Summary
Qui, presentiamo un protocollo per iniettare le cellule staminali autologhe muscolo-derivate nella prossimità al nervo laringeo ricorrente con l'aiuto di uno stimolatore elettrico del nervo. Questa nuova tecnica potrebbe rivelarsi utile per il trattamento della neuropatia laringea ricorrente equina.
Abstract
Neuropatia laringea ricorrente (RLN) comunemente colpisce cavalli ed è caratterizzata dall'intolleranza di suoni ed esercizio respiratorio anormale. Il nervo laringeo ricorrente Mostra lesioni del demyelination. Il beneficio dell'applicazione di cellule staminali a demyelinated nervi è stato dimostrato in vari modelli animali. Lo scopo dello studio era di verificare la fattibilità e la sicurezza di un'iniezione di peri-di un neurone del muscolo-derivate cellule mesenchimali autologhe per il nervo laringeo ricorrente di sinistra in cavalli sani utilizzando uno stimolatore elettrico del nervo.
Cellula di muscolo-derivate steli sono ottenuti da cinque cavalli trottatori sani mediante un campione di 20 mg di tessuto muscolare con un ago di biopsia 14 G semi-automatica dal muscolo del triceps. Movimenti della laringe sono monitorati tramite della superiore-via aerea dei video endoscopia. Il nervo laringeo ricorrente di sinistro si avvicina con un ago isolato blocco del nervo. Stimolazione del nervo viene applicata, a partire da 2 mA e il rapimento di successo di sinistra arytenoid è monitorato. L'intensità di stimolazione è ridotta progressivamente. Quando si osserva una perdita di risposta motoria a 0.5 mA, 107 autologo muscolo-derivate staminali cellule vengono iniettate. Due esaminatori, che sono accecati fino al punto di tempo, Punteggio ottenuto la funzione laringea dei cavalli prima del trattamento e al giorno 1 e giorno 7 giorno 28 dopo l'iniezione delle cellule. In un sesto cavallo, 1 mL di lidocaina 2% viene iniettato ad ulteriore conferma il corretto posizionamento dell'ago. Questo porta ad una paralisi temporanea della cartilagine arytenoid sinistra.
Questo studio dimostra che il nervo laringeo ricorrente può essere affrontato con l'aiuto di uno stimolatore elettrico del nervo e che la stimolazione elettrica del nervo è ben tollerato dai cavalli. Nessuna modifica della funzione laringea è stata osservata in uno qualsiasi dei cavalli dopo l'iniezione delle cellule staminali. Ulteriori studi dovrebbero essere condotti per descrivere gli effetti di un'iniezione di peri-di un neurone del muscolo-derivate cellule mesenchimali autologhe ai cavalli affetti da RLN.
Introduction
RLN è una patologia comune delle vie respiratorie nei cavalli caratterizzati da diversi gradi di paralisi aritenoideo superiore. Il lato sinistro della laringe è più comunemente colpito. La prevalenza della malattia può raggiungere fino al 35% in alcune popolazioni di cavallo. Anche se parecchie ipotesi tentato di spiegare l'eziologia e la patogenesi di questa malattia, la causa esatta di RLN rimane incerta. La patologia è descritto come un axonopathy distale del nervo laringeo ricorrente con le lesioni di demielinizzazione, ma anche un certo grado di remyelination. Questo axonopathy conduce alla denervazione dei muscoli laringei intrinsechi e concomitante atrofia1,2. Questa patologia è spesso lentamente progressiva e può portare a una perdita totale del arytenoid rapimento del lato colpito3.
I cavalli colpiti emettono suoni respiratori anomali durante l'esercizio fisico e, talvolta, mostrano intolleranza all'esercizio fisico nei casi più gravi. La diagnosi definitiva è fatta da esame endoscopico su un cavallo non sedato in piedi dove una perdita parziale o totale di abduction laringeo è osservata1,2,4. Attualmente, il trattamento più comune è laryngoplasty (noto anche come "tie-back"), che a volte è associato con un ventriculo-cordectomy. Anche se il tasso di successo globale di questi interventi è considerato buono a eccellente5, complicanze post-operatorie sono molto comuni. La complicazione più comune è una perdita graduale di abduction. Barnett et al. 6 ha riportato una perdita di almeno un grado di abduzione entro le prime sei settimane dopo l'intervento in almeno il 76% dei cavalli. Altre complicazioni, quali insufficienza protesica, tosse e contaminazione delle vie aeree, sono anche segnalati5.
Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono stati una parte della medicina equina nella ricerca e nella pratica per più di un decennio, anche se dimostrato gli studi sulla loro efficienza sono ancora scarsi. Le due più comunemente sfruttate fonti di cellule staminali mesenchimali adulte nei cavalli sono del midollo osseo e del tessuto adiposo7. Entrambe le tecniche di campionamento sono relativamente invasive e non sempre portano a un numero sufficiente di cellule. Recentemente, Ceusters et al. 7 descritto la cultura delle cellule staminali derivate dal tessuto del muscolo striato, che si ottiene da una tecnica meno invasiva di microbiopsy.
MSCs sono capaci di auto-rinnovamento, auto-generazione, multipotenza e differenziazione7,8. Loro capacità di differenziarsi in tutti i lignaggi di mesoderma del grasso, muscolo, osso e la cartilagine è ora ben consolidata9. Tuttavia, in determinate condizioni ambientali, possono differenziare in linee cellulari non-mesenchimale quali neuroni, astrociti e myelinating cellule del sistema nervoso periferico e il midollo spinale9,10. MSCs sono già stati utilizzati in parecchi neuropatia modelli10,11. Loro capacità di migrare in aree del tessuto nervoso degenerato e a rigenerare le cellule neurali è stata dimostrata dopo una somministrazione sistemica e locale11. Inoltre, le cellule di Schwann-come derivate da MSCs possono reclutare macrofagi per rimuovere i detriti cellulari e secernere fattori neurotrofici promuovendo la crescita assonale e remyelination9.
Lo scopo di questo studio è di descrivere la tecnica di un'iniezione di stimolatore-Guida di nervo del muscolo-derivate le cellule staminali autologhe vicino il nervo laringeo ricorrente di sinistra in cavalli sani. In genere, uno stimolatore del nervo collegato ad un ago per iniezione viene utilizzato per la electro-localizzazione dei nervi periferici al fine di applicare anestetici locali a quello di zona12. Un impulso di corrente debole è fornito in prossimità del nervo per indurre una risposta motoria. La capacità di produrre questa risposta motoria dipende da diversi parametri, quali l'area conduttiva dell'ago, qualsiasi impedenza del tessuto, la corrente applicata, la durata dell'impulso e la distanza tra l'ago e il nervo. Aghi di stimolatore del nervo sono progettati per avere una zona conduttiva molto restrittiva sulla punta dell'ago, mentre il resto dell'ago è isolato. Questo design consente di localizzare con precisione il nervo. Gli stimolatori del nervo moderna adattano a diverse impedenze di tessuto e consegnare l'amperaggio costante impostato sulla macchina. Inoltre, la maggior parte delle macchine utilizzano una durata dell'impulso di 0,1 s, affinché i parametri determinanti sono la corrente e la distanza rispetto all'ago. La relazione tra la distanza dell'ago-nervo e la corrente necessaria per produrre una risposta motoria è descritta dalla legge di Coulomb: E = kQ/r; dove E è la carica necessaria stimolazione, k è la costante di Coulomb, Q è la carica minima stimolazione necessaria e r è la distanza tra i due elettrodi. La electro-localizzazione dei nervi, la distanza tra i due elettrodi è considerata la distanza dell'ago nervo12. Carica elettrica dissipa seguendo la regola del quadrato inverso della distanza dell'ago nervo13. Pratica clinica ha dimostrato che il motore del nervo stimolazione a 0,5 mA è altamente correlata al blocco del nervo successo e che una perdita di segnale motore a correnti inferiori impedirà all'utente di amministrare le iniezioni intraneuronale accidentale. Lo scopo di questo studio è quello di testare la fattibilità e la sicurezza di questa tecnica in un numero limitato di cavalli. Se si confermano la fattibilità e la sicurezza di questa tecnica, possono essere facilmente trasferito a cavalli colpiti. Più ulteriormente, equina RLN può servire come modello per neuropatia degenerativa.
Protocol
La Commissione per l'uso etico di animali dell'Università di Liegi ha approvato il protocollo di studio.
1. muscolo Microbiopsy
- Identificare il sito di esempio di ispezione visiva e palpazione, nel capo lungo del muscolo del triceps, circa sulla linea mediana tra il punto del gomito e il punto della spalla.
- Clip di una zona di circa 2 x 2 cm2 con una tosatrice elettrica. Applicare scrub chirurgico consistente di sapone liquido polyiodide e alcool comprime per 1 min sopra l'area ritagliata. Iniettare per via sottocutanea 1 mL di soluzione di lidocaina 2% con un ago 25 G al centro della zona ritagliata e disinfettata.
- Strofinare le mani con sapone antibatterico per le mani. Indossare guanti sterili. Utilizzare un telino sterile monouso come superficie sterile per inserire l'ago per biopsia e il trocar.
- L'ago di biopsia di 14 G semi-automatico del braccio tirando il meccanismo a molla, come mostrato nelle figure 1b e 1C. L'ago di biopsia per familiarizzare con il suo meccanismo di rilascio. Inserire l'ago biopsia armati nell'area sterile. Familiarizzare con il trocar, che consiste di una cannula e un otturatore come mostrato in Figura 1un.
Figura 1 : Il set di aghi di biopsia. Il set di aghi di biopsia consiste di (un) la cannula e l'otturatore e la biopsia dell'ago (dall'alto in basso). Gli altri pannelli mostrano l'ago biopsia nel suo (b) neutro e (c) armati di posizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Preparare il trocar assemblando l'otturatore e la cannula e tenerli in posizione di blocco. Introdurre il trocar perpendicolarmente alla pelle attraverso la zona precedentemente desensibilizzata. Far avanzare il trocar una posizione dove la punta del trocar è di circa 1,5 cm di profondità nel muscolo. Estrarre il trocar, dissociare la cannula dal suo obturator e posizionare l'otturatore sulla superficie sterile.
- Introdurre l'ago biopsia armati attraverso la cannula. Introdurre l'ago e la cannula attraverso l'incisione cutanea nel muscolo. Avanzare l'ago ad una posizione dove la punta dell'ago è nel mezzo del capo lungo del muscolo del triceps.
- Rimuovere l'ago di biopsia e quindi estrarre l'ago biopsia insieme con la cannula. Estrarre l'ago biopsia fuori dalla cannula. Lasciare la cannula sulla superficie sterile.
- Aprire l'ago biopsia tirando la molla con una mano e tenendolo con l'altra.
Nota: L'esemplare diventa visibile sulla punta dell'ago. - Con l'aiuto di una seconda persona, aprire la provetta contenente il campione di terreno. Utilizzare un ago ipodermico 19G per rimuovere il pezzo di muscolo minuscolo dall'ago biopsia. Posizionare il campione di muscolo nel mezzo di campionamento. Chiudere la provetta con il tappo a vite e inclinarlo delicatamente 2x per garantire che il campione è fluttuante nel mezzo.
- Braccio l'ago biopsia. Prendere la cannula dalla superficie sterile e rimontare l'ago per biopsia armati e la cannula. Introdurre l'ago armato e la cannula attraverso l'incisione cutanea come descritto in precedenza. Ripetere la procedura di esempio 2 – 3 x fino a circa 20 mg di tessuto muscolare viene campionata. Chiudere il tubo di campionamento. Ruotare delicatamente il tubo 2 x mescolare i pezzi di muscolo con il mezzo di campionamento.
- Spedire i campioni al laboratorio a temperatura costante tra 4-8 ° C.
Nota: È possibile che il laboratorio elaborerà quindi il campione. Il protocollo può essere messo in pausa qui. - La procedura è ben tollerata e dolore al lato di campionamento non è osservata. Nel caso improbabile di indolenzimento muscolare osservato presso il sito di campionamento, amministrare trattamento analgesico appropriato.
2. il trattamento delle cellule
Nota: Le cellule staminali utilizzate in questo studio sono state preparate secondo il metodo descritto da Ceusters et al. 7. loro articolo descrive anche la caratterizzazione delle cellule.
- Iniziare preparando il terreno di coltura specifico, DF20, aggiungendo un 20% di calore-inattivati di siero bovino fetale, 5 mL di penicillina (1.000 UI/mL)-streptomicina (10.000 µ g/mL) e 2,5 mL di amfotericina B (250 µ g/mL) per una bottiglia di 500 mL di un commercialmente disponibili terreno di coltura con glutammina e rosso fenolo.
- Versare 150 µ l di terreno di coltura DF20 in ciascuno dei 16 pozzetti interni di un 24-multi-pozzetto. Versare 1 mL di tampone fosfato salino (PBS) [cloruro di potassio (200 mg/L), potassio fosfato monobasico (200 mg/L), cloruro di sodio (8.000 mg/L) e fosfato di potassio difasico (2.160 mg/L)] nei restanti pozzetti esterni.
- Sciacquare il muscolo piccolo pezzi 2x in PBS. Separarli in pezzi molto piccoli con l'aiuto di un bisturi e pinze e mettere un piccolo pezzo (della dimensione della punta della lama bisturi) in ogni interno-16 bene del piatto multi-pozzetto.
- Posizionare il piatto multi-pozzetto in un incubatore mantenuto alle seguenti condizioni: 37 ° C, 21% O2e 5% CO2. Monitorare i pozzetti ogni giorno sotto un microscopio invertito e aggiungere 50 µ l di DF20 se necessario impedire le celle di essiccazione.
Nota: Dopo circa 10 d, non ci sarà abbastanza cellule sviluppate da explant per consentire l'isolamento di cellule staminali. Il protocollo può essere messo in pausa qui. - Quando un alone di cellule è visibile intorno al muscolo espianti, scartare l'espianto del tessuto muscolare. Scollegare le cellule utilizzando 150 µ l di una soluzione di tripsina EDTA-contenenti in ciascun pozzetto: scartare il terreno di coltura, risciacquare le cellule con 1 mL di PBS, scartare il PBS e aggiungere la soluzione di tripsina per un massimo di 10 min a 37 ° C. Aggiungere il terreno di coltura per fermare l'azione della tripsina, raccogliere la sospensione cellulare e, quindi, centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 10 min a 37 ° C. Scartare il surnatante e sospendere il pellet in una soluzione salina bilanciata.
- Trasferire la sospensione cellulare su una pendenza di densità discontinua di 3 strati (15%, 25% e 35%). Centrifugare la provetta contenente la sospensione cellulare e la soluzione di gradienti di densità discontinua a 1.250 x g per 20 minuti a 25 ° C. Non utilizzare il freno della centrifuga. Osservare le frazioni di cellule differenziate che apparirà tra i diversi strati della soluzione gradiente discontinuo densità dopo la centrifugazione.
- Continuare la cultura con la frazione tra 15 e 25%. Trasferirlo in una provetta e lavare con la soluzione salina bilanciata. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 10 min a 37 ° C. Scartare il surnatante. Procedere con la sospensione il pellet in 1 mL di DF20. Prefill un matraccio di cultura cellulare, con una superficie di 25 cm2, con 6 mL di DF20. Trasferire le cellule nel matraccio di cultura cellulare preriempita e cultura li in un'incubatrice con le seguenti condizioni: 37° C, 21% O2e 5% CO2.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. - Monitorare le cellule ogni giorno sotto un microscopio invertito. Se necessario, modificare il terreno di coltura (scartare il vecchio mezzo e aggiungere 6 mL di terreno di coltura nuovo). Determinare la confluenza cellulare osservando gli strati di cellule in piastre di coltura, utilizzando un microscopio ottico con un ingrandimento predefinito. Stimare la superficie del piatto che è occupato dalle cellule. Lavorare a un ingrandimento al microscopio fisso per ogni osservazione essere in grado di valutare la confluenza. Quando le cellule occupano l'85% della superficie del piatto, procedere con un passaggio delle cellule.
- Quando le cellule sono confluenti, disconnetterli utilizzando una soluzione di tripsina EDTA-contenenti con lo stesso protocollo, come descritto al punto 2.4. Poi, centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 10 min a 37 ° C. Scartare il surnatante e procedere con la risospensione delle cellule in 5 mL di DF20. Metterli in un matraccio di cultura cellulare di 175 cm2 preriempiti con 25 mL di DF20. Collocare la beuta in un incubatore con le seguenti condizioni: 37° C, 21% O2e 5% CO2.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. - Monitorare le cellule ogni giorno sotto un microscopio invertito. Se necessario, modificare il mezzo (scartare il vecchio mezzo e aggiungere 30 mL di terreno nuovo). Quando le cellule sono confluenti, disconnetterli utilizzando tripsina-EDTA come descritto al punto 2.4. Poi, centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 10 min a 37 ° C. Scartare il surnatante e sospendere le cellule in 6 mL di DF20. Posizionare 1 mL della sospensione delle cellule in sei-175cm2 palloni, ciascuno preriempiti con 25 mL di DF20 e li della coltura a 37 ° C in un incubatore a CO2 (con 21% O2 e 5% CO2).
- Monitorare le cellule ogni giorno sotto un microscopio invertito. Se necessario, modificare il mezzo (scartare il vecchio mezzo e aggiungere 30 mL di terreno nuovo in ciascuna beuta). Quando le cellule sono confluenti, disconnetterli utilizzando tripsina-EDTA come descritto al punto 2.5. Centrifugare le loro 3 x a 200 x g per 10 min a 37 ° C e scartare il supernatante a ogni passo.
- Contare le celle con l'aiuto di un Bürker contando camera e un microscopio ottico. Preparare una sospensione cellulare di 10 milioni di cellule/mL di un mezzo specifico di crioconservazione.
- Le dosi terapeutiche di 1 x 107 cellule in 1 mL di terreno di crioconservazione di congelamento e memorizzarli in fase vapore di azoto liquido fino al loro utilizzo.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. - Le cellule nel flacone il ghiaccio secco per uso finale della nave.
3. iniezione delle cellule
Nota: Sono necessarie due persone per eseguire l'iniezione delle cellule staminali.
- Riscaldare la sospensione cellulare progressivamente a temperatura ambiente. Aspirare la sospensione in una siringa da 2 mL.
- Sedare il cavallo iniettando detomidina 10 µ g/kg nella vena giugulare con un ago ipodermico 19G. Attendere 5 minuti vedere l'effetto completo della sedazione, che diventa visibile la caratteristica posizione a testa in giù del cavallo.
- Clip di una zona di 20 x 10 cm2 sopra la regione laringea sinistra del cavallo con un clipper, come mostrato nella Figura 2. Quindi, applicare un scrub chirurgico di alcol e sapone di polyiodide nella regione ritagliato.
- Inserire un video endoscopio flessibile standard attraverso la narice sinistra del cavallo e farlo avanzare verso la rinofaringe. Regolare la posizione dell'endoscopio fino ad ottenuta una vista completa di cartilagini arytenoid e l'epiglottide. Tenere l'endoscopio in questa posizione durante la procedura e girate lo schermo dell'endoscopio video verso gli operatori.
- Collegare l'ago di stimolazione/iniezione per elettrodo negativo dello stimolatore del nervo. Mantenere le condizioni di sterilità dell'ago. Collegare l'elettrodo positivo dello stimolatore del nervo di un patch di elettrodo, che è bloccato per la zona di pelle ritagliata.
- Collegare la siringa contenente la sospensione di cellule per la linea di iniezione e riempire il tubo per inseguire l'aria del sistema. Ricordate il volume del sistema e preparare una siringa con lo stesso volume di soluzione salina sterile.
- Se non hanno familiarità con questa tecnica, è possibile utilizzare un trasduttore lineare di ultrasuono di 5 a 7 MHz disinfettati per visualizzare le strutture anatomiche della regione di interesse. Utilizzare un ultrasuono sterile gel di accoppiamento per aumentare la qualità dell'immagine. Visualizzare la laringe ed i vasi che esegue nella regione dorsale della laringe.
- Una volta che hanno familiarità con l'anatomia della regione, introdurre l'ago di stimolazione/iniezione verso l'aspetto dorsolateral della laringe. Quando si avvicina l'aspetto dorsolateral della laringe, avviare lo stimolatore del nervo nella modalità di stimolazione di 1 Hz con una corrente di 2 mA.
- Spostare delicatamente l'ago verso la posizione del nervo laringeo ricorrente osservando la visualizzazione endoscopica sullo schermo. Appena il movimento di abduzione della cartilagine arytenoid sinistro è visibile sullo schermo video, ridurre la corrente fino a quando scomparirà il movimento mantenendo l'ago in posizione.
- Identificare la posizione ideale dell'ago. Considerare una perdita di risposta motoria a 0.5 mA come la distanza ideale dal nervo. Quando i movimenti di cartilagine arytenoid persistono a correnti inferiori a 0,4 mA, non iniettare le cellule, che possono causare un'iniezione intraneuronale.
- Quando la perdita di risposta motoria a 0,5 mA è osservata, iniettare la sospensione cellulare contenente 107 di cellule staminali autologhe e la linea di iniezione a filo con la soluzione salina preparata nel passaggio 3.6. Questo inietterà il resto della sospensione delle cellule che è rimasto nel tubo di iniezione.
- Dopo l'iniezione delle cellule, estrarre l'ago e l'endoscopio.
- Lasciato il cavallo a riprendersi la sedazione. Nessun ulteriore trattamento è necessaria per il sito di biopsia.
Representative Results
La Commissione per l'uso etico di animali dell'Università di Liegi ha approvato il protocollo di studio. Sei cavalli dal branco dei cavalli di ricerca presso il centro di ricerca equina di Mont-le-Soie sono stati inclusi in questo studio. Nel primo cavallo, il nervo laringeo ricorrente è stato localizzato da elettrostimolazione. La figura 2 Mostra l'impostazione utilizzata, con l'ago di stimolazione inserito nella funzione dorsolateral di sinistra della laringe del cavallo nello stimolatore del nervo. Quando la perdita di movimento della cartilagine arytenoid è osservata a 0.5 mA, 1 mL di lidocaina 2% viene iniettata. Ciò ha provocato un'assenza di movimento alle correnti più elevate e una paralisi transitoria del arytenoid sinistra. L'endoscopia di controllo, 24 ore più tardi, ha rivelato un recupero completo della funzione aritenoideo. Il protocollo completo è stato ripetuto con successo in cinque cavalli. Nessuno dei cavalli hanno mostrato una reazione negativa per la microbiopsy muscolare. In tutti i cavalli, un numero sufficiente di cellule sono stato coltivato nel tempo stabilito. L'endoscopia delle vie respiratorie superiore è stato effettuato in tutti i cinque cavalli e i punteggi di funzione laringea di I o II. 1 secondo Robinson et al. 14 sono stati determinati. Tutti i cavalli tollerato la stimolazione del nervo del nervo laringeo ricorrente molto bene. Nessuna reazione avversa è stata osservata durante o dopo la stimolazione o l'iniezione delle cellule staminali.
Tutte le endoscopie sono state registrate e segnate da due medici accecati. Non c'era alcuna differenza tra i punteggi di pre-iniezione delle funzioni della laringe e i punteggi ottenuti sul giorno 1, 7 e 28 dopo l'iniezione di cellule staminali, come testato da Wilcoxon rank analisi15. La tabella 1 riassume i punteggi laringei di tutti i cavalli a intervalli di tempo differenti, come pure il tempo dall'inserimento dell'ago per l'iniezione delle cellule staminali e la corrente che ha provocato il movimento aritenoideo quando le celle dove iniettato.
Le cellule che sono state utilizzate nel presente studio sono state preparate secondo un protocollo pubblicato in precedenza7. Le cellule da tutte le frazioni sono stati in grado di differenziazione di trilineage, espresso CD90 e CD44, non hanno espresso CD45 e MHC II e avevano capacità clonogenica. Le cellule della frazione 15 – 25% sono stati scelti per l'ulteriore elaborazione perché hanno mostrato la più grande espressione di CD90 e la più grande capacità proliferativa.
Lo scopo del presente studio era non per testare l'efficienza dell'applicazione delle cellule staminali per rigenerare un nervo periferico danneggiato ma solo per testare la fattibilità della procedura e per valutare la sicurezza dell'iniezione di cellule staminali per il nervo laringeo ricorrente in un smal l numero di cavalli sani. Un'assenza di modifiche funzionali sull'imaging endoscopico in cinque cavalli fino a 28 giorni dopo l'iniezione e l'assenza di segni clinici in quattro dei cinque cavalli fino a 1 anno dopo l'iniezione conferma la fattibilità e la sicurezza della procedura. Un cavallo doveva essere eutanasia nel periodo di follow-up per ragioni non legate allo studio. Anche se le tecniche di dimostrano di essere al sicuro in un piccolo numero di cavalli, il numero di cavalli inclusi nel presente studio è troppo basso per dimostrare l'assenza di eventi rari.
| Punteggio ottenuto prima dell'iniezione | Tempo di iniezione (min) | Corrente a iniezione (mA) | Punteggio ottenuto al 1 ° giorno dopo l'iniezione | Punteggio ottenuto al 7 ° giorno dopo l'iniezione | Punteggio ottenuto al 28 ° giorno dopo l'iniezione | |
| Cavallo 1 (Standardbred, mare, 16 anni) | II. 1 | 12 | 0,5 | Ho | II. 1 | II. 1 |
| Cavallo 2 (Standardbred, mare, 22 anni) | Ho | 3 | 0,7 | Ho | Ho | Ho |
| Cavallo 3 (Standardbred, mare, 11 anni) | II. 1 | 4 | 0,5 | II. 2 | II. 1 | II. 1 |
| Cavallo 4 (Standardbred, mare, 12 anni) | Ho | 7 | 0,5 | Ho | II. 1 | Ho |
| Cavallo 5 (Standardbred, mare, 10 anni) | Ho | 3 | 0,7 | II. 1 | Ho |
Tabella 1: Signalment e laringeo funzione punteggi dei cavalli. Questa tabella indica i tempi di iniezione, la corrente minima provocazione qualsiasi movimento aritenoideo prima dell'iniezione e i punteggi laringei di cinque cavalli sani prima e al giorno 1, 7 e 28 dopo l'iniezione del muscolo-derivate cellule mesenchimali autologhe in vicinanza al nervo laringeo ricorrente sinistro. Cavallo #5 non era disponibile per il controllo al giorno 28 dopo l'iniezione per motivi estraneo a questo studio. I punteggi si riferiscono ai punteggi descritti da Robinson et al. 14. qui, Punteggio ottenuto I mezzi che i movimenti delle due cartilagini arytenoid erano sincroni e simmetrici, e un completo rapimento di entrambi cartilagini arytenoid poteva essere ottenuto e mantenuto. Punteggio ottenuto II. 1 significa che i movimenti delle cartilagini arytenoid erano asincroni o possono essere asimmetrici in determinati periodi; Tuttavia, un rapimento completo di entrambi cartilagini arytenoid poteva essere ottenuto e mantenuto.
Figura 2 : Impostazione durante l'iniezione delle cellule staminali. L'ago di stimolazione del nervo è introdotto sul lato sinistro della laringe e diretto verso il nervo laringeo ricorrente di sinistro. Lo stimolatore del nervo è impostato a 0,8 mA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo protocollo descrive la riuscita applicazione di cellule staminali autologhe derivate dal muscolo per i nervi laringei ricorrenti nei cavalli utilizzando un approccio guidato stimolatore del nervo. La vendemmia dell'esemplare di microbiopsy del muscolo, così come l'isolamento, cultura e caratterizzazione delle cellule staminali, sono stati descritti in dettaglio prima, mentre l'iniezione di queste cellule in prossimità di un nervo periferico è originale. La electro-localizzazione del nervo con uno stimolatore elettrico del nervo ha servito per il presente studio ed è stata usata per iniettare le cellule staminali mesenchimali in diretta prossimità con il nervo laringeo ricorrente. La risposta di motore è stata controllata dall'endoscopia video attraverso il nasofaringe. Se, durante il processo di posizionamento dell'ago, altri nervi sono state stimolate, il movimento corrispondente era visibile sullo schermo di endoscopia. Un riuscito stimolo del nervo laringeo ricorrente è stato caratterizzato dal rapimento tipico della cartilagine arytenoid. In un cavallo, è stato iniettato anestetico locale per indurre una transitoria paralisi del Muscolo aritenoideo. Anche se il riuscito impianto delle cellule in prossimità del nervo non è stato testato in modo specifico nel presente studio, la electro-localizzazione del nervo e l'iniezione a una bassa corrente ha dimostrato che le cellule staminali sono state applicate vicino al nervo. La vicinanza della per iniettato al nervo più ulteriormente è stata dimostrata da un riuscito blocco motore indotto da un'iniezione di un anestetico locale.
Nei restanti cinque cavalli, il tempo dalla stimolazione prima fino a quando l'iniezione di cellule staminali successo varia da 3 a 12 min. cavalli erano leggermente sedati durante la procedura, che ha aumentato la loro conformità con la stimolazione elettrica. Nessuno dei cavalli hanno mostrato reazioni avverse in qualsiasi momento, che indica che la durata della stimolazione può essere prolungata se necessario per ottenere il posizionamento dell'ago buona. Una ripida curva di apprendimento dovrebbe essere osservato se l'operatore sta utilizzando questa tecnica regolarmente e in un maggior numero di cavalli con diversa anatomia.
I cavalli comunemente soffrono di RLN, che è caratterizzata da diversi gradi di paralisi della cartilagine arytenoid sinistra che conduce a suoni respiratori anormali e intolleranza all'esercitano. Un'istologia dei nervi interessati rivela le lesioni tipiche di neuropatia periferica16. La neuropatia periferica è un termine usato per descrivere i vari tipi di lesioni periferiche del nervo che porta a sensazioni alterate, movimenti o funzioni dell'organo. Le cause sono altamente variabili e possono includere diabete, carenze nutrizionali, un trattamento con farmaci specifici, una lesione traumatica, ischemia o un'infezione, oppure possono essere idiopatiche. Indipendente della causa, neuropatie periferiche condividono comuni segni istopatologici, come degenerazione Walleriana, axonopathy distale o demielinizzazione segmentale. È stato dimostrato che la somministrazione di cellule staminali mesenchimali ai nervi periferici danneggiati può essere utile per la loro rigenerazione; Tuttavia, i meccanismi di fondo non sono capiti bene. Tradizionalmente, crediamo che le cellule staminali mesenchimali si differenzierà solo nei progenitori di adiposo, muscoli, cartilagine e tessuto osseo, ma a determinate condizioni, sono stati indicati a differenziarsi in miociti17, astrociti18 e myelinating cellule del periferico19 e del sistema nervoso centrale19. Durante una coltura in vitro , un'esposizione di neuropeptidi favorirà la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali in cellule che esprimono marcatori neuronali21,22. Diversi studi in vivo hanno dimostrato l'effetto benefico delle cellule staminali mesenchimali sulla rigenerazione del nervo ed un recupero funzionale nei modelli del ratto di lesione del nervo sciatico10,23. Questo è probabilmente causato da condizioni ambientali favorevoli che contribuiscono per la differenziazione delle cellule staminali in cellule tessuto-specifiche24. Gli studi futuri dovrebbero studiare anche questa tecnica per l'amministrazione delle cellule pre-differenziate nei cavalli RLN-commovente.
Al meglio della nostra conoscenza, questo è il primo rapporto che descrive l'uso di uno stimolatore del nervo per localizzare un nervo periferico al fine di iniettare un trattamento specifico in esso. Altre patologie del nervo periferico in varie specie, come il dolore neuropatico, possono essere trattate con la somministrazione di cellule staminali nella prossimità al nervo25,26. Gli studi futuri dovrebbero verificare l'effetto di questa tecnica in pazienti clinici e indagare il rischio di migrazione e il potenziale di differenziazione delle cellule iniettate.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Lo studio è stato finanziato dal centro di ricerca di Mont-le-Soie equina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
| Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
| TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
| TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG - 14090C | |
| Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
| DMEM - F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
| Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
| Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
| 24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
| Trypsin | Life technologies | 12604 | |
| HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
| NaCl | Sigma | S8776 | |
| T-25 cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
| T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
| Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |
References
- Duncan, I. D., Griffiths, I. R., Madrid, R. E. A light and electron microscopic study of the neuropathy of equine idiopathic laryngeal hemiplegia. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (6), 483-501 (1978).
- Cahill, J. I., Goulden, B. E. Equine laryngeal hemiplegia. IV. Muscle pathology. New Zealand Veterinary Journal. 34 (11), 186-190 (1986).
- Dixon, P. M., et al. Laryngeal paralysis: a study of 375 cases in a mixed-breed population of horses. Equine Veterinary Journal. 33 (5), 452-458 (2001).
- Dixon, P. M., Robinson, E., Wade, J. F. Review of the pathological changes in equine recurrent laryngeal neuropathy. Havemeyer Workshop on Equine Laryngeal Neuropathy. Havemeyer Monograph Series No. 11. , R&W Publications. Newmarket, UK. 9-11 (2003).
- Biasutti, S., Dart, A. J., Jeffcott, L. B. A review of recent developments in the clinical application of prosthetic laryngoplasty for recurrent laryngeal neuropathy: Indications, complications and outcome. Equine Veterinary Education. 29 (6), 337-345 (2016).
- Barnett, T. P., O'Leary, J. M., Parkin, T. D. H., Dixon, P. M., Barakzai, S. Z. Long-Term Maintenance of Arytenoid Cartilage Abduction and Stability During Exercise After Laryngoplasty in 33 Horses. Veterinary Surgery. 42 (3), 291-295 (2013).
- Ceusters, J., et al. From skeletal muscle to stem cells: an innovative and minimally-invasive process for multiple species. Scientific Reports. 7 (1), 696 (2017).
- Ding, D. C., Shyu, W. C., Lin, C. Z. Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 20 (1), 5-14 (2011).
- Jiang, L., Jones, S., Jia, X. Stem Cell Transplantation for Peripheral Nerve Regeneration: Current Options and Opportunities. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), 94 (2017).
- Tohill, M., Mantovani, C., Wiberg, M., Terenghi, G. Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration. Neuroscience Letters. 362 (3), 200-203 (2004).
- Ji, J. F., He, B. P., Dheen, S. T., Tay, S. S. W. Interactions of Chemokines and Chemokine Receptors Mediate the Migration of Mesenchymal Stem Cells to the Impaired Site in the Brain After Hypoglossal Nerve Injury. Stem Cells. 22 (3), 415-427 (2004).
- Urmey, W. F. Using the nerve stimulator for peripheral or plexus nerve blocks. Minerva Anesthesiologica. 72 (6), 467-471 (2006).
- De Andrés, J., Sala-Blanch, X. Peripheral nerve stimulation in the practice of brachial plexus anesthesia: a review. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 26 (5), 478 (2001).
- Robinson, N. E. Consensus statements on equine recurrent laryngeal neuropathy: conclusions of the Havemeyer Workshop. Equine Veterinary Education. 16 (6), 333-336 (2004).
- The BMJ: Rank Score Tests. , Available from: https://www.bmj.com/about-bmj/resources-readers/publications/statistics-square-one/10-rank-score-tests (2018).
- Hahn, C. N., et al. Histological and ultrastructural evidence that recurrent laryngeal neuropathy is a bilateral mononeuropathy limited to recurrent laryngeal nerves. Equine Veterinary Journal. 40 (7), 666-672 (2008).
- Orlic, D., et al. marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410 (6829), 701-705 (2001).
- Kopen, G. C., Prockop, D. J., Phinney, D. G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proceedings of the National Academy of Science. 96 (19), 10711-10716 (1999).
- Dezawa, M., Takahashi, I., Esaki, M., Takano, M., Sawada, H. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone marrow stromal cells. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1771-1776 (2001).
- Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39 (3), 229-236 (2002).
- Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. Journal of Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
- Sanchez-Ramos, J., et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Experimental Neurology. 164 (2), 247-256 (2000).
- Farzamfar, S., et al. Sciatic nerve regeneration by transplantation of menstrual blood-derived stem cells. Molecular Biology Reports. 44 (5), 407-412 (2017).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Brini, A. T., et al. Therapeutic effect of human adipose-derived stem cells and their secretome in experimental diabetic pain. Scientific Reports. 7 (1), 9904 (2017).
- Liu, W., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Stem Cells for Treating Diabetic Neuropathy in Metabolic Syndrome. Biomed Research International. 2017, 8945310 (2017).
