Summary
Burada, otolog kas kaynaklı kök hücre tekrarlayan gırtlak sinir bir mesafede bir elektriksel sinir Stimülatörü yardımıyla enjekte için bir protokol mevcut. Bu roman tekniği at tekrarlayan gırtlak nöropati tedavisinde yararlı olabilir.
Abstract
Tekrarlayan gırtlak nöropati (RLN) yaygın olarak atları etkiler ve anormal solunum sesleri ve egzersiz intoleransı ile karakterizedir. Tekrarlayan gırtlak sinir lezyonları demiyelinizasyon gösterir. Kök hücre demyelinated sinirler için uygulama yararı çeşitli hayvan modellerinde gösterilmiştir. Çalışmanın amacı fizibilite ve güvenlik bir peri-nöronal enjeksiyon otolog kas elde edilen mezenkimal kök hücrelerin sol tekrarlayan gırtlak sinir sağlıklı atları bir elektriksel sinir Stimülatörü kullanarak sınamak için yapıldı.
Kas kaynaklı kaynaklanıyor hücre elde edilir beş sağlıklı Standardbred at triceps kas bir yarı otomatik 14 G biyopsisi iğne ile 20 mg kas dokusunun örnekleme tarafından. Gırtlak hareketlerin üst hava yolu video endoskopi izlenen yolu ile . Sol tekrarlayan gırtlak sinir bir yalıtılmış sinir bloğu iğne ile yaklaştı. Sinir stimülasyonu uygulanan, 2'de başlayan anne ve sol arytenoid başarılı kaçırılması izlenir. Uyarılma şiddeti giderek azalır. Ne zaman motor yanıt kaybı 0.5 gözlenen Anne, hücre enjekte 107 otolog kas kaynaklı kök. Saat noktasına kör, iki sınav, tedavi öncesinde ve 1 gün, 7 gün ve gün 28 hücreleri enjeksiyon sonra atların gırtlak işlevi puan. Altıncı at, daha fazla iğne doğru konumlandırma onaylamak için 1 mL %2 lidokain enjekte edilir. Bu sol arytenoid kıkırdak geçici bir felç için yol açar.
Bu çalışmada tekrarlayan gırtlak sinir bir elektriksel sinir Stimülatörü yardımı ile yaklaşılabilir ve sinir elektriksel stimülasyon iyi tolere atların yanında kanıtlıyor. Hiçbir değişiklik gırtlak işlevinin atları hiçbirinde kök hücre enjeksiyon sonra gözlendi. Otolog kas kaynaklı mezenkimal kök hücre RLN acı atları bir peri-nöronal enjeksiyon etkilerini açıklamak için daha fazla çalışmalar yapılmalıdır.
Introduction
RLN üst solunum yolu arytenoid felç değişen derecelerde tarafından karakterize at ortak bir patoloji olduğunu. Gırtlak sol tarafında en çok etkilenir. Hastalığın yaygınlığı bazı at nüfus % 35'e kadar ulaşabilir. Çeşitli hipotezler etyoloji ve bu hastalığın patogenezinde açıklamaya çalıştı rağmen RLN kesin nedeni belirsiz kalır. Patoloji tekrarlayan gırtlak sinir distal bir axonopathy ile demiyelinizasyon ama aynı zamanda bir dereceye remyelination lezyonlar olarak tanımlanıyor. Bu axonopathy iç gırtlak kasları ve eşlik eden atrofi1,2denervation yol açar. Bu patoloji genellikle yavaş yavaş ilerleyici ve etkilenen tarafta3arytenoid kaçırılması toplam kaybına yol açabilir.
Etkilenen at egzersiz sırasında anormal solunum sesleri yayarlar ve bazen, egzersiz intoleransı daha ciddi vakalarda ortaya. Kesin tanı gırtlak kaçırma kısmi veya toplam kaybı1,2,4nerede gözlenen olmayan yatıştırıcı ayakta duran at Endoskopik muayenede tarafından yapılır. Şu anda, en yaygın laryngoplasty (olarak da bilinen "kravat geri"), bazen ventriculo cordectomy ile ilişkili olduğu tedavisidir. Bu ameliyatlar genel başarı oranı mükemmel5' e kadar iyi olarak kabul edilir, ancak, ameliyat sonrası komplikasyonlar çok yaygındır. Kaçırma kademeli kaybı en sık görülen komplikasyondur. Barnett vd. 6 kaçırma atlar en az % 76 ameliyatı takiben ilk altı hafta içinde en az bir kalite kaybı rapor. Protez hatası, öksürük ve solunum yolu kirlenme, gibi diğer komplikasyonlar da bildirilen5vardır.
Mezenkimal kök hücre (MSCs) araştırma ve uygulama at tıpta bir parçası için on yıldan fazla, onların verimliliği üzerinde çalışmalar hala kıt kanıtlanmış rağmen edilmiştir. İki en çok yararlanılan kaynaklar at yetişkin mezenkimal kök hücrelerin kemik iliği ve yağ dokusu7vardır. Her iki örnekleme teknikleri nispeten invaziv ve her zaman yeterli sayıda hücre için yol değil. Son zamanlarda, Ceusters vd. 7 kültür daha az invazif microbiopsy tekniği ile elde edilen çizgili kas dokusundan elde edilen kök hücrelerin nitelendirdi.
MSCs kendini yenileme, öz üretimi, multipotency ve farklılaşma7,8yeteneğine sahiptirler. Yeteneklerini yağ, kemik, kas ve kıkırdak tüm mesoderm soy ayırt etmek için şimdi iyi kurulmuş9' dur. Ancak, belirli çevresel koşullar altında onlar nöronlar, astrocytes ve periferik sinir sistemi ve spinal kord9,10myelinating hücreleri gibi mezenkimal soy içine ayırabilirsiniz. MSCs zaten birkaç nöropati modelleri10,11' kullanılmıştır. Yeteneklerini dejenere sinir doku alanlarına geçirmek ve sinir hücreleri yeniden oluşturmak için bir sistemik ve yerel yönetim11' den sonra göstermiştir. Ayrıca, MSCs türetilmiş Schwann benzeri hücreleri makrofajlar hücresel enkaz kaldırmak ve aksonal büyüme ve remyelination9teşvik nörotrofik faktör salgılar işe.
Bu çalışmada kas kaynaklı otolog kök hücre sağlıklı at sol tekrarlayan gırtlak sinir yakınındaki bir sinir Stimülatörü güdümlü enjeksiyon tekniği tarif etmektir. Genellikle, bir enjeksiyon iğneye bağlı bir sinir Stimülatörü periferik sinirler elektro-yerelleştirme için yerel anestezi o alan12' ye uygulamak için kullanılır. Zayıf akım itici motor yanıt ikna etmek için sinir bir mesafede sağlanır. Bu motor yanıt üretmek için iğne iletken alan, herhangi bir empedans doku, uygulanan akım, darbe süresi ve sinir iğne mesafe gibi çeşitli parametreleri üzerinde bağlıdır. Sinir Stimülatörü iğne iğne kalan edinilebilir izolasyonlu iğne ucu çok kısıtlayıcı bir iletken bölgede için tasarlanmıştır. Bu tasarım tam sinir yerelleştirmek için yardımcı olur. Modern sinir uyarıcılar farklı doku impedances uyum ve set machine üzerinde sürekli amper teslim. Ayrıca, bir darbe süresi 0.1 birçok makinesi kullanımı s, böylece uygulanan akım ve iğne Uzaklik belirleyici parametreleridir. İğne sinir mesafe ve motor yanıt üretmek için geçerli gerekli ilişkisi Coulomb'ın yasa ile tanımlanır: E = kQ/r; nerede E gerekli stimülasyon suçlanıyor, k Coulomb'ın sabittir, Q en az gerekli stimülasyon suçlanıyor ve r iki elektrot arasındaki mesafedir. Elektro-lokalizasyonu içinde sinirler, iki elektrot arasındaki uzaklığı12iğne sinir mesafe olarak kabul edilir. Elektrik akımı ters kare iğne sinir mesafe13kural kalır. Klinik pratikte motor stimülasyon 0,5 mA son derece başarılı sinir bloğu ilişkilidir, sinir ve daha düşük akımlar, motor sinyal kaybı yanlışlıkla intraneuronal enjeksiyonları yönetme Kullanıcı engeller göstermiştir. Bu çalışmada fizibilite ve güvenlik bu tekniğin sınırlı sayıda atını test etmektir. Fizibilite ve güvenlik bu tekniğin tasdik edilirse, kolayca etkilenen atlara aktarılabilir. Ayrıca, at RLN dejeneratif periferik nöropati için bir model olarak hizmet verebilir.
Protocol
Etik kullanmak için komisyon of Liege Üniversitesi hayvanların çalışma protokolü onayladı.
1. Kas Microbiopsy
- Görsel muayene ve palpasyonla, triceps kas, yaklaşık orta hat noktası dirsek ve omuz noktası arasında uzun Başkanı tarafından örnek siteyi tanımlar.
- Küçük bir elektrik kesme makinesi ile yaklaşık2 2 x 2 cm bir bölge. Cerrahi fırçalayın için kırpılan alanın üzerine 1 dk polyiodide sıvı sabun ve alkol sıkıştırır oluşan uygulanır. Kirpik ve dezenfekte bölge merkezinde 25 G iğne ile subkutan 1 mL %2 lidokain çözeltisi enjekte.
- Antibakteriyel sabun ile El fırçalayın. Steril eldiven takmışım. Tek kullanımlık steril örtü steril bir yüzey üzerinde Biyopsi iğnesini ve trokar eklemenizi sağlar.
- Yarı otomatik 14 G Biyopsi iğnesini rakamlar 1b ve 1 cgösterildiği gibi bahar mekanizması çekerek kol. Onun mekanizma ile tanımak için Biyopsi iğnesini serbest bırakın. Silahlı Biyopsi iğnesini steril yüzey üzerine yerleştirin. Oluşan bir kanül ve Şekil 1biriçinde gösterildiği gibi bir obturator trokar hakkında bilgi edinin.
Resim 1 : Biyopsisi iğne kümesi. Biyopsi iğnesi (bir) kanül ve onun obturator ve biyopsi oluşan küme iğne (üstten alta). Diğer panellerin Biyopsi iğnesini onun (b) tarafsız göstermek ve (c) pozisyon silahlı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Trokar kanül ve obturator birleştirerek hazırlamak ve bir konumda saklayın. Trokar dik cilt eski düşüncesiz bölgesi ile tanıtmak. Trokar trokar ucu yaklaşık 1.5 cm nerede bir konuma ilerletmek derin kas içinde. Trokar çıkar, onun obturator üzerinden kanül ayırmak ve obturator steril yüzey üzerine yerleştirin.
- Silahlı Biyopsi iğnesini kanül aracılığıyla tanıtmak. İğne ve kas içine cilt kesi yoluyla kanül tanıtmak. İğne iğne ucu ortasında triceps kas kafa uzun nerede bir konuma ilerlemek.
- Biyopsi iğnesini yayın ve Biyopsi iğnesini kanül ile birlikte dışarı çekin. Biyopsi iğnesini kanül dışarı çekin. Kanül steril yüzeyde bırakın.
- Biyopsi iğnesini bahar tek elle çekerek ve diğer tutarak açın.
Not: Örnek Biyopsi iğnesini ucunda görünür hale gelir. - İkinci bir kişi sayesinde, örnek ortam içeren örnek tüp açın. 19 G Hipodermik İğne Biyopsi iğnesini küçük kas parçası kaldırmak için kullanın. Kas örnek örnekleme ortamda yerleştirin. Vida kapaklı tüp kapatın ve hafifçe eğimli örnek ortamda yüzer emin olmak için 2 x.
- Biyopsi iğnesini kol. Kabul kanül steril yüzey ve silahlı Biyopsi iğnesini ve kanül yenilemek. Silahlı iğne ve kanül daha önce açıklandığı gibi cilt kesi yoluyla tanıtmak. Yaklaşık 20 mg kas dokusunun örneklenir kadar 2-3 x örnek yordamı yineleyin. Örnekleme tüp kapatın. Yavaşça çevirmek tüp 2 x kas parçaları ile örnekleme orta karıştırmak için.
- 4-8 ° c arasında sabit bir ısıda laboratuvar örnekleri gemi
Not: Laboratuvar sonra örnek işleyecektir. Protokol burada duraklatılmış. - Yordamı iyi tolere edilir ve örnekleme tarafında ağrı değil görülmektedir. Kas ağrıları örnekleme sitesinde gözlenen olası olay uygun analjezik tedavi yönetmek.
2. tedavi hücre
Not: Bu çalışmada kullanılan kök hücreler Ceusters vd tarafından açıklanan yöntemine göre hazırlanmıştır 7. kendi makalede ayrıca hücrelerin karakterizasyonu.
- Özel kültür ortam, DF20, ısı inaktive fetal Sığır serum, 5 mL penisilin (1000 IU/mL) % 20'si ekleyerek hazırlayarak başlayın-streptomisin (10.000 µg/mL) ve Amfoterisin B (250 µg/mL) için piyasada bulunan 500 mL şişe 2.5 mL Glutamin ve fenol red ile kültür orta.
- DF20 kültür ortamının 150 µL her bir 24-multi-da yemek iç 16 kuyu içine dökün. 1 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) [potasyum klorür (200 mg/L), potasyum fosfat monophasic (200 mg/L), sodyum klorür (8000 mg/L) ve potasyum fosfat diphasic (2160 mg/L)] kalan dış kuyu dökün.
- Durulama küçük kas PBS 2 x adet. Bunları bir neşter ve forseps yardımıyla çok küçük parçalar halinde ayırın ve küçük bir parça (neşter bıçak ucu boyutunu) içinde de çok iyi yemek, her iç-16 yerleştirin.
- Aşağıdaki koşullar tutulan bir kuluçka çok iyi çanak yerleştirin: 37 ° C, % 21 O2ve %5 CO2. Kuyuları ters bir mikroskop altında her gün izlemek ve DF20 50 µL hücreleri kurumasını önlemek gerekirse ekleyin.
Not: yaklaşık 10 d sonra kök hücre izolasyon izin vermek için explant yetiştirilen yeterince hücre olacak. Protokol burada duraklatılmış. - Ne zaman bir hale hücre kas görünür olacağını explants, kas dokusu explant atın. Hücreleri her kuyuya EDTA içeren tripsin çözümünün 150 µL kullanarak bağlantısını kesin: kültür orta atmak, PBS 1 mL hücrelerle durulama, PBS atmak ve tripsin çözüm en fazla 10 dk 37 ° C'de ekleyin Kültür tripsin eylemi durdurmak, hücre süspansiyon hasat ve sonra hücre süspansiyon vasıl 200 x g 37 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi için orta Ekle Süpernatant atın ve Pelet dengeli tuz çözeltilerine askıya alma.
- Hücre süspansiyon kesintili yoğunluğu degradeyi 3 kat (% 15, % 25 ve % 35) üzerinde aktarın. Hücre süspansiyon ve kesintili yoğunluğu degrade çözüm 1,250 x g için 25 ° C'de 20 dk de içeren tüp santrifüj kapasitesi Santrifüj fren kullanmayın. Kesintili yoğunluk gradient çözüm Santrifüjü sonra farklı katmanları arasında görünür farklı yoğunlukları ile hücre kesirler gözlemlemek.
- Kültür 15 ve % 25 arasında kesir ile devam edin. Bir tüp aktarmak ve dengeli tuz solüsyonu ile yıkayın. Hücre süspansiyon vasıl 200 x g 37 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak. 1 mL DF20 Pelet askıya ile devam edin. DF20 6 mL ile 25 cm2, yüzeyli bir hücre kültür şişesi prefill. Hücreleri doldurulmuş hücre kültür şişesi aktarmak ve onları bir kuluçka aşağıdaki koşullar ile kültür: 37° C, % 21 O2ve %5 CO2.
Not: Protokol burada duraklatılmış. - Hücreleri her gün ters bir mikroskop altında izlemek. Kültür orta gerekirse değiştirin (eski orta atmak ve yeni kültür orta 6 mL ekleyin). Hücresel kesiştiği yerde önceden tanımlanmış bir büyütme optik bir mikroskop kullanarak hücre katmanlarında kültür yemekleri gözlemleyerek belirlemek. Hücreler tarafından işgal çanak yüzeyi tahmin ediyoruz. Sabit bir mikroskobik büyütmede kesiştiği yerde değerlendirmek her gözlem için çalışıyorum. Hücreleri çanak yüzeyinin % 85'i işgal, hücreleri bir geçit ile devam.
- Hücreleri konfluent olduğunuzda, EDTA içeren tripsin çözümünü 2.4 adımda anlatıldığı gibi ile aynı iletişim kuralını kullanarak ayırabilirsiniz. Sonra hücre süspansiyon vasıl 200 x g 37 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve 5 mL DF20 de hücrelerde resuspension devam etmek. 175 cm2 DF20 25 mL ile doldurulmuş bir hücre kültür şişesi içine koyun. Aşağıdaki koşullar ile bir kuluçka şişeye koyun: 37° C, % 21 O2ve %5 CO2.
Not: Protokol burada duraklatılmış. - Hücreleri her gün ters bir mikroskop altında izlemek. Orta gerekirse değiştirin (eski orta atmak ve yeni orta 30 mL ekleyin). Hücreleri konfluent olduğunda tripsin-EDTA 2.4. adımda açıklandığı gibi kullanarak ayırabilirsiniz. Sonra hücre süspansiyon vasıl 200 x g 37 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak ve DF20 6 mL hücrelerde askıya alma. Yer 1 mL altı 175 cm2 şişe içine hücre süspansiyon, her DF20 25 mL ile doldurulmuş ve onları bir CO2 kuluçka (%21 O2 ve %5 CO2ile) 37 ° C'de kültür.
- Hücreleri her gün ters bir mikroskop altında izlemek. Orta gerekirse değiştirin (eski orta atmak ve yeni orta 30 mL her şişeye ekleyin). Hücreleri konfluent olduğunda tripsin-EDTA 2.5. adımda açıklandığı gibi kullanarak ayırabilirsiniz. Onları santrifüj kapasitesi 3 x 200 x g 10 dk 37 ° C ve atma süpernatant her adımda için de.
- Bir Bürker sayım odası ve ışık mikroskop yardımıyla hücreleri saymak. 10 milyon hücre/mL belirli dondurma orta hücresel bir süspansiyon hazırlamak.
- Tedavi edici dozlarda dondurma orta 1 mL 1 x 107 hücrelerinin kuzine ve bunların kullanımı kadar sıvı azot buharı aşamasında depolayabilirsiniz.
Not: Protokol burada duraklatılmış. - Şişeyi son kullanım için kuru buzda hücrelerde gemi.
3. enjeksiyon hücrelerin
Not: Enjeksiyon kök hücrelerin gerçekleştirmek için iki kişi gerekir.
- Hücre süspansiyon giderek için oda sıcaklığında ısıtın. Süspansiyon 2 mL şırınga Aspire edin.
- At detomidine 10 µg/kg juguler ven 19 G Hipodermik iğne ile enjekte edilerek sakinleştir. At karakteristik baş aşağı konumunu tarafından görünür hale gelir sedasyon tam etkisini görmek için 5 dakika bekleyin.
- Şekil 2' de gösterildiği gibi bir kesme makinesi ile at sol gırtlak bölge üzerinde bir bölge 20 x 10 cm2 küçük. Daha sonra bir cerrahi bodur polyiodide sabun ve alkol kısaltıldı bölgesine uygulayın.
- Esnek bir standart video endoskop at sol burun yoluyla yerleştirin ve nazofarinksi doğru ilerlemek. Arytenoid kıkırdak ve gırtlak kapağını tam bir görünümünü elde edene kadar endoskop konumunu ayarlayın. Endoskop işlem sırasında bu konumda tutun ve işleçleri doğru video endoskop ekran dönüş.
- Stimülasyon/enjeksiyon iğne sinir Stimülatörü'nın negatif elektrot için bağlayın. İğne Steril koşullar korumak. Sinir Stimülatörü pozitif elektrot kirpik cilt bölgeye sıkışmış bir elektrot yama bağlayın.
- Enjeksiyon satırına hücre süspansiyon içeren şırınga bağlanmak ve hava sisteminin kovalamak için tüp prefill. Sistem hacmi hatırlıyorum ve bir şırınga steril serum fizyolojik çözüm aynı hacmi ile hazırlayın.
- Tanıdık değil, bu teknik ile bir dezenfekte 5-7 MHz lineer Ultrason çevirici ilgi bölgede anatomik yapıları görselleştirmek için kullanın. Steril bir ultrason jeli kaplin görüntü kalitesini artırmak için kullanın. Gırtlak ve gırtlak dorsal bölgede çalışan gemiler görselleştirin.
- Bölge anatomisi ile tanıdık bir kez stimülasyon/enjeksiyon iğne gırtlak dorsolateral yönünü doğru tanıtmak. Gırtlak dorsolateral yönünü yaklaşırken, sinir Stimülatörü bir akım 2 ile 1 Hz stimülasyon modda başlatmak anne.
- Yavaşça iğneyi endoskopik görünüm üstünde belgili tanımlık perde kesilmediğini gözleyerek tekrarlayan gırtlak sinir konumunu doğru hareket ettirin. Sol arytenoid kıkırdak kaçırma hareketini video ekranda görünür olduğunda, hareketin yerde iğne tutarken kaybolana kadar geçerli azaltmak.
- İğne ideal konumunu tanımlayın. 0.5, motor yanıt kaybı dikkate sinir ideal mesafe olarak anne. Ne zaman arytenoid kıkırdak hareketleri kalıcı akımları 0,4 düşük, mA,-değil enjekte hücreleri, bu intraneuronal iğne neden olabileceğinden.
- MA görülmektedir, 0.5, motor yanıt kaybı 107 otolog kök hücre içeren hücre süspansiyon enjekte ve enjeksiyon satır hazırlanan tuzlu çözüm ile flush 3.6. adımda. Bu enjeksiyon tüpte kaldı hücre süspansiyon kalan enjekte edecek.
- Hücreleri enjeksiyon sonra iğne ve endoskop al.
- Sedasyon kurtarma atı Sal. Daha fazla tedavi biyopsi site için gereklidir.
Representative Results
Etik kullanmak için komisyon of Liege Üniversitesi hayvanların çalışma protokolü onayladı. Sürünün Mont-le-Soie at Araştırma Merkezi'nde araştırma atların altı atları bu çalışmaya dahil. İlk at, tekrarlayan gırtlak sinir tarafından Elektrostimülasyon yerelleştirilmiş. Şekil 2 , sinir Stimülatörü at gırtlak sol dorsolateral yönünü içine eklenen stimülasyon iğne ile kullanılan ayarını gösterir. Ne zaman hareket arytenoid kıkırdak kaybı 0.5 gözlenen Anne, 1 mL %2 lidokain enjekte edilir. Bu hareketin daha yüksek akımlar olmayışı ve sol arytenoid geçici bir felç sonuçlandı. Denetim Endoskopi, 24 saat sonra arytenoid işlevinin tam bir iyileşme gösterdi. Tam iletişim kuralı başarıyla beş atları tekrarlandı. Atları hiçbiri kas microbiopsy olumsuz bir tepki gösterdi. Bütün atları hücreleri yeterli sayıda ayarlamak zaman yetiştirilmiştir. Üst solunum yolu endoskopi Robinson ve ark. göre tüm beş at ve ben ya da II.1 gırtlak işlevi puanları gerçekleştirildi 14 tespit. Tüm at nalı sinir stimülasyonu tekrarlayan gırtlak sinir çok iyi tolere. Olumsuz hiçbir tepki sırasında veya sonrasında stimülasyon veya enjeksiyon kök hücrelerin gözlendi.
Tüm endoscopies kaydedilir ve iki kör klinisyenler tarafından attı. Wilcoxon rank analiz15tarafından sınav öncesi enjeksiyon puanları gırtlak fonksiyonların ve günde 1, 7 ve 28 kök hücre enjeksiyon sonra elde edilen puanlar arasında hiçbir fark vardı. Tablo 1 özetler farklı zaman puan, hem de iğne ekleme enjeksiyon kök hücreler ve arytenoid hareketi tahrik geçerli zaman tüm at nalı gırtlak puanları ne zaman hücreleri enjekte nerede.
Mevcut çalışmada kullanılan hücreler göre hazırlanmış bir protokol, daha önce7yayınlandı. Bütün fraksiyonları hücrelerden trilineage farklılaşma için başardık, CD90 ve CD44 ifade, CD45 ve MHC II ifade edemediği ve klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar kapasiteleri vardı. 15-%25 kesir hücreleri CD90 ve en büyük proliferatif kapasiteleri en büyük ifadesi gösterdiler çünkü işlenmesi için seçildi.
Mevcut çalışmada değil bozuk bir periferik sinirleri yeniden oluşturmak için ama sadece fizibilite yordam sınamak için ve bir smal içinde tekrarlayan gırtlak sinir kök hücre enjeksiyon güvenliğini değerlendirmek için kök hücre uygulama etkinliğini test etmek için yapıldı. l sayısı sağlıklı atlar. Beş dakika içinde endoskopik görüntüleme işlev herhangi bir değişiklik bir yokluğu 28 gün sonra enjeksiyon atlar ve bir yokluğu herhangi bir klinik belirtiler dört beş ilâ 1 yıl sonra enjeksiyon fizibilite ve yordam güvenlik onaylar atları. Çalışma odasına ilgisiz nedenlerle takip süresi içinde euthanized bir atım vardı. Teknikleri atları küçük birkaç güvenli olarak kanıtlamak rağmen atları da çalışmanın dahil sayısı çok nadir olaylar bir yokluğu göstermek için düşüktür.
| Enjeksiyon önce puan edinildi | Enjeksiyon (dak) için saat | Enjeksiyon (mA) mevcut | Gün 1 skora Enjeksiyon sonrası | 7. gün skora Enjeksiyon sonrası | Günde 28 puan Enjeksiyon sonrası | |
| At 1 (Standardbred, mare, 16 yaşında) | II.1 | 12 | 0,5 | Ben | II.1 | II.1 |
| At 2 (Standardbred, mare, 22 yaşında) | Ben | 3 | 0,7 | Ben | Ben | Ben |
| At 3 (Standardbred, mare, 11 yaşında) | II.1 | 4 | 0,5 | II.2 | II.1 | II.1 |
| At 4 (Standardbred, mare, 12 yaşında) | Ben | 7 | 0,5 | Ben | II.1 | Ben |
| At 5 (Standardbred, mare, 10 yaşında) | Ben | 3 | 0,7 | II.1 | Ben |
Tablo 1: Signalment ve laryngeal çalışması skor atların. Bu tablo, enjeksiyon, enjeksiyon ve beş sağlıklı at önce ve gırtlak puanları günde 1, 7 ve 28 enjeksiyon sonra otolog kas elde edilen mezenkimal kök hücrelerin içinde önce arytenoid herhangi bir hareket kışkırtan en düşük geçerli saati gösterir Sol gırtlak tekrarlayan sinir yakınlığı. At #5 Bu çalışma için ilgisiz gün 28 enjeksiyon sonra nedeniyle denetim için mevcut değildi. Robinson ve ark. tarafından açıklanan puanları puanları bakın 14. burada, ben her iki arytenoid kıkırdak hareketleri zaman uyumlu ve simetrik ve her iki arytenoid kıkırdak tam kaçırılması elde edilen ve muhafaza anlamına gelir puan edinildi. Skor II.1 arytenoid kıkırdak hareketleri zaman uyumsuz veya belirli zamanlarda; asimetrik olabilir anlamına gelir Ancak, her iki arytenoid kıkırdak tam kaçırılması elde edilen ve yapılmaktadır.
Resim 2 : Kök hücre enjeksiyon sırasında ayarlama. Sinir stimülasyonu iğne gırtlak sol tarafında tanıttı ve doğru sol tekrarlayan gırtlak sinir yönetti. Sinir Stimülatörü 0,8 ayarla anne. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bu iletişim kuralı tekrarlayan gırtlak sinirlere sinir Stimülatörü güdümlü bir yaklaşım kullanarak at kas kaynaklı otolog kök hücre uygulaması başarılı açıklanır. Kas microbiopsy örnek yanı sıra yalıtım, kültür ve kök hücrelerin karakterizasyonu hasat tarif edilmiştir ayrıntılı daha önce bu hücrelerin periferik sinir birbirine enjeksiyon orijinal olmakla birlikte. Sinir bir elektriksel sinir Stimülatörü ile elektro lokalizasyonu da çalışmanın için hizmet vermiştir ve tekrarlayan gırtlak sinir çok yakındır mezenkimal kök hücre enjekte için kullanılan. Motor yanıt video endoskopi nazofarinksi aracılığıyla takip. Eğer iğne konumlandırma işlemi sırasında diğer sinir uyarılmış, karşılık gelen hareket endoskopi ekranda görünür. Tekrarlayan gırtlak sinir başarılı uyarılması arytenoid kıkırdak tipik kaçırılması tarafından karakterize edildi. Bir atı, bir geçici felç arytenoid kas ikna etmek için lokal anestezi enjekte ettiler. Her ne kadar yakınlık sinir hücrelerinde başarılı implantasyonu özellikle mevcut çalışmada test edilmemiştir, elektro-lokalizasyonu sinir ve düşük akım, enjeksiyon kök hücre sinir uygulandı kanıtladı. İnjectate yakınlık sinir daha da başarılı bir motor bloğu bir lokal anestezik enjeksiyonu ile indüklenen tarafından sunuldu.
Kalan beş at, ilk stimülasyon başarılı kök hücre enjeksiyon 12 dk. 3 çeşitli kadar zaman atlar biraz elektrik stimülasyonu ile onların uyum arttı işlemi sırasında sakinleştirici. Atları hiçbiri herhangi bir zamanda, advers reaksiyon gösterdi stimülasyon süresini gösteren iyi iğne konumlandırma elde etmek gerekirse uzun süreli. Dik bir öğrenme eğrisi operatör bu teknik düzenli olarak ve atların daha büyük bir sayı ile değişen anatomi kullanıp kullanmadığını dikkat edilmesi bekleniyor.
Atları genellikle felç sol arytenoid kıkırdak anormal solunum sesleri için önde gelen değişen derecelerde ile karakterize RLN muzdarip ve hoşgörüsüzlük egzersiz. Histoloji etkilenen sinir tipik lezyonlar periferik nöropati16ortaya koymaktadır. Periferik nöropati, periferik sinir lezyonları Engelli duyumları, hareketleri veya organ fonksiyonları için önde gelen çeşitli türlerini tanımlamak için kullanılan bir terimdir. Nedenleri çok değişkendir ve diyabet, besin eksiklikleri, belirli ilaçlar ile tedavi, bir travma olabilir, iskemi veya bir virüs içerebilir veya idyopatik olabilir. Bağımsız nedeninin, periferik neuropathies Wallerian dejenerasyon, distal axonopathy veya gelen bir segmental demiyelinizasyon gibi ortak histopatolojik işaretleri, paylaşmak. Mezenkimal kök hücreler hasarlı periferik sinirler için yönetim onların yenilenme için yararlı olabilir gösterilmiştir; Ancak, temel mekanizmaları iyi anlaşılmış değil. Geleneksel olarak, biz inanıyoruz mezenkimal kök hücre sadece yağ, kas, kıkırdak ve kemik dokusu ataları ayırt, ancak belirli koşullar altında miyositler17, astrocytes18 ayırt etmek için onlar gösterilmiştir ve myelinating hücrelerinin periferik19 ve merkezi sinir sistemi19. Bir vitro kültür sırasında nöropeptitler bir maruz mezenkimal kök hücre farklılaşma nöronal işaretleri21,22ifade hücreye lehine. Çeşitli in vivo çalışmalarda yararlı etkisi mezenkimal kök hücre sinir yenilenme ve siyatik sinir yaralanma10,23fare modellerinde fonksiyonel iyileşme gösterdi. Bu muhtemelen kök hücre farklılaşma doku özel hücreler24içine katkıda uygun çevre koşulları nedeniyle oluşur. Gelecekteki çalışmaları da bu teknik yönetim RLN etkilenen at önceden farklılaşmış hücre için araştırmak gerekir.
Bizim bilgi en iyi şekilde, belirli bir tedaviye enjekte için periferik sinirleri yerelleştirmek için sinir Stimülatörü kullanımını açıklayan ilk rapor bu. Nöropatik ağrı gibi çeşitli türlerin diğer periferik sinirleri patolojiler kök hücrelerin birbirine sinir25,26yönetim tarafından tedavi edilebilir. Gelecek çalışmalar klinik hastalarda bu teknik etkisini sınayın ve geçiş riski ve enjekte hücrelere farklılaşma potansiyelini araştırmak gerekir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Çalışma Mont-le-Soie at Araştırma Merkezi tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
| Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
| TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
| TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG - 14090C | |
| Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
| DMEM - F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
| Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
| Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
| 24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
| Trypsin | Life technologies | 12604 | |
| HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
| NaCl | Sigma | S8776 | |
| T-25 cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
| T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
| Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |
References
- Duncan, I. D., Griffiths, I. R., Madrid, R. E. A light and electron microscopic study of the neuropathy of equine idiopathic laryngeal hemiplegia. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (6), 483-501 (1978).
- Cahill, J. I., Goulden, B. E. Equine laryngeal hemiplegia. IV. Muscle pathology. New Zealand Veterinary Journal. 34 (11), 186-190 (1986).
- Dixon, P. M., et al. Laryngeal paralysis: a study of 375 cases in a mixed-breed population of horses. Equine Veterinary Journal. 33 (5), 452-458 (2001).
- Dixon, P. M., Robinson, E., Wade, J. F. Review of the pathological changes in equine recurrent laryngeal neuropathy. Havemeyer Workshop on Equine Laryngeal Neuropathy. Havemeyer Monograph Series No. 11. , R&W Publications. Newmarket, UK. 9-11 (2003).
- Biasutti, S., Dart, A. J., Jeffcott, L. B. A review of recent developments in the clinical application of prosthetic laryngoplasty for recurrent laryngeal neuropathy: Indications, complications and outcome. Equine Veterinary Education. 29 (6), 337-345 (2016).
- Barnett, T. P., O'Leary, J. M., Parkin, T. D. H., Dixon, P. M., Barakzai, S. Z. Long-Term Maintenance of Arytenoid Cartilage Abduction and Stability During Exercise After Laryngoplasty in 33 Horses. Veterinary Surgery. 42 (3), 291-295 (2013).
- Ceusters, J., et al. From skeletal muscle to stem cells: an innovative and minimally-invasive process for multiple species. Scientific Reports. 7 (1), 696 (2017).
- Ding, D. C., Shyu, W. C., Lin, C. Z. Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 20 (1), 5-14 (2011).
- Jiang, L., Jones, S., Jia, X. Stem Cell Transplantation for Peripheral Nerve Regeneration: Current Options and Opportunities. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), 94 (2017).
- Tohill, M., Mantovani, C., Wiberg, M., Terenghi, G. Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration. Neuroscience Letters. 362 (3), 200-203 (2004).
- Ji, J. F., He, B. P., Dheen, S. T., Tay, S. S. W. Interactions of Chemokines and Chemokine Receptors Mediate the Migration of Mesenchymal Stem Cells to the Impaired Site in the Brain After Hypoglossal Nerve Injury. Stem Cells. 22 (3), 415-427 (2004).
- Urmey, W. F. Using the nerve stimulator for peripheral or plexus nerve blocks. Minerva Anesthesiologica. 72 (6), 467-471 (2006).
- De Andrés, J., Sala-Blanch, X. Peripheral nerve stimulation in the practice of brachial plexus anesthesia: a review. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 26 (5), 478 (2001).
- Robinson, N. E. Consensus statements on equine recurrent laryngeal neuropathy: conclusions of the Havemeyer Workshop. Equine Veterinary Education. 16 (6), 333-336 (2004).
- The BMJ: Rank Score Tests. , Available from: https://www.bmj.com/about-bmj/resources-readers/publications/statistics-square-one/10-rank-score-tests (2018).
- Hahn, C. N., et al. Histological and ultrastructural evidence that recurrent laryngeal neuropathy is a bilateral mononeuropathy limited to recurrent laryngeal nerves. Equine Veterinary Journal. 40 (7), 666-672 (2008).
- Orlic, D., et al. marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410 (6829), 701-705 (2001).
- Kopen, G. C., Prockop, D. J., Phinney, D. G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proceedings of the National Academy of Science. 96 (19), 10711-10716 (1999).
- Dezawa, M., Takahashi, I., Esaki, M., Takano, M., Sawada, H. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone marrow stromal cells. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1771-1776 (2001).
- Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39 (3), 229-236 (2002).
- Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. Journal of Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
- Sanchez-Ramos, J., et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Experimental Neurology. 164 (2), 247-256 (2000).
- Farzamfar, S., et al. Sciatic nerve regeneration by transplantation of menstrual blood-derived stem cells. Molecular Biology Reports. 44 (5), 407-412 (2017).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Brini, A. T., et al. Therapeutic effect of human adipose-derived stem cells and their secretome in experimental diabetic pain. Scientific Reports. 7 (1), 9904 (2017).
- Liu, W., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Stem Cells for Treating Diabetic Neuropathy in Metabolic Syndrome. Biomed Research International. 2017, 8945310 (2017).
