencia de signos clínicos en cuatro de los cinco caballos hasta 1 año después de la inyección confirma la viabilidad y la seguridad del procedimiento. Un caballo tuvo que ser sacrificados en el período de seguimiento por razones ajenas al estudio. Aunque las técnicas resultan para ser seguras en un pequeño número de caballos, el número de caballos incluidos en el presente estudio es insuficiente para demostrar la ausencia de eventos raros.
| Puntuación antes de la inyección | Tiempo de inyección (min) | Corriente de inyección (mA) | Puntuación en día 1 post inyección | Anotar en el día 7 después de la inyección | Anotar en el día 28 después de la inyección | |
| Caballo 1 (Standardbred, mare, 16 años de edad) | II.1 | 12 | 0.5 | Me | II.1 | II.1 |
| Caballo 2 (Standardbred, mare, 22 años de edad) | Me | 3 | 0,7 | Me | Me | Me |
| Caballo 3 (Standardbred, mare, 11 años de edad) | II.1 | 4 | 0.5 | II.2 | II.1 | II.1 |
| Caballo 4 (Standardbred, mare, 12 años de edad) | Me | 7 | 0.5 | Me | II.1 | Me |
| Caballo 5 (Standardbred, mare, 10 años de edad) | Me | 3 | 0,7 | II.1 | Me |
Tabla 1: puntuaciones de los caballos de función Signalment y laríngea. Esta tabla muestra el tiempo de inyección, la más baja corriente que provoca cualquier movimiento aritenoideo antes de la inyección y las puntuaciones laríngeas de cinco caballos sanos antes y en el día 1, 7 y 28 después de la inyección de autólogas derivado de músculo células madre mesenquimales en proximidad al nervio laríngeo recurrente izquierdo. Caballo #5 no estaba disponible para el control en el día 28 después de la inyección razones ajena a este estudio. Las calificaciones se refieren a los resultados descritos por Robinson et al. 14. anotar aquí, que significa que los movimientos de ambos cartílagos aritenoideo eran sincrónicos y simétricos, y una abducción completa de ambos cartílagos aritenoideo podría ser obtenida y mantenida. Puntuación II.1 significa que los movimientos de los cartílagos aritenoideo asincrónicos o pueden ser asimétricos en ciertos momentos; sin embargo, una abducción completa de ambos cartílagos aritenoideo podría obtenido y mantenido.
Figura 2 : Ajuste durante la inyección de las células madre. La aguja de estimulación del nervio se introduce en el lado izquierdo de la laringe y dirigida hacia el nervio laríngeo recurrente izquierdo. El estimulador del nervio está fijado en 0,8 mA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este protocolo describe el uso acertado de células madre autólogas derivadas de músculo a los nervios laríngeos recurrentes en equinos mediante un enfoque guiado por el estimulador del nervio. La recolección de la muestra de microbiopsy de músculo, así como el aislamiento, la cultura y la caracterización de las células madre, se han descrito en detalle antes, mientras que la inyección de estas células en cerca de un nervio periférico es original. La electro-localización del nervio con un estimulador de nervio eléctrico ha servido para el presente estudio y se utilizó para inyectar las células madre mesenquimales en proximidad directa al nervio laríngeo recurrente. La respuesta de motor fue monitoreada por video endoscopia a través de la nasofaringe. Si durante el proceso de colocación de la aguja, otros nervios fueron estimuladas, el movimiento era visible en la pantalla de la endoscopia. Una acertada estimulación de nervio laríngeo recurrente se caracterizó por el secuestro típico del cartílago aritenoideo. En un caballo, se inyecta anestesia local para inducir una parálisis transitoria del músculo aritenoideo. Aunque el éxito de la implantación de las células cerca el nervio no ha sido probado específicamente en el presente estudio, la electro-localización del nervio y la inyección a una corriente baja demostró que las células madre se aplicaron cerca del nervio. La proximidad de la injectate al nervio quedó demostrada además por un exitoso bloque motor inducido por una inyección de un anestésico local.
En los restantes cinco caballos, el tiempo desde el primer estímulo hasta que la inyección de células madre éxito varió de 3 a 12 min. caballos levemente fueron sedados durante el procedimiento, que aumentó su cumplimiento con la estimulación eléctrica. Ninguno de los caballos mostraron reacciones adversas en cualquier momento, lo que indica que la duración de la estimulación puede prolongarse si es necesario para obtener la aguja buen posicionamiento. Se espera que una curva de aprendizaje se observa si el operador está usando esta técnica regularmente y en un mayor número de caballos con anatomía diferente.
Caballos comúnmente sufren de Galerla, que se caracteriza por diversos grados de parálisis de la izquierda cartílago aritenoideo lleva a sonidos respiratorios anormales e intolerancia del ejercicio. Una histología de los nervios afectados revela las lesiones típicas de la neuropatía periférica16. Neuropatía periférica es un término usado para describir varios tipos de lesiones de nervio periférico conduce a deterioro de sensaciones, movimientos o funciones del órgano. Las causas son muy variables y pueden incluir diabetes, deficiencias nutricionales, un tratamiento con fármacos específicos, un traumatismo, isquemia o una infección, o puede ser idiopáticas. Independientemente de la causa, neuropathies periféricos comparten signos histopatológicos comunes, tales como la degeneración Wallerian distal axonopathy y desmielinización segmentaria. Se ha demostrado que la administración de células madre mesenquimales a los nervios periféricos dañados puede ser beneficiosa para su regeneración; sin embargo, los mecanismos subyacentes no están bien entendidos. Tradicionalmente, cree que las células madre mesenquimales se diferencian sólo en progenitores de adiposo, músculo, cartílago y tejido óseo, pero en condiciones específicas, se ha demostrado que se diferencian en miocitos17, astrocitos18 y las células myelinating del periférico19 y del sistema nervioso central19. Durante un cultivo en vitro , una exposición a neuropéptidos favorecerá la diferenciación de las células madre mesenquimales en células que expresan marcadores neuronales21,22. Varios en vivo los estudios han demostrado el efecto beneficioso de las células madre mesenquimales en regeneración nerviosa y una recuperación funcional en modelos de rata de lesión de nervio ciático10,23. Esto es probablemente causado por condiciones ambientales favorables que contribuyan a la diferenciación de células madre en células de tejidos específicos24. Los estudios futuros deben investigar también esta técnica para la administración de células previamente diferenciadas en los caballos afectados Galerla.
A lo mejor de nuestro conocimiento, éste es el primer informe que describe el uso de un estimulador del nervio para localizar un nervio periférico con el fin de inyectar un tratamiento específico en ella. Otras patologías de nervio periférico en varias especies, como el dolor neuropático, pueden tratarse mediante la administración de células madre en proximidad al nervio25,26. Los estudios futuros deben probar el efecto de esta técnica en pacientes clínicos e investigar el riesgo de migración y el potencial de diferenciación de las células inyectadas.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El estudio ha sido financiado por el centro de investigación equina de Mont-le-Soie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
| Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
| TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
| TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG - 14090C | |
| Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
| DMEM - F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
| Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
| Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
| 24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
| Trypsin | Life technologies | 12604 | |
| HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
| NaCl | Sigma | S8776 | |
| T-25 cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
| T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
| Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |
References
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