Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at injicere autolog muskel-afledte stamceller i nærhed til den tilbagevendende larynx nerve ved hjælp af en elektrisk nerve stimulator. Denne nye teknik kan blive nyttig til behandling af equine tilbagevendende larynx neuropati.
Abstract
Tilbagevendende larynx neuropati (RLN) almindeligt påvirker heste og er kendetegnet ved unormal respiratoriske lyde og motion intolerance. Den tilbagevendende larynx nerve viser læsioner af demyelinering. Fordelen ved anvendelse af stamceller til at demyelinated nerver er blevet påvist i forskellige dyremodeller. Formålet med undersøgelsen var at afprøve gennemførligheden og sikkerhed i en peri-neuronal injektion af autologe muskel-afledte mesenkymale stamceller til venstre tilbagevendende larynx nerve i sunde heste ved hjælp af en elektrisk nerve stimulator.
Muskel-afledte stængler celle er fremstillet af fem sunde Standardbred heste ved prøveudtagning 20 mg af muskelvæv med en semi-automatiske 14 G biopsi nål fra triceps muskel. Bevægelser i strubehovedet er overvåget via øvre luftvejs video endoskopi. Den venstre tilbagevendende larynx nerve er nærmede sig med en isoleret nerve blok nål. Nervestimulation er anvendt, startende med 2 mA, og den vellykkede bortførelse af den venstre arytenoid er overvåget. Stimulation intensiteten reduceres gradvist. Når et tab af motor respons er observeret på 0,5 mA, 107 autolog muskel-afledte stamceller celler injiceres. To eksaminatorer, der er blændet til tidspunkt, score larynx funktionen af hestene inden behandlingen og på dag 1, dag 7 og dag 28 efter indsprøjtning af celler. I en sjette hest sprøjtes 1 mL 2% lidocain for at få yderligere bekræftet den korrekte placering af nålen. Dette fører til en midlertidig lammelse af venstre arytenoid brusk.
Denne undersøgelse viser, at den tilbagevendende larynx nerve kan gribes an ved hjælp af en elektrisk nerve stimulator og at den elektrisk stimulation af nerve er godt tolereret af hestene. Ingen ændring af funktionen larynx blev observeret i nogen af hestene efter injektion af stamceller. Yderligere undersøgelser bør gennemføres for at beskrive virkningerne af en peri-neuronal injektion af autologe muskel-afledte mesenkymale stamceller til heste lider af RLN.
Introduction
RLN er en fælles patologi af de øvre luftveje på heste karakteriseret ved varierende grader af arytenoid lammelse. Den venstre side af strubehovedet er mest berørt. Forekomsten af sygdommen kan nå op til 35% i visse hest populationer. Selv om flere hypoteser forsøgte at forklare ætiologi og patogenese af denne sygdom, den nøjagtige årsag til RLN er fortsat usikker. Patologi er beskrevet som en distal axonopathy af de tilbagevendende larynx nerve med læsioner af demyelinering men også en vis grad af remyelination. Denne axonopathy fører til denervering af iboende larynx muskler og ledsagende atrofi1,2. Denne patologi er ofte langsomt fremadskridende og kan føre til et samlet tab af arytenoid bortførelse af den ramte side3.
Berørte heste udsender unormale respiratoriske lyde under træningen, og undertiden, vise motion intolerance i mere alvorlige tilfælde. Den endelige diagnose er lavet af endoskopisk undersøgelse på en ikke-bedøvet stående hest hvor en hel eller delvis tab af larynx bortførelse er observeret1,2,4. I øjeblikket er den mest almindelige behandling laryngoplasty (også kendt som "slips-tilbage"), som er undertiden forbundet med en ventriculo-cordectomy. Selvom den overordnede succesrate af disse operationer anses for at være så god til fremragende5, er postoperative komplikationer meget almindelige. Den hyppigste komplikation er en gradvis tab af bortførelse. Barnett et al. 6 rapporterede et tab af mindst én klasse af bortførelse inden for de første seks uger efter indgrebet i mindst 76% af heste. Andre komplikationer, såsom protesen fiasko, hoste og luftvejene forurening, er også rapporteret5.
Mesenchymale stamceller (msc) har været en del af equin medicin i forskning og praksis i mere end et årti, selvom bevist undersøgelser af deres effektivitet er stadig sparsomme. De to mest almindeligt udnyttede kilder til voksne mesenkymale stamceller i heste er knoglemarv og fedtvæv7. Begge stikprøver er relativt invasive og altid fører ikke til et tilstrækkeligt antal celler. For nylig, Ceusters et al. 7 beskrevet kultur af stamceller afledt af tværstribet muskelvæv, der er fremstillet ved en mindre invasiv microbiopsy teknik.
MSC'er er i stand til selvfornyelse, egenproduktion, multipotency og differentiering7,8. Deres evne til at differentiere i alle mesoderm lineages af fedt, knogle, muskler og brusk er nu veletableret9. Imidlertid kan de under særlige miljøbetingelser differentiere i ikke-mesenchymale lineages som neuroner, astrocytter og myelinating celler i det perifere nervesystem og rygmarv9,10. MSC'er har allerede været brugt i flere neuropati modeller10,11. Deres evne til at overflytte til områder af degenererede nervevæv og regenerere neurale celler er påvist efter en systemisk og lokale administration11. Derudover kan Schwann-lignende celler, der stammer fra MSCs rekrutterer makrofager at fjerne celleaffald og udskiller neurotrope faktorer cytoskeletale vækst og remyelination9.
Formålet med denne undersøgelse er at beskrive en teknik, en nerve stimulator-vejledt injektion af muskel-afledte autolog stamceller i nærheden af den venstre tilbagevendende larynx nerve i sunde heste. Typisk, en nerve stimulator tilsluttet en injektion nål bruges til electro-lokalisering af perifere nerver anvendelse af lokalanalgetika til at område12. En svag jævnstrøm impuls leveres i nærhed af nerve til at fremkalde en motor respons. Evnen til at producere denne motor svar afhænger af flere parametre, som den ledende område af nålen, enhver impedans af vævet, den nuværende anvendelse, impulslængde og afstanden fra nålen til nerven. Nerve stimulator nåle er designet til at have en meget restriktiv ledende området på spidsen af nålen, mens resten af nålen er isoleret. Dette design hjælper til præcist lokalisere nerven. Moderne nerve Stimulatorer tilpasse sig varierende væv impedances og levere den konstante strømstyrke på maskinen. Endvidere, de fleste maskiner bruger en impulslængde på 0,1 s, således at de afgørende parametre er den nuværende anvendelse og afstanden til nålen. Forholdet mellem den nål til nerve afstand og den aktuelle nødvendige for at producere en motor respons er beskrevet af Coulombs lov: E = kQ/r; hvor E er den nødvendige stimulering afgift, k er Coulombs konstant, Q er minimal kræves stimulation afgift og r er afstanden mellem de to elektroder. I elektro-lokalisering af nerver, er afstanden mellem de to elektroder anses for at være nål til nerve afstand12. Elektrisk ladning forsvinder efter reglen om det inverse kvadratet på nål til nerve afstand13. Klinisk praksis har vist at motoren nerve stimulation på 0,5 mA er stærkt korreleret til den succesfulde nerve blok og at tab af motor signal på lavere strømninger vil forhindre brugeren i administration af utilsigtet intraneuronal injektioner. Formålet med denne undersøgelse er at afprøve gennemførligheden og sikkerhed i denne teknik i et begrænset antal heste. Hvis gennemførlighed og sikkerhed i denne teknik er bekræftet, kan det nemt overføres til berørte heste. Yderligere, equin RLN kan tjene som model for perifer degenerative neuropati.
Protocol
Kommissionen for den etiske brug af dyr af universitetet i Liege godkendt undersøgelse-protokollen.
1. muskel Microbiopsy
- Identificere webstedet prøve ved besigtigelse og palpering, i den lange hoved af triceps muskel, ca midterlinjen mellem albue og skulder litra.
- Klip en zone af ca 2 x 2 cm2 med en elektrisk clipper. Anvende kirurgisk krat bestående af polyiodide flydende sæbe og alkohol komprimerer for 1 min over det klippede område. Injicere subcutant 1 mL 2% lidocain løsning med en 25 G nål midt på zonen klippede og desinficeres.
- Skrubbe hænder med antibakteriel håndsæbe. Sætte på sterile handsker. Brug en engangs sterile drapere som en steril overfladen til at placere biopsi nålen og trokar på.
- Arm halvautomatisk 14 G biopsi nålen ved at trække foråret mekanisme, som vist i tal 1b og 1 c. Frigive biopsi nål til at blive fortrolig med dens mekanisme. Placer væbnede biopsi nålen på den sterile overflade. Blive fortrolig med trokar, som består af en kanyle og en obturatoren som vist i figur 1en.
Figur 1 : Biopsi nål sæt. Biopsi nål sæt består af (en) kanylen og dens obturatoren og biopsi nål (fra top til bund). De andre paneler viser biopsi nålen i sin (b) neutral og (c) bevæbnet holdning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Forberede trokar ved at samle kanylen og obturatoren og holde dem i en låst position. Indføre trokar vinkelret på huden gennem den tidligere desensibiliserede zone. Fremme trokar til en position, hvor spidsen af trokar ca 1,5 cm dybt i musklen. Tegne trokar, adskille kanyle fra sin obturatoren, og placere obturatoren på den sterile overflade.
- Indføre væbnede biopsi nålen gennem kanylen. Indføre nålen og kanyle gennem hud indsnit i musklen. Forhånd nålen til en position, hvor spidsen af nålen i midten af den lange hoved af triceps muskel.
- Frigive biopsi nålen og træk derefter ud biopsi nålen sammen med kanylen. Trække biopsi nålen ud af kanylen. Forlade kanylen på den sterile overflade.
- Åbn biopsi nålen ved at trække foråret med den ene hånd og holde den med den anden.
Bemærk: Modellen bliver synlige på spidsen af biopsi nålen. - Med hjælp fra en anden person, åbne prøveglas, der indeholder prøve medium. Brug en 19 G kanyle til at fjerne den lille muskel stykke fra biopsi nålen. Musklen prøven anbringes på mellemlang og prøveudtagning. Luk røret med skruelåg og forsigtigt VIP det 2 x for at sikre, at prøven flydende i mediet.
- Arm biopsi nålen. Tage kanyle fra den sterile overflade og saml væbnede biopsi nål og kanyle. Indføre væbnede nålen og kanyle gennem huden snit som tidligere beskrevet. Gentag proceduren prøve 2 – 3 x indtil ca 20 mg af muskelvæv er stikprøven. Luk prøveudtagning tube. Forsigtigt slå tube 2 x at blande muskel stykker med prøveudtagning medium.
- Skibet prøverne til laboratoriet ved en konstant temperatur på mellem 4-8 ° C.
Bemærk: Laboratoriet vil derefter behandle prøven. Protokollen kan være midlertidigt her. - Proceduren er veltolereret og ømhed ved prøveudtagning side er overholdt ikke. I det usandsynlige tilfælde af muskelømhed observeret på prøvetagningsstedet, administrere passende smertestillende behandling.
2. behandling af celler
Bemærk: Den stamceller anvendes i denne undersøgelse er udarbejdet efter den metode, beskrevet af Ceusters et al. 7. deres artikel beskriver også karakterisering af cellerne.
- Start ved at forberede specifikke næringssubstratet, DF20, ved at tilføje 20% af varmen-inaktiverede føtal bovint serum, 5 mL af penicillin (1.000 IU/mL)-streptomycin (10.000 µg/mL) og 2,5 mL af amphotericin B (250 µg/mL) til en flaske på 500 mL af en kommercielt tilgængelig substratet med glutamin og phenol rød.
- Hæld 150 µL af næringssubstratet DF20 i hver af de inderste 16 wells af en 24-multi-godt parabol. Hæld 1 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) [kaliumchlorid (200 mg/L), kalium fosfat monofasiske (200 mg/L), natriumchlorid (8.000 mg/L), og kalium fosfat diphasic (2160 mg/L)] i de resterende ydre brønde.
- Skyl den lille muskel stykker 2 x i PBS. Adskille dem i meget små stykker med hjælp af en skalpel og pincet, og placere et lille stykke (på størrelse med spids skalpel vingens) i hver indre-16 godt af flere godt skålen.
- Placere multi godt skålen i en inkubator vedligeholdes på følgende betingelser: 37 ° C, 21% O2og 5% CO2. Overvåge brøndene hver dag under en inverteret mikroskop og tilsæt 50 µL af DF20 hvis det er nødvendigt at forhindre cellerne mod udtørring.
Bemærk: Efter ca 10 d, vil der være nok celler vokset fra eksplantat til at tillade stamceller isoleret. Protokollen kan være midlertidigt her. - Når en glorie af celler er synlige omkring muskel explants, skille sig eksplantat af muskelvæv. Frigør cellerne ved hjælp af 150 µL af en EDTA-holdige trypsin løsning i hver brønd: kassér næringssubstratet, skyl celler med 1 mL PBS, kassere PBS og tilføje trypsin løsning til et maksimum på 10 min ved 37 ° C. Tilføje næringssubstrat for at stoppe handlingen af trypsin, høste cellesuspension og derefter centrifugeres cellesuspension ved 200 x g i 10 min. ved 37 ° C. Supernatanten og suspendere pellet i en afbalanceret saltopløsning.
- Overføre cellesuspension på en diskontinuert tæthed farveforløb i 3 lag (15%, 25% og 35%). Centrifugeres rør indeholdende cellesuspension og diskontinuert tæthed gradient løsning på 1250 x g i 20 min. ved 25 ° C. Brug ikke bremsen i centrifugen. Observere celle fraktioner med forskellige tætheder, der vises mellem de forskellige lag af diskontinuert tæthed gradient løsning efter centrifugeringen.
- Fortsætte kultur med brøk mellem 15 og 25%. Overføre det til et rør og vaske det med en afbalanceret saltopløsning. Centrifugeres cellesuspension ved 200 x g i 10 min. ved 37 ° C. Supernatanten. Fortsætte med at suspendere pelleten i 1 mL DF20. Prefill en celle kultur kolbe, med en overflade af 25 cm2, med 6 mL af DF20. Overføre cellerne i forudfyldte celle kultur kolbe og kultur dem i en inkubator med følgende betingelser: 37° C, 21% O2og 5% CO2.
Bemærk: Protokollen kan pause her. - Overvåge cellerne hver dag under en inverteret mikroskop. Eventuelt ændre næringssubstratet (kassér den gamle medium og tilføje 6 mL af nye næringssubstratet). Bestemme det cellulære sammenløbet af observere cellelag i kultur retter, ved hjælp af en optisk mikroskop på en foruddefineret forstørrelse. Skøn overflade af fadet, der er besat af celler. Arbejde på en fast mikroskopiske forstørrelse til hver observation at evaluere sammenløbet. Når cellerne optager 85% af overfladen af fadet, gå videre med en passage af celler.
- Når cellerne er sammenflydende, frigøre dem ved hjælp af et EDTA-holdige trypsin løsning med samme protokol som beskrevet i trin 2.4. Derefter centrifugeres cellesuspension ved 200 x g i 10 min. ved 37 ° C. Supernatanten og fortsætte med ophvirvling af celler i 5 mL af DF20. Placere dem i en celle kultur kolbe af 175 cm2 udfyldes på forhånd med 25 mL af DF20. Kolben anbringes i en inkubator med følgende betingelser: 37° C, 21% O2og 5% CO2.
Bemærk: Protokollen kan pause her. - Overvåge cellerne hver dag under en inverteret mikroskop. Eventuelt ændre medium (kassér den gamle medium og der tilsættes 30 mL nyt medium). Når cellerne er sammenflydende, frigøre dem ved hjælp af trypsin-EDTA, som beskrevet i trin 2.4. Derefter centrifugeres cellesuspension ved 200 x g i 10 min. ved 37 ° C. Supernatanten og suspendere celler i 6 mL af DF20. Sted 1 mL cellesuspension i seks 175 cm2 flasker, hver udfyldes på forhånd med 25 mL af DF20, og kultur dem ved 37 ° C i en CO2 inkubator (med 21% O2 og 5% CO2).
- Overvåge cellerne hver dag under en inverteret mikroskop. Eventuelt ændre medium (kassér den gamle medium og tilsættes 30 mL nyt medium i hver kolbe). Når cellerne er sammenflydende, frigøre dem ved hjælp af trypsin-EDTA, som beskrevet i trin 2,5. Der centrifugeres dem 3 x 200 x g i 10 minutter ved 37 ° C og Fjern supernatanten ved hvert skridt.
- Tælle celler ved hjælp af en Bürker tælle kammer og et lysmikroskop. Forberede en cellulær suspension af 10 millioner celler/mL af en specifik kryopræservering medium.
- Dybfryser de terapeutiske doser af 1 x 107 celler i 1 mL af kryopræservering medium og gemme dem i vapor fase af flydende kvælstof indtil deres brug.
Bemærk: Protokollen kan pause her. - Skibet celler i hætteglas på tøris til endeligt forbrug.
3. indsprøjtning af celler
Bemærk: To personer er forpligtet til at udføre injektion af stamceller.
- Varm cellesuspension gradvis til stuetemperatur. Opsug suspensionen i en 2 mL sprøjte.
- Adstadige hesten ved at indsprøjte detomidin 10 µg/kg i halsfedt med en 19 G kanyle. Vente på 5 min at se den fulde effekt af sedation, som bliver synlig ved den karakteristiske head-down position af hesten.
- Klip en zone af 20 x 10 cm2 over venstre larynx området hest med en clipper, som vist i figur 2. Derefter, anvende en kirurgisk krat polyiodide sæbe og alkohol på det fritlagte område.
- Placer en fleksibel standard video endoskop gennem venstre næsebor af hesten og fremme det mod nasopharynx. Justere placeringen af endoskopet, indtil der opnås et fuldstændigt overblik over både arytenoid brusk og strubelåget. Hold endoskopet i denne position under proceduren og drej skærmen på den video endoskop mod erhvervsdrivende.
- Tilsluttes den nerve stimulator negative elektrode stimulation/injektion nålen. Opretholde de sterile forhold af nålen. Tilsluttes en elektrode patch, som sidder fast på område af huden, klippes den positive elektrode af nerve stimulator.
- Tilslut sprøjte indeholdende cellesuspension til linjen injektion og prefill røret for at jage luften i systemet. Husk omfanget af systemet og forberede en sprøjte med den samme mængde af steril saltvandsopløsning.
- Hvis ikke bekendt med denne teknik, skal du bruge en desinficeret 5 til 7 MHz linear ultralyd transducer for at visualisere de anatomiske strukturer i det pågældende område. Brug en steril ultralyd kobling gel til at øge billed seriøs. Visualisere strubehovedet og de fartøjer, der kører i den dorsale region i strubehovedet.
- Når bekendt med anatomi af regionen, indføre stimulation/injektion nålen mod dorsolateral aspekt af strubehovedet. Når du nærmer det dorsolateral aspekt i strubehovedet, starter nerve stimulatoren i 1 Hz stimulation tilstand med en strøm af 2 mA.
- Forsigtigt flytte nålen mod placeringen af de tilbagevendende larynx nerve under iagttagelse af endoskopisk visning på skærmen. Så snart bortførelse bevægelse af venstre arytenoid brusk er synlige på skærmen, reducere nuværende indtil bevægelsen forsvinder mens du holder nålen på plads.
- Identificere den ideelle position af nålen. Overveje et tab af motoriske svar på 0,5 mA som den ideelle afstand fra nerve. Hvornår arytenoid brusk bevægelser persist på strømninger lavere end 0,4 mA, Injicér ikke cellerne, som der kan resultere i en intraneuronal indsprøjtning.
- Når tabet af motor respons på 0,5 mA er observeret, injicere cellesuspension indeholdende 107 autolog stamceller og skylle linjen injektion med at saltvandsopløsning forberedt trin i 3.6. Dette vil tilføre resten af cellesuspension, der forblev i injektion tube.
- Efter indsprøjtning af celler, tag nålen og endoskopet.
- Lad hesten tilbagesøge sedation. Ingen yderligere behandling er nødvendig for biopsi webstedet.
Representative Results
Kommissionen for den etiske brug af dyr af universitetet i Liege godkendt undersøgelse-protokollen. Seks heste fra besætningen af forskning heste på Mont-le-Soie Equine Forskningscenter indgik i denne undersøgelse. I den første hest, blev den tilbagevendende larynx nerve lokaliseret af elektrostimulation. Figur 2 viser indstillingen bruges, med stimulation nål indsættes i den venstre dorsolateral aspekt af strubehovedet hest i nerve stimulator. Når tab af bevægelse af arytenoid brusk er observeret på 0,5 mA, 1 mL 2% lidocain sprøjtes. Dette resulterede i manglende bevægelse på højere strømme og en forbigående lammelse af venstre arytenoid. Kontrol endoskopi, 24 timer senere, afslørede en fuldstændig genopretning af funktionen arytenoid. Fuld protokollen blev med succes gentaget i fem heste. Ingen af hestene viste en negativ reaktion på muskel microbiopsy. Alle heste, var et tilstrækkeligt antal celler dyrket i den fastsatte tid. Øvre luftveje endoskopi blev udført i alle fem heste og larynx funktion snesevis af jeg eller II.1 Ifølge Robinson et al. 14 blev fastlagt. Alle heste tolereret nervestimulation af de tilbagevendende larynx nerve meget godt. Ingen bivirkninger blev observeret under eller efter stimulering eller injektion af stamceller.
Alle endoskopier blev indspillet og scoret af to blindet klinikere. Der var ingen forskel mellem det før injektion af larynx funktioner og de point, som på dag 1, 7 og 28 efter injektionen af stamceller, som testet med Wilcoxon rang analyse15. Tabel 1 er en oversigt over de larynx scores af alle heste på forskellige tidspunkter, samt tiden fra indsættelsen af nålen til injektion af stamceller og den nuværende, der fremkaldte den arytenoid bevægelse når cellerne hvor injiceres.
De celler, der har været anvendt i den foreliggende undersøgelse blev udarbejdet i henhold til en protokol offentliggjort tidligere7. Celler fra alle fraktioner var i stand til at trilineage differentiering, udtrykt CD90 og CD44, ikke gav udtryk for CD45 og MHC II og havde clonogenic kapacitet. Celler i brøken, 15 – 25% er blevet udvalgt til yderligere behandling, fordi de viste den største udtryk for de største proliferativ kapacitet og CD90.
Formålet med den foreliggende undersøgelse var ikke at teste effektiviteten af programmet stamceller til at regenerere en beskadiget perifere nerve, men kun til at afprøve gennemførligheden af proceduren og at vurdere sikkerheden af indsprøjtning af stamceller til den tilbagevendende larynx nerve i en smal l antal sunde heste. Fravær af funktionelle ændringer på det endoskopiske billeddannelse i de fem heste op til 28 dage efter injektionen og manglende kliniske tegn i fire af de fem heste op til 1 år efter injektionen bekræfter gennemførligheden og sikkerheden for proceduren. En hest måtte aflives i opfølgningsperioden grunde ikke er relateret til undersøgelsen. Selv om teknikkerne viser sig for at være sikkert i et lille antal heste, er antallet af heste i den foreliggende undersøgelse for lav til at påvise fravær af sjældne hændelser.
| Inden injektion | Tid til injektion (min) | Strøm ved injektion (mA) | Score på dag 1 post injektion | Score på dag 7 post injektion | Score på dag 28 post injektion | |
| Hest 1 (Standardbred, mare, 16 år gammel) | II.1 | 12 | 0,5 | Jeg | II.1 | II.1 |
| Hest 2 (Standardbred, mare, 22 år gammel) | Jeg | 3 | 0,7 | Jeg | Jeg | Jeg |
| Hest 3 (Standardbred, mare, 11 år gammel) | II.1 | 4 | 0,5 | II.2 | II.1 | II.1 |
| Hest 4 (Standardbred, mare, 12 år gamle) | Jeg | 7 | 0,5 | Jeg | II.1 | Jeg |
| Hest 5 (Standardbred, mare, 10 år gammel) | Jeg | 3 | 0,7 | II.1 | Jeg |
Tabel 1: Signalment og larynx fungere snesevis af hestene. Denne tabel viser tidspunktet for indsprøjtning, den laveste aktuelle provokere nogen arytenoid bevægelse før injektion, og larynx snesevis af fem sunde heste før og på dag 1, 7 og 28 efter injektion af autologe muskel-afledte mesenkymale stamceller i nærhed til den venstre tilbagevendende larynx nerve. Hest #5 var ikke tilgængelige for kontrol i dag 28 efter injektion af årsager relateret til denne undersøgelse. Scorer henvise til de scores beskrevet af Robinson et al. 14. her score jeg betyder, at bevægelser af begge arytenoid brusk var synkron og symmetrisk, og en komplet bortførelse af begge arytenoid brusk kunne opnås og vedligeholdes. Score II.1 betyder at bevægelser af den arytenoid brusk var asynchronous eller kan være asymmetrisk på bestemte tidspunkter; en komplet bortførelse af begge arytenoid brusk kunne dog opnået og vedligeholdes.
Figur 2 : Under injektion af stamceller. Nerve stimulation nålen er indført på venstre side af strubehovedet og rettet mod den venstre tilbagevendende larynx nerve. Nerve stimulator er indstillet på 0,8 mA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol beskriver den vellykkede anvendelse af muskel-afledte autolog stamceller til de tilbagevendende larynx nerverne i heste ved hjælp af en nerve stimulator-guidede tilgang. Høsten af muskel microbiopsy modellen, samt isolering, kultur og karakterisering af stamceller, er beskrevet i detaljer før, mens indsprøjtning af disse celler i nærhed til en perifer nerve er original. Electro-lokalisering af nerven med en elektrisk nerve stimulator har tjent i den nuværende undersøgelse og blev brugt til at injicere mesenkymale stamceller i direkte nærhed til den tilbagevendende larynx nerve. Den motoriske svar blev overvåget af video endoskopi gennem nasopharynx. Hvis under positionering processen med nålen, andre nerver blev stimuleret, var den tilsvarende bevægelse synlige på skærmbilledet endoskopi. En vellykket stimulering af de tilbagevendende larynx nerve var præget af den typiske bortførelse af arytenoid brusk. I en hest, var lokalbedøvelse sprøjtes for at fremkalde en forbigående lammelse af arytenoid musklen. Selv om den succesfulde implantation af celler i nærhed til nerve ikke er blevet testet specifikt i den foreliggende undersøgelse, bevist electro-lokalisering af nerven og injektion på en lav nuværende, at Stamcellerne blev anvendt i nærheden af nerven. Injectate nærhed til nerven blev finpudset af en vellykket motor blok fremkaldt af en indsprøjtning af en lokalbedøvelse.
I de resterende fem heste, tid fra den første stimulering indtil vellykket stamcelle injektion varierede fra 3 til 12 min. heste var lidt bedøvet under den procedure, der øgede deres overholdelse af elektrisk stimulation. Ingen af hestene viste bivirkninger når som helst, hvilket indikerer, at varigheden af stimulation kan forlænges hvis det er nødvendigt at få god nål positionering. En stejl indlæringskurve forventes at vaere overholdt, hvis operatøren bruger denne teknik regelmæssigt og i et større antal heste med varierende anatomi.
Heste almindeligt lider af RLN, som er karakteriseret ved varierende grader af lammelse af venstre arytenoid brusk fører til unormale respiratoriske lyde og motion intolerance. En histologi af berørte nerver afslører typiske læsioner af perifer neuropati16. Perifer neuropati er en term, der anvendes til at beskrive forskellige former for perifere nerve læsioner fører til forringet fornemmelser, bevægelser eller organfunktioner. Årsagerne er meget varierende og kan omfatte diabetes, ernæringsmæssige mangler, en behandling med bestemt medicin, en traumatisk skade, iskæmi eller en infektion, eller de kan være idiopatisk. Uafhængig af årsagen, perifere neuropatier deler fælles histopatologiske tegn, såsom Wallerian degeneration, distale axonopathy eller segmental demyelinering. Det har vist sig at administrationen af mesenkymale stamceller til beskadigede perifere nerver kan være gavnligt for deres regenerering; men de underliggende mekanismer er ikke godt forstået. Traditionelt, mener vi, at mesenkymale stamceller vil kun udvikle sig til stamfaderen til fedt, muskel, brusk og knoglevæv, men på særlige betingelser, de har vist at differentiere i myocytes17, astrocytter18 , og myelinating celler i det perifere19 og centrale nervesystem19. Under en in vitro- kultur, vil en udsættelse for neuropeptider favor differentiering af mesenkymale stamceller i celler, der udtrykker neuronal markører21,22. Flere i vivo studier har vist den gavnlige effekt af mesenkymale stamceller på nerve regenerering og en funktionel genopretning i rotte modeller af iskiasnerven skade10,23. Dette er sandsynligvis forårsaget af gunstige miljømæssige forhold, der bidrager til differentieringen af stamceller til væv-specifikke celler24. Fremtidige studier bør også undersøge denne teknik til administration af pre differentierede celler i RLN-ramte heste.
Til bedste af vores viden er dette den første rapport, der beskriver brugen af en nerve stimulator at lokalisere en perifer nerve for at injicere en særlig behandling i det. Andre perifere nerve patologier i forskellige arter, såsom neuropatiske smerter, kan behandles ved indgift af stamceller i nærhed af nerve25,26. Fremtidige studier bør afprøve effekten af denne teknik i kliniske patienter og undersøge risikoen for migration og mulighederne for differentiering af de injicerede celler.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Undersøgelsen har været finansieret af Mont-le-Soie Equine Forskningscenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
| Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
| TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
| TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG - 14090C | |
| Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
| DMEM - F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
| Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
| Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
| 24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
| Trypsin | Life technologies | 12604 | |
| HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
| NaCl | Sigma | S8776 | |
| T-25 cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
| T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
| Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |
References
- Duncan, I. D., Griffiths, I. R., Madrid, R. E. A light and electron microscopic study of the neuropathy of equine idiopathic laryngeal hemiplegia. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (6), 483-501 (1978).
- Cahill, J. I., Goulden, B. E. Equine laryngeal hemiplegia. IV. Muscle pathology. New Zealand Veterinary Journal. 34 (11), 186-190 (1986).
- Dixon, P. M., et al. Laryngeal paralysis: a study of 375 cases in a mixed-breed population of horses. Equine Veterinary Journal. 33 (5), 452-458 (2001).
- Dixon, P. M., Robinson, E., Wade, J. F. Review of the pathological changes in equine recurrent laryngeal neuropathy. Havemeyer Workshop on Equine Laryngeal Neuropathy. Havemeyer Monograph Series No. 11. , R&W Publications. Newmarket, UK. 9-11 (2003).
- Biasutti, S., Dart, A. J., Jeffcott, L. B. A review of recent developments in the clinical application of prosthetic laryngoplasty for recurrent laryngeal neuropathy: Indications, complications and outcome. Equine Veterinary Education. 29 (6), 337-345 (2016).
- Barnett, T. P., O'Leary, J. M., Parkin, T. D. H., Dixon, P. M., Barakzai, S. Z. Long-Term Maintenance of Arytenoid Cartilage Abduction and Stability During Exercise After Laryngoplasty in 33 Horses. Veterinary Surgery. 42 (3), 291-295 (2013).
- Ceusters, J., et al. From skeletal muscle to stem cells: an innovative and minimally-invasive process for multiple species. Scientific Reports. 7 (1), 696 (2017).
- Ding, D. C., Shyu, W. C., Lin, C. Z. Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 20 (1), 5-14 (2011).
- Jiang, L., Jones, S., Jia, X. Stem Cell Transplantation for Peripheral Nerve Regeneration: Current Options and Opportunities. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), 94 (2017).
- Tohill, M., Mantovani, C., Wiberg, M., Terenghi, G. Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration. Neuroscience Letters. 362 (3), 200-203 (2004).
- Ji, J. F., He, B. P., Dheen, S. T., Tay, S. S. W. Interactions of Chemokines and Chemokine Receptors Mediate the Migration of Mesenchymal Stem Cells to the Impaired Site in the Brain After Hypoglossal Nerve Injury. Stem Cells. 22 (3), 415-427 (2004).
- Urmey, W. F. Using the nerve stimulator for peripheral or plexus nerve blocks. Minerva Anesthesiologica. 72 (6), 467-471 (2006).
- De Andrés, J., Sala-Blanch, X. Peripheral nerve stimulation in the practice of brachial plexus anesthesia: a review. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 26 (5), 478 (2001).
- Robinson, N. E. Consensus statements on equine recurrent laryngeal neuropathy: conclusions of the Havemeyer Workshop. Equine Veterinary Education. 16 (6), 333-336 (2004).
- The BMJ: Rank Score Tests. , Available from: https://www.bmj.com/about-bmj/resources-readers/publications/statistics-square-one/10-rank-score-tests (2018).
- Hahn, C. N., et al. Histological and ultrastructural evidence that recurrent laryngeal neuropathy is a bilateral mononeuropathy limited to recurrent laryngeal nerves. Equine Veterinary Journal. 40 (7), 666-672 (2008).
- Orlic, D., et al. marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410 (6829), 701-705 (2001).
- Kopen, G. C., Prockop, D. J., Phinney, D. G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proceedings of the National Academy of Science. 96 (19), 10711-10716 (1999).
- Dezawa, M., Takahashi, I., Esaki, M., Takano, M., Sawada, H. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone marrow stromal cells. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1771-1776 (2001).
- Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39 (3), 229-236 (2002).
- Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. Journal of Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
- Sanchez-Ramos, J., et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Experimental Neurology. 164 (2), 247-256 (2000).
- Farzamfar, S., et al. Sciatic nerve regeneration by transplantation of menstrual blood-derived stem cells. Molecular Biology Reports. 44 (5), 407-412 (2017).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Brini, A. T., et al. Therapeutic effect of human adipose-derived stem cells and their secretome in experimental diabetic pain. Scientific Reports. 7 (1), 9904 (2017).
- Liu, W., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Stem Cells for Treating Diabetic Neuropathy in Metabolic Syndrome. Biomed Research International. 2017, 8945310 (2017).
