Summary
Здесь мы представляем протокол придать аутологичные стволовые клетки мышцы, полученных в близости к ПГН с помощью Электрические нейростимулятор. Эта технология может стать полезным для лечения лошадей периодических гортани нейропатии.
Abstract
Рецидивирующий гортани нейропатии (РЛН) часто влияет на лошадей и характеризуется аномальной дыхательных звуки и упражнения нетерпимости. ПГН показывает поражения демиелинизации. Преимущество применения стволовых клеток в demyelinated нервов было продемонстрировано в различных моделях животных. Целью исследования было протестировать возможности и безопасность Пери нейронов инъекции аутологичных мышц производные мезенхимальных стволовых клеток для левой ПГН в здоровых лошадей с использованием Электрические нейростимулятор.
Клетки мышц производные стебли получаются из пяти здоровых лошадей Standardbred выборки 20 мг мышечной ткани с полуавтоматические 14 G биопсия иглы от трехглавых мышц. Движения гортани являются контроль через верхний сократимость видео эндоскопии. Левый ПГН подошел с иглой изолированные нерва блока. Стимуляция нерва применяется, начиная с 2 мА и успешное похищение левой arytenoid контролируется. Постепенно уменьшается интенсивность стимуляции. Когда наблюдается потеря мотор ответ на 0,5 мА, 107 аутологичной мышц производные стволовые клетки вводят. Два эксперта, которые являются ослепленный к точке времени, оценка функцию гортани лошадей до лечения и в день 1, день 7 и 28 дней после инъекции клеток. В шестой лошадь 1 мл 2% лидокаин вводится для дальнейшего подтверждения правильного позиционирования иглы. Это приводит к временный паралич левой arytenoid хряща.
Это исследование доказывает, что ПГН можно подходить с помощью Электрические нейростимулятор и что электростимуляция нерва хорошо переносится лошадей. Никакая модификация гортани функции было отмечено в любом из лошадей после инъекции стволовых клеток. Дальнейшие исследования должны проводиться для описания последствий Пери нейронов инъекции аутологичных мышц производные мезенхимальных стволовых клеток для лошадей, страдает от РЛН.
Introduction
РЛН является общей патологии верхних дыхательных путей в лошадей, характеризуются различной степени arytenoid паралича. В левой части гортани чаще всего пострадавших. Распространенность этого заболевания может достигать до 35% в некоторых популяциях лошади. Хотя несколько гипотез пытался объяснить этиология и патогенез этого заболевания, точная причина РЛН остается неопределенным. Патологии характеризуется как Дистальная axonopathy ПГН с поражениями демиелинизации, но также в некоторой степени remyelination. Этот axonopathy приводит к денервации внутренних мышц гортани и сопутствующих атрофия1,2. Эта патология часто медленно прогрессирующим и может привести к полной потере arytenoid похищения3затрагиваемой Стороне.
Пострадавших лошадей излучают Аномальные звуки дыхания во время физических упражнений и, иногда, показать упражнения нетерпимости в более тяжелых случаях. Окончательный диагноз производится эндоскопическое обследование на коне-седативные стоя, где частичной или полной потере гортани похищения наблюдается1,2,4. В настоящее время наиболее распространенным лечения является laryngoplasty (также известен как «галстук back»), который иногда ассоциируется с ventriculo-cordectomy. Хотя общий показатель успеха этих операций рассматривается как хорошо отлично5, послеоперационные осложнения очень распространены. Наиболее распространенным осложнением является постепенная потеря похищения. Барнетт и др. 6 сообщили потери по крайней мере один класс похищения в течение первых шести недель после операции в по крайней мере 76% лошадей. Другие осложнения, такие как отказ протез, кашель и сократимость загрязнения, являются также сообщил5.
Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) были частью лошадиный медицины в области исследований и практики для более чем десяти лет, хотя доказано, что исследования на их эффективность по-прежнему ограничены. Два наиболее часто используемых источников взрослых мезенхимальных стволовых клеток в лошадей являются7костного мозга и жировой ткани. Обе методики выборки относительно инвазивных и не всегда приводят к достаточное количество клеток. Недавно, Ceusters и др. 7 описал культуры стволовых клеток, полученных из поперечно-полосатых мышц ткани, который получается путем менее инвазивной техники microbiopsy.
MSCs способны самообновления, самостоятельное поколение, multipotency и дифференциации7,8. Их способности различать во всех линий мезодермы жира, костей, мышц и хряща в настоящее время хорошо организованной9. Однако при определенных условиях окружающей среды, они могут дифференцироваться в не мезенхимальных линий таких нейронов, астроциты и myelinating клеток периферической нервной системы и позвоночника9,10. MSCs уже были использованы в нескольких нейропатии модели10,11. Их способности мигрируют в районы выродились нервной ткани и регенерировать нервные клетки была продемонстрирована после системные и местные администрации11. Кроме того как Шванновские клетки, полученные из MSCs можно набирать макрофагов для удаления сотовой мусора и выделяют нейротрофических факторов, содействующих аксональное роста и remyelination9.
Цель этого исследования заключается в описать технику стимулятор руководствуясь инъекций нерва мышц производные аутологичных стволовых клеток вблизи левого ПГН здоровых лошадей. Как правило нейростимулятор подключен к иглу используется для электро локализации периферических нервов для того, чтобы применить к этой области12местных анестетиков. Слабого тока ИМП ульс поставляется в близости к нерв для того чтобы побудить мотор ответ. Способность производить этот мотор ответ зависит от нескольких параметров, таких как проводящие области иглы, любое сопротивление ткани, тока применяется, длительность импульса, и расстояние от иглы на нерв. Нерва стимулятор иглы предназначены для имеют весьма ограничительным проводящая зона на кончике иглы, в то время как остальная часть иглы изолирован. Эта конструкция позволяет точно локализовать нерва. Препараты, стимулирующие нервные современные адаптироваться к разной ткани импедансов и доставить постоянного тока на машине. Кроме того, большинство машин использовать длительности импульса 0.1 сек, так что определяющими параметрами являются применяется текущий и расстояние до иглы. Отношения между расстояние иглы нерва и текущий необходимые для производства моторных ответов описывается законом кулона: E = kQ/r; E-заряд необходимые стимуляции, k — константа кулона, Q-заряд минимальный требуемый стимуляции, где r-расстояние между двумя электродами. В электро локализация нервов игла нерва расстояние12считается расстояние между двумя электродами. Электрический заряд рассеивается после правило обратной площади иглы нерва расстояние13. Клинической практике показал, что мотор нерва стимуляции на 0.5 мА очень коррелирует с успешным анестезия и что потеря мотор сигнала при более низких токов позволит пользователю от управляющей случайного инактивируемых инъекции. Цель этого исследования заключается в проверке возможности и безопасность этой техники в ограниченное количество лошадей. Если подтвердил целесообразность и безопасность этой техники, он может быть легко передана затрагиваемой лошадей. Кроме того, коневодство РЛН может служить моделью для периферической нейропатии дегенеративных.
Protocol
Комиссия для этического использования животных из Университета Льеж одобрил протокол исследования.
1. мышц Microbiopsy
- Идентифицировать образец сайта визуальный осмотр и пальпация, в длинная голова трехглавых мышц, примерно срединной линии между точкой локтя и плеча.
- Клип зоны приблизительно2 2 x 2 см с электрической машинки. Применять хирургические скраб, состоящий из полииодидов жидкого мыла и алкоголя сжимает за 1 мин через обрезанную область. Ввести подкожно 1 мл 2% раствора лидокаина с 25 G иглы в центре подстриженные и обрабатываемой зоны.
- Вымыть руки с мылом антибактериальных руку. Наденьте стерильные перчатки. Используйте одноразовые стерильные Пелерина как стерильные поверхность для размещения биопсия иглы и троакара на.
- Рукоятка полуавтоматические 14 G биопсия иглы, потянув пружинный механизм, как показано в цифры 1b и 1 c. Релиз биопсия иглы для ознакомления с его механизмом. Место вооруженных биопсия иглы на поверхности стерильные. Ознакомиться с троакара, который состоит из канюли и затвора, как показано на рисунке 1.
Рисунок 1 : Биопсия иглы набор. Биопсия иглы состоит из () канюлю и его затвора и биопсия иглы (сверху вниз). Другие панели показывают нейтральных биопсия иглы в его (b) и (c) вооруженных позиции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Подготовьте троакара, сборка канюлю и затвора и держать их в закрытом положении. Ввести троакара перпендикулярно на кожу через ранее десенсибилизированные зону. Заранее троакар в позицию, где кончик троакара находится около 1,5 см глубоко в мышцу. Вынуть троакара, отделить канюли из его затвора и место затвора на поверхности стерильные.
- Ввести вооруженные биопсия иглы через канюлю. Ввести иглу и катетер через разрез в мышцу. Заранее иглу в позицию, где кончик иглы находится в середине длинная голова трехглавых мышц.
- Отпустите биопсия иглы, а затем вытащить биопсия иглы вместе с канюли. Вытяните биопсия иглы из канюли. Оставьте канюлю на поверхности стерильные.
- Откройте биопсия иглы, потянув весной с одной стороны и удерживая его с другой.
Примечание: Образец становится видимым на кончике иглы биопсии. - С помощью второго лица Откройте образец трубки, содержащий среднего образца. Используйте 19 G подкожных игл для удаления крошечные мышцы кусок от биопсия иглы. Поместите образец мышц в среде выборки. Закройте трубку с винтовой крышкой и аккуратно наклоните его 2 x, чтобы обеспечить, что образец располагается в среде.
- Рукоятка биопсия иглы. Возьмите канюля с поверхности стерильных и соберите вооруженных биопсия иглы и канюли. Внедрить вооруженные иглы и катетер через разрез кожи как описано ранее. Повторите процедуру образца 2 – 3 x до тех пор, пока около 20 мг мышечной ткани пробы. Закройте трубку выборки. Осторожно поверните трубку 2 x смешивать части мышцы с среднего выборки.
- Корабль образцов в лабораторию при постоянной температуре 4-8 ° C.
Примечание: Лаборатория будет затем обрабатывать образца. Протокол может быть приостановлена здесь. - Процедура переносится хорошо и не наблюдается болезненность в стороне выборки. В маловероятном случае болезненность мышц наблюдается на участке отбора проб управлять соответствующим болеутоляющее лечение.
2. Лечение клеток
Примечание: Стволовые клетки, используемые в данном исследовании были подготовлены в соответствии с методом, описанным в Ceusters et al. 7. их статье также описываются характеристики клеток.
- Начните с подготовки конкретных питательной среды, DF20, добавив 20% тепла инактивированная плода бычьим сывороточным, 5 мл пенициллина (1000 МЕ/мл)-стрептомицином (10 000 мкг/мл) и 2,5 мл амфотерицин B (250 мкг/мл) бутылка 500 мл коммерчески доступных питательной среды с глютамином и фенола красного.
- Наливайте 150 мкл DF20 питательной среды в каждой из внутренней 16 скважин 24-multi ну блюдо. Налейте 1 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS) [хлорид калия (200 мг/Л), Калия фосфат монофазных (200 мг/Л), хлорид натрия (8000 мг/Л) и калия фосфат двухфазный (2160 мг/Л)] остальные внешние скважин.
- Промыть крошечные мышцы куски 2 x в PBS. Разделите их на очень мелкие кусочки с помощью скальпеля и щипцы и Поместите кусочек (размер кончика лезвия скальпеля) в каждой внутренней-16 хорошо несколькими хорошо блюдо.
- Место несколько хорошо блюдо в инкубаторе, поддерживается на следующих условиях: 37 ° C, 21% O2и 5% CO2. Контролировать каждый день под инвертированным микроскопом скважин и добавьте 50 мкл DF20, если необходимо предотвратить клетки от высыхания.
Примечание: После приблизительно 10 d, будет достаточно клетки, выросли из экспланта разрешить изоляции стволовых клеток. Протокол может быть приостановлена здесь. - Когда видна гало клеток вокруг мышц эксплантах, выбросьте экспланта мышечной ткани. Отсоединить клетки с помощью 150 мкл раствора ЭДТА содержащих трипсина в каждой скважине: отбросить питательной среды, промойте клетки с 1 мл раствора PBS, отбросить PBS и добавить раствор трипсина для максимум 10 минут при 37 ° C. Добавить питательной среды остановить действие трипсина, урожай суспензию клеток, и, затем, центрифуга суспензию клеток на 200 x g в течение 10 минут при 37 ° C. Отменить супернатант и приостановить гранулы в сбалансированного солевого раствора.
- Передача суспензию клеток на градиент разрывными плотности 3 слоев (15%, 25% и 35%). Центрифуга трубка, содержащая суспензию клеток и разрывные плотность градиента решение на 1250 x g 20 мин при 25 ° C. Не используйте тормоз центрифуги. Наблюдать за клеток фракций различной плотности, которые будут отображаться между различными слоями разрывными плотность градиентного раствора после центрифугирования.
- Продолжить культуры с долей между 15 и 25%. Передача его в трубку и промойте его сбалансированного солевого раствора. Центрифуга суспензию клеток на 200 x g в течение 10 минут при 37 ° C. Выбросите супернатант. Приступайте к приостановке гранулы в 1 мл DF20. Заполнять клетки культуры колбу, с поверхностью 25 см2, с 6 мл DF20. Перевести клетки в колбу преднаполненных клетки культуры и культуры их в инкубаторе с соблюдением следующих условий: 37° C, 21% O2и 5% CO2.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. - Контролировать каждый день под инвертированным микроскопом клетки. При необходимости измените питательной среды (отбросить старые среднего и добавить 6 мл новой питательной среды). Определите сотовой слияния, наблюдая слои клеток в культуре блюда, с помощью оптического микроскопа в предопределенный масштаб. Оцените поверхность блюдо, которое занимают клетки. Работают на фиксированной микроскопического увеличения для каждого наблюдения иметь возможность оценивать слияния. Когда клетки занимают 85% поверхности блюдо, продолжите проход клеток.
- Когда клетки вырожденная, отсоедините их с помощью решения трипсина содержащие ЭДТА с тот же протокол, как описано в шаге 2.4. Затем центрифуга суспензию клеток на 200 x g в течение 10 минут при 37 ° C. Отменить супернатант и продолжите ресуспендирования клеток в 5 мл DF20. Поместите их в колбе культуры клеток 175 см2 заполнено автоматически с 25 мл DF20. Место колбу в инкубаторе с соблюдением следующих условий: 37° C, 21% O2и 5% CO2.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. - Контролировать каждый день под инвертированным микроскопом клетки. При необходимости измените среднего (отбросить старые среднего и добавьте новое средство по 30 мл). Когда клетки вырожденная, отсоедините их с помощью трипсина ЭДТА, как описано в шаге 2.4. Затем центрифуга суспензию клеток на 200 x g в течение 10 минут при 37 ° C. Отменить супернатант и приостановить клетки в 6 мл DF20. Место 1 мл суспензии клеток в шести 175 cm2 фляги, каждый заполнено автоматически с 25 мл DF20 и их культура при 37 ° C в инкубатор CO2 (с 21% O2 и 5% CO2).
- Контролировать каждый день под инвертированным микроскопом клетки. При необходимости измените среднего (отбросить старые среднего и добавить новое средство по 30 мл в каждом колбу). Когда клетки вырожденная, отсоедините их с помощью трипсина ЭДТА, как описано в пункте 2.5. Центрифуга для них 3 x 200 x g 10 минут при 37 ° C и удалить супернатант на каждом шагу.
- Подсчет количества ячеек с помощью Bürker, считая камеры и световой микроскоп. Подготовьте сотовых подвеска 10 миллионов клеток/мл среды, конкретных криоконсервирования.
- Глубокой заморозки терапевтических дозах 1 x 107 клеток в 1 мл среды криоконсервирования и хранить их в паровой фазе жидкого азота до их использования.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. - Корабль клетки во флаконе на сухой лед для конечного использования.
3. инъекции клеток
Примечание: Два человека требуются для выполнения инъекции стволовых клеток.
- Теплый суспензию клеток постепенно до комнатной температуры. Аспирационная подвеска в шприц 2 мл.
- Степенный лошади путем инъекций Детомидина 10 мкг/кг в яремную Вену с 19 G подкожных игл. Подождите 5 минут, чтобы увидеть полный эффект седативных препаратов, который становится видимым по характерным позиции вниз головой лошади.
- Клип зоны 20 х 10 см2 над левой гортани региона лошади с клипер, как показано на рисунке 2. Затем примените хирургической скраб мыло полииодидов и алкоголя в подстриженные регион.
- Поместите гибкий стандарт видео эндоскоп через левую ноздрю лошади и выдвинуться к носоглотки. Отрегулируйте положение эндоскоп, пока не получили полное представление о arytenoid хрящей и надгортанник. Держите эндоскоп в этом положении во время процедуры и поверните экран видео эндоскоп к операторам.
- Подключите к нейростимулятор отрицательный электрод стимуляции/иглу. Поддерживать стерильной иглой. Соединить положительный электрод нейростимулятор электрода патч, который застрял в области обрезанный кожи.
- Подключите шприц, содержащего суспензию клеток к линии впрыска и заполнять трубку преследовать воздуха системы. Помните, объем системы и подготовки шприц с такой же объем стерильным физиологическим раствором.
- Если не знакомы с этой техникой, используйте преобразователь линейных УЗИ вылеченных 5-7 МГц для визуализации анатомических структур в регионе интереса. Используйте стерильные УЗИ муфты гель для повышения качества изображения. Визуализация гортани и судов, которые работают в регионе спинной гортани.
- Как только знаком с анатомией региона, ввести стимуляции/иглу к Дорсолатеральное аспект гортани. При приближении Дорсолатеральное аспект гортани, запустите нейростимулятор в стимуляции режиме 1 Гц с ток 2 мА.
- Осторожно двигаться иглы к позиции ПГН соблюдая эндоскопической представление на экране. Как только похищение движение левой arytenoid хряща виден на экране видео, уменьшите ток до тех пор, пока движение исчезает при сохранении иглы на месте.
- Определите идеальное положение иглы. Рассмотрим потеря мотор ответ на 0,5 мА как идеальное расстояние от нерва. Когда arytenoid хряща движения сохраняются на токах меньше 0,4 мА, не вводите клетки, как это может привести к инактивируемых инъекции.
- Когда потеря мотор ответ на 0,5 мА наблюдается, инъекционные суспензии клеток, содержащих 107 аутологичных стволовых клеток и промойте топливопровод солевой раствор готовят в шаге 3.6. Это будет внедрить остальные суспензии клеток, которые остались в трубки впрыска.
- После инъекции клеток выньте иглу и эндоскоп.
- Пусть лошади оправиться от седативных препаратов. Без дальнейшего лечения необходима для биопсии узла.
Representative Results
Комиссия для этического использования животных из Университета Льеж одобрил протокол исследования. В этом исследовании были включены шесть лошадей от табун лошадей исследований Мон Ле Soie Equine научно-исследовательского центра. В первый конь ПГН было локализовано по электростимуляции. На рисунке 2 показан параметр используется с иглой стимуляции, вставляется в левой Дорсолатеральное аспект гортани лошади в нейростимулятор. Когда потеря движения arytenoid хряща наблюдается при 0,5 мА, 1 мл 2% лидокаин вводится. Это привело к отсутствие движение на более высоких токах и лицевой паралич левой arytenoid. Управления эндоскопии, 24 h позже, показали полное восстановление функции arytenoid. Полный протокол был успешно повторен в пять лошадей. Ни одна из лошадей показало негативную реакцию на microbiopsy мышц. В всех лошадей достаточное количество клеток выращивали в установленное время. Эндоскопия верхних дыхательных путей была исполнена в все пять лошадей и гортани функции десятки я или II.1 согласно Робинсон и др. были определены 14 . Все лошади мириться нерва стимуляции ПГН очень хорошо. Неблагоприятные реакции не было отмечено во время или после стимуляции или инъекции стволовых клеток.
Все эндоскопии были зарегистрированы и забил два ослепленный клиницистов. Нет никакой разницы между Предварительный впрыск десятки функций гортани и баллы, полученные на день 1, 7 и 28 после инъекции стволовых клеток, как проверены Вилкоксон Ранг анализ15. В таблице 1 приведены гортани десятки всех лошадей в разное время точек, а также время от вставки иглы для инъекции стволовых клеток и ток, который спровоцировал движение arytenoid когда клетки где вводится.
Клетки, используемые в настоящем исследовании были подготовлены согласно протоколу ранее опубликованы7. Клетки из всех фракций смогли trilineage дифференциация, выразил CD90 и CD44, не выразить CD45 и MHC II и имел колониеобразования потенциала. Клетки 15 – 25% фракции были выбраны для дальнейшей обработки, потому что они показали, что наибольшее выражение CD90 и крупнейших пролиферативный потенциал.
Целью настоящего исследования было не для проверки эффективности применения стволовых клеток к регенерации поврежденных периферических нервов, но только для проверки целесообразности процедуры и оценить безопасность инъекций стволовых клеток с ПГН в Смаль l число здоровых лошадей. Отсутствие каких-либо функциональных изменений на эндоскопического изображения в пять лошадей до 28 дней после инъекции, и отсутствие каких-либо клинических признаков в четырех из пяти лошадей до 1 года после инъекции подтверждает целесообразность и безопасность процедуры. Одна лошадь пришлось быть умерщвлены в последующий период по причинам, не связанным в исследовании. Хотя методы доказать быть безопасными в небольшое количество лошадей, количество лошадей, включенных в настоящем исследовании является слишком низким для того, чтобы продемонстрировать отсутствие редких событий.
| Оценка перед инъекцией | Время впрыска (мин) | Ток в инъекции (mA) | Оценка в день 1 пост инъекций | Оценка в день 7 пост инъекций | Оценка в день 28 пост инъекций | |
| Лошадь 1 (Standardbred, Маре, 16 лет) | II.1 | 12 | 0.5 | Я | II.1 | II.1 |
| Лошадь 2 (Standardbred, Маре, 22 лет) | Я | 3 | 0,7 | Я | Я | Я |
| Лошадь 3 (Standardbred, Маре, 11 лет) | II.1 | 4 | 0.5 | II.2 | II.1 | II.1 |
| Лошадь 4 (Standardbred, Маре, 12 лет) | Я | 7 | 0.5 | Я | II.1 | Я |
| Лошадь 5 (Standardbred, Маре, 10 лет) | Я | 3 | 0,7 | II.1 | Я |
Таблица 1: Signalment и гортани функционируют десятки лошадей. Эта таблица показывает время инъекции, низкий ток, провоцируя любой arytenoid движение до инъекции и гортани десятки пяти здоровых лошадей до и в день 1, 7 и 28 после инъекции аутологичных мышц производные мезенхимальных стволовых клеток в близость к левого возвратного нерва гортани. Лошадь #5 не была доступна для элемента управления в день 28 после инъекции по причинам не связанным с этим исследованием. Результаты относятся к оценки, описанные в Robinson et al. 14. здесь, оценка я означает, что движения как arytenoid хрящи были синхронных и симметрично, и полный похищение обоих arytenoid хрящей можно получить и поддерживать. Оценка II.1 означает, что движения arytenoid хрящи были асинхронные или может быть асимметричной в определенное время; Однако полный похищение обоих arytenoid хрящей можно получить и поддерживать.
Рисунок 2 : Установка во время инъекции стволовых клеток. Нерва стимуляции игла вводится на левой стороне гортани и направлены на левой ПГН. Нейростимулятор устанавливается на 0,8 мА. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Этот протокол описывает успешное применение мышц производные аутологичных стволовых клеток для периодических гортани нервы в лошадей, используя подход стимулятор руководствуясь нерва. Урожай образца microbiopsy мышц, а также изоляции, культуры и характеристике стволовых клеток, были описаны в деталях, в то время как инъекции этих клеток в близости к периферического нерва является оригинальным. Электро локализация нерва с Электрические нейростимулятор служил для настоящего исследования и был использован для введения мезенхимальных стволовых клеток в непосредственной близости от ПГН. Мотор ответ контролируется видео эндоскопии через носоглотки. Если, в процессе позиционирования иглы, были стимулировали другие нервы, соответствующее движение был виден на экране эндоскопии. Успешное стимулирование ПГН характеризовался типичный похищение arytenoid хряща. В одной лошади местной анестезии вводили навести временный паралич arytenoid мышцы. Хотя конкретно в настоящем исследовании не тестировалась успешной имплантации клеток в близости к нерва, электро локализация нерва и инъекций на низкий ток доказал, что стволовые клетки были применены вблизи нерва. Близость injectate нерва далее была продемонстрирована успешно моторный блок, индуцированных инъекции под местной анестезией.
В оставшиеся пять лошадей время от первого стимуляции до успешного стволовых клеток инъекции варьировало от 3 до 12 мин лошадей были слегка под наркозом во время процедуры, который увеличил их соответствие электрической стимуляции. Ни одна из лошадей показали неблагоприятных реакций в любое время, показывая, что длительность стимуляции может быть продлен при необходимости получить хорошую иглу позиционирования. Крутой кривой обучения, как ожидается, будет наблюдаться, если оператор использует эту технику регулярно и в большее количество лошадей с различной анатомии.
Лошадей часто страдают от РЛН, который характеризуется различной степени паралича левой arytenoid хряща, ведущих к Аномальные звуки дыхания и проявлять нетерпимость. Гистология пострадавших нервов показывает типичные поражения периферической нейропатии16. Периферическая невропатия является термин используется для описания различных типов поражения периферических нервов, ведущих к нарушение ощущений, движений или функции органа. Причины, крайне непостоянны и может включать в себя диабета, питательных, обращения с конкретными препаратами, травмы, ишемии или инфекции, или они могут быть идиопатическим. Независимо от причины, периферические нейропатии разделяют общие гистопатологические признаки, Валлерова дегенерация, дистальная axonopathy или сегментарная демиелинизации. Было показано, что администрация мезенхимальных стволовых клеток для повреждения периферических нервов может быть полезным для их регенерации; Однако не хорошо известны основные механизмы. Традиционно мы считаем, что мезенхимальные стволовые клетки только будут дифференцироваться в прародителями жировой, мышечной, хрящевой и костной ткани, но при определенных условиях, они показали дифференцироваться в миоциты17, астроциты18 и myelinating клеток периферической19 и19центральной нервной системы. Во время в vitro культуры подверженности Нейропептиды будет способствовать дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток в клетки, выражая маркеров нейрональных21,22. Несколько в vivo исследования показали благотворное влияние мезенхимальных стволовых клеток на регенерацию нерва и функциональное восстановление в модели крыса седалищный нерв травмы10,23. Вероятно, это вызвано благоприятных экологических условий, которые способствуют Дифференцировка стволовых клеток в клетки ткани конкретных24. Будущие исследования также должны расследовать эту технику для отправления предварительно дифференцированных клеток в пострадавших от РЛН лошадей.
Насколько нам известно это первый доклад, который описывает использование нейростимулятор для локализации периферического нерва для того, чтобы придать специального лечения в нее. Другие патологии периферического нерва в различных видов, таких как невропатической боли, можно лечить с помощью администрации стволовых клеток в близости от нервных25,26. Будущие исследования должны проверить действие этой техники в клинических больных и расследования риска миграции и потенциал дифференцировки клеток вводили.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование финансируется Мон Ле Soie Equine научно-исследовательский центр.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
| Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
| TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
| TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG - 14090C | |
| Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
| DMEM - F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
| Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
| Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
| 24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
| Trypsin | Life technologies | 12604 | |
| HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
| NaCl | Sigma | S8776 | |
| T-25 cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
| T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
| Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |
References
- Duncan, I. D., Griffiths, I. R., Madrid, R. E. A light and electron microscopic study of the neuropathy of equine idiopathic laryngeal hemiplegia. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (6), 483-501 (1978).
- Cahill, J. I., Goulden, B. E. Equine laryngeal hemiplegia. IV. Muscle pathology. New Zealand Veterinary Journal. 34 (11), 186-190 (1986).
- Dixon, P. M., et al. Laryngeal paralysis: a study of 375 cases in a mixed-breed population of horses. Equine Veterinary Journal. 33 (5), 452-458 (2001).
- Dixon, P. M., Robinson, E., Wade, J. F. Review of the pathological changes in equine recurrent laryngeal neuropathy. Havemeyer Workshop on Equine Laryngeal Neuropathy. Havemeyer Monograph Series No. 11. , R&W Publications. Newmarket, UK. 9-11 (2003).
- Biasutti, S., Dart, A. J., Jeffcott, L. B. A review of recent developments in the clinical application of prosthetic laryngoplasty for recurrent laryngeal neuropathy: Indications, complications and outcome. Equine Veterinary Education. 29 (6), 337-345 (2016).
- Barnett, T. P., O'Leary, J. M., Parkin, T. D. H., Dixon, P. M., Barakzai, S. Z. Long-Term Maintenance of Arytenoid Cartilage Abduction and Stability During Exercise After Laryngoplasty in 33 Horses. Veterinary Surgery. 42 (3), 291-295 (2013).
- Ceusters, J., et al. From skeletal muscle to stem cells: an innovative and minimally-invasive process for multiple species. Scientific Reports. 7 (1), 696 (2017).
- Ding, D. C., Shyu, W. C., Lin, C. Z. Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 20 (1), 5-14 (2011).
- Jiang, L., Jones, S., Jia, X. Stem Cell Transplantation for Peripheral Nerve Regeneration: Current Options and Opportunities. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), 94 (2017).
- Tohill, M., Mantovani, C., Wiberg, M., Terenghi, G. Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration. Neuroscience Letters. 362 (3), 200-203 (2004).
- Ji, J. F., He, B. P., Dheen, S. T., Tay, S. S. W. Interactions of Chemokines and Chemokine Receptors Mediate the Migration of Mesenchymal Stem Cells to the Impaired Site in the Brain After Hypoglossal Nerve Injury. Stem Cells. 22 (3), 415-427 (2004).
- Urmey, W. F. Using the nerve stimulator for peripheral or plexus nerve blocks. Minerva Anesthesiologica. 72 (6), 467-471 (2006).
- De Andrés, J., Sala-Blanch, X. Peripheral nerve stimulation in the practice of brachial plexus anesthesia: a review. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 26 (5), 478 (2001).
- Robinson, N. E. Consensus statements on equine recurrent laryngeal neuropathy: conclusions of the Havemeyer Workshop. Equine Veterinary Education. 16 (6), 333-336 (2004).
- The BMJ: Rank Score Tests. , Available from: https://www.bmj.com/about-bmj/resources-readers/publications/statistics-square-one/10-rank-score-tests (2018).
- Hahn, C. N., et al. Histological and ultrastructural evidence that recurrent laryngeal neuropathy is a bilateral mononeuropathy limited to recurrent laryngeal nerves. Equine Veterinary Journal. 40 (7), 666-672 (2008).
- Orlic, D., et al. marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410 (6829), 701-705 (2001).
- Kopen, G. C., Prockop, D. J., Phinney, D. G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proceedings of the National Academy of Science. 96 (19), 10711-10716 (1999).
- Dezawa, M., Takahashi, I., Esaki, M., Takano, M., Sawada, H. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone marrow stromal cells. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1771-1776 (2001).
- Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39 (3), 229-236 (2002).
- Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. Journal of Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
- Sanchez-Ramos, J., et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Experimental Neurology. 164 (2), 247-256 (2000).
- Farzamfar, S., et al. Sciatic nerve regeneration by transplantation of menstrual blood-derived stem cells. Molecular Biology Reports. 44 (5), 407-412 (2017).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Brini, A. T., et al. Therapeutic effect of human adipose-derived stem cells and their secretome in experimental diabetic pain. Scientific Reports. 7 (1), 9904 (2017).
- Liu, W., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Stem Cells for Treating Diabetic Neuropathy in Metabolic Syndrome. Biomed Research International. 2017, 8945310 (2017).
